PREPARAZIONE DEI PLASMIDI RICOMBINANTI BASATI SU PBID4 1 Amplificazione delle sequenze E7 ed E7GGG

La sequenza codificante per la proteina E7 di HPV16 ed il gene mutato E7GGG sono stati fusi alla regione del “loop” (tra i siti BglII e HindIII) del gene lichenasi clonato nel vettore pET–PRACS-Lic-KDEL e pET–PRACS-Lic-VAC.

A tale scopo essi sono stati amplificati con opportuni oligonucleotidi dai plasmidi pQE30-E7 e pQE30-E7GGG mediante PCR effettuata con Platinum PCR Supermix (Invitrogen). Le miscele di PCR sono state così preparate.

- 45 µl Platinum PCR Supermix 1x [22 U/ml Taq DNA polimerasi

anticorpo Platinum® Taq

22 mM Tris-HCl (pH 8.4) 55 mM KCl 1.65 mM MgCl2 220 µM dGTP 220 µM dATP 220 µM dTTP 220 µM dCTP]

- 10 pmoli di primer diretto, - 10 pmoli di primer inverso, - 100 ng di DNA templato, - H2Odd sterile a volume (50 µl).

Per l’amplificazione delle sequenze sono stati usati il primer diretto E7NotBgl dir, fiancheggiato dal sito di restrizione per le endonucleasi NotI e BglII ed il primer inverso

E7Hind rev, fiancheggiato dal sito di restrizione NotI e contenente il codone di stop della

traduzione (indicato in corsivo). Infatti, essendo disponibile per il clonaggio intermedio delle sequenze amplificate il vettore pBlueScript SK(-) (nel cui polylinker NotI è a monte rispetto a

HindIII), ed essendo stato utilizzato l’enzima Taq DNA polimerasi per l’amplificazione, l’uso

di tali siti nei corrispondenti oligonucleotidi facilita la selezione dei cloni trasformanti durante la verifica per sequenziamento. Il sito BglII, mancando nel polylinker del vettore di clonaggio intermedio, è stato introdotto con il primer E7NotBgl dir.

E7NotBgl dir:

5’- ggC CgC ggC CgCAgA TCT ATgCAT ggA gAT ACA CCT ACA TTg -3’ |________________| |___________________________________________________ NotI BglII gene E7/E7GGG

E7Hind rev:

5’- ggCC AAg CTT Tgg TTT CTg AgA ACA gAT ggg g -3’ |_____________| |_____| |________________________________________ HindIII STOP gene E7GGG

3.14.2 Clonaggio delle sequenze nel vettore intermedio pBlueScriptSK(-)

Le sequenze E7 ed E7GGG, amplificate come descritto, sono state analizzate mediante elettroforesi su gel d’agarosio. Quindi il DNA è stato purificato direttamente dalla miscela di PCR mediante “Qiaquik PCR purification kit (QIAGEN) al fine di effettuare i clonaggi. Il DNA purificato è stato digerito con le endonucleasi NotI e HindIII, quindi purificato da gel dopo corsa elettroforetica utilizzando il “QIAGEN minelute extraction kit” (QIAGEN) secondo le indicazioni fornite dalla casa produttrice. Le sequenze sono state inizialmente clonate nel vettore pBlueScriptSK(-) tra i siti NotI e HindIII per la selezione mediante alfa- complementazione dei cloni trasformanti di Escherichia coli e per la successiva verifica mediante digestione con le endonucleasi di restrizione delle sequenze clonate.

3.14.2.1 Reazione di ligazione e trasformazione delle cellule batteriche

La reazione di ligazione, catalizzata dalla DNA ligasi T4 (Invitrogen), derivante da

Escherichia coli, è stata condotta mediante incubazione O.N. a 4°C della miscela di reazione

- 1 µl di tampone di reazione 10x [18.8 mM Tris-HCl (pH 8.3) 90.6 mM KCl 4.6 mM MgCl2 3.8 mM DTT 0.15 mM NAD 10 mM (NH4)2SO4] - vettore plasmidico digerito

- inserto (in quantità conformi a un rapporto molare 1:1, o 1:2 con il vettore) - 1 unità di DNA ligasi T4 [1 U/µl] (Roche)

- H2Odd sterile, fino al volume di 10 µl.

Le cellule XL-1 blue di E.coli sono state trasformate con metodo chimico come già descritto e piastrate su su terreno LB agarizzato, contenente 0,1 µg/ml di ampicillina, X-Gal (50 µl X-Gal 2% / piastra) ed IPTG (20 µl IPTG 10 mM/piastra).

3.14.2.2 Caratterizzazione dei ricombinanti batterici mediante digestione di miniprep

Dai cloni di Escherichia coli, trasformati con i plasmidi ricombinanti, si è proceduto ad estrazione del DNA plasmidico mediante minipreparazioni che sono state, poi, analizzate mediante digestione con gli enzimi BglII e HindIII per la verifica della dimensione del frammento.

Le mini preparazioni di DNA plasmidico sono state effettuate centrifugando per 2’ a 13000 rpm 2 ml di coltura O.N. cresciuta in brodo 2xYT. I pellet sono stati risospesi in 200 µl di soluzione 1 (50 mM glucosio; 25 mM Tris-Cl pH 8.0; 10 mM EDTA pH 8.0), lisati in 400 µl di soluzione 2 preparata al momento (0.2 M NaOH; 1% SDS ) e precipitati in 300 µl di soluzione 3 (5 M potassio acetato 60 ml, acido acetico glaciale 11.5 ml, H20 28.5 ml ) ed incubati in ghiaccio per 15’. E’ seguita una centrifugazione a 4 C per 5’ a 13000 rpm . Il sovranatante e’ stato trasferito in un tubo pulito e dopo incubazione a temperatura ambiente in isopropanolo, e’ stato precipitato in etanolo al 70 % freddo, poi allontanato. I pellet sono stati risospesi in H20dd sterile ed utilizzati per le restrizioni BglII-HindIII secondo le istruzioni della casa produttrice (Biolabs).

La qualità del DNA purificato è stata verificata mediante elettroforesi su gel di agarosio, mentre la concentrazione è stata determinata spettrofotometricamente, mediante lettura dell’assorbanza a 260 nm.

I plasmidi intermedi ricombinanti sono stati sequenziati con i primers E7NotBgl dir ed

3.14.3 Clonaggio delle sequenze E7 ed E7GGG nei vettori pET-PRACS-lic-KDEL e pET-PRACS-lic-VAC

Per i cloni batterici positivi alla digestione e contenenti le sequenze corrette, si è proceduto a Midi preparazione di DNA plasmidico con “Genopure Plasmid Midi kit” (Roche), secondo il protocollo fornito dalla casa produttrice. Utilizzando tali preparazioni, le sequenze sono state excise dal vettore pBluescriptSK(-) intermedio con le endonucleasi di restrizione BglII e

HindIII, e sottoposte a ligazione, nelle condizioni già descritte, nei vettori pET-PRACS-lic-

KDEL e pET-PRACS-lic-VAC digeriti con gli stessi enzimi. Si è proceduto quindi alla trasformazione dei batteri XL-1 che sono stati piastrati su LB/Amp. I plasmidi ricombinanti ottenuti dai trasformanti (pET-PRACS-lic-E7-KDEL e pET-PRACS-lic-E7VAC, pET- PRACS-lic-E7GGG-KDEL e pET-PRACS-lic-E7GGG-VAC) verificati mediante digestione

BglII-HindIII, sono stati poi impiegati per il clonaggio delle sequenze PRACS-lich-E7-KDEL

e PRACS-lich-E7VAC, PRACS-lich-E7GGG-KDEL e PRACS-lich-E7GGG-VAC nel vettore pBID4 per la successiva agroinfezione (Fig. 43).

Fig. 43: Fusione dei geni E7 ed E7GGG nella sequenza codificante per il gene lichenasi tra i siti BglII ed HindIII e successivo clonaggio nel vettore pBID4tra i siti PacI ed XhoI

3.14.4 Clonaggio delle sequenze PRACS-lic-E7-KDEL e PRACS-lic-E7-VAC, PRACS lic-E7GGG-KDEL e PRACS-lic-E7GGG-VAC nel vettore pBID4

recupero della intera sequenza di fusione per il successivo clonaggio nel vettore pBID4 digerito nelle stesse condizioni, mediante reazione di legazione per ottenere i plasmidi pBID4-Lic-E7-KDEL, pBID4-Lic-E7GGG-KDEL, pBID4-Lic-E7-VAC e pBID4-Lic- E7GGG-VAC (Figura 21). Si è proceduto quindi alla trasformazione dei batteri XL-1 che sono stati piastrati su LB/Kan e verificati mediante digestione.

3.15 ESPRESSIONE TRANSIENTE MEDIATA DA Agrobacterium tumefaciens ED