Vaccino terapeutico derivato da pianta basato sull’espressione della proteina E7 mediata da P

Alcuni virus ad RNA (+) a singolo filamento si sono dimostrati utili e promettenti strumenti ingegnerizzabili per l’espressione rapida di geni eterologhi in piante ospiti suscettibili all’infezione. Il potexvirus Potato Virus X (PVX), già introdotto, si è dimostrato un efficace vettore per l’espressione in forma solubile di proteine eterologhe. Alcune caratteristiche di PVX (assenza di vettori animali, ampio spettro d’ospite) lo rendono un efficace strumento per l’espressione transiente in pianta evitando il molto più laborioso e costoso ottenimento di piante transgeniche.

In un precedente studio, come già accennato, abbiamo ottenuto con successo l’espressione transiente della proteina E7 di HPV 16 in piante di Nicotiana benthamiana, utilizzando un vettore derivante, appunto, dal PVX. Topi immunizzati con l’estratto crudo di foglia somministrato per via sub-cutanea (e che aveva dimostrato di non avere effetti tossici sugli animali in esperimenti preliminari) hanno sviluppato alti titoli di IgG totali contro E7 contro E7 e la selezione di cloni CTL E7-specifici. Tale vaccino è stato, dunque, in grado di indurre una potente risposta cellulo-mediata ed ha fornito protezione dallo sviluppo di tumore dopo sfida con una dose tumorigenica di cellule esprimenti E7 (circa il 40% degli animali immunizzati sono risultati protetti) (Franconi et al., 2002). I dati ottenuti hanno dato, inoltre, indicazioni che tale vaccino derivato da pianta possiede un intrinseco potere adiuvante, poiché la protezione indotta dal solo estratto di pianta contenente la proteina E7 si è dimostrata paragonabile a quella prodotta da elevate quantità di proteina ricombinante purificata da E.

coli somministrate in formulazioni contenenti l’adiuvante Quil-A. Dai dati di protezione

ottenuti, è stato ipotizzato che fosse possibile ottenere una maggiore percentuale di topi responsivi aumentando il contenuto dell’antigene E7 in ciascuna dose di estratto crudo di pianta somministrata con il vaccino. Infatti, utilizzando 10 µg di proteina E7 ricombinante purificata da E. coli, la protezione ottenuta dopo l’immunizzazione è stata pressoché totale. Dunque, un fattore limitante l’efficacia dell’immunogeno E7 in tale vaccino, potrebbe essere rappresentato dal contenuto della proteina E7 stessa negli estratti utilizzati per l’immunizzazione. Questo rappresenta uno dei principali problemi tecnici associati con l’espressione di antigeni vaccinali in pianta, ma potrebbe essere superato aumentando i livelli di espressione della proteina in pianta (Franconi et al., 2002).

L’indirizzamento verso compartimenti sub-cellulari potrebbe avere un ruolo fondamentale nell’accumulo di una proteina di interesse. Il “targeting” verso la secrezione fornisce generalmente un sistema più adatto ad un ripiegamento ed ad un assemblaggio appropriati di una proteina di quanto non sia l’ambiente riducente offerto dal citoplasma, come dimostrato da studi condotti sull’espressione di anticorpi in pianta (Franconi et al., 1999; Schillberg et

al., 1999) e rappresenta, dunque, un sito vantaggioso per un accumulo ad alto livello di una

proteina d interesse. Il RE è caratterizzato da un ambiente ossidante, caratterizzato da un’abbondanza di “chaperone” molecolari che assistono il “folding” della proteina e, al contrario, carenza di proteasi , limitando, così, il rischio di proteolisi. Inoltre, soprattutto proteine potenzialmente tossiche come E7 potrebbero essere più facilmente espresse se segregate in un compartimento sub-cellulare oppure secrete nell’apoplasto. In questo caso, il “targeting” nella via secretoria oltre ad incrementare i livelli di espressione, determinando l’accumulo nei fluidi interstiziali, potrebbe semplificare le procedure di estrazione ed aumentare la quantità di proteina ottenuta con l’estratto, rappresentando un sistema naturale per concentrare proteine eterologhe in un tessuto vegetale.

La sequenza PGIPss di Phaseolus .vulgaris era stata impiegata in precedenza, nel nostro laboratorio, per la produzione della versione secretoria di un anticorpo ricombinante di tipo scFv per la realizzazione di piante transgeniche resistenti ai tospovirus. Per determinare se l’espressione del scFv fosse compatibile con la produzione di un prodotto funzionale, è stata inizialmente effettuata l’espressione transiente utilizzando, appunto, un vettore epicromosomico d’espressione derivato da PVX. In tale vettore il gene del scFv era stato clonato in modo da ottenere un anticorpo citosolico oppure secretorio. Per ottenere la forma secretoria, era stata utilizzata la PGIPss di Phaseolus vulgaris. Successivamente, il gene codificante per la versione secretoria dell’anticorpo è stato usato per la trasformazione stabile

di Nicotiana benthamiana e, sia le piante infettate per l’espressione transiente sia quelle trasformate stabilmente con il gene codificante per tale versione secretoria, sono state in grado di esprimere molecole scFv completamente funzionali nei fluidi interstiziali (Franconi et al., 1999).

Scopo di questa sezione del presente lavoro è stato, dunque, la produzione dell’oncoproteina E7 di HPV16 attraverso il “targeting” nella via secretoria di pianta con l’impiego della sequenza PGIPss (ottenendone auspicabilmente la secrezione nei fluidi interstiziali), oppure attraverso la ritenzione nel RE con l’uso della sequenza KDEL, con l’obiettivo di incrementare i livelli di espressione dell’oncoproteina E7 in pianta in modo da aumentarne la resa di produzione / grammo di tessuto e, in ultima analisi, il contenuto / dose di vaccino. Questo al fine di migliorare l’attività immunogenica della formulazione vaccinale che prevede l’immunizzazione con estratti crudi di Nicotiana benthamiana ed ottenere un maggior livello di protezione contro i tumori indotti da HPV in un modello pre-clinico.

E’ stata inoltre prodotta una versione mutata del gene E7 di HPV16 nel sito di legame al pRb per ottenere vaccini a sub-unità più accettabile basati sulla stessa strategia.

Per semplificare le procedure di purificazione (qualora questa si rendesse necessaria per lo sviluppo del vaccino in alternativa alla somministrazione dell’estratto crudo di foglia), è stata prodotta una proteina E7 provvista di un “tag” di poli-istidine utile alla purificazione mediante cromatografia per affinità all’estremità N-terminale dell’onco-proteina con o senza la sequenza KDEL all’estremità C-terminale.

2.2.2 Vaccino terapeutico derivato da pianta basato sull’espressione della proteina di