Vaccini terapeutici contro HPV

Le considerazioni fatte nel precedente paragrafo evidenziano quanto vi sia necessità di sviluppare un vaccino terapeutico piuttosto che preventivo. Questa necessità è soprattutto dettatata dal fatto che nel mondo c‘è un‘alta prevalenza di infezioni da HPV già esistenti, sulle quali i vaccini preventivi non hanno effetto (Hildesheim et al., 2007; Markowitz et

al., 2007). A differenza dei vaccini preventivi, i vaccini terapeutici devono essere in grado

di indurre risposte cellulo-mediate contro antigeni di HPV espressi durante l‘infezione. Gli antigeni E6 ed E7 rappresentano i candidati ottimali per lo sviluppo di tali vaccini, in quanto sono essenziali per l‘induzione ed il mantenimento dello stato trasformato e sono costitutivamente espressi nelle cellule infettate da HPV, nelle lesioni precancerose e nei tumori, ma non nelle cellule sane. Queste oncoproteine contengono delle regioni antigeniche che sono presentate dal complesso MHC e la loro immunogenicità è stata dimostrata in modelli animali e nell‘uomo (Kanodia et al., 2008).

Tuttavia, un vaccino ideale contro i carcinomi associati ad HPV deve superare i problemi causati dal fatto che il virus crea un ambiente immunosoppressivo e di conseguenza le risposte immunitarie contro di esso sono generalmente inefficienti. Un vaccino terapeutico contro il cancro dovrebbe essere in grado di stimolare un traffico di cellule T effettrici, superando l‘immunosoppressione e generando un‘infiammazione acuta al sito tumorale. Queste richieste potrebbero essere soddisfatte dal legame dell‘antigene tumore- specifico impiegato per la vaccinazione con molecole in grado di aumentarne la visibilità al sistema immunitario o con altre strategie che presentino l‘antigene direttamente alle cellule immunocompetenti (Giorgi et al., 2010).

Sono stati sviluppati numerosi vaccini terapeutici sperimentali basati sui geni E6 ed E7 che comprendono principalmente vaccini basati su vettori vivi, su cellule dendritiche, vaccini a DNA e vaccini peptidici e proteici. Molti di essi si trovano in ―trial‖ clinico e sono descritti nel dettaglio in recenti lavori (Cid-Arregui, 2009; Lin et al., 2010; Su et al., 2010). Di seguito sono riportati i principali esempi di ―trial‖ clinico di ciascuna delle principali categorie vaccinali terapeutiche basati sull‘antigene E7, ponendo particolare attenzione ai vaccini a subunità proteici, in quanto maggiore campo d‘interesse di questa tesi di dottorato.

Nell‘ambito dei vaccini basati su vettori vivi, è attualmente in corso uno studio clinico del vaccino basato sul batterio Listeria esprimente E7 di HPV-16 (Lovaxin C) in donne con carcinoma cervicale in stadio avanzato (Lowry, 2008) e recentemente è stato dimostrato che una formulazione vaccinale basata su questa tecnologia in pazienti con carcinoma cervicale allo stadio terminale è sicura e ben tollerata (Maciag et al., 2009). Studi clinici

di fase I/II hanno dimostrato che l‘impiego di virus vaccinia ricombinanti esprimenti la proteina di fusione E6-E7 di HPV-16 e -18 (TA-HPV), porta all‘induzione di una forte risposta immunitaria sia di tipo umorale che cellulo-mediato, in pazienti con CIN III e carcinoma cervicale (Borysiewicz et al., 1996; Kaufmann et al., 2002) e numerose altre formulazioni saggiate in modelli preclinici mostrano risultati promettenti (Lin et al., 2010). Anche i vaccini basati sulle cellule dendritiche (DC) risultano molto efficienti nel trattamento delle lesioni associate ad HPV, ma richiedono molto tempo nella preparazione e hanno costi alti. In studi in fase clinica, DC autologhe, caricate con l‘antigene E7 di HPV-16 o -18, sono state somministrate in donne con cancro cervicale causato da HPV- 16 o -18, respettivamente. Una risposta cellulo-mediata specifica contro E7 è stata riscontrata in 4 degli 11 pazienti (Ferrara et al., 2003). Uno studio simile di DC caricate con E7 di HPV-16 o -18 ha mostrato una risposta E7-specifica di tipo CD4+ in 2 pazienti su 4 e di tipo CD8+ in tutti e 4 i pazienti (Santin et al., 2006). Attualmente è in corso uno studio su pazienti con carcinoma cervicale ricorrente causato da HPV-16 con un vaccino basato su DC caricate con E7 di HPV-16 (sito web 13).

Un‘altra tipologia vaccinale ampiamente utilizzata è rappresentata dai vaccini a DNA. Attualmente è in fase clinica I un vaccino a DNA contenente i geni E6 ed E7 di HPV-16 e -18, somministrato per via intramuscolare ed elettroporazione in pazienti con CIN II/III (Best et al., 2009). Altri studi in fase clinica su pazienti con CIN II/III che si basano su un vaccino a DNA, chiamato ZYC-101, contenente le sequenze codificanti per epitopi immunogenici di E7 di HPV-16, o su un vaccino a DNA basato sul gene E7 mutagenizzato e fuso alla HSP70 di M. tuberculosis, mostrano risposte cellulari specifiche contro E7 (Sheets et al., 2003; Garcia et al., 2004; Trimble et al., 2009). Anche nel nostro laboratorio sono stati elaborati vaccini a DNA terapeutici basati sull‘antigene E7; in particolare sono state preparate formulazioni vaccinali basate sul gene E7 mutagenizzato (E7GGG) e sulla fusione di E7GGG con la CP del PVX. Il vaccino genetico basato sul gene di fusione E7GGG-CP è in grado di inibire con più efficacia la crescita del tumore in modello pre-clinico rispetto al gene E7GGG da solo ed è in grado di generare risposte immunitarie sia di tipo umorale che cellulo-mediato (Massa et al., 2008).

Nel caso dei vaccini peptidici, il problema di trovare un unico epitopo immunogenico che vada bene per tutti (a causa della natura polimorfica delle molecole del complesso MHC) sembra essere superato dall‘uso di lunghi peptidi che contengono diversi epitopi di E6 ed E7. Studi preclinici in topi (Vambutas et al., 2005) e conigli (Zwaveling et al., 2002)

tollerati in studi clinici di fase I e II (Steller et al., 1998; van Driel et al., 1999; Ressing et

al., 2000; Muderspach et al., 2000). Recentemente, Kenter e colleghi hanno condotto uno

studio in fase I in pazienti allo stadio terminale di carcinoma cervicale con un lungo peptide che comprende epitopi di E6 ed E7 di HPV-16 e l‘adiuvante Montanide ISA-51, ottenendo una risposta T cellulare specifica per E6 (Kenter et al., 2008). Una vaccinazione simile condotta su 6 pazienti con carcinoma cervicale indotto da HPV-16 ha mostrato l‘induzione di una risposta immunitaria di tipo CD4+

e CD8+ E6-specifica in tutte le pazienti ed E7-specifica in 5 pazienti su 6 (Welters et al., 2008). Attualmente è in fase di valutazione lo studio condotto in fase II con vaccino peptidico basato sul lungo peptide comprendente epitopi di E6 ed E7 di HPV-16 in pazienti con carcinoma cervicale in stadio avanzato e metastatico (sito web 14).

Nel caso dei vaccini proteici, il maggiore interesse è incentrato nello sviluppo di strategie che permettano di stimolare le risposte cellulo-mediate (ricordiamo che a causa della loro somministrazione esogena, i vaccini proteici sono presentati mediante la via che coinvolge il complesso MHC di classe II e ciò genera una risposta anticorpale piuttosto che una risposta cellulo-mediata) (Lin et al., 2010). Ad esempio, gli adiuvanti ―liposome- polycationic-DNA‖ (LPD) (Cui & Huang, 2005) e l‘ ISCOMATRIX basato sulla saponina (Stewart et al., 2004) hanno la capacità di promuovere il processamento endogeno e quindi l‘espressione dell‘antigene con il complesso MHC I. In aggiunta, la fusione di antigeni di HPV con molecole che sono in grado di renderle più visibili alle APC, può incrementarne l‘―uptake‖ e quindi la presentazione in associazione al complesso MHC I, portando quindi ad un aumento della risposta CD8+. Alcuni esempi includono la fusione di E7 di HPV-16 con l‘adenilato-ciclasi di Bordetella pertussis che interagisce con i recettori integrina delle DC (Preville et al., 2005) e la fusione di E7 di HPV-16 con un dominio dell‘esotossina A di Pseudomonas, che facilita la traslocazione della proteina per la presentazione in associazione al complesso MHC I (Liao et al., 2005b). Un‘altra importante molecola immunostimolatoria in grado di incrementare la risposta CTL è l‘HSP70 di Mycobacteria (Chu et al., 2000; Liu et al., 2008).

Diversi vaccini proteici contro HPV sono stati impiegati in studi clinici. Ad esempio, il vaccino denominato PD-E7 creato dalla fusione della proteina E7 mutagenizzata di HPV- 16 con un frammento della proteina D di Haemophilus influenzae, sviluppato in una formulazione contenente il Monofosforil lipide A, l‘adiuvante QS-21 basato sulla saponina e un‘emulsione di olio in acqua (adiuvante AS02B, GlaxoSmithKline), ha mostrato l‘induzione di una risposta di tipo CD8+

E7-specifica in pazienti con lesioni CIN 1 o CIN 3 (Hallez et al., 2004). Un vaccino costituito da una proteina di fusione di E6 ed

E7 di HPV-16 con l‘adiuvante ISCOMATRIX ha mostrato la generazione di risposte CD8+ specifiche per E6 ed E7 (Frazer et al., 2004). In aggiunta, una proteina di fusione costituita da E7 di HPV-16 e la HSP65 di M. bovis usata come vaccino in pazienti con lesioni CIN 3, ha mostrato una risposta patologica completa in 13 di 58 pazienti e incompleta (una regressione della lesione maggiore del 50% in dimensioni) in 32 di 58 pazienti (Einstein et al., 2007). Recentemente, la Nventa Biopharmaceuticals ha investito su questo vaccino, potenziandolo con l‘uso dell‘adiuvante Poly-ICLC e testandolo in fase I (sito web 15).

Oltre ai vaccini terapeutici proteici appena descritti, sono stati formulati e saggiati in studi clinici vaccini combinati terapeutici/profilattici che comprendono epitopi provenienti dalle proteine virali (L1 o L2) e dalle oncoproteine (E6 e/o E7). Questi vaccini dovrebbero essere in grado sia di stimolare risposte anticorpali virus neutralizzanti e quindi funzionare da vaccini preventivi, sia di elicitare risposte cellulo-mediate contro le oncoproteine e quindi funzionare da vaccini terapeutici, nel caso in cui l‘infezione da HPV sia già presente.

Ad esempio, una proteina di fusione composta dalle proteine L2 ed E7 di HPV-6 (TA- GW) è stata saggiata su 42 uomini sani (Thompson et al., 1999) e 27 pazienti con verruche genitali (Lacey et al., 1999). Questo vaccino è stato ben tollerato dai pazienti ed è stato in grado di generare una risposta cellulo-mediata in 19 pazienti e la scomparsa delle verruche genitali in 5 pazienti. Un altro vaccino proteico denominato TA-CIN, costituito dalla fusione degli antigeni L2, E6 ed E7 di HPV-16, è stato saggiato su 40 pazienti sani, mostrando l‘induzione di risposte anticorpali contro L2 in tutti i pazienti e di risposte cellulo-mediate contro le proteine E6 ed E7 in 8 degli 11 pazienti che hanno ricevuto la dose vaccinale più alta (de Jong et al., 2002).