Metodica della coltura e antibiogramma

Dopo la rimozione, al contenitore sterile contenente la punta del catetere estratto viene aggiunta una quantità di circa 2 ml di brodo di coltura TSB (Tryptic Soy Broth o brodo di soia triptico). Il TSB è costituito da un estratto di caseina di soia ed è un terreno di arricchimento liquido universale usato per le procedure qualitative dei test di sterilità e per l’arricchimento e la coltura di microrganismi aerobi non eccessivamente esigenti, in particolare gli aerobi comuni e gli anaerobi facoltativi. Il contenitore viene quindi messo in incubazione per 24 ore a 37° C.

Successivamente, un’aliquota del brodo (corrispondente a qualche microlitro) viene seminata su tre differenti terreni di coltura, che sono i seguenti: Agar Sangue, Agar Sale Mannite, Mac Conkey Agar. In particolare, l’Agar Sangue è un terreno elettivo contenente una miscela di peptoni ed è particolarmente adatto alla coltura della maggior parte dei microrganismi d’interesse clinico. La presenza del sangue permette inoltre la determinazione dell’emolisi, che è un criterio per l’identificazione batterica e anche per la valutazione della patogenicità di un microrganismo, in particolare del

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genere Streptococcus. L’Agar Sale Mannite è un terreno selettivo e differenziale utilizzato per l’isolamento degli Stafilococchi. Il Mac Conkey Agar invece, è un terreno selettivo e differenziale utilizzato per l’isolamento dei batteri Gram negativi non esigenti. Una volta ottenuta la semina, questi tre terreni, vengono messi in incubazione per 24 ore a 37° C.

Dopo la seconda incubazione si guarda quindi la crescita batterica sui tre terreni e già a questo punto si può fare una discriminazione in base al tipo di terreno su cui è avvenuta la crescita e alle caratteristiche macroscopiche e microscopiche delle colonie. Nel dettaglio, la crescita sull’Agar Sangue e sul Mac Conkey Agar è indicativa di un batterio Gram negativo; la crescita sull’Agar Sangue e sull’Agar Sale Mannite è indicativa di uno stafilococco; in ogni caso, si tratta di un’identificazione presuntiva, che deve essere accompagnata anche dall’esame microscopico delle colonie con la colorazione di Gram.

A questo punto si prelevano alcune colonie e si trasferiscono su un vetrino per la colorazione di Gram. Questa colorazione permette di differenziare i batteri Gram positivi dai Gram negativi, mettendo in evidenza le proprietà della parete cellulare dei microrganismi. I passaggi attraverso i quali è stata effettuata la colorazione di Gram sono i seguenti:

1. L’operatore sterilizza l’ansa sulla fiamma fino a farla diventare incandescente, aspetta poi che si raffreddi e con essa preleva una parte della colonia e la pone sul vetrino portaoggetti;

2. L’operatore predispone una vaschetta per la colorazione e appoggia il vetrino su un supporto orizzontale sopra elevato alla vaschetta;

3. Usando una pipetta, si ricopre il vetrino con diverse gocce di cristal-violetto e si lascia agire per 60 secondi;

4. Si versa l’eccesso di colorante e si risciacqua con acqua: a questo punto i batteri Gram negativi verranno decolorati, mentre i Gram positivi resistono all’azione dell’acqua e rimangono viola

5. Si ricopre il vetrino con il liquido di Lugol che ha effetto fissante e si lascia agire per 60 secondi. Si fa poi scivolare l’eccesso di Lugol lavando il vetrino con etanolo;

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6. Usando una pipetta si ricopre il vetrino con diverse gocce di safranina e si lascia agire per 60 secondi; quindi si sciacqua con acqua, si fa sgocciolare il vetrino e si mette ad asciugare;

7. Infine, si osserva il vetrino al microscopio ottico. Come risultato finale si avranno i batteri Gram positivi di colore viola, mentre i batteri Gram negativi saranno di colore rosso.

A questo punto, grazie alle caratteristiche macroscopiche delle colonie e dal risultato della colorazione di Gram è possibile fare una identificazione presuntiva del batterio isolato.

