1. INTRODUZIONE
1.2 CASO DI STUDIO 1 L’AGENTE EZIOLOGICO DELLA SINDROME
1.2.4 STATO DELL’ARTE DEI VACCINI CONTRO IL SARS-CoV
Nei pazienti immunocompetenti affetti da SARS dopo 2-3 settimane dall‘inizio della malattia sono stati riscontrati anticorpi neutralizzanti e nel 90% dei casi la malattia si è risolta senza bisogno di cure (Ksiazek et al., 2003). Questi dati indicano che la maggior parte dei pazienti risponde con successo all‘infezione da SARS-CoV. Tuttavia, al fine di prevenire una possibile ricomparsa dell‘epidemia nella popolazione umana, molti gruppi di ricerca si sono focalizzati sullo sviluppo di vaccini profilattici efficaci.
Diverse formulazioni vaccinali, comprendenti virus inattivati, VLP, vaccini a subunità peptidici/proteici, vaccini genetici e vaccini basati su vettori virali sono attualmente in elaborazione (Enjuanes et al., 2007; Roper & Rehm, 2009). Le prime formulazioni ad essere state sviluppate si basano sull‘impiego di vaccini inattivati o attenuati in quanto l‘urgenza dell‘epidemia poteva essere assecondata più facilmente mediante l‘uso di tecnologie già ben radicate. Diversi lavori dimostrano che virioni del SARS-CoV purificati e inattivati, somministrati in concomitanza con adiuvanti, generano risposte anticorpali alte (Kong et al., 2005; See et al., 2006; Qin et al., 2006). Tuttavia, queste tipologie vaccinali non sono facili da ottenere con un livello di biosicurezza 3 (ricordiamo che il SARS-CoV è un patogeno di classe C) e proprio a causa dell‘alta patogenicità non sono completamente sicuri per l‘uso clinico (Roper & Rehm, 2009).
sulle proteine S, M ed E, usando diversi sistemi di espressione e diversi tipi cellulari, ma non forniscono dati rigurdo la loro efficacia nell‘indurre risposte immunitarie (Enjuanes et
al., 2007). Solo recentemente un gruppo di ricerca ha riportato l‘induzione di una forte
risposta umorale, anche di tipo neutralizzante in topi immunizzati per via intraperitoneale o mucosale con VLP costituite dalle proteine S, M ed E espresse in cellule di insetto (Lu
et al., 2009).
Nel caso dei vaccini a subunità o basati su vettori virali, il candidato vaccinale più studiato è rappresentato dalla proteina S, che interagisce per primo con i recettori di membrana dell‘ospite ed è in grado di indurre una forte risposta anticorpale neutralizzante in grado di bloccare l‘infezione virale con alta efficienza. Tuttavia, essendo presenti alla superificie virale altre proteine che hanno mostrato di essere in grado di elicitare risposte anticorpali, riscontrate in sieri di pazienti SARS convalescenti, si è sviluppato un certo interesse anche su di esse, al fine di incrementare la risposta immunitaria protettiva generata dal vaccino a subunità (Roper & Rehm, 2009). Ad esempio, è stato osservato che la proteina M è in grado di stimolare la produzione di anticorpi neutralizzanti in topi immunizzati (Pang et al., 2004). In aggiunta, la proteina N rappresenta un candidato vaccinale molto interessante. Essa, di per sé, non fornisce protezione contro il SARS- CoV; non sono stati riscontrati anticorpi neutralizzanti contro la proteina N negli anti-sieri dei pazienti infettati dal SARS-CoV (Buchholz et al., 2004; Pang et al., 2004, Liang et
al., 2005). Questo è dovuto principalmente alla localizzazione della proteina all‘interno
del capside virale, che non risulta quindi accessibile agli anticorpi durante l‘infezione (Surjit & Lal, 2007). D‘altra parte però, la proteina N è in grado di indurre una risposta cellulo-mediata efficiente (Buchholz et al., 2004; Gao et al., 2003; Zhu et al., 2004) e un vaccino più efficace potrebbe quindi essere costituito dalla co-somministrazione delle proteine N e S oppure N e M.
Diversi approcci basati su vaccini a DNA sono stati descritti; alcuni di essi si basano su strategie di ―prime-boost‖ eterologo, che combinano vaccini a DNA con vaccini basati sul virus inattivato (Woo et al., 2005; Zakhartchouk et al., 2005). Altri vaccini a DNA si basano sull‘antigene N, espresso da solo, fuso alla calreticolina, o insieme agli antigeni S ed M (Kim et al., 2004; Zhu et al., 2004; Wang et al., 2005; Gupta et al., 2006). Attualmente è in studio clinico un vaccino a DNA basato sulla proteina S (Martin et al., 2008). Sorprendentemente, uno studio comparativo di vaccinazioni a DNA basate sugli antigeni S, M ed N, mostra che la risposta cellulo-mediata più forte è stata generata da M
In aggiunta, diverse tipologie di vaccini basati su vettori adenovirali contenenti le sequenze degli antigeni S, N ed M, o su altre strategie, sono stati formulati e descritti nel dettaglio (Enjuanes et al., 2007; Roper & Rehm, 2009).
E‘ stato riportato uno studio interessante circa l‘uso di vettori adenovirali basati su S ed N in vaccinazioni di topi per via intramuscolare o nasale. Questo studio mostra come la somministrazione intramuscolare sia più efficiente nella induzione di anticorpi neutralizzanti sierici, mentre la somministrazione intranasale induce la produzione di anticorpi mucosali IgA e risulta più efficiente nel bloccare la replicazione virale nei tessuti nasali e polmonari (See et al., 2006). Questi dati mostrano l‘importanza della stimolazione dell‘immunità mucosale nel caso del SARS-CoV che entra nell‘organismo proprio attraverso le superfici mucosali (Roper & Rehm, 2009).
1.2.4.1 Vaccini a subunità peptidici/proteici basati sugli antigeni N e M
Come già discusso, questa categoria vaccinale presenta alcuni vantaggi rispetto ai vaccini convenzionali, soprattutto in termini di sicurezza, per cui risulta molto adeguata per l‘uso in pazienti umani per la prevenzione dell‘infezione da SARS-CoV.
Per quanto riguarda l‘antigene M, è stato riportato un solo studio che mostra che un peptide ricombinante (M106-221) è in grado di indurre una risposta umorale virus neutralizzante in topi immunizzati (Pang et al., 2004). In aggiunta, questo studio dimostra la capacità di indurre una risposta umorale specifica da parte dei peptidi M1-31 ed M132- 161.
Nel caso dell‘antigene N, invece, questo campo di ricerca è stato sviluppato maggiormente. In un caso la proteina N è stata espressa in E. coli, purificata ed impiegata per la vaccinazione di topi Balb/c in emulsione di Montanide ISA-51 contenente le sequenze ipometilate CpG o in PBS (Liu et al., 2006). Nel primo caso è stata ottenuta prevalentemente una risposta cellulo-mediata. Al contrario, nel secondo caso la risposta immunitaria riscontrata è stata principalmente di tipo umorale.
Un altro studio ha riportato che l‘immunizzazione di topi con peptidi della proteina N comprendenti gli epitopi immunodominanti, risulta nell‘induzione di una forte immunità cellulare (Zhao et al., 2007). Inoltre, uno studio condotto con la proteina N prodotta in
Lactobacillus lactis mostra il suo potenziale uso in somministrazioni vaccinali mucosali
(Pei et al., 2005). Recentemente Schulze e colleghi hanno riportato una forte risposta umorale sia a livello sistemico che mucosale in topi e una risposta cellulo-mediata, in seguito a vaccinazione con un protocollo di ―prime-boost‖ eterologo consistente in una prima somministrazione (―prime‖) intranasale con la proteina N insieme ad un adiuvante
e ad una seconda somministrazione (―boost‖) intramuscolare con il virus modificato vaccinia Ankara (MVA) esprimente la proteina N (Schulze et al., 2008). Altri lavori riportano l‘induzione di risposte mediate da cellule T in seguito alla vaccinazione con la proteina N in modelli animali (Gupta et al., 2006; Liu et al., 2006).
1.2.4.2 Vaccini in pianta contro il SARS-CoV
Al fine di sviluppare vaccini sicuri, efficienti e a basso costo, la piattaforma di espressione basata sulla produzione di proteine eterologhe in pianta è stata esplorata anche per gli antigeni della SARS.
Il dominio S1 della proteina S del SARS-CoV è stato espresso stabilmente in pomodoro e in tabacco a basso livello di nicotina, nel citoplasma o nel cloroplasto (Pogrebnyak et al., 2005; Li et al., 2006). Tale antigene prodotto in pianta è in grado di indurre in topi risposte immunitarie sistemiche e mucosali specifiche per il SARS-CoV, in seguito a somministrazione orale (Pogrebnyak et al., 2005).
Recentemente è stata prodotta la proteina N del SARS-CoV in tabacco mediante agroinfiltrazione. Questa proteina ha mostrato di essere in grado di indurre una forte risposta immunitaria sia di tipo umorale che cellulo-mediata in topi. Infatti, alti titoli anticorpali appartenenti alle sottoclassi IgG1 e IgG2 sono stati riscontrati nei sieri dei topi immunizzati. Inoltre, durante la vaccinazione è stata identificata l‘espressione di IFN e IL 10 negli splenociti, ma non di IL 2 e 4 (Zheng et al., 2009).