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2. S
COPO DELLA TESI.
La raccomandazione del Ministero della Salute del 20.4.2007, relativa alla ricerca dei Norovirus negli alimenti, considera la Real Time RT-PCR come il metodo più sensibile e automatizzabile per l'esame di un elevato numero di campioni.
Lʼapproccio molecolare per la diagnosi di questi virus nei molluschi bivalvi ha portato allo sviluppo di diverse metodiche di PCR convenzionale ed in Real Time. Diverse problematiche rendono però difficoltosa la loro rilevazione in matrici complesse come i molluschi bivalvi, sia a causa dei bassi livelli di contaminazione che per la difficoltà di ottenere unʼestrazione efficiente. La presenza di inibitori della PCR può inoltre influire negativamente sullʼefficienza di amplificazione della Real Time RT-PCR. Le fasi di estrazione, concentrazione e purificazione dellʼRNA virale dai tessuti di molluschi bivalvi rappresentano quindi step critici per la rilevazione dei virus con metodiche molecolari. Per questo motivo sono essenziali lʼuso di un controllo di amplificazione ed un controllo di processo co-estratti e co-amplificati con la sequenza target per evitare falsi negativi legati ad insuccessi di amplificazione e di estrazione.
Recentemente è stato costituito un gruppo di esperti CEN 275 WG 6 TG4 del quale fanno parte anche ricercatori dell'Istituto Superiore di Sanità con il compito della messa a punto di un metodo di riferimento per la determinazione di virus enterici negli alimenti.
Al fine di uniformare la metodica sul territorio nazionale, il Laboratorio di Riferimento per il Monitoraggio delle Contaminazioni Virali dei Molluschi Bivalvi dellʼIstituto Superiore di Sanità (Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinario e Sicurezza Alimentare) ha messo a punto e distribuito ai diversi laboratori, operanti nel settore, la procedura per la
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"#! “Determinazione di Norovirus ed HAV in Molluschi Bivalvi mediante Real Time PCR”. Il presente studio si inserisce allʼinterno del recepimento da parte del Laboratorio di Ittiopatologia dellʼIstituto Zooprofilattico Sperimentale delle regioni Lazio e Toscana, Sezione di Pisa, della procedura redatta dallʼIstituto Superiore di Sanità.
La procedura prevede, per lʼestrazione degli acidi nucleici, la possibilità di utilizzare differenti kit di estrazione commerciali. Da un precedente studio, utilizzando il kit QIAmp Viral RNA Mini Kit (Qiagen), erano emerse difficoltà nel rientrare nei limiti di accettabilità indicati dalla procedura per quanto riguarda lʼefficienza di estrazione e di amplificazione.
In questo lavoro è stato quindi effettuato un confronto tra il kit commerciale di estrazione dellʼRNA virale in uso presso il laboratorio di Ittiopatologia ed uno dei kit indicati dalla procedura (Minimag – Nuclisens Magnetic Extraction kit) su campioni di molluschi bivalvi che routinariamente vengono analizzati presso il Laboratorio di Ittiopatologia. Questa attività è stata svolta in collaborazione con il Laboratorio di Igiene e Virologia ambientale del Dipartimento di Biologia dellʼUniversità di Pisa.
Un altro punto critico, nel recepimento della procedura da parte del laboratorio era stato la reperibilità dei campioni positivi necessari come controllo di amplificazione e per la valutazione dellʼefficienza di amplificazione dei virus. A tal proposito un altro scopo del presente lavoro è stato lʼallestimento di plasmidi degli amplificati di NoV GI, NoV GII e HAV da cui ottenere trascritti da utilizzarsi come standard di riferimento nella metodica.
Lʼallestimento dei plasmidi e dei trascritti di NoV GI, NoV GII e HAV permette di sviluppare una Real Time RT-PCR Quantitativa; un ulteriore scopo di questo lavoro è stato quindi lo sviluppo delle prime fasi necessarie per quantificare il numero di copie virali per microlitro di RNA estratto da alcuni campioni risultati positivi per questi virus.