L’identificazione a livello di specie e l’antibiogramma sono analisi che partono nello stesso momento.

Per quanto riguarda l’identificazione, questa è stata realizzata tramite il sistema semi- automatizzato miniAPI (bioMérieux) e le gallerie API 20 Strep, per l’identificazione delle Streptococcaceae e dei germi correlati, ID 32 GN per l’identificazione dei bacilli Gram negativi, e ID 32 STAPH per l’ identificazione degli stafilococchi. Di seguito è riportato il procedimento per l’identificazione dei diversi sistemi.

API® 20 Strep

La galleria API 20 Strep è costituita da 20 microprovette contenenti dei substrati disidratati per la rilevazione delle attività enzimatiche o della fermentazione degli zuccheri.

Per i test enzimatici l’inoculo è costituito da una sospensione densa, ottenuta da una coltura pura, che consente la reidratazione del substrato enzimatico. Le reazioni prodotte durante il periodo di incubazione sono evidenziate da un viraggio cromatico spontaneo o successivo all’aggiunta di reattivi ausiliari.

Per i test fermentativi l’inoculo è costituito da un terreno arricchito (contenente un indicatore di pH) che consente la reidratazione degli zuccheri. La fermentazione dei carboidrati comporta un processo di acidificazione che si traduce con un viraggio cromatico spontaneo dell’indicatore.

La lettura delle reazioni si effettua utilizzando la Tabella di Lettura e l’identificazione di ottiene consultando l’Indice Analitico oppure utilizzando un software di identificazione.

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- Dopo l’isolamento del microrganismo che deve essere identificato e dopo aver verificato che questo appartenga alla famiglia delle Streptococcaceae:

• Annotare il tipo di emolisi sulla scheda per la registrazione dei risultati; • Prelevare una colonia ben isolata e sospenderla in 0,3 ml di acqua

sterile. Omogeneizzare bene;

• Inondare una piastra di agar Columbia al sangue di montone con questa sospensione (o strofinare in condizioni di sterilità l’intera superficie dell’agar con un tampone);

• Incubare la piastra 24 ore (± 2 ore) a 36°C ± 2°C in anaerobiosi.

- Riunire fondo e coperchio di una vaschetta di incubazione e distribuire circa 5 ml di acqua distillata o demineralizzata nei pozzetti per creare un ambiente umido;

- Annotare il riferimento del ceppo sulla linguetta laterale della vaschetta; - Estrarre la galleria dal suo involucro e metterla nella vaschetta di incubazione; - Aprire una fiala di API Suspension Medium (2 ml) o utilizzare una provetta

contenente 2 ml di acqua distillata senza additivi;

- Servendosi di un tampone, prelevare l’intera coltura precedentemente separata;

- Preparare una sospensione piuttosto densa con opacità superiore al punto 4 di McFarland e utilizzarla immediatamente;

- Nella prima metà della galleria (test da VP ad ADH). Distribuire la sospensione preparata evitando la formazione di bolle (a tale scopo inclinare leggermente in avanti la vaschetta di incubazione ad appoggiare la punta della pipetta o della PSIpetta sul lato interno della cupola):

• Per i test da VP a LAP: distribuire circa 100µl in ciascuna cupola; • Per il test ADH: riempire unicamente la provetta.

- Nella seconda metà della galleria (test da RIB a GLYG):

• Aprire una fiala di API GP Medium e trasferirvi il resto della sospensione, ossia al minimo 0,5 ml. Omogeneizzare bene;

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- Riempire con olio di paraffina le cupole dei test sottolineati da ADH a GLYG fino a formare un menisco convesso;

- Chiudere la vaschetta di incubazione;

- Incubare a 36°C ± 2°C in aerobiosi per 4-4,5 ore per una prima lettura ed eventualmente, se necessario, per 24 ore (± 2 ore) per una seconda lettura. Dopo 4 ore di incubazione:

• Aggiungere i reattivi specifici per ogni substrato

• Attendere 10 minuti, poi leggere tutte le reazioni riferendosi alla Tabella di Lettura. Se necessario, esporre la galleria ad una lampada potente (1000 W) per 10 secondi per decolorare il reattivo in eccesso nelle provette da PYRA a LAP. A distanza di 24 ore eseguire nuovamente la lettura delle reazioni ESC, ADH, e da RIB a GLYG senza rileggere le reazioni enzimatiche e VP. Trascrivere tutte le reazioni sulla scheda dei risultati.

L’identificazione si ottiene partendo dal profilo numerico.

- Determinazione del profilo numerico: sulla scheda dei risultati, i test vengono separati in gruppi di tre e ad ognuno viene attribuito un valore pari a 1, 2 o 4. All’interno di ogni tripletta, vengono sommati fra di loro i valori corrispondenti alle sole reazioni positive, ottenendo così, un profilo numerico a 7 cifre;

- Identificazione: si ottiene partendo dalla base dei dati (V6.0), utilizzando l’Indice Analitico basta ricercare il profilo numerico nella lista dei profili; se si utilizza il software di identificazione invece, bisogna digitare sulla tastiera le 7 cifre del profilo numerico.

106 Figura 26 Base dei dati (V6.0)

ID 32 GN

La galleria ID 32 GN è composta da 32 cupole; ogni cupola contiene un substrato disidratato (carboidrato).

Il germe da identificare viene messo in sospensione in un terreno semi-solido. Dopo 24-48 ore di incubazione, un lettore automatico misura la crescita in ogni cupola e l’identificazione si ottiene con gli strumenti ATB Expression o mini API.

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- Estrarre la galleria dall’involucro, gettare il sacchetto del disidratante e mettere il coperchio;

- Annotare il riferimento del ceppo sulla linguetta laterale della galleria;

- Aprire una fiala API NaCl 0,85% Medium (2 ml) o usare una provetta contenente 2 ml della stessa soluzione, senza additivi;

- Prelevare una o più colonie identiche dal terreno di coltura. Si raccomanda di utilizzare colonie giovani (18-24 ore);

- Preparare una sospensione batterica con una opacità pari al punto 0,5 di McFarland;

- Aprire la fiala di API AUX Medium e trasferirvi circa 200 µl della sospensione precedentemente preparata. Questa sospensione deve essere inoculata immediatamente dopo la preparazione;

- Inoculo AUTOMATICO:

• Disporre sul vassoio dell’inoculatore ATB la galleria, la fiala di API AUX Medium inoculata ed il puntale;

• L’inoculatore eseguirà automaticamente l’omogeinizzazione della fiala ed il riempimento delle cupole (135 µl/cupola);

- Inoculo MANUALE:

• Omogeneizzare la fiala di API AUX Medium inoculata e, servendosi della ATB Pipetta Elettronica distribuire 135 µl di sospensione in ogni cupola - Mettere il coperchio sulla galleria

- Incubare a 29°C ± 2°C per 24 ore (± 2 ore).

La lettura e l’interpretazione devono essere eseguite automaticamente con i sistemi ATB ExpressionTM o miniAPI utilizzando la base dei dati (V3.1).

Il lettore ricerca in ogni cupola una crescita significativa e trasmette i dati all’elaboratore. Questo interpreta i dati, sotto forma di profilo numerico ad 11 cifre, ed indica l’identificazione del ceppo in esame.

108 Figura 27 Base dei dati (V3.1) prima parte

Figura 28 Base dei dati (V3.1) seconda parte

ID 32 STAPH

La galleria ID 32 STAPH è costituita da 32 cupole di cui 26 sono utilizzate come cupole- test ciascuna contenente un terreno di reazione disidratato.

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La lettura delle reazioni si effettua dopo 24 ore di incubazione, sia ad occhio nudo che utilizzando gli strumenti ATBTM ExpressionTM o miniAPI®.

L’identificazione si ottiene con un software di identificazione. Procedimento:

- Per l’isolamento delle colonie utilizzare i seguenti terreni: agar al sangue, Chapman (MSA) o Baird Parker;

- Estrarre la galleria dal suo involucro, eliminare il disidratante e chiudere la galleria con il coperchio;

- Annotare il riferimento del ceppo sulla linguetta laterale della galleria;

- Aprire una fiala di API®Suspension Medium, 2 ml (3 ml se si utilizza l’inoculatore ATBTM) o utilizzare una provetta contenente acqua distillata sterile senza additivi;

- Prelevare una o più colonie identiche. Utilizzare di preferenza colture giovani; - Preparare una sospensione batterica con opacità pari al punto 0,5 di

McFarland. La sospensione deve essere utilizzata subito dopo la sua preparazione;

- Inoculo AUTOMATICO:

• Disporre su un vassoio dell’inoculatore ATB la galleria, la fiala di API Suspension Medium inoculata ed un puntale;

• L’inoculatore esegue automaticamente l’omogeinizzazione della fiala ed il riempimento delle cupole (55 µl/cupola);

- Inoculo MANUALE:

• Omogeinizzare la fiala di API Suspension Medium seminata e, servendosi della Pipetta Elettronica ATB, inoculare la galleria distribuendo 55 µl di sospensione in ogni cupola;

- Ricoprire le cupole dei test URE, ADH e ODC con 2 gocce di olio di paraffina; - Mettere il coperchio sulla galleria;

- Incubare a 36°C ± 2°C per 24 ore in aerobiosi.

Rivelare tutte le reazioni della fila 0 aggiungendo 1 goccia dei rispettivi reattivi. Leggere dopo 5 minuti (fino a 10 minuti):

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• Verificare che la parte centrale della galleria sia pulita, per permettere che il lettore riconosca il codice della galleria. Il lettore registra il colore di ogni cupola e trasmette i dati al computer;

- Lettura VISIVA:

• Vedere la Tabella di Lettura. Annotare i risultati sulla scheda dei risultati.

L’identificazione si ottiene tramite la base dei dati (V2.1):

- DOPO LA LETTURA AUTOMATICA: i risultati trasmessi al computer vengono interpretati dal software di identificazione dell’ATB Expression o del miniAPI - DOPO LA LETTURA VISIVA: le reazioni ottenute sono codificate in un profilo

numerico.

Sulla scheda dei risultati i test sono divisi in gruppi di tre e per ciascuno di essi è indicato un valore pari a 1, 2 o 4. All’interno di ogni tripletta, vengono sommati fra di loro i valori corrispondenti alle sole reazioni positive.

Dopo aver digitato manualmente sulla tastiera le 9 cifre del profilo numerico, l’identificazione viene eseguita direttamente dal software di identificazione apiwebTM: le 4 cifre della fila in alto a sinistra, seguite dalle 4 cifre della fila in basso a sinistra, seguite infine da una 9a cifra per la codifica dei test RIB e CEL.

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Per quanto riguarda l’antibiogramma, questo è stato effettuato mediante la procedura di Kirby-Bauer (figura 30), descritta in seguito:

1. Una colonia isolata viene prelevata dalla piastra di agar;

2. È stata preparata una sospensione batterica in soluzione salina (o soluzione fisiologica) alla densità specifica di 0,5 McFarland (circa 108 CFU/ml);

3. Un tampone è stato quindi introdotto nella sospensione batterica e poi strisciato su tutta la superficie di una piastra di MuelleHinton agar sterile in modo da ottenere una crescita batterica uniforme;

4. Sono stati quindi posti sulla piastra dischetti di carta imbevuti di diversi antibiotici a concentrazioni note;

5. La piastra è stata infine incubata per 18 ore a 37°C per consentire la crescita batterica;

6. Infine, viene misurato il diametro degli eventuali aloni di inibizione prodotti attorno ai dischetti dei differenti antibiotici ed i valori ottenuti vengono interpretati confrontandoli con i valori di riferimento specifici o breakpoint (EUCAST www.eucast.org), in modo da stabilire se il batterio isolato è sensibile o resistente.

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