PRODUZIONE IN PIANTA DELLA PROTEINA M

Precedentemente al presente lavoro di dottorato, nel nostro laboratorio era stata dimostrata la possibilità di esprimere la proteina M del SARS-CoV in E. coli, soltanto nella forma mutata denominata MRLV contenente tre mutazioni (K13 > R, F36 > L e I160 >

V) e in cellule di mammifero in coltura con la sequenza originaria. Inoltre si era cercato di esprimere la proteina con la sequenza originaria in pianta mediante il vettore pPVX201. Tuttavia, con questo sistema di espressione, nella maggior parte delle piante analizzate non si riusciva ad osservare la presenza della proteina e nelle poche piante esprimenti, il livello di espressione era molto basso, al limite della visualizzazione in immunoblotting (Demurtas, tesi di laurea, dati non pubblicati).

Per cercare di risolvere questo problema, si è scelto di produrre la proteina con la sequenza originaria mediante la tecnica dell‘agroinfiltrazione.

all‘estremità C-terminale al ―tag‖ di sei istidine (M-His6). La scelta della posizione del

―tag‖ è dovuta al fatto che all‘estremità N-terminale è presente una putativa sequenza segnale per l‘indirizzamento in membrana (evidenziata in rosso).

Figura 51. Sequenza amminoacidica originaria della proteina M-His6 (230 aa).

In rosso è riportata la sequenza segnale per l‘indirizzamento in membrana; In viola è riportato il ―tag‖ di istidine; in arancio sono indicati gli amminoacidi interposti (a funzione di braccio spaziatore) tra la sequenza della proteina M e il ―tag‖, in giallo sono indicati gli amminoacidi mutati nella forma proteica espressa in E. coli.

4.2.1 Preparazione del costrutto pBI-M-His6 e agroinfiltrazione delle piante

A partire dal costrutto pBS-M-His6 precedentemente sviluppato nel nostro laboratorio, il

gene M-His6 (693 nt) è stato clonato nel vettore pBI-B9, sostituendo il gene scFv-B9 ed

ottenendo il costrutto pBI-M-His6 (come schematizzato in figura 52), verificato per PCR

su colonie trasformanti di E. coli e per sequenziamento. La sequenza si è rivelata corretta ed il DNA plasmidico è stato impiegato per la trasformazione dei ceppi competenti di A.

tumefaciens GV3101 e C58C1.

Figura 52. Schema del costrutto pBI-M-His6 per l’agroinfiltrazione

Un clone positivo per ciascun ceppo di A. tumefaciens contenente il costrutto pBI-M-His6

è stato impiegato per l‘agroinfiltrazione di piante di N. benthamiana.

Piantine di circa 4 settimane sono state infiltrate manualmente con le sospensioni batteriche ricombinanti come illustrato in figura 53. Prima di procedere all‘infezione massiva delle piante è stato effettuato un esperimento di ―time-course‖ su 3 piante per ogni ceppo di agrobatterio, campionando dischetti fogliari nei giorni III, IV, V, VI, VII e X successivi all‘infezione (p.i.), in modo da chiarire il giorno di massimo accumulo della proteina.

Figura 53. Procedura di agroinfiltrazione manuale, condotta inoculando la sospensione batterica esercitando una leggera pressione sulla pagina inferiore delle foglie di N. benthamiana.

4.2.2 Analisi dell’espressione della proteina M

L‘esperimento di ―time-course‖ è stato verificato mediante immunoblotting degli estratti ottenuti dai dischetti fogliari campionati nei diversi giorni.

In figura 54 è riportato l‘esperimento di ―time-course‖ ottenuto con il ceppo C58C1. Dall‘immagine mostrata si osserva la produzione della proteina M nei giorni IV e V p.i, ma in realtà nella lastra originale si riesce ad osservare una debole banda anche negli altri giorni. Anche con il ceppo GV3101 si ottengono bande flebili, non apprezzabili mediante foto della lastra originale. Questi risultati sono in gran parte imputabili alla cattiva estrazione della proteina M in questo esperimento (dischetti fogliari pestellati, direttamente risospesi in tampone di caricamento ―gel loading buffer‖ e bolliti).

Questo esperimento ci ha comunque indirizzati a scegliere, nel successivo esperimento, di effettuare un unico campionamento massivo di materiale agroinfiltrato al V giorno p.i., per entrambi i ceppi.

Figura 54. “Time-course” dell’espressione della proteina M con il ceppo C58C1 (immunoblotting con pAb α-M1/2 mouse).

1: Marcatore di peso molecolare (Magic Mark Invitrogen); 2: proteina MRLV prodotta in E. coli; 3: pBI-M-

His6 giorno III p.i; 4: pBI-M-His6 giorno IV p.i.; 5: pBI-M-His6 giorno V p.i; 6: pBI-M-His6 giorno VI p.i.;

7: pBI-M-His6 giorno VII p.i.; 8: pBI-M-His6 giorno X p.i.; 9: controllo negativo= pBI-B9 giorno V p.i.

Peso molecolare della proteina M-His6: 26 KDa

Una volta collezionato il materiale vegetale al V giorno p.i., si è cercato di trovare le condizioni ideali per l‘estrazione della proteina M.

Risospendendo il materiale vegetale in tampone GB e scaldando i campioni a 40°C per 10‘ una volta aggiunto il tampone di caricamento ―gel loading buffer‖ (la bollitura dei campioni non consente di visualizzare la proteina in immunoblotting, forse a causa della formazione di aggregati idrofobici ad alto peso molecolare), si ottiene la migliore estrazione della proteina ricombinante.

L‘agroinfiltrazione ha permesso di ottenere livelli di proteina più elevati e riproducibili di quelli ottenuti in precedenza con il vettore pPVX201, soprattutto impiegando il ceppo C58C1 (più virulento del ceppo GV3101), come si vede in figura 55.

Questo rappresenta quindi il primo esempio di produzione della proteina M in un sistema vegetale.

Figura 55. Comparazione della produzione proteina M ottenuta mediante infezione con pPVX e mediante agro infiltrazione (immunoblotting con pAb α-M1/2 rabbit).

1: Proteina M_RLV prodotta in E. coli; 2: Marcatore di peso molecolare (Magic Mark Invitrogen); 3: estratto di N. benthamiana infettata con il costrutto pPVX-M-His6; 4: estratto di N. benthamiana agroinfiltrata con il

ceppo C58C1/pBI-M-His6; 5: estratto di N. benthamiana agroinfiltrata con il ceppo GV3101/pBI-M-His6; 6:

controllo negativo=estratto di N. benthamiana agroinfiltrata con il ceppo C58C1/pBI-B9.

Nei pozzetti 3, 4 e 5 sono stati caricati 20 µl di estratto preparato a partire dalla stessa quantità di materiale vegetale.

Comparando la proteina M prodotta in E. coli (sequenza mutata MRLV) e in pianta

(sequenza originaria), si osserva che quella da pianta presenta un peso molecolare leggermente superiore, dovuto forse ad eventi di modificazioni post-traduzionali (ad esempio glicosilazione) della proteina o alla differenza nella composizione amminoacidica delle due proteine (figura 56). Questo aspetto dovrà essere investigato ulteriormente.

Figura 56. Comparazione della proteina M prodotta in sistema procariotico (MRLV) e vegetale (immunoblotting con pAb α-M1/2 rabbit).

1: Proteina MRLV purificata da E. coli; 2: estratto di N. benthamiana infiltrata con il ceppo C58C1/pBI-M-

His6; 3: marcatore di peso molecolare (Magic Mark, Invitrogen); 4: controllo negativo=estratto di N.

B) PIATTAFORME VEGETALI PER LA PRODUZIONE DI VACCINI TERAPEUTICI BASATI SULL’ONCOPROTEINA E7 DI HPV-16

4.3 PRODUZIONE DELLA PROTEINA E7 IN PIANTA MEDIANTE