DOPO AGROINFEZIONE (effettuato presso il “Fraunhofer Center for Molecular Biotechnology”, Newark-DE)
4.8 PREPARAZIONE DEI PLASMIDI RICOMBINANTI BASATI SU PBID4
4.8.1 Amplificazione delle sequenze E7 ed E7GGG per il clonaggio nel vettore intermedio pBlueScriptSK(-) ai fini della fusione nella regione del “loop” del gene della lichenasi B di Clostridium thermocellum
La sequenza codificante per la proteina E7 di HPV16 ed il gene mutato E7GGG sono stati fusi alla regione del “loop” (tra i siti Bgl II e Hind III) del gene lichenasi clonato nel vettore pET– PRACS-Lic-KDEL e pET–PRACS-Lic-VAC (tali vettori erano stati già ottenuti presso il “Fraunhofer Center for Molecular Biotechnology”).
Per l’amplificazione delle sequenze attese di 371pb, sono stati utilizzati il primer diretto
E7NotBgl dir, ed il primer inverso E7Hind rev.
Il DNA purificato è stato digerito con le endonucleasi Not I e HindIII e inizialmente clonato nel vettore pBlueScriptSK(-) tra i siti NotI e Hind III per la selezione mediante alfa- complementazione dei cloni trasformanti di Escherichia coli che sono stati analizzati mediante digestione.
I plasmidi intermedi ricombinanti sono stati sequenziati con i primers E7NotBgl dir ed
E7Hind rev per l’analisi delle sequenze (non essendo stata utilizzata Pfu polimerasi per
l’amplificazione dei geni).
4.8.2 Clonaggio delle sequenze E7 ed E7GGG nei vettori pET-PRACS-lic-KDEL e pET-PRACS-lic-VAC
Le sequenze relative ai geni E7 ed E7GGG sono state excise dal vettore pBluescriptSK(-) a partire da un clone scelto tra quelli risultati positivi dopo digestione e sottoposte a ligazione, nelle condizioni descritte, nei vettori pET-PRACS-lic-KDEL e pET-PRACS-lic-VAC digeriti con gli stessi enzimi. Si è proceduto quindi alla trasformazione dei batteri XL1 blue. I plasmidi ricombinanti ottenuti dai trasformanti (pET-PRACS-lic-E7-KDEL e pET-PRACS- lic-E7VAC, pET-PRACS-lic-E7GGG-KDEL e pET-PRACS-lic-E7GGG-VAC) verificati mediante digestione Bgl II-Hind III, sono stati poi impiegati per il clonaggio delle sequenze
PRACS-lich-E7-KDEL e PRACS-lich-E7VAC, PRACS-lich-E7GGG-KDEL e PRACS-lich- E7GGG-VAC nel vettore pBID4 per la successiva agroinfezione.
4.8.3 Clonaggio delle sequenze PRACS-lic-E7-KDEL e PRACS-lic-E7-VAC, PRACS lic-E7GGG-KDEL e PRACS-lic-E7GGG-VAC nel vettore pBID4
Le sequenze sono state excise dai vettori ricombinanti con le endonucleasi di restrizione Pac I ed Xho I per il recupero della intera sequenza di fusione per il successivo clonaggio nel vettore pBID4 (digerito nelle stesse condizioni) mediante reazione di ligazione. Si è proceduto quindi alla trasformazione dei batteri XL-1 blue che sono stati piastrati su LB/Kan e verificati mediante digestione.
4.9 ANALISI DEGLI ESTRATTI DI FOGLIE INFILTRATE DI Nicotiana benthamiana 4.9.1 Preparazione degli estratti di foglia ed analisi mediante “immunoblotting”
Piante di Nicotiana benthamiana sono state infiltrate sotto vuoto o manualmente con colture di Agrobacterium tumefaciens GV3101 o Agrobacterium rhizogenes A4 trasformate con i plasmidi pBID4-Lic-E7-KDEL, pBID4-Lic-E7GGG-KDEL, pBID4-Lic-E7-VAC e pBID4- Lic-E7GGG-VAC.
Alla comparsa dei sintomi dell’infezione (dopo circa 4 giorni) e sino a 7 giorni dall’infiltrazione, i campioni di foglie infiltrate sono stati collezionati ed analizzati per la valutazione dell’espressione.
L’espressione della proteina E7 è stata inizialmente verificata nelle foglie infiltrate a quattro giorni dall’agro-infiltrazione mediante “immunoblotting”, sviluppato con ambo gli anticorpi primari pAb α-lichenasi (Fig. 77) e pAb α-His6E7 (Fig. 78) seguiti da incubazione con gli anticorpi secondari dell’appropriata specificità. Tale analisi ha dimostrato come l’espressione della proteina sia associata ai sintomi dell’infezione da Agrobacterium.
Gli estratti ottenuti da piante di Nicotiana benthamiana infiltrate con le colture di
Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes trasformati con i plasmidi pBID4-
Lic-E7-KDEL mostrano una banda cospicua corrispondente alla fusione della proteina E7 con la lichenasi B (circa 35-38 kDa).
Il valore di ≤40 kDa corrisponde effettivamente al pM atteso per il prodotto di fusione completo Lic-E7-KDEL, considerando che la proteina E7 esibisca una mobilità elettroforetica corrispondente al proprio pM teorico di 11 kDa (anziché a quello di circa 21), poiché il pM della lichenasi B corrisponde a 21-24 kDa (Fig. 77, 78, 79, 80 ).
L’analisi degli estratti di Nicotiana benthamiana infiltrate con le colture di Agrobacterium
tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes trasformati con i plasmidi pBID4-Lic-E7-VAC
rivela che le piante, a seguito dell’infiltrazione, esprimono la relativa fusione. I segnali, tuttavia, risultano sdoppiati in due bande distinte che potrebbero rappresentare la forma correttamente processata della fusione per la ritenzione nel vacuolo e la forma non processata ancora provvista di sequenza segnale (Fig. 77, 78, 79, 80 ).
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
Fig. 77 (pAb α-lichenasi): Fig. 78 (pAb α-His6E7):
(Agrobacterium tumefaciens GV3101) (Agrobacterium tumefaciens GV3101)
1) Lichenasi 30ng 1) His6E7 60ng
2) pBID4-Lic-E7-KDEL (pianta 1) 2) pBID4-Lic-E7-KDEL (pianta 1)
3) pBID4-Lic-E7-KDEL (pianta 2) 3) pBID4-Lic-E7-KDEL (pianta 2)
4) pBID4-Lic-E7-KDEL (pianta 3 4) pBID4-Lic-E7-KDEL (pianta 3)
5) Marker 5) pBID4-Lic-E7-VAC (pianta 1)
6) pBID4-Lic-E7-VAC (pianta 1) 6) pBID4-Lic-E7-VAC (pianta 2)
7) pBID4-Lic-E7-VAC (pianta 2) 7) pBID4-Lic-E7-VAC (pianta 3)
A. rhizogenes A. tumefaciens A. rhizogenes A. tumefaciens
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Fig. 79: Fig. 80:
1) Marker 1) Lichenasi 30 ng
2) pBID4-Lic-E7-KDEL (4 giorni) 2) pBID4-Lic-E7- VAC (4 giorni)
3) pBID4-Lic-E7-KDEL (5 giorni) 3) pBID4-Lic-E7- VAC (5 giorni)
4) pBID4-Lic-E7-KDEL (6 giorni) 4) pBID4-Lic-E7-VAC (6 giorni)
5) pBID4-Lic-E7-KDEL (7 giorni) 5) pBID4-Lic-E7-VAC (7 giorni)
6)pBID4-Lic-E7-KDEL (4 giorni) 6) Marker
7) pBID4-Lic-E7-KDEL (5 giorni) 7) pBID4-Lic-E7- VAC (4 giorni)
8) pBID4-Lic-E7-KDEL (6 giorni) 8) pBID4-Lic-E7- VAC (5 giorni)
9) pBID4-Lic-E7-KDEL (7 giorni) 9) pBID4-Lic-E7-VAC (6 giorni)
10) Lichenasi 30 ng 10) pBID4-Lic-E7-VAC (7 giorni)
Per ambo i ceppi di Agrobacterium, il costrutto che esprime un maggior livello di prodotto si è rivelato essere quello codificante per le fusioni provviste del segnale KDEL, che è stato scelto, quindi, ai fini della produzione massiva di tessuto esprimente la fusione di E7 (ed E7GGG) con la lichenasi.
Sia l’espressione della fusione E7-Lic-KDEL, sia della fusione E7-Lic-VAC si mantiene piuttosto stabile dal quarto al settimo giorno dall’infezione, senza variazioni di rilievo nel livello di espressione che si mantiene costantemente elevato (sebbene sembri aumentare leggermente in corrispondenza del quinto giorno). Fa eccezione l’espressione indotta dall’agro-infezione con il ceppo di Agrobacterium rhizogenes, che diminuisce drammaticamente dal sesto al settimo giorno. Si è deciso, quindi, di procedere al campionamento in corrispondenza del quinto giorno dall’infiltrazione in assenza di degradazione della fusione. Tali risultati, ottenuti inizialmente per le fusioni con la proteina E7, si sono ripetuti anche per le fusioni con la proteina E7GGG (Fig. 81, 82)