Fӧrster Resonance Energy Transfer (FRET)

Il trasferimento di energia per risonanza, dall’inglese Fluorescence Resonance Energy

Transfer o Fӧrster Resonance Energy Transfer (FRET), consiste nell’interazione tra gli

stati elettronici di due specie molecolari nel quale, l’energia viene trasferita da una molecola donatore (D) ad una molecola accettore (A), senza alcuna emissione di fotoni

[61-68].

Questo processo viene ampiamente utilizzato per studiare una vasta gamma di fenomeni biologici che producono cambiamenti della struttura e della conformazione molecolare di proteine e altri sistemi biologici [61]. Presenta inoltre una valida soluzione per migliorare e ottimizzare le prestazioni dei dispositivi LSC, andando a minimizzare le perdite di efficienza di Light Harvesting (ηLH) trattate nel capitolo precedente [62,63,65].

Tramite il processo FRET due molecole di colorante che assorbono in regioni dello spettro solare differenti possono scambiarsi energia e quindi massimizzare l’intensità di fluorescenza del colorante che emette in corrispondenza del range spettrale di assorbimento della cella fotovoltaica, posta sul bordo del dispositivo. In questo modo è possibile sfruttare una ulteriore finestra dello spettro solare e quindi concentrare una maggiore quantità di luce.

Secondo Fӧrster e Weber, tale trasferimento di energia non radiativo è causato da una interazione dipolo-dipolo tra la molecola D e la molecola A. Quando una molecola D

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assorbe l’energia di una radiazione luminosa di opportuna frequenza, si genera un dipolo oscillante il quale risuona successivamente con il dipolo oscillante di una molecola A nelle vicinanze. Tale interazione dipolo-dipolo coinvolge un trasferimento di energia dal fluoroforo donatore a quello accettore. Quindi in questo processo le molecole di colorante eccitate vengono considerate come un dipolo oscillante che può subire uno scambio energetico con un secondo dipolo avente una frequenza di risonanza simile [68]. A tal proposito, il trasferimento di energia per risonanza è analogo al comportamento di oscillatori accoppiati, come una coppia di diapason che vibrano alla stessa frequenza.

Una coppia di molecole in grado di interagire in tal modo e scambiare energia tramite il FRET è spesso definita come coppia donatore-accettore (coppia D-A) (Figura 1.16).

Figura 1.16: Trasferimento di energia tramite FRET per una coppia Donatore-Accettore. L’intero processo può essere schematizzato utilizzando il diagramma di Jablonski, nel quale si riassumono i diversi passaggi (Figura 1.17) [67,68]:

1. L’assorbimento della radiazione luminosa incidente da parte della molecola D causa l’eccitazione dallo stato fondamentale di singoletto (S0) ad uno stato

energetico superiore;

2. Un rapido decadimento, dell’ordine dei picosecondi, porta la molecola D dallo stato elettronicamente eccitato al livello vibrazionale più basso dello stato S1;

3. Se la molecola D è sufficientemente vicina ad una molecola A essa può trasferire energia in maniera non radiativa. Tale trasferimento si manifesta attraverso la diminuzione o il quenching della fluorescenza di D e attraverso la riduzione dell’emivita del suo stato eccitato;

4. La molecola A assorbe l’energia ed emette in fluorescenza con una intensità

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Figura 1.17: Diagramma di Jablonski modificato che descrive le transizioni energetiche che coinvolgono il processo FRET.

Questo trasferimento energetico “a cascata” fa sì che l’accettore emetta una radiazione luminosa molto più intensa di quella che avrebbe se fosse eccitata direttamente dalla radiazione solare.

Le condizioni fondamentali [61,68] affinché possa avvenire il FRET sono le seguenti:

 È necessaria una buona sovrapposizione spettrale tra lo spettro di emissione del donatore e lo spettro di assorbimento dell’accettore (Figura 1.18a);

 Le molecole di colorante donatore e di accettore devono essere sufficientemente vicine tra loro, circa 10 nm (Figura 1.18b);

 Gli orientamenti dei momenti di dipolo di entrambe le molecole devono essere approssimativamente paralleli tra loro (Figura 1.18c);

 L’emivita dello stato eccitato del fluoroforo D deve essere sufficiente a consentire il verificarsi del FRET.

Figura 1.18: Condizioni fondamentali FRET: a) Sovrapposizione tra lo spettro di assorbimento del donatore e lo spettro di emissione dell’accettore; b) Distanza della coppia D-A; c) Corretta orientazione

della coppia D-A.

L’efficienza del processo FRET (EFRET) dipende evidentemente dalla distanza tra i due fluorofori, infatti la fluorescenza della molecola A è tanto più intensa quanto più la

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coppia D-A è vicina. L’equazione di Fӧrster (Eq. 1.14) definisce gli elementi essenziali necessari per calcolare la distanza D-A [68]:

EFRET =

1

(1+𝑅6

𝑅06)

Eq. 1.14

Dove R6 indica la distanza effettiva tra le due molecole di colorante, mentre R06 viene

definita distanza critica di Fӧrster ovvero, la distanza alla quale l’efficienza del FRET è del 50%. Come si può vedere dal grafico in Figura 1.19 l’efficienza del trasferimento di energia è massimo per distanze della coppia D-A molto brevi, stimate intorno ai 10 nm.

Figura 1.19: Rappresentazione grafica della relazione tra l’efficienza del FRET e la distanza donatore- accettore. R0 è indicato dalla linea tratteggiata. I limiti pratici delle distanze donatore-accettore sono

indicati dalle linee tratteggiate [68].

Il parametro R06 viene definito dalla seguente relazione (Eq. 1.15):

R06 = 8,8x1023 k2 n-4 Q0 J(λ) Eq. 1.15 Dove:

 Il termine k indica il fattore di orientamento del dipolo (dipendente dalla libertà di orientazione delle molecole) statisticamente uguale a 0,476 per molecole di D e A distribuite casualmente in una matrice polimerica rigida;

 Il parametro n è l’indice di rifrazione del mezzo in cui sono disperse le molecole di colorante;

 Q0 indica la resa quantica di fluorescenza del donatore in assenza dell’accettore;

 J(λ) è l’integrale di sovrapposizione spettrale (Eq. 1.16) in cui fD(λ) è la funzione

dello spettro normalizzato di emissione del donatore ed εA(λ) il coefficiente di

estinzione molare dell’accettore:

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La relazione tra l’efficienza del FRET e l’intensità di fluorescenza è definita dalla seguente equazione (Eq. 1.17) [68]:

EFRET = 1 – 𝐹𝐷𝐴

𝐹_𝐷 Eq. 1.17

Dove FDA e FD rappresentano le intensità di fluorescenza del donatore rispettivamente in

presenza e in assenza dell’eccettore. Perché l’efficienza sia massima (pari a 1), occorre al limite che tutta l’energia emettibile dal donatore sia trasmessa per FRET all’accettore.