E SPRESSIONE TRANSIENTE MEDIATA DA Agrobacterium tumefaciens ED Agrobacterium rhizogenes IN PIANTE DI Nicotiana benthamiana.

3.15.1 Preparazione delle cellule batteriche elettrocompetenti di Agrobacterium

tumefaciens (ceppo GV3101) ed Agrobacterium rhizogenes (ceppo A4).

Sono stati inoculati 5 ml di coltura O.N. in brodo LB (Agrobacterium rhizogenes) o in brodo YEB (Agrobacterium tumefaciens) da una singola colonia fresca.

La coltura è stata diluita 1/500 e 1/1000 in LB ovvero YEB e lasciata crescere in agitazione a 28 °C (250 rpm) O.N., fino al raggiungimento della fase di crescita esponenziale.

Il giorno dopo le beute contenenti i batteri sono state poste in ghiaccio per 15’ e le colture sono state centrifugate at 4000 g per 5’ in tubi da 250 ml sterili.

Il sovranatante è stato decantato, i pellet sono stati risospesi in 50 ml di H2Odd sterile e centrifugati come sopra.

Di nuovo, il sovranatante è stato decantato, i pellet sono stati risospesi in 10 ml di H2Odd sterile e trasferiti in tubi da 50 ml e centrifugati come sopra.

Tale passaggio è stato ripetuto 6 volte utilizzando glicerolo freddo al 10% per i lavaggi. I pellet sono stati quindi risospesi in 1 ml di glicerolo al 10%, e suddivisi in aliquote da 50 µl, che sono state immerse in azoto liquido e rapidamente conservate a -80°C.

3.15.2 Trasformazione di Agrobacterium tumefaciens ed Agrobacterium rhizogenes con i plasmidi pBID4-Lic-E7-KDEL, pBID4-Lic-E7GGG-KDEL, pBID4-Lic-E7-VAC o pBID4-Lic-E7GGG-VAC

Al fine di verificare l’espressione delle proteine di fusione nell’ambito dei costrutti realizzati sia per l’agroinfezione di piante di Nicotiana benthamiana, sia per la trasformazione stabile di tessuti da cui ottenere la generazione di radici, i costrutti ottenuti sono stati utilizzati per la trasformazione sia del ceppo GV 1031 di Agrobacterium tumefaciens sia del ceppo A4 di

Sono state scongelate su ghiaccio un numero di aliquote corrispondenti alle trasformazioni con i costrutti in pBID4 da effettuare. 1-2 µl di DNA (1-100 ng) sono stati aggiunti a ciascuna aliquota di cellule, mescolati delicatamente alla sospensione cellulare ed aggiunti in cuvette da elettroporazione pre-raffreddate in ghiaccio in modo da coprire tutta la superficie del fondo ed evitando la formazione di bolle. Dopo aver rimosso l’umidità dalle pareti esterne delle cuvette, esse sono state poste nell’elettroporatore e trasformate per shock elettrico.

E’ stato quindi immediatamente aggiunto 1ml di brodo LB o YEB, ed il campione è stato risospeso e recuperato dalla cuvetta in un tubo pulito.

I batteri sono stati posti a crescere in incubatore a 28°C in agitazione per circa 2-3 ore, e poi piastrati (100 µl) su LB o YEB agar contenenti kanamicina 100 µg/ml.

3.15.2.1 Minipreparazioni di DNA dai ceppi di Agrobacterium trasformati

Per ciascuna trasformazione in Agrobacterium sono state scelte tre colonie, che sono state inoculate in 2 ml di brodo LB o YEB contenente kanamicina 100 µg/ml. Per l’estrazione del DNA plasmidico, i pellet sono stati risospesi in soluzione 1 + lisozima ed incubati a temperatura ambiente per 15’. Le sospensioni cellulari sono state poi incubate in Proteinasi K per 15’ a temperatura ambiente e si è proceduto come descritto per E. coli (§ 3.14.2.4). Le preparazioni di DNA sono state quindi utilizzate per trasformare nuovamente E. coli al fine di valutare l’effettiva stabilità del costrutto in pBID4.

3.15.3 Agroinfiltrazione di piante di Nicotiana benthamiana con i ceppi di Agrobacterium trasformati (Protocollo modificato da Kapila et al., 1997)

Una singola colonia fresca è stata inoculata O.N. a 28°C in brodo LB (Agrobacterium

rhizogenes) o in brodo YEB (Agrobacterium tumefaciens) contenenti kanamicina 100 µg/ml

(il volume di coltura “starter” dipende dal volume finale di coltura richiesta per l’infiltrazione).

La coltura O.N. è stata quindi diluita 1:100 in LB ovvero YEB (in beute di volume appropriato a garantire le migliori condizioni di crescita) a cui sono stati aggiunti:

Kanamicina 50mg/ml) 1M MES (pH 5.6) 1:100 1M MgSO4 1:500

20 µM Acetosiringone (in 50%Dimetilformamide/50%dH20)

raggiungimento di una OD600 pari a 2.4. Quindi la sospensione batterica è stata incu bata a temperatura ambiente in acetosiringone 200 µM per 1-3 ore prima dell’infiltrazione manuale o sottovuoto di foglie intatte in Nicotiana benthamiana.

3.15.3.1 Infiltrazione sotto vuoto di piante di Nicotiana benthamiana con Agrobacterium Piante di Nicotiana benthamiana sono state capovolte ed immerse in un “beaker” contenente la sospensione di Agrobacterium posto all’interno di un essiccatore.

E’ stata quindi applicata una pressione negativa pari a 0.2 mbar per circa un minuto (in funzione delle dimensione delle piante) per 3 volte.

3.15.3.2 Infiltrazione manuale di piante di Nicotiana benthamiana con Agrobacterium

Alternativamente, la pagina inferiore delle foglie (3 foglie/pianta all’atto delle analisi preliminari, possibilmente tutte le foglie all’atto dell’infiltrazione effettuata al fine della purificazione delle proteine di fusione) è stata infiltrata manualmente mediante l’uso di una siringa con circa 1 ml di sospensione batterica procurando di infiltrare l’intera superficie fogliare.

3.16 ANALISI DEGLI ESTRATTI DI FOGLIE INFILTRATE DI Nicotiana benthamiana

3.16.1 Preparazione degli estratti di foglia ed analisi mediante SDS-PAGE ed “immunoblotting”

Alla comparsa dei sintomi dell’infezione (dopo circa 4 giorni) e sino a 7 giorni dall’infiltrazione, 3 campioni casuali di foglie infiltrate da ciascuna pianta sono stati collezionati ed analizzati subito dopo il campionamento per la valutazione dell’espressione. Il materiale è stato anche collezionato e conservato a –80 °C per la successiva preparazione di estratti per le immunizzazioni in modello pre-clinico.

I campioni freschi provenienti dalle foglie infiltrate sono stati risospesi in PBS 1x in presenza di inibitori di proteasi (Roche) in un rapporto peso/volume pari a 1/3 (1 ml/0.3 g di foglia) e triturati finemente con l’aiuto di un pestello in plastica. Gli omogenati di tessuto sono stati quindi bolliti per 5’ in “gel loading buffer” per proteine e quindi centrifugati a 12000 rpm per 5 minuti a 4°C, ed i sovranatanti trasferiti in un tubo pulito, pronti ad essere separati mediante SDS-PAGE al 12% e trasferiti su membrana PVDF (Immobilon-P membrane - Millipore, Bedford, Ma, USA). Le membrane sono state sottoposte a “blocking” O.N. a 4°C (oppure per

1 ora a temperatura ambiente) con “blocking solution” (I-block reagent, Tropix – Bedford, MA) 0.5% w/v in PBS 1x + Tween 20 0.1% v/v. Le membrane sono state quindi incubate con anticorpo policlonale di topo contro la proteina His6-E7 ricombinante (1:1000), oppure con anticorpo policlonale di coniglio contro la proteina lichenasi ricombinante (1:5000) diluiti in “blocking solution”. Dopo 3 lavaggi in PBST, le membrane sono state incubate con anticorpo secondario policlonale, “anti-rabbit” (ovvero “anti-mouse”) perossidasati (1:10000) in “blocking solution”.

Si è poi proceduto, alla rivelazione della chemioluminescenza mediante Pierce SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (circa 5 ml/membrana) acquisendo l’immagine mediante “software” (Gene Snap, Syngene).

3.16.2 Rivelazione dell’attività lichenasica nelle fusioni mediante Zimogramma

Lo zimogramma è un metodo elettroforetico per la valutazione di attività proteolitiche. Tale metodica utilizza gel di separazione di poliacrilammide in presenza di SDS impregnati con il substrato di degradazione della proteasi di interesse che viene risolta durante la corsa elettroforetica. La successiva colorazione del gel con pigmenti ad affinità per le proteine rivela i siti di proteolisi sul gel in forma di bande chiare su fondo colorato. In un certo intervallo di valori, l’intensità delle bande può essere posta in relazione lineare con la quantità di proteasi caricata su gel. La denaturazione dei campioni relativi agli estratti delle piante infiltrate mediante bollitura in “gel loading buffer” e la corsa denaturante nel gel non inficiano il metodo. Le proteasi, infatti, hanno la proprietà di rinaturare e di esercitare la loro attività proteolitica dopo rimozione dell’SDS ed anche nella matrice del gel di poliacrilammide. Inoltre durante l’elettroforesi, gli inibitori di proteasi utilizzati per la preparazione del campione per evitare la degradazione della fusione in studio, si dissociano dalla proteasi stessa e non interferiscono con l’analisi dell’attività enzimatica. Tale metodo è estremamente sensibile (consentendo la rilevazione anche di 10 pg di proteasi).

Di conseguenza, parallelamente all’ ”immunoblotting”, i campioni relativi agli estratti di pianta infiltrati sono stati analizzati per la rivelazione dell’espressione delle proteine di fusione attraverso il metodo dello zimogramma, mediante separazione su gel di poliacrilammide al 12% preparato sostituendo, nel gel di separazione, 1 ml di H20dd del protocollo canonico con 1 ml di substrato per la lichenasi (lichenano 0.5% in H20d) secondo la ricetta in Tab. 6.

Tab. 6

Dopo la corsa elettroforetica, il gel è stato sottoposto a due lavaggi da 5’ in ddH20, a due lavaggi da 5’ in 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 0.1% Triton X-100 ed è stato, quindi, posto in incubazione a 65°C per 1 ora con tampone di lavaggio fresco.

Successivamente, il gel è stato colorato con rosso Congo (0.5%) per 5’ a temperatura ambiente ed in agitazione ed è stato poi sottoposto a tre lavaggi in ddH20. La colorazione è stata sviluppata a temperatura ambiente mediante aggiunta di 1M NaCl. Il contrasto della colorazione a livello delle bande di reazione è stato incrementato con 1M Tris-base.