LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS
Ona Ambrazaitytė
Šaldytos ožių spermos tyrimai
Assessment of frozen goat semen post-thaw
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovė: lekt. dr. Neringa Sutkevičienė
2 DARBAS ATLIKTAS STAMBIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOS REPRODUKCIJOS
KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Šaldytos ožių spermos tyrimai“. 1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiau visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBA
Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba taisyklinga.
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
_____________________________________________________________________________
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
TURINYS ... 3 SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10 1.1. Pieninė ožkininkystė ... 10 1.1.1. Alpių veislė ... 10 1.1.2. Zaaneno veislė ... 10 1.2. Reprodukcija ... 11 1.3. Veisimas ... 12 1.3.1. Dirbtinis sėklinimas ... 13 1.3.2. Sėklinimo metodai ... 13 1.4. Sperma ... 14 1.4.1. Spermos surinkimas ... 141.4.2. Šviežia ir atvėsinta sperma ... 15
1.4.3. Kriokonservuota sperma ... 16
1.5. Spermos kokybė ... 17
1.5.1. Spermatozoidų sandara ir savybės ... 18
1.5.2. Spermatozoidų koncentracija ... 19
1.5.3. Spermatozoidų judrumas ir judėjimas ... 19
1.5.4. Spermatozoidų plazminės membranos vientisumas ir gyvybingumas ... 20
1.5.5. Spermatozoidų morfologija ... 20
4
2.1. Spermos atšildymas ... 23
2.2. Spermatozoidų koncentracijos nustatymas ... 23
2.3. Subjektyvus (mikroskopu) ir objektyvus (SCA) spermatozoidų judrumo nustatymas ... 24
2.4. Spermatozoidų gyvybingumo nustatymas naudojant eozino – nigrozino ir SYBR–14/PI dažus ... 24
2.5. Spermatozoidų morfologiniai pakitimai ... 25
2.6. Statistiniai skaičiavimai ... 26
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 27
3.1. Atšildytos ožių spermos spermatozoidų koncentracijos vertinimas ... 27
3.2. Spermatozoidų judrumas ir judėjimo parametrai vertinant subjektyviu (mikroskopu) metodu ir objektyviu (SCA)... 28
3.3. Spermatozoidų gyvybingumo vertinimas su eozino – nigrozino dažais ir Sybr–14/PI po atšildymo ir praėjus 2 val. inkubacijos 37°C temperatūros vandens vonelėje ... 30
3.4. Spermatozoidų morfologinių pakitimų vertinimas ... 32
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 35
IŠVADOS ... 37
REKOMENDACIJOS ... 38
5 ŠALDYTOS OŽIŲ SPERMOS TYRIMAI
Ona Ambrazaitytė Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Darbo tikslas: įvertinti atšildytos ožių spermos kokybinius rodiklius po kriokonservavimo, palyginti parametrus, tirtus iš karto po atšildymo bei praėjus 2 valandoms po inkubacijos 37°C temperatūros vandens vonelėje bei palyginti rezultatus tarp dviejų pieninių ožių veislių. Buvo tirti 7 pieninių veislių ožiai (4 Zaaneno veislės ir 3 Alpių veislės). Kiekvieno ožio buvo analizuojami 2 spermos mėginiai: vienas tirtas iš karto po atšildymo, kitas – praėjus 2 valandoms inkubavimo vandens vonelėje, palaikiusioje 37°C temperatūrą. Tiriami parametrai: spermatozoidų koncentracija spermos dozėje (mikroskopuojant ir SCA metodu), spermatozoidų judėjimo parametrai (subjektyviai ir SCA metodas), spermatozoidų gyvybingumas (mikroskopija) bei morfologija (mikroskopija).
Tyrimo metu nustatyta, kad vidutinė visų ožių spermatozoidų koncentracija dozėje buvo 424,71 ± 15,11× 106. Didžiausia koncentracija buvo Alpių veislės ožių (459,00 ± 2,31 × 106
spermatozoidai dozės mililitre). Spermatozoidų judrumo procentas po atšildymo buvo 57,14 ±1,55. Alpių ožių judrumas tiek po atšildymo, tiek praėjus 2 valandoms inkubacijos išliko vienodas (60 proc.), o Zaaneno veislės ožių iš 55 proc. sumažėjo iki 43,75 proc. Vidutinis visų ožių spermatozoidų progresyvaus judėjimo vidurkis po atšildymo siekė 52,57 ± 2,19 proc. Didžiausias progresyvus spermatozoidų judėjimas po atšildymo buvo Alpių ožių (65 proc.). Abiejų veislių ir bendras visų ožių spermatozoidų gyvybingumas iš karto po atšildymo buvo vienodas (68 proc.) vertinant eozino – nigrozino dažymo metodu. Po dažymo SYBR-14/PI dažais aukščiausias vidurkis buvo Alpių veislės ožių (4,43 proc. didesnis nei visų ožių ir 7,75 proc. didesnis nei Zaaneno veislės ožių(p < 0,05)). Praėjus 2 valandoms inkubavimo mažiausiai pakito Alpių veislės procentas (nukrito 1 proc. (p < 0,05)). Bendras vidutinis patologinių spermatozoidų kiekis vienoje dozėje po atšildymo buvo 9,43± 2,80 proc. Mažiausias spermatozoidų patologijų dozėje vidurkis buvo Alpių ožių spermoje (3,33 ± 1,20 proc.). Dažniausiai pasitaikiusios buvo kitos patologijos (palaidos patologinės galvutės, akrosomų pakitimai, distaliniai ir proksimaliniai lašeliai) – Zaaneno ožių spermoje šis patologijų vidurkis siekė 8,50 ± 2,60 proc. (7,84 proc. didesnis nei bendras ožių vidurkis(p < 0,05)).
