Linea cellulare HEK 293 (“Human Embryo Kidney”).

Linea permanente di cellule umane aderenti al substrato descritte per la prima volta nel 1977, generata mediante trasformazione con Adenovirus 5 di una popolazione di cellule di derivazione neuronale rinvenuta in colture cellulari embrionali di rene. Tale linea è utilizzata per la produzione di adenovirus, vettori virali e proteine umane ricombinanti glicosilate (Graham et al., 1977). Le condizioni di mantenimento richieste sono standard: temperatura 37°C, CO2 5%, umidità relativa 95%. Per la propagazione del monostrato ancorato alla fiasca di coltura è richiesta la tripsinizzazione (Trypsin lyophilised, Gibco).

3.1.5 Anticorpi

3.1.5.1 Anticorpi primari

• Anticorpo policlonale contro la proteina E7 di HPV16, derivante da topi BALB/c immunizzati con la proteina di fusione His6-E7 purificata dopo espressione in Escherichia

coli (pAb α-E7). Diluizione d’uso: 1:1000.

• Anticorpo policlonale di coniglio contro E7. Diluizione d’uso: 1:1000

• Anticorpo policlonale di coniglio contro il virus PVX, (pAb α-PVX, Adgen). Diluizione d’uso: 1:5000.

• Anticorpo policlonale di coniglio contro la proteina lichenasi di Clostridium

termocellum, (pAb α-Lich). Diluizione d’uso: 1:5000.

• Anticorpo monoclonale di topo contro l’epitopo “His6-tag” (SIGMA). Diluizione d’uso:

3.1.5.2 Anticorpi secondari

• Anticorpo policlonale, “anti-mouse” biotinilato, 1021 (Amersham Pharmacia biotech). Diluizione d’uso: 1:5000.

• Anticorpo policlonale, “anti-rabbit” biotinilato (Amersham Pharmacia biotech). Diluizione d’uso: 1:5000.

• Streptavidina perossidasata (Amersham Pharmacia biotech). Diluizione d’uso: 1:2000. • Anticorpo policlonale, “anti-rabbit” coniugato con perossidasi di rafano (Amersham Pharmacia biotech). Diluizione d’uso: 1:10000.

• Anticorpo policlonale, “anti-mouse” coniugato con perossidasi di rafano (Amersham Pharmacia biotech). Diluizione d’uso: 1:10000.

• Anticorpo policlonale, “goat-anti-mouse” coniugato con perossidasi di rafano (Pierce) Diluizione d’uso 1: 10000.

3.1.6 Oligonucleotidi.

Per gli oligonucleotidi utilizzati per le amplificazioni delle sequenze oggetto di questo lavoro si rimanda ai paragrafi in cui queste sono descritte.

•

T3

•

T7 oligonucleotidi commerciali utilizzati per il sequenziamento • Sp6

3.1.7 Plasmidi

3.1.7.1 pQE-30 (QIAGEN, QIAespress system)

Il vettore di clonaggio e d’espressione batterica pQE30 (Fig. 25) ha una complessità pari a 3400 pb. A monte del “polylinker”, contiene un sito di legame per il ribosoma (RBS) ed un “tag” di sei istidine (His6 tag) che viene aggiunto a monte della proteina espressa dal gene di interesse clonato per la purificazione della stessa mediante cromatografia per affinità. Il plasmide contiene l’origine di replicazione batterica ColE1 ed il marcatore di selezione Ampr. Il sistema di espressione è regolato dalla regione promotore/operatore costituita dal promotore del fago T5 (PT5) e da due sequenze operatore lacO.

Fig. 25: Mappa del vettore d’espressione pQE-30.

3.1.7.2 pBlueScriptSK(+)(Stratagene)

Il vettore di clonaggio pBlueScriptSK(+) (Fig. 26) è un fagemide di 2958 bp, derivato dal plasmide pUC19. Contiene l’origine di replicazione di Escherichia coli e del fago filamentoso f1 ed il marcatore di selezione Ampr. Il “polylinker” è parte integrante del gene lacZ, codificante l’enzima β-galattosidasi e generalmente represso, in assenza di lattosio, dal legame del prodotto del gene lacI al sistema promotore.

Fig. 26: Mappa del vettore pBlueScriptSK

Il gene lacZ è attivato dall’isopropil-β-D-tiogalattoside (IPTG), che induce l’espressione dell’enzima e quindi l’idrolisi del substrato incolore 5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galattoside

(X-Gal) aggiunto al mezzo di coltura, convertendolo in un composto blu insolubile. Il clonaggio di un gene di interesse nel “polylinker” determina l’interruzione del gene lacZ e l’espressione di una β-galattosidasi incapace di idrolizzare il cromogeno X-Gal. I cloni trasformati con il plasmide ricombinante e quelli contenenti il vettore ‘scarico’ saranno, pertanto, distinguibili risultando incolori i primi e blu i secondi (sistema di selezione mediante alfa-complementazione). Il “polylinker” è fiancheggiato dai promotori T3 e T7, per la trascrizione in vitro del gene clonato ed il suo sequenziamento.

3.1.7.3 pcDNA3.1(+) (Invitrogen)

pcDNA3.1(+) (Fig. 27) è un vettore di circa 5.400 bp per l’espressione di proteine ricombinanti in cellule di mammifero. Tale plasmide contiene una sequenza promotrice derivante dal Citomegalovirus (CMV) per l’efficiente trascrizione del gene clonato, ed il segnale di poliadenilazione e le sequenze di terminazione della trascrizione del gene dell’ormone della crescita bovino (BGH), che incrementano la stabilità dell’RNA. E’ presente l’origine di replicazione di Escherichia coli, del virus 40 della scimmia (SV40), e del fago filamentoso f1. I geni di resistenza all’ampicillina e alla neomicina (questo ultimo è provvisto del promotore e del terminatore della trascrizione di SV40) consentono la selezione, rispettivamente, dei cloni trasformati di Escherichia coli e delle cellule di mammifero trasfettate stabilmente. Il “polylinker” è fiancheggiato dai promotori T7 e Sp6, per la trascrizione in vitro del gene clonato ed il suo sequenziamento.

Fig. 27: Mappa del vettore pcDNA3.1 del suo polylinker. Sono stati evidenziati i siti di restrizione utilizzati per i clonaggi.

3.1.7.4 pPVX201

Fig. 28: Diagramma con le principali caratteristiche del vettore pPVX201(descritte nel testo) .

Il vettore pPVX201 (Fig. 28) è un vettore basato sul virus PVX (virus ad RNA (+) a singolo filamento, membro della famiglia dei potexvirus). In tale vettore è stato clonato il cDNA corrispondente al genoma virale che comprende 5 ORF: la ORF situata all’estremità 5’ (ORF1) codifica la replicasi virale RNA-dipendente di 166 kDa; le ORFs 2,3,4, parzialmente sovrapposte e costituenti il “blocco genico triplo” (TGB) codificano tre proteine (TGBp1, TGBp2, TGBp3), essenziali per il la diffusione del virus da cellula a cellula. La ORF 5 situata in 3’ codifica per la “coat protein” (CP) del virus. Nel vettore pPVX201 il promotore subgenomico (sgP) per l’RNA della CP è stato duplicato. Tale duplicazione consente il controllo della trascrizione dell’RNA subgenomico della CP tramite il promotore al 3’, mentre la regolazione della trascrizione della sequenza di interesse clonata nel polylinker è affidata al promotore duplicato in 5’ posizionato, appunto, a monte del sito multiplo di clonaggio. A monte del cDNA virale così modificato è stato inserito il promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore (CaMV35S); a valle, si trova il terminatore della trascrizione del gene della nopalina sintasi di Agrobacterium tumefaciens (nos ter).

Lo scheletro del vettore pPVX201 contiene anche l’origine di replicazione di Escherichia coli ed il marcatore di selezione Ampr.(Baulcombe et al., 1995).

3.1.7.5 pET-32a

I vettori pET sono plasmidi batterici progettati per consentire la rapida produzione di proteine ad elevati livelli, quando attivati. Tale plasmide contiene il gene lacI che codifica per il repressore lac, un promotore T7 specifico per la RNA polimerasi di T7, un operatore lac che può bloccare la trascrizione, il “polylinker”, l’origine di replicazione f1 (per la produzione di un plasmide a singolo filamento durante la co-infezione con il fago helper M13), il marcatore di selezione Ampr e l’origine di replicazione ColE1 (Fig. 29).

Fig. 29: Mappa del plasmide pET32a. In alto a sinistra è indicata la regione compresa tra il promotore T7 ed il terminatore T7 della trascrizione mancante nel plasmide modificato utilizzato per i clonaggi.

Nel presente lavoro, il plasmide pET-32a è stato meramente utilizzato ai fini della fusione dei geni E7 ed E7GGG nella regione del “loop” del gene della lichenasi di Clostridium

thermocellum, poiché quest’ultimo era stato già clonato in tale plasmide.

Infatti, la regione corrispondente al dominio catalitico della lichenasi provvisto della sequenza per la secrezione PR-1A (“pathogen-related protein A”) all’estremita’ 5’, di un His6 tag all’estremità 3’(preceduto o meno dalla sequenza di ritenzione nel reticolo endoplasmatico KDEL o da una sequenza di indirizzamento al vacuolo) e dei siti di restrizione Pac I ed XhoI (rispettivamente a monte ed a valle), era stato già ligato in un plasmide pET-32a modificato (mediante excisione della regione compresa tra il promotore ed il terminatore T7) tra i siti Bam HI e SacI introdotti artificialmente con l’uso di due primers. In questo modo erano stati ottenuti i costrutti pET–PRACS-Lic-KDEL e pET–PRACS-Lic- VAC (Fig. 30).

Fig. 30: Antefatto alla fusione delle sequenze E7 ed E7GGG al gene della lichenasi (sono indicate le regioni A e C del dominio catalitico): realizzazione dei costrutti pET–PRACS-Lic- KDEL e pET–PRACS-Lic-VAC derivanti dal clonaggio delle sequenze PRACS-Lic-KDEL e PRACS-Lic-VAC in un vettore pET modificato.

3.1.7.6 Plasmidi derivati da TMV e vettore pBI-D4

pBI-D4 è un vettore derivato dal vettore binario pBI121 in cui il gene “reporter” della beta-D- glucuronidasi di Escherichia coli (GUS) è stato sostituito con un “polylinker” (Fig. 31) nel quale, fra i siti Xba I e Sac I è stato clonato un vettore derivato dal virus del mosaico del tabacco (TMV), in cui il gene per la CP virale è stato sostituito da un altro “polylinker” per l’espressione di un gene di interesse sotto il controllo del promotore subgenomico della CP (Fig. 32) (Shivprasad et al., 1999). Tale vettore era stato già ottenuto presso il “Fraunhofer Center for Molecular Biotechnology”, Newark –DE).

Fig. 31: Diagramma schematico dell’organizzazione del vettore pBI121

Il virus del mosaico del tabacco è un virus a RNA (+) di 6395 nucleotidi a simmetria elicoidale il cui cDNA è alla base di diversi vettori per l’espressione transiente ad elevati livelli in pianta di proteine eterologhe. L’.RNA virale genomico esprime due proteine associate alla

subgenomici. L’efficienza del sgP della CP (freccia verde in Figura 8) e di un altro sgP situato più a monte di questo (che promuove la trascrizione di un RNA subgenomico relativo sia alla proteina del movimento M, sia alla CP - freccia viola), fa sì che la CP del TMV rappresenti il 10% delle proteine solubili totali (TSP) contenute nelle piante infettate da questo virus.

Fig. 32: Diagramma schematico della derivazione del plasmide pBID4 da un vettore pBI dopo excisione del gene GUS in cui è stato clonato un plasmide derivato da TMV (tale vettore è stato ottenuto presso il “Fraunhofer Center forMolecular Biotechnology”, Newark –DE).

A) REALIZZAZIONE DI UN VACCINO TERAPEUTICO A DNA BASATO SU

Nel documento Impiego delle piante come biofabbriche ed uso di sequenze derivate da pianta e/o da virus vegetali per lo sviluppo di vaccini di nuova generazione (genetici e di origine vegetale) contro i tumori indotti dai virus del papilloma umano ad alto rischio. (pagine 109-117)