Vaccini in pianta contro HPV

1.3.3.3.1 Vaccini profilattici prodotti in pianta

Nel caso dei vaccini profilattici contro HPV sono state prodotte numerose formulazioni in pianta basate sulla proteina capsidica L1.

Nel 2003 sono stati pubblicati, quasi simultaneamente, tre lavori riguardo la produzione di VLP di L1 in pianta e della loro immunogenicità in modello preclinico: Varsani e colleghi hanno ottenuto VLP di L1 di HPV-16 in tabacco transgenico, in grado di generare una risposta immunitaria, sebbene debole, quando iniettata in conigli in presenza

debole risposta immunitaria, in seguito alla somministrazione orale in topi di materiale non concentrato (Warzecha et al., 2003); infine, il terzo lavoro riporta la produzione di VLP di L1 di HPV-16 con i codoni ottimizzati per l‘espressione in pianta, in patata e tabacco transgenici. Tale ottimizzazione ha permesso di incrementare notevolmente i livelli di espressione di L1 rispetto ai precedenti lavori, tuttavia, in seguito a somministrazione orale del materiale vegetale in un modello murino, anche in questo caso la risposta immunitaria riportata è stata bassa (Biemelt et al., 2003). Successivamente, la proteina L1 di HPV-16 è stata prodotta in pianta transientemente, mediante un vettore basato sul TMV, ottenendo livelli di espressione più alti di quelli ottenuti in transgenico (Varsani et al., 2006). Una prova importante dell‘efficacia dei vaccini prodotti in pianta contro i papillomavirus è stata fornita da due lavori sul papillomavirus che infetta i conigli (―Cottontail Rabbit Papilloma Virus‖, CRPV). Nel primo caso viene mostrato come i conigli sono completamente o parzialmente protetti contro l‘infezione da CRPV, in seguito a immunizzazione parenterale con particelle di TMV purificate che espongono peptidi di proteina L2 alla loro superficie (Palmer et al., 2006). Il secondo lavoro mostra invece una protezione completa contro CRPV in seguito a somministrazione intramuscolare, in presenza dell‘adiuvante FIA, di estratti di pianta concentrati derivanti da tabacco transgenico o infettato con il TMV ricombinante, esprimenti la proteina L1 di CRPV (Kohl et al., 2006).

Alti lavori mostrano che VLP o capsomeri di L1 di HPV possono essere prodotti in pianta mediante trasformazione stabile o transiente, ad alte concentrazioni, circa 10-20 mg/kg tessuto fresco, che tuttavia rappresentano lo 0.5% delle TSP e quindi non sono sufficienti ad avviare una produzione commerciale (Cardi et al., 2010; Giorgi et al., 2010). Recentemente Rybicki e colleghi, mediante strategie di ottimizzazione dei codoni, di tecnologie di espressione e compartimentalizzazione, sono riusciti ad ottenere livelli di espressione di proteina L1 di HPV-16 notevolmente alti (17 % delle TSP, nella versione plastidiale, 15 % di TSP nella versione citoplasmatica) (Maclean et al., 2007). E‘ stato osservato un apprezzabile accumulo di VLP e i topi immunizzati per via parenterale con gli estratti vegetali concentrati, senza l‘impiego di adiuvanti, hanno mostrato l‘induzione di alti titoli anticorpali neutralizzanti, comparabili a quelli ottenuti con le VLP prodotte in cellule di insetto del vaccino commerciale. Questo lavoro rappresenta la migliore evidenza che la produzione del vaccino profilattico contro HPV può essere avviata in pianta, rappresentando una valida alternativa a basso costo ai vaccini commerciali attuali. Altri gruppi di ricerca si sono focalizzati sulla produzione del vaccino profilattico contro HPV nel cloroplasto di pianta, ottendendo alte rese di proteina L1, in un caso del 24%

delle TSP, con formazione di VLP altamente immunogeniche (Fernández-San Millán et

al., 2008).

Come già accennato, in aggiunta all‘abbattimento dei costi, il miglioramento dei vaccini profilattici contro HPV, rispetto a quelli attualmente in commercio, può essere ottenuto anche mediante la formulazione di un vaccino che sia cross-protettivo contro molti tipi di HPV e non solo contro quelli presenti nella formulazione vaccinale stessa. Ciò può essere ottenuto attraverso il coinvolgimento della proteina L2 di HPV, che mostra proprio queste caratteristiche (Slupetzky et al., 2007; Jagu et al., 2009). La proteina L2 è stata prodotta con successo in pianta mediante sistemi transienti o transgenici (Pereira et al., 2009) e lo sviluppo di vaccini profilattici di seconda generazione contro HPV prevede la produzione di chimere costituite dalle proteine L1 ed L2 in pianta, con alcuni risultati preliminari incoraggianti (Whitehead M, Hitzeroth I, Rybicki EP, dati non pubblicati).

1.3.3.3.2 Vaccini terapeutici prodotti in pianta

Rispetto ai vaccini profilattici, i vaccini terapeutici contro HPV prodotti in pianta sono rappresentati da un numero minore di lavori in letteratura. La prima dimostrazione della possibilità dell‘impiego delle piante per la produzione di questa tipologia di vaccini risale al 2002, quando nel nostro gruppo di ricerca è stata espressa transientemente l‘oncoproteina E7 di HPV-16 in tabacco (Franconi et al., 2002). In seguito ad immunizzazione di topi con l‘estratto vegetale contenente E7 è stata riportata una risposta immunitaria sia di tipo umorale che cellulo-mediata E7-specifica. Inoltre, l‘attività antitumorale del vaccino è stata valutata dopo sfida con una linea cellulare tumorale esprimente la proteina E7 di HPV-16, mostrando una riduzione della crescita tumorale e una protezione totale dallo sviluppo del tumore nel 40% degli animali, la stessa ottenuta con la proteina E7 purificata da E. coli in presenza dell‘adiuvante QuilA. Questi dati mostrano che l‘estratto vegetale possiede intrinseche proprietà adiuvanti (spiegate più avanti).

L‘attività antitumorale di questa formulazione vaccinale è stata in seguito migliorata, mediante l‘incremento della quantità di proteina E7 nell‘estratto vegetale, ottenuta grazie alla veicolazione della proteina nella via secretoria (Franconi et al., 2006). A 50 giorni dalla sfida con la linea cellulare tumorale, l‘80 % dei topi immunizzati con tale estratto non mostrava la presenza di tumore. In seguito ad immunizzazione orale di topi con il materiale vegetale liofilizzato esprimente E7, sono stati riportati alti titoli anticorpali

Inoltre, come già accennato in precedenza, le proprietà adiuvanti dell‘estratto ed un possibile impiego dell‘estratto contenente E7 nell‘immunoterapia delle lesioni associate ad HPV, sono state investigate mediante l‘uso di DC umane derivanti da pazienti sani (Di Bonito et al., 2009). L‘estratto non si è mostrato tossico per queste cellule, non influenza l‘―uptake‖ di E7 nelle cellule, non affligge la differenziazione delle DC, ma ne induce la maturazione. Di maggiore importanza, l‘estratto contenente E7 è in grado di indurre linfociti naïve a produrre una risposta T cellulare specifica contro E7.

In un altro studio, mediante l‘uso di un vettore virale di seconda generazione basato sul TMV, la proteina E7 mutagenizzata fusa alla lichenasi ingegnerizzata di Clostridium

thermocellum, già impiegata in altri studi come ―carrier‖ per la produzione di molecole

ricombinanti in pianta (Musiychuk et al., 2007), è stata espressa transientemente in tabacco con alte rese (1 mg/g tessuto fresco). L‘immunizzazione di topi con la proteina di fusione purificata ha portato all‘induzione di IgG e di risposte T citotossiche specifiche contro E7 e alla protezione del 100% degli animali in seguito a sfida con le cellule tumorali (Massa et al., 2007). In aggiunta, la vaccinazione terapeutica di topi con questo antigene previene la crescita tumorale nel caso di tumori già stabilizzati (Venuti et al., 2009). Questo antigene è stato espresso anche in colture di radici aeree di tabacco, mediante l‘uso dello stesso vettore virale usato per la pianta intera (Massa et al., 2009). I risultati incoraggianti ottenuti con la formulazione basata sulla proteina di fusione LicKM-E7GGG, aprono la strada alla possibilità di saggiare questo antigene in studi di fase clinica I. La produzione dell‘antigene in colture di radici, grazie al maggiore contenimento e all‘adattabilità delle procedure di GMP, potrebbe inoltre rappresentare una piattaforma di espressione migliore rispetto alla pianta intera.

Un altro gruppo di ricerca, riporta la produzione di una forma inattiva della proteina E7 di HPV-16 ad alti livelli in N. benthamiana mediante agroinfiltrazione, fusa ad un peptide derivato da zeina (Zera®, Era Biotech, Barcellona), che promuove l‘aggregazione ed il sequestro delle proteine accoppiate in un corpo proteico circondato da membrana del RE. Risultati preliminari indicano che l‘immunizzazione di topi con questa formulazione purificata da pianta li protegge quando sfidati con cellule tumorali esprimenti E7 e causa una regressione di tumori stabilizzati (Whitehead M et al., dati non pubblicati).

Recentemente, è stata riportata l‘espressione della proteina E7 di HPV-16 da sola o fusa alla CP del PVX nei cloroplasti di tabacco (Morgenfeld et al., 2009). Sebbene i livelli di espressione per la proteina di fusione non siano elevati nel cloroplasto (0.5% delle TSP), l‘impiego della CP aiuta a stabilizzare la proteina E7 e ad incrementarne i livelli di espressione rispetto alla proteina da sola (0.1% delle TSP).

Cerovská e colleghi hanno recentemente riportato la produzione di un epitopo di L2 e di un epitopo di E7, fusi rispettivamente, all‘N-terminale e al C-terminale della CP del virus A della patata (PVA) (Cerovská et al., 2008). Tale costrutto è stato espresso in pianta mediante l‘uso di un vetore virale di seconda generazione basato sul PVX. In un altro studio, è riportata l‘espressione in pomodoro transgenico della proteina di fusione costituita dalla proteina L1 di HPV-16 e da una fila di tre epitopi di E7 ed uno di E6, noti nel mediare l‘attività CTL (Paz De la Rosa et al., 2009). Tale proteina di fusione è in grado di assemblare in VLP, ma il livello di espressione non è molto alto. L‘immunizzazione intraperitoneale di topi con le VLP, ha mostrato l‘induzione sia di anticorpi neutralizzanti, sia di attività cellulo-mediata contro E6 ed E7.

Come già detto, i benefici della vaccinazione profilattica saranno visibili solo fra molti anni e i vaccini preventivi non hanno effetti terapeutici sulle donne che presentano già infezione da HPV. Perciò l‘uso combinato di vaccini profilattici e terapeutici potrebbero superare alcuni limiti della vaccinazione profilattica ed in particolare essere efficaci in pazienti con infezione e/o lesioni pre-cancerose.