6 ASSESSMENT OF FROZEN GOAT SEMEN POST–THAW
Ona Ambrazaitytė Master‘s Thesis
SUMMARY
The purpose of this paper was to evaluate buck semen quality parameters after cryopreservation, compare sperm quality rates just after thawing and after incubating semen for 2 hours in water bath with temperature maintained at 37°C, additionally assessing sperm parameters between two dairy goat breeds. Sperm was analysed from 7 different bucks (4 Saanen and 3 Alpine breed). There were 2 samples of each buck’s sperm – one was examined right after thawing, other one – after 2 hours incubation at water bath maintaining 37°C temperature. Evaluated criteria: sperm concentration (microscopy and SCA method), sperm motility parameters (subjectively and using SCA), spermatozoa membrane integrity (microscopy) and morphology (microscopy).
It was determined that mean spermatozoa concentration in one sample was 424.71 ± 15.11 × 106. The highest concentration index was detected in Alpine buck sperm (459.00 ± 2.31 × 106). The average motile spermatozoa percentage after thawing was 57.14 ±1.55. Alpine buck spermatozoa motility did not fluctuate throughout the experiment, it remained at 60 %. Whereas Saanen buck sperm motility from 55 % dropped to 43.75 %. The average progressive motility of all buck samples after thawing was 52.57 ± 2.19 %. The highest progressively moving spermatozoa percent was in Alpine breed (55 %). After carrying out an analysis of spermatozoa membrane integrity with eosin – nigrosin stain, the results displayed that both breeds, also the average of the whole group, was the same after sperm thawing (68 %). After sample staining with SYBR–14/PI, the highest membrane integrity percentage was found in Alpine breed (4.43% higher than whole group’s average, and 7.75 % higher than in Saanen bucks(p < 0.05)). After 2 hour incubation in water bath the least affected percentage of viable spermatozoa was found in Alpine breed (parameter decreased by 1%(p < 0.05)). The average percent of post–thaw pathological spermatozoa morphology in one sperm sample of all tested bucks was 9.43 ± 2.80. The least spermatozoa with morphological pathologies were found in Alpine buck semen (3.33 ± 1.20 %). The most frequently discovered pathologies were other type (detached head, acrosome defects, distal and proximal droplets) and the highest percentage was found in Saanen breed 8.50 ± 2.60 % (7.84 % higher than average of all bucks(p < 0.05)).
7
SANTRUMPOS
CASA – kompiuterinė spermos analizės sistema (Computer Assisted Sperm Analyzer); K – spermatozoidų koncentracija viename spermos dozės mililitre;
P – praskiedimas;
S – spermatozoidų skaičius 80-tyje mažų kvadratų arba 5-kiuose dideliuose;
8
ĮVADAS
Istoriniuose šaltiniuose minima, jog žmogus ožkas prisijaukino daugiau nei prieš 10 tūkstančių metų. Nors pirmiausia ožkininkystę pradėjo taikyti skurdžios šalys – Irakas, Iranas, Sirija, Rytų Turkija – amžiams bėgant ožkų naudingumas buvo pripažintas ir besivystančių šalių (1). Ožka yra puikus žemės ūkio gyvulio pasirinkimas dėl iš jų išgaunamos produkcijos įvairovės ir komercinės vertės bei palyginus trumpo nėštumo laikotarpio (5 mėnesiai vietoje karvės 9 mėnesių) (2). Nors didžioji dalis pieninių ožkų produkcijos yra gaunama iš Azijos regiono (45,6 proc.), tačiau Europa pasaulyje pirmauja pasiektu primilžiu, kuris yra dvigubai didesnis nei bendras viso pasaulio primilžio vidurkis (3). Tokie rezultatai įvykdyti taikant genetinę atranką bei selektyvų veisimą. Pasaulinė ožkų pieno produkcija per paskutiniuosius 50 metų padvigubėjo, o iki 2030 metų yra numatoma, jog išaugs 53 proc. (3).
