Produzione della proteina E7GGG mediante trasformazione nucleare

Come studio di produzione proteica in un sistema vegetale a noi nuovo quale C.

reinhardtii si è scelto in primo luogo di esprimere il gene E7 mediante trasformazione

nucleare in maniera costitutiva o inducibile, in quanto la tecnologia ed i vettori erano già disponibili. Si è scelto di esprimere la proteina E7 nella forma mutagenizzata E7GGG (già impiegata nel nostro laboratorio in formulazioni vaccinali terapeutiche contro HPV, Massa et al., 2007, 2008), che presenta tre mutazioni amminoacidiche nel sito di legame alla proteina RB (figura 60), che aboliscono il suo potere trasformante, risultando quindi più sicura per un‘eventuale futura applicazione clinica.

Figura 60. Mutazioni presenti nella forma mutagenizzata del gene E7 di HPV-16 (E7GGG).

Si è scelto di inserire all‘estremità N-terminale della proteina il ―tag‖ di istidine, sia ai fini dell‘eventuale purificazione, sia per la protezione dell‘estremità di E7 che in cellule di mammifero viene velocemente ubiquitinata e quindi degradata dal complesso proteasomale (Reinstein et al., 2000). La sequenza amminoacidica della proteina His6-

E7GGG è riportata in figura 61.

Figura 61. Sequenza amminoacidica della proteina His6-E7GGG (431 aa).

In viola è riportato il ―tag‖ di istidine; in arancio sono indicati gli amminoacidi interposti (a funzione di braccio spaziatore) tra il ―tag‖ e la sequenza della proteina E7GGG. Sono evidenziati i tre amminoacidi mutati rispetto alla forma originaria.

4.4.1.1 Preparazione dei costrutti per la trasformazione nucleare

Come accennato in introduzione, C. reinhardtii è spesso recalcitrante all‘espressione di sequenze esogene che non siano state adattate, nel contenuto di GC e nella scelta dei

codoni, alle caratteristiche del suo genoma (per l‘espressione nel genoma nucleare: 63% di GC, 90% in terza posizione e solo i codoni dei geni nucleari più espressi).

L‘ottimizzazione della sequenza del gene His6-E7GGG è stata condotta dalla GenScript

Corporation, a partire dalla sequenza amminoacidica da noi fornita, fiancheggiata dai i siti di restrizione necessari per il clonaggio del gene nei vettori per la trasformazione nucleare.

La sequenza nucleotidica ottenuta del gene His6-E7GGG ottimizzato (324 pb) è la

seguente:

Tale gene sintetico (fornito nel vettore pUC57) è stato clonato nel vettore pSL18-psaD- cRLuc, ottenendo il costrutto pSL18-psaD-His6-E7GGG (figura 62), che dovrebbe

consentire l‘espressione costitutiva di E7GGG nel nucleo di C. reinhardtii.

In parallelo, il gene sintetico è stato clonato nel vettore pSL18-cyc6 ottenendo il costrutto

pSL18-cyc6-His6-E7GGG (figura 63), che dovrebbe invece consentire l‘espressione

inducibile da nichel di E7GGG. I costrutti sono stati verificati per PCR su colonie trasformanti di E. coli e per sequenziamento. La sequenza si è rivelata corretta ed il DNA plasmidico è stato linearizzato ed impiegato per la trasformazione di C. reinhardtii.

Figura 62. Schema dell’ottenimento del costrutto pSL18-psaD-His6-E7GGG per l’espressione

Figura 63. Schema dell’ottenimento del costrutto pSL18-cyc6-His6-E7GGG per l’espressione

inducibile di E7GGG nel nucleo di C. reinhardtii.

4.4.1.2 Generazione di linee transgeniche nucleari e analisi dei trasformanti

La trasformazione nucleare di C. reinhardtii è stata condotta sul ceppo privo di parete cw15 con il metodo delle ―glass beads‖, ottenendo un numero variabile di trasformanti stabili, nei casi migliori circa 50-100 per evento di trasformazione, con entrambi i costrutti. In figura 64 sono riportati alcuni dei trasformanti stabili ottenuti.

Figura 64. Alcuni trasformanti stabili ottenuti con il costrutto pSL18-psaD-His6-E7GGG

L‘analisi dell‘espressione della proteina E7GGG è stata condotta mediante ELISA ed immunoblotting sugli estratti ottenuti dai trasformanti cresciuti in coltura liquida. Nel caso dei trasformanti inducibili, l‘espressione della proteina è stata analizzata 16 ore dopo l‘induzione della sua espressione come descritto nel sottoparagrafo 3.12.2.3.

Dapprima sono stati saggiati mediante ELISA gli estratti ottenuti in tampone PBS di 24 trasformanti per ogni costrutto, utilizzando l‘anticorpo policlonale pAb α-E7, senza ottenere segnali significativi (non mostrato). Successivamente i 24 trasformanti per ciascun costrutto sono stati analizzati in 6 gruppi (4 trasformanti/gruppo) mediante immunoblotting. Tuttavia, come si nota in figura 65, per il costrutto costitutivo non si

osservano bande all‘altezza di E7GGG, ma solo una banda di cross-reattività presente anche nel controllo negativo, di circa 30 KDa, mentre per il costrutto inducibile (figura

66), si osservano diverse bande, anche all‘altezza di E7GGG ma sono presenti anche nel

controllo negativo.

Figura 65. Analisi dei trasformanti nucelari ottenuti con il costrutto costitutivo pSL18-psaD-His6-

E7GGG (immunoblotting con pAb α-E7).

1: Proteina His6-E7GGG purificata da E. coli (50 ng); 2: marcatore di peso molecolare visibile solo su gel

SDS-PAGE; 3-8: trasformanti nucleari cositutivi ottenuti con il costrutto pSL18-psaD-His6-E7GGG (in

ogni pozzetto è stato caricato un ―pool‖ di 4 trasformanti; 9: controllo negativo= trasformante nucleare cositutivo ottenuto con il costrutto pSL18-psaD-cRLuc.

Figura 66. Analisi dei trasformanti nucelari ottenuti con il costrutto inducibile pSL18-cyc6-His6-

E7GGG (immunoblotting con pAb α-E7).

1: Proteina His6-E7GGG purificata da E. coli (50 ng); 2: marcatore di peso molecolare (Magic Mark,

Invitrogen); 3-8: trasformanti nucleari inducibili ottenuti con il costrutto pSL18-cyc6-His6-E7GGG (in ogni

pozzetto è stato caricato un ―pool‖ di 4 trasformanti; 9: controllo negativo= trasformante nucleare inducibile ottenuto con il plasmide pSL18-cyc6 ―scarico‖.

Si è quindi deciso di ripetere la trasformazione solo con il costrutto costitutivo (il promotore è più forte rispetto a quello presente nel costrutto inducibile) ed analizzare un numero maggiore di trasformanti.

Estratti preparati in PBS di 91 nuovi trasformanti sono stati analizzati mediante saggio ELISA. Sebbene sia stato osservato un piccolo segnale su alcuni trasformanti (non mostrato), l‘analisi successiva degli stessi mediante immunoblotting non ha confermato il

espressa con questo sistema è molto bassa, al limite della rilevazione con l‘anticorpo pAb α-E7. Come passaggio successivo, si è tentato di esprimere la proteina E7GGG nei ceppi di C. reinhardtii UVM4 e UVM11 isolati dal gruppo di Ralph Bock del Max-Planck- Institute di Potsdam-Golm, Germania (Neupert et al., 2009). Questo gruppo di ricerca ha riportato una percentuale maggiore di trasformanti positivi e livelli di espressione più alti per la proteina GFP con questi ceppi, rispetto al ceppo wt cw15. Nel nostro laboratorio entrambi i ceppi sono stati trasformati con il costrutto costitutivo pSL18-psaD-His6-

E7GGG ottenendo diverse colonie trasformanti. Per ciascun ceppo sono stati analizzati 24 trasformanti mediante immunoblotting degli estratti ottenuti secondo diversi protocolli, incluso il tampone GB e la precipitazione delle proteine con l‘acido tricloroacetico (TCA). Tuttavia, anche in questo caso nessuna banda del peso molecolare atteso è stata osservata.

Nonostante sia necessario condurre analisi più approfondite e su un numero maggiore di trasformanti per trarre delle conclusioni definitive, si è deciso di mettere momentaneamente da parte questa via di espressione e di puntare sulla trasformazione del cloroplasto, ad oggi l‘unica strategia impiegata per la produzione di biofarmaceutici in microalghe da diversi grupppi di ricerca.