La proteina M

Il gene M (666 nucleotidi) codifica per una glicoproteina di membrana di 221 amminoacidi, con un peso di 25 KDa, principalmente coinvolta nell‘assemblaggio e nel rilascio dei virioni dalla cellula, e nell‘interazione con le proteine N e S.

Essa consiste in un breve ectodominio N-terminale con un sito N-glicosilato (Oostra et

al., 2006), tre segmenti transmembrana e una lunga coda citosolica al C-terminale (Voß et al., 2009) (figura 19). Una caratteristica distintiva è la presenza di una bassa percentuale

di cisteine (1.4%) rispetto alle altre proteine virali (eccetto la proteina N che ne è totalmente priva). Il 40% della proteina è formata da 4 residui amminoacidici non polari alifatici (Leu, Ala, Ile, e Val).

La proteina M del SARS-CoV presenta una bassa omologia di sequenza con la proteina M degli altri coronavirus. Da studi condotti dal gruppo di Hu et al. (2003) si evince inoltre che, tra i vari isolati del SARS-CoV, la proteina M è quella che presenta maggiori variazioni di sequenza rispetto alle altre proteine del virus. Le sostituzioni nucleotidiche portano a tre principali cambiamenti delle proprietà della proteina:

-le sostituzioni che fanno variare il punto isoelettrico (pI) e la carica netta sono probabilmente correlate alle proprietà antigeniche della proteina. E‘ noto, infatti, che un alto valore di pI genera un‘antigenicità più marcata;

-le sostituzioni che portano ad un cambiamento d‘idrofobicità, sono correlate alla stabilità della membrana. Un abbassamento dell‘idrofobicità dei segmenti transmembranari porta ad una riduzione della stabilità della membrana che influenza le interazioni tra la proteina M e la membrana dell‘ospite;

-le sostituzioni che portano ad un cambiamento d‘idrofilicità sono correlate all‘interazione della proteina con le molecole interne.

Figura 19. Rappresentazione della proteina M del SARS-CoV TM: domini transmembranari

A) Fonte: He et al., 2005.

B) Figura modificata da: Voß et al., 2009

L‘intera proteina risulta essere basica (pI 9.63) e carica positivamente. La regione transmembranaria, costituita da tre domini, comprende circa 80 amminoacidi. Il primo di questi domini, è composto in prevalenza da amminoacidi non polari alifatici (83%), risultando quindi altamente idrofobo. Il secondo dominio presenta l‘81% di amminoacidi non polari alifatici. Il segmento compreso tra i primi due domini transmembrana si trova all‘interno del virione. Il terzo dominio transmembrana è meno idrofobico degli altri due, presentando il 68.2% di amminoacidi non polari alifatici. Il segmento compreso tra il secondo e il terzo dominio transmembrana è collocato all‘esterno. La regione ammino- terminale esterna è composta da 15 codoni, è localmente acida e idrofilica, e a livello del quarto codone è presente un sito di glicosilazione. La regione carbossi-terminale è composta da 123 residui altamente idrofilici ed è collocata all‘interno del virione. Sono presenti tre siti di fosforilazione a livello dei codoni 98, 171 e 183 correlati ad una possibile interazione con le proteine S ed E, e tre siti di N-miristilazione (codoni 125, 187 e 211) (Hu et al., 2003). Inoltre, la regione compresa fra i codoni 94 e 114 (che sembra essere la più conservata tra i vari coronavirus) contiene una sequenza consenso correlata all‘interazione con la proteina N e con l‘RNA virale durante la morfogenesi virale. E‘ stato, infatti, dimostrato che la proteina M contiene un sito legante la proteina N, ed uno legante l‘RNA virale, il quale interagisce con il segnale di impacchettamento dell‘RNA (Narayanan et al., 2003; He et al., 2004, Fang et al., 2005).

Il gruppo di Hu e colleghi ha inoltre evidenziato, mediante analisi BLAST, nella zona C-

B

A

olfattorio dei topi ed è un recettore di feromoni che media una trasduzione del segnale Ca²⁺-dipendente. Questa scoperta indica che tale motivo svolge un ruolo cruciale nell‘infezione delle cellule epiteliali del tratto respiratorio, suggerendo un possibile collegamento con la manifestazione di sintomi a livello respiratorio nell‘infezione mediata da SARS-CoV. La proteina M è correlata all‘infettività virale mediante il legame con la proteina S ed il successivo legame con i recettori cellulari, aiutando la fusione del virione con la membrana dell‘ospite. Tale funzione è svolta dall‘estremità N-terminale della proteina M (Hu et al., 2003). La proteina M è coinvolta anche in meccanismi che consentono al virus di evadere le prime barriere dell‘ospite (immunità innata), alterando l‘espressione genica di molecole infiammatorie chiave come ad esempio il fattore di trascrizione nucleare kappa B (NF-kB) (Fang et al., 2007).

Sono stati rilevati otto possibili siti antigenici, sei dei quali a livello della regione C- terminale della proteina. E‘ stato postulato che tali siti rivolti verso l‘interno del virione, sono correlati con l‘antigenicità virale, dopo l‘entrata del virione nella cellula ospite, quando esso è collassato e la regione interna della proteina M è rilasciata ed esposta nel citoplasma, o immediatamente dopo la sua traduzione. Quattro segmenti (codoni 1-20, 137-157, 189-211, 206-221), hanno mostrato reattività con anticorpi provenienti da pazienti affetti da SARS (Hu et al., 2003). Inoltre sono stati identificati due epitopi immunodominanti, localizzati all‘estremità della regione N-terminale (aa 1-31) e all‘interno della regione C-terminale (aa 132-161). Peptidi sintetici comprendenti tali regioni hanno mostrato di essere altamente reattivi con i sieri di pazienti convalescenti affetti da SARS, suggerendo la loro potenziale applicazione nella diagnosi sierologica della SARS (He et al., 2005b).

Inoltre, questi peptidi hanno mostrato di essere capaci di indurre forti risposte anticorpali in conigli in seguito ad immunizzazione (He et al., 2005). Diversi esperimenti effettuati su animali modello con la proteina M hanno mostrato che essa è in grado d‘indurre la produzione di anticorpi neutralizzanti, suggerendo che tale proteina può essere utilizzata per lo sviluppo di un vaccino preventivo anti-SARS-CoV (Pang et al., 2004; Tripp et al., 2005). Recentemente è stato dimostrato che cellule CD4+ e CD8+ della memoria M- specifiche persistono nel sangue periferico di pazienti infettati dal SARS-CoV dopo più di un anno dall‘infezione (Yang et al., 2007).