2019 metų sausio mėnesio duomenimis Lietuvoje buvo 4095 ožkų laikytojai, kurie laikė 14 591 ožką. Lietuvoje yra klasifikuojamos 14 pieninių, 4 mėsinių bei 5 egzotinių veislių ožkos (Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centro duomenys). Nuo 2009 m. šalyje veikia pripažinta veislininkystės institucija – Lietuvos pieninių ožkų augintojų asociacija (LPOAA), kurios tikslai yra gerinti Lietuvos vietinės veislės ožkas, didinti jų pieningumą, baltymingumą ir pieno riebumą, koordinuoti veislinio ožkų prieauglio platinimą, rengti ožkų gerinimo programas ir jas įgyvendinti, organizuoti seminarus, konsultacijas ir parodas (4).
Praktikoje dažniausiai naudojamas natūralus sėklinimo būdas, tačiau siekiant ožkų produkcijos lyderių rezultatų geriausia strategija – selektyvus dirbtinis sėklinimas aukščiausios kokybės sperma. Lietuvoje naudojama sperma turi atitikti direktyvoje nustatytus gyvūnų sveikatos reikalavimus, reglamentuojančius prekybą Europos Bendrijoje gyvūnais, sperma, kiaušialąstėmis bei embrionais (5). Lietuvoje nėra reglamentuotų ožių spermos kokybinių rodiklių. Remiantis nustatytais bulių spermos rodikliais, spermatozoidų judrumas turėtų būti ne mažesnis 40 proc., normali morfologija – ne mažesnė nei 75 proc., spermatozoidų koncentracija vienoje dozėje – ne mažesnė nei 15 mln. spermatozoidų (6).
Šiuolaikinių tyrimų ir fundamentalios informacijos, orientuotos į kriokonservuotos ožių spermos kokybės analizę po atšildymo, nėra daug, nėra reglamentų, nurodančių ožių spermos kokybės reikalavimus. Suformuotas darbo tikslas – įvertinti į Lietuvą įvežamos ir šalyje ožkų sėklinimui naudojamos kriokonservuotos, Alpių ir Zaaneno veislių, ožių spermos kokybę.
Darbo uždaviniai:
9 2. Įvertinti Alpių ir Zaaneno veislių ožių spermatozoidų judrumą (vertinant subjektyviai ir objektyviai) spermos dozėje po atšildymo ir praėjus 2 valandoms po inkubacijos 37°C temperatūros vandens vonioje.
3. Įvertinti Alpių ir Zaaneno veislių ožių spermatozoidų gyvybingumą (naudojant eozino - nigrozino ir SYBR–14/PI dažymą) spermos dozėje po atšildymo ir praėjus 2 valandoms po inkubacijos 37°C temperatūros vandens vonioje.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Pieninė ožkininkystė
Ožkų pienas tapo vertinamas dėl jo išskirtinių savybių: panašumo į žmogaus pieną, švelnesnės varškės formavimo ir, ko gero, pagrindinio aspekto, išpopuliarinusio ožkų pieną – mažesnis alergizuojantis poveikis (lyginant su karvių pienu) (7). Lyginant su galvijų pieno realizavimu, ožkų pienas yra mažiau vartojamas tiesiogiai, bet naudojamas maisto produktų gamyboje (pavyzdžiui, Fetos sūris, jogurtas ir kt.) ir gaminant etninį maistą individualiam naudojimui ar parduodant pieno supirkėjams (3).Lyginant ožkų ir avių pieno primilžį, ožkos produkuoja maždaug 50 proc. daugiau pieno (1,47 kartus) nei pieninės avys (8). Lietuvoje didžiausias ožkų populiacijas sudaro Čekų baltosios (60 proc.) ir Zaaneno veislės ožkos(4), taip pat auginamos yra Alpių, Lietuvos vietinės, Vokietijos baltosios, Rusų baltosios, Vokietijos margosios, Angoros pieninės veislės(Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centro duomenimis).
1.1.1. Alpių veislė
Ši veislė yra klusi iš Šveicarijos ir garsėja puikiu pieno primilžiu, gera kūno forma, dideliais tešmenims. Dauguma mišrintų ožkų veislių turi Alpių veislės kilmę (9). Iš Šveicariškų Alpių ožkų yra kilusios Prancūzų Alpių ir Britų Alpių ožkos.
Prancūzų Alpių ožkos veisiamos dėl jų vienarūšiškumo, stambaus dydžio, didelės pieno produkcijos bei prisitaikymo prie daugelio klimato sąlygų. Specifinė veislės spalva nėra nustatyta (gali būti balta, pilkų, rudų ar juodų atspalvių), dažniausiai pasitaiko rudo atspalvio kailiai. Tai trumpaplaukė veislė, tačiau patinai įprastai turi ilgų plaukų ruožą stuburo srityje. Suaugęs ožys sveria apie 77 kg (patelė – 61 kg), aukštis ties ketera 85 – 100 cm (patelės– 75cm). Gali būti beragiai ar raguoti, stačiaausiai (9).
Britų Alpių ožkos gali būti ir beragės, ir raguotos. Pieno primilžis svyruoja nuo vidutinio iki didelio. Suaugusių patinų ūgis ties ketera siekia 95 cm, o patelių 83 cm. Ši veislė tinkamiausia auginti vidutiniame klimate (9).
1.1.2. Zaaneno veislė
Tai geriausiai žinoma pieninių ožkų veislė, kilusi iš Zaaneno slėnio esančio Šveicarijoje. Veislės knyga buvo pripažinta 1890 metais Šveicarijoje. Zaaneno ožkoms būdingas didelis pieno išmilžis su vidutiniu pieno riebalų kiekiu. Suaugęs ožys sveria 80 – 91 kg (patelė – 68 kg), o ūgis ties ketera siekia 90 cm (patelė – 75 cm). Kailis trumpas, baltas ar kreminio atspalvio. Tai beragė veislė(9).
11
1.2. Reprodukcija
Kadangi vienas ožys gali sukergti daug patelių, patino reprodukcinės savybės yra laikomos svarbesnėmis nei patelių (11). Šios reprodukcinės funkcijos priklauso nuo genetinių ir aplinkos faktorių sąveikos. Veiksniai gali būti šie: racionas, aplinkos temperatūra, gyvūnų laikymo tankumas, amžiaus grupės ir kita. Nepaisant to, jog ožkos garsėja gebėjimu prisitaikyti prie bet kokių sąlygų, aplinkos faktoriai dažnai lemia reprodukcinio funkcionavimo sutrikimus (12).
Ožių lytinės brandos pradžia yra siejama su ženklia testosterono produkcija ir spermatogeneze. Šis fenomenas yra pastebimas jau 4 – 6 mėnesių amžiaus ožiukams. Prasidėjus brendimo laikotarpiui pradeda atsiskirti apyvarpės suaugimai, dėl kurių nesubrendę ožiai negali apsėklinti patelių, ir jau 4 – 5 mėnesių patinai gali apvaisinti patelę. Tokių „paauglių“ spermos kokybė yra netinkama naudoti reprodukciniams tikslams. Veiksniai, lemiantys lytinio brendimo pradžią, yra fotoperiodas ir taikomas racionas. Ožys yra laikomas lytiškai subrendusiu kuomet pasiekia maždaug 18 mėnesių amžių, sveria apie 60 – 80 kg(atsižvelgiant į veislę) (9, 13).
Sveikų ožių kapšelio oda turėtų būti švelni ir be pažeidimų. Kapšelio apimties rodiklis, dėl koreliacijos su sėklidžių dydžiu ir spermos produkcijos galimybėmis, yra itin reikšmingas ožiams. Šis parametras naudojamas įvertinti veisimo galimybėms, tačiau nėra tiksliai apibrėžtas. Kapšelio apimtis pieninių ožių veislėms, sveriančioms 45 kg, turėtų būti apie 25 – 28 cm, o daugiau sveriantiems patinams – 34 – 36 cm. Kapšelis išlaiko sėklidžių temperatūrą 3 – 5°C laipsniais žemiau kūno temperatūros, taip užtikrinamas optimaliausias sėklidžių funkcionavimas (13 –16).
Apžiūrint sėklides reikėtų įvertinti jų dydį, simetriškumą ir konsistenciją. Jos kapšelyje turėtų būti paslankios, ovalo formos, panašaus dydžio, turėti „prinokusio pomidoro“ konsistenciją(veisimo sezonu konsistencija gali būti šiek tiek minkštesnė). Diagnostikai galima pasitelkti ultrasonografiją, kuri gali padėti rasti galimas patologijas. Apčiuopos metodu turėtų būti įvertinama antsėklidžio galva, kūnas ir uodega, jų dydis. Atliekant apčiuopą gyvūnas neturi jausti skausmo. Ožiams antsėklidžio pokyčiai yra reti (13, 14).
12 Ožio pridėtines lytines liaukas įvertinti yra sudėtinga. Šių liaukų(sėklinių pūslelių, prostatos, šlaplės stormens liaukų (arba Kuperio liaukų) ir sėklatakio ampulės) funkcija – išskirti sekretą, formuojantį spermą. Priedinių liaukų sekrete yra cukrų atliekančių maitinamąją funkciją, buferių reikalingų apsaugoti spermą nuo staigių pH pokyčių bei kitų chemikalų, apsaugančių ir pastumiančių spermą per reprodukcinį traktą ejakuliacijos metu. Nors prostatos liauka, atliekant rektinį tyrimą, yra pasiekiama pirštais, tačiau dėl jos difuzinės prigimties apčiuopa nėra informatyvi (nebent yra ryški liaukos patologija – tuomet gyvūnui sukeliamas skausmas) (14, 15).
Norint užtikrinti sėklinimo sklandumą derėtų atkreipti dėmesį į šiuos patino klinikinės apžiūros aspektus, kurie gali likti neįvertinti: įmitimo indeksas, gleivinių spalva, kailio išvaizda (dėl galimo parazitizmo, nepakankamo raciono, lėtinių infekcijų ir kt.), dantys, akys, kojos, sąnariai, ar yra matomi genetiniai ar paveldimi defektai (išvaržos, žandikaulio anomalijos, didesnis negu įprasta spenelių skaičius), reprodukcinių organų apžiūra (kapšelis, sėklidės, varpa ir kt.), kapšelio apimties išmatavimas, spermos surinkimas ir jos parametrų tyrimas, libido įvertinimas (17, 13).Diagnostikos procedūroms taip pat gali būti naudojama sėklidžių (transkutaninė) ir pridėtinių lytinių liaukų (transrektinė) ultrasonografija. Taip pat galimas kultūrų auginimas ar kitų patologinių agentų izoliavimas iš ejakuliato mėginio (14).
Dažnai pasitaiko, jog neveisimo sezonu augintojai nepakankamai rūpinasi ožiais reproduktoriais. Dėl šios priežasties dažnai reproduktoriai gali turėti įvairų problemų, pavyzdžiui, netinkamas įmitimo indeksas, endoparazitai, ektoparazitai, sąnarių ligos. Netinkamas ožio įmitimas gali neigiamai paveikti gyvūno libido bei spermos kokybę (dėl didesnio riebalų atsidėjimo kapšelyje didėja temperatūra) (14). Reprodukcijai naudojamiems ožiams rekomenduojama išlaikyti 3 balų (5 balų sistemoje) įmitimo įvertinimą (9).
1.3. Veisimas
13 trumpėja (veisimo periodas) lyginant su ilgėjančiu dienos periodu (neveisimo laikotarpis). (18, 13, 19) Tyrimų duomenimis Zaaneno ožių ejakuliato tūris, spermatozoidų koncentracija ir gyvų normalių ląstelių procentas yra aukščiausi rugpjūčio ir rugsėjo mėnesiais (20).
Suaugusio ožio liuteinizuojančio hormono, testosterono rodikliai, libido ir natūralus kūno kvapas pasiekia piką rudenį. Seksualinė elgsena apima rujojančių patelių paiešką, meilikavimo demonstravimą (spardymas, kapstymas kanopa, nosies kaišiojimas, niurnėjimas, Flemeno reakcija), lipimą ant patelės, varpos įvedimą ir ejakuliaciją. Ejakuliacija įvyksta spontaniškai ir yra charakterizuojama stipriu dubens srities stūmimu į priekį, tuo pačiu atmetant galvą atgal. Po ejakuliacijos, patinas nulipa nuo patelės ir nerodo jokių lytinio sujaudinimo požymių nuo kelių minučių iki kelių valandų (13).
1.3.1. Dirbtinis sėklinimas
Dirbtinis sėklinimas pakeitė smulkių atrajotojų industriją. Patobulintas genų fondas, pagerinta ligų kontrolė (sumažino gyvulių judėjimą ir lytiškai plintančių ligų pasireiškimą), supaprastino pageidaujamų genetinių požymių išskyrimą, pagerino bandų vienarūšiškumą ir bandų valdymą (21, 22). Naudojant vieno ožio spermą, per 3 savaites, yra įmanoma apsėklinti 400 patelių. Taikant konvencinę sėklinimo metodiką, per tą patį laikotarpį galima apsėklinti tik 30 – 50 patelių (9). Nors smulkių atrajotojų sėklinimo sėkmingumo koeficientas yra nuo prasto iki vidutinio, yra priežastys, paaiškinančios tokius rezultatus. Rezultatus prastina sąveika tarp krioprotektorių, žalingas skiediklio tipas, netinkamas atšildymo metodas po kriokonservavimo, prastas spermos pakavimas ir transportavimas, gyvybingumas ir kapacitacijos rodikliai spermatozoidams po spermos atšildymo, tarpląstelinių ledo kristalų susiformavimas, embrioninis mirtingumas, kiti veiksniai susiję su patelėmis (pavyzdžiui, netinkamas rujos sinchronizacijos metodas, rujos stebėjimo ir sėklinimo laiko klaidos) (23–25).
Tinkamai atliekant procedūrą galima pasiekti nuo 40 iki 60 proc. apvaisinimo efektyvumą. Šiam procentui reikšmingi veiksniai – spermos tipas (šviežia, atvėsinta ar šaldyta) ir sėklinimo metodas (per gimdos kaklelį ar laparoskopinis). Apvaisinimo sėkmingumo procentas yra 5 proc. mažesnis patelėms, kurioms buvo taikytas hormoninis gydymas ir kuomet naudojama sperma buvo kriokonservuota ilgiau nei 9 metus (14).
Tačiau reikia nepamiršti ir neigiamų dirbtinio sėklinimo aspektų: didelės įrangos, reikalingos dirbtinio sėklinimo atlikimui, kainos, taip pat azoto indų (kriokonservuotai spermai laikyti) kaštai, nepakankamai standartizuota ožių spermos kokybės kontrolė, reikia investuoti daugiau laiko ir darbo sekant patelių rujas ir planuojant sėklinimą (8).
1.3.2. Sėklinimo metodai
14 apsėklintos praėjus 12 valandų po pirmų užfiksuotų rujos požymių. Jei po pirmo sėklinimo ruja tęsiasi dar 12 – 24 valandas yra rekomenduojama sėklinti pakartotinai (22).
Cervikalinis sėklinimas į gimdą gali pasiekti 50 – 70 proc. apvaisinimo sėkmingumą, nes ožkų gimdos kakleliu spermatozoidams yra lengviau keliauti. Sėkmingumo procentas taip pat priklauso nuo sezoniškumo: pavasario ir vasaros laikotarpiu žemesnis negu rudenį ir žiemą. Kitais atvejais sperma gali būti deponuojama į gimdos kaklelį – 30 proc. pasisekimas, giliai į gimdą – 10 proc. sėkmingumas. Kuomet yra išlaikoma lytinio ciklo sinchronizacija, optimalus laikas sėklinimui (su šviežia ar šaldyta sperma) yra maždaug 45 valandos po progesterono taikymo, o sėklinant du kartus tai turėtų būti atliekama 30 ir 45 valandos po progesterono (2, 22).
Taikant laparoskopinį sėklinimą į gimdą geriausi rezultatai pasiekiami procedūrą atliekant 43 – 46 valandą po progesterono panaudojimo. Taikant tokį metodą yra reikalingas mažesnis spermos kiekis, taip pat pasiekiami geresni sėklinimo rezultatai naudojant šaldytą spermą. Laparoskopinio sėklinimo neigiami aspektai – reikalinga speciali įranga atlikti procedūrai bei specifiniai įgūdžiai atliekant tokio tipo invazinę operaciją. Minimalus reikalingas spermatozoidų skaičius vienoje dozėje yra 20 × 106 spermatozoidų. Laparoskopinio sėklinimo apvaisinimo sėkmingumas siekia 80
ir daugiau proc. (2, 22).
Transcervikalinis sėklinimas į gimdą buvo sukurtas siekiant atraumiškai įvesti spermą giliai į gimdos ragus. Mažiausias reikalingas skaičius judrių spermatozoidų yra 60 × 106 dozėje, o
optimaliausias sėklinimo laikas yra 49 ir 65 valandos po progesterono panaudojimo (22). Taikant intrauterinį sėklinimo metodą pasiekiamas 50 – 60 proc. apsėklinimo sėkmingumas. Geresni rezultatai pasiekiami, kuomet sperma yra deponuojama giliau į gimdą. Naudojant šviežią spermą apsėklinimo sėkmingumas gali siekti net 80 proc. (22, 26).
1.4. Sperma
Spermos formavimasis ožiams yra ganėtinai ilgas procesas, vidutiniškai užtrunka nuo 50 iki 60 dienų (nuo spermatogonijos iki spermos formavimo). Pasibaigus spermatogenezei, sperma keliauja į antsėklidį, kur dar 2 – 3 savaites spermatozoidai bręsta. Galima teigti, jog subrendusios ir sėklinimui tinkamos spermos formavimas užtrunka nuo 60 iki 80 dienų (9).
1.4.1. Spermos surinkimas
15 sėklinės plazmos kompoziciją ir gali sumažinti spermatozoidų gebėjimą išgyventi konservavimą. Vidutiniška surinktos spermos dozė varijuoja nuo 60 iki 120 × 106 spermatozoidų koncentracijos ir
nuo 0,5 iki 1,5 ml tūrio (14, 18, 13, 27).
Spermos surinkimas turi būti atliekamas švaria įranga, derėtų atkreipti dėmesį valymui naudojant muilą ar dezinfekantus (pavyzdžiu, povidonojodidas ar chlorheksidinas), nes šie gali turėti stiprų spermatocidinį poveikį (28). 0,05 proc. koncentracijos povidonojodido kontaktas su sperma per minutę visiškai imobilizuoja spermatozoidus (29). Neatsižvelgiant į spermos surinkimo būdą, visos procese naudojamos priemonės, laikymo talpos, skiedikliai, stiklinės talpos, pipetės, kurios turi kontaktą su ejakuliatu, turi būti sušildyti iki 37°C temperatūros tam, kad spermatozoidai nepatirtų šalčio šoko, dėl kurio sperma gali prarasti judrumą ir būti visiškai imobilizuota (28).
Ypač svarbu tinkamas spermos skiedimas tam, kad būtų optimalus spermatozoidų pasiskirstymas siekiant aukščiausio apsėklinimo koeficiento, tuo pačiu panaudojant mažiausią sėklinimų skaičių ir spermos kiekį (30). Istoriškai, skiedimo santykiai nuo 1:1 iki 1:23 (sperma: skiediklis) buvo sėkmingai panaudoti praktikoje (31). Labiau priimtinas spermos skiedimo variantas – skiedimas, atsižvelgiant į ėminio koncentraciją. Atlikti tyrimai rodo, jog sėkmingas spermos šaldymas gali būti pasiektas, išlaikant gerą apsėklinimo koeficientą, kuomet spermos koncentracija varijuoja nuo 80 iki 500 × 106 ląstelių/ml (32).
Tinkamo skiediklio parinkimas itin svarbus, nes nuo jo priklauso, ar ląstelės turės pakankamą energijos šaltinį, bus apsaugotos nuo žalos susijusios su temperatūros pokyčiais, išlaikys trumpalaikę optimalią aplinką spermatozoidų išgyvenimui užtikrinti. Dažniausiai naudojami ožių spermos skiedikliai: neprasiskverbiantis krioprotektorius (pienas ar kiaušinio baltymas), prasiskverbiantis krioprotektorius (glicerolis, metileno glikolis, dimetil sulfoksidas), buferis (Tris ar Test), vienas ar daugiau cukrų (gliukozė, laktozė, rafinozė, sacharozė), druskos (natrio citratas, citrinos rūgštis) ir antibiotikai (penicilinas, streptomicinas) (31).
1.4.2. Šviežia ir atvėsinta sperma
Siekiant patenkinamo apsėklinimo koeficiento šviežia sperma dažniausiai naudojama sėklinant pateles vaginaliniu ar cervikaliniu metodu (22). Po praskiedimo, šviežia sperma yra laikoma 30°C temperatūroje ir turi būti panaudota per 30 min. po surinkimo (14).
16 1.4.3. Kriokonservuota sperma
Norint pasiekti pageidaujamą sėkmingo apvaisinimo koeficientą naudojant šaldytą spermą yra rekomenduojama taikyti laparoskopinį ar transcervikalinį sėklinimą. Dėl kriokonservavimo, sumažėja spermatozoidų gyvybingumas ir judrumas – mažesnis kiekis spermatozoidų pereina gimdos kaklelį. Norint didesnio sėklinimo sėkmingumo su šaldyta sperma, ji turėtų būti deponuota tiesiai į gimdos spindį, kuo arčiau apsėklinimo zonos (22). Kriokonservavimo metu žalingai veikiami įvairūs spermos parametrai – judrumas, membranos vientisumas, DNR funkcija ir mitochondrinis funkcionavimas (24).
Spermos kriokonservavimo bei dirbtinio apvaisinimo sėkmingumą lemia įvairūs faktoriai: naudojamas skiediklis, krioprotektorių tarpusavio kontaktas, atvėsinimo greitis, atšildymo greitis, fiziologinė gyvūno būklė. Taip pat reikšmingi ir kiti veiksniai: tinkamas gyvulio maitinimasis, veisimo sezonas, klimato sąlygos, patelės atvestų gyvų jauniklių skaičius, veislė, auginimo aplinka, spermos įvedimo gylis bei hormonų taikymas (34). Be šių faktorių dar yra tinkamų krioprotektorių naudojimas, medžiagos išlaikančios osmosiškumą, aprūpinimas energijos šaltiniu (pavyzdžiui, gliukozė ar fruktozė), taip pat enzimų ir antibiotikų šaltiniai, kurie yra reikalingi išlaikyti spermatozoidų gyvybingumą spermos atvėsinimo, šaldymo, o vėliau – atšildymo metu (35).
Bet kokios rūšies gyvūnų spermos šaldymas yra rimtas iššūkis. Nors visos ląstelės turi išgyventi panašų stresą, susijusį su krioprezervacija, tačiau skirtingų gyvūnų sperma skiriasi savo atsparumu šaldymui. Taikant vienai gyvūnų rūšiai tinkamus kriokonservavimo metodus, šie gali būti žalingi kitai.
17 kurie buvo skiesti naudojant kiaušinio baltymo pagrindo skiediklį (37). Kitas tyrimas lygino skirtingų spermos šaldymų protokolų taikymą, pirmu metodu sperma buvo iš karto skiedžiama su kiaušinio pagrindo, Tris buferio, gliukozės ir glicerolio skiedikliu, o antru – spermos sėklinė plazma buvo atskirta centrifuguojant, tuomet naudojamas pieno pagrindo ir gliukozės (be glicerolio) skiediklis. Tyrimo rezultatai parodė, jog nors po spermos atšildymo abiejų metodų spermos mėginiai buvo tinkami sėklinimui, tačiau judrumo ir gyvybingumo rodikliai buvo kur kas didesni taikius antrąjį šaldymo protokolą (38).
Jei naudojamas spermos skiediklis yra pieno pagrindo, susiduriama su kita problema. Pastebėta, kad skiedžiant spermą prieš atvėsinimą ar šaldymą pieno pagrindo skiedikliu, sumažėja spermatozoidų gyvybingumas po atšildymo, taip pat, laikant spermą 37°C pieno pagrindo terpėje – suaktyvinama akrosominė reakcija ir spermatozoidai pamažu žūva. Bulbouretralinė liauka sekretuoja baltymą (BUSgp60), mažinantį atšildytos spermos judrumą ir gyvybingumą. Dėl BUSgp60 proteino vyksta hidrolizė tarp spermatozoido plazminės membranos ir naudojamo pieno pagrindo skiediklio. Proceso rezultatas – riebalų rūgščių susidarymas, dėl kurio yra pažeidžiama spermos ląstelių struktūra (23, 30).Rekomenduojama naudojamo skiediklio pH išlaikyti tarp 6,75 ir 7 (23).
Surinkta ir atskiesta ožio sperma per 1,5 – 4 valandas yra vėsinama iki 4 – 5°C temperatūros ir tuomet šaldoma šiaudeliuose (39). Šiaudeliai dažniausiai būna 0,25 ar 0,5 ml talpos, sudedami į lentynas ir šaldomi skysto azoto garuose. Rekomenduojami šaldymo metodai azoto induose: 0,5 ml dydžio šiaudeliai turėtų būti šaldomi 4 cm virš skysto azoto 5 minutes, ir tuomet panardinami į skystą azotą, 0,25 ml šiaudeliai turėtų būti laikomi 16 cm virš skysto azoto 2 minutes, tuomet 4 cm virš skysčio 3 minutes ir tik tada panardinami į skystą azotą (39). Nustatyta, jog šiaudelius laikant nuo –75°C iki –125°C temperatūroje šaltis visiškai neturi įtakos spermos kokybės parametrams. Tačiau, kuomet temperatūra pakyla iki –55°C sumažėja gyvybingų spermatozoidų skaičius po atšildymo (23).
Taikomas kriokonservuotos spermos atšildymo metodas priklauso nuo to, kaip ji buvo užšaldyta. Įprastinis šiaudelių atšildymo metodas yra 12 – 30 sekundžių palaikyti juos 37°C temperatūros vandens vonelėje (30). Nerekomenduojama taikyti metodų, kuomet temperatūra yra aukštesnė nei 37°C, tokiais atvejais, įvykus minimaliam procedūros atlikimo nuokrypiui, rezultatas – didžiulis žuvusių spermatozoidų kiekis (40).
1.5. Spermos kokybė
18 priklausomai nuo patino amžiaus, sezono, aplinkos temperatūros, veislės ir tarp skirtingų tos pačios veislės individų (13).
Rodikliai vertinami nustatant spermos kokybę:
tūris; spalva ir išvaizda; koncentracija; bendras judrumas; progresyvus judėjimas; morfologija; spermatozoidų gyvybingumas; spermos pH;
ląstelinis ir bakterinis užterštumas (14).
Atliekant makroskopinį spermos tyrimą turėtų būti vertinamas tūris, konsistencija, spalva, pašalinių ląstelių buvimas mėginyje. Mikroskopinio tyrimo metu tiriamas spermatozoidų bendras judrumas ir judėjimo parametrai, morfologija, mėginio koncentracija (28, 13).
Dėl mažo ejakuliato kiekio (0,5 – 2 ml) ožių sperma paprastai yra itin koncentruota, konsistencija tirštesnė (atkreipti dėmesį į surinkimo metodą). Skiedžiant mažesnės koncentracijos spermos mėginius, jie gali atrodyti vandeningi ar pilkšvi. Kartais spermoje galima matyti geltoną spalvą, atsiradusią dėl riboflavino, tačiau tai neturi reikšmės kokybiniams ejakuliato tyrimams. Sperma surinkta naudojant elektroejakuliaciją dažniausiai būna didesnio tūrio, bet mažesnės koncentracijos lyginant su sperma, surinkta naudojant dirbtinę makštį. Pasitaiko ejakuliato užteršimas šlapimu, dėl kurio atsiranda specifinis kvapas. Šlapimas spermą veikia neigiamai – žūva spermatozoidai. Mėginyje negali būti matoma kraujo priemaiša, t.y. rožinis mėginio atspalvis. Optimalus spermos pH rodiklis turėtų būti tarp 6,8 ir 7,0 (28, 14, 17).
Galimas papildomas spermos tyrimas – 2 valandų spermos streso testas. Iš karto po surinkimo yra įvertinamas spermatozoidų judrumas. Tuomet mėginys yra inkubuojamas kambario temperatūroje 2 valandas ir praėjus šiam laikui judrumas yra pakartotinai įvertinamas. Po 2 valandų spermatozoidų judrumas turėtų būti 20 proc. pradinio judrumo (13).
1.5.1. Spermatozoidų sandara ir savybės
19 Spermatozoido galvutė yra ovali ir šiek tiek plokščia. Galvutė padalinta į du segmentus: priekinę akrosomą ir poakrosominį regioną. Abu šie regionai yra jungiami branduolinio žiedo. Spermatozoido branduolys yra lokalizuotas po priekine akrosoma ir besitęsiantis iki galvutės pamato (41). Didžiausias spermatozoido galvutės komponentas – branduolys, kuriame yra lokalizuota DNR. Branduolys yra apsuptas cistoskeletinio darinio sudaryto iