Espressione transiente di proteine eterologhe in pianta

Il principale vantaggio nell’uso dei sistemi di espressione transiente è rappresentato dalla replicazione batterica o virale stessa, che amplifica il numero di copie del gene d’interesse e tipicamente determina un livello di espressione del gene di interesse molto più alto rispetto alla trasformazione stabile ed è specialmente vantaggiosa per specie recalcitranti alla rigenerazione; inoltre, non richiedendo l’integrazione del gene di interesse nel genoma dell’ospite, determina livelli di espressione della proteina di interesse che non sono influenzati da effetti di posizione e sono valutabili in tempi brevi; inoltre, non viene permessa la diffusione del transgene all’esterno con il polline.

Espressione transiente mediata da Agrobacterium (Agro-infezione).

Sono disponibili differenti sistemi per l’espressione transiente in pianta come alternativa alla trasformazione stabile. Tra questi, vi è l’infiltrazione con ceppi ricombinanti dello stesso

Agrobacterium tumefaciens utilizzato per la generazione di piante transgeniche. Mentre per la

trasformazione stabile è richiesta l’integrazione del T-DNA nel genoma dell’ospite, nel caso transiente (che si ottiene mediante agro-infiltrazione manuale o sotto-vuoto di tessuti o piante intere con sospensioni cellulari di Agrobacterium tumefaciens transgenici in opportune condizioni di induzione dei geni vir), copie di T-DNA che non si integrano, rimangono transientemente presenti nel nucleo dell’ospite e vengono trascritte per portare all’espressione transiente dei geni clonati al loro interno. (Kapila et al., 1997). Il sistema di espressione transiente mediato da Agrobacterium tumefaciens, tuttavia, a differenza dei sistemi transienti basati sui vettori virali, non porta all’espressione sistemica del gene d’interesse. D’altra parte, però, presenta il vantaggio di poter ospitare sequenze esogene di lunghezza anche superiore a 2kb per la generazione di costrutti che sarebbero altrimenti instabili in vettori virali (Voinnet

et al., 2003). Un ulteriore vantaggio è rappresentato dalla possibilità, quindi, di trasformare la

pianta con più di transgene, cosicché proteine multimeriche come gli anticorpi o proteine di fusione possono essere espressi ed assemblati; inoltre vi è la possibilità di co-esprimere più transgeni attraverso la co-infiltrazione con differenti colture di Agrobacterium mescolate. Il livello di espressione del transgene in queste condizioni di solito presenta un picco a 72 ore dall’infiltrazione e dopo declina rapidamente principalmente a causa di fenomeni di “silencing” post-trascrizionale (Kapila et al., 1997; Voinnet et al., 2003).

La tecnica dell’agro-infezione può essere utilizzata per produrre limitate quantità di proteina di interesse al fine di verificarne l’espressione prima di procedere alla produzione di piante transgeniche stabili, oppure per produrre elevate quantità di proteina e, dunque, come

piattaforma principale di produzione. In linea di principio, dunque, il sistema di espressione transiente mediato da Agrobacterium può essere applicato su scala industriale.

Espressione transiente mediata da vettori virali.

L’espressione di proteine eterologhe mediata da virus in tabacco si è dimostrata uno strumento valido e potente per la produzione di proteine a valore farmaceutico come anticorpi e vaccini a sub-unità rispetto alla tecnologia della trasformazione stabile che richiede tempo per la rigenerazione di piante transgeniche (Koprowski & Yusibov, 2001, Awram et al., 2002). Il gene codificante per la proteina di interesse è clonato nel genoma virale che quindi viene utilizzato per l’infezione di piante ospiti all’opportuno stadio di crescita. Il virus così ingegnerizzato si diffonde e si replica, e come conseguenza, numerose copie del gene eterologo sono prodotte dalla pianta ospite ed alti livelli di espressione vengono raggiunti in un periodo di tempo relativamente breve (Fig. 24). I vettori virali presentano molti vantaggi come la rapidità di espressione, le alte rese, i costi ridotti. Inoltre, essi non sono diffusi dal polline, impedendo così la contaminazione di altre piante con il gene di interesse. In più, nei casi in cui il gene eterologo codifica per un prodotto tossico o che interferisce con il metabolismo della pianta (e che, dunque, non potrebbe essere espresso in piante transgeniche stabili), l’espressione mediata da virus vegetali rappresenta la sola possibilità di esprimere il gene di interesse. Tuttavia, il sistema dei virus vegetali può essere inficiato dall’instabilità del costrutto che può portare alla perdita del gene se questo è più grande di 1 kb. Inoltre la necessità di inoculare singolarmente ogni pianta fa della produzione su larga scala un lavoro piuttosto intenso.

Sostanzialmente, vettori virali efficienti consistono di virus pienamente funzionali che, di solito, si comportano come il virus selvatico e, dunque, mantengono l’infettività, sono stabili, hanno la capacità di diffondersi sistemicamente nella pianta ospite (generalmente in due-tre settimane) e producono particelle virali infettive, ma sono stati modificati in modo da poter sostenere il clonaggio e consentire l’espressione del gene che codifica per la proteina eterologa di interesse. Inoltre, in molti casi, è possibile incrementare i livelli di proteina espressa semplicemente effettuando più re-infezioni nello stesso o in un altro ospite utilizzando gli estratti di piante infette (Fig. 24). I vettori derivati da virus vegetali sono basati principalmente su virus ad RNA come il virus del mosaico del tabacco (TMV) ed il virus X della patata (PVX). A volte, come nel caso di PVX, sono già disponibili i DNA plasmidici contenenti il cDNA del virus vegetale. Alcune caratteristiche di PVX, come l’assenza di vettori animali e l’ampio spettro d’ospite, ne fanno uno strumento sicuro per l’espressione

transiente in pianta (Chapman et al., 1992). L’uso dei vettori virali basati sui virus vegetali ad RNA è limitato dalla comprensione non ancora completa dei meccanismi di replicazione virali e dalle limitazioni che geni clonati al loro interno possono infliggere all’efficienza di replicazione. Molti sono stati i tentativi di incrementare l’efficienza di produzione di proteine eterologhe migliorando i vettori stessi o le piante ospiti (Gleba et al., 2004).

Fig. 24: Espressione transiente mediata da vettori virali (PVX) (da Franconi & Venuti, 2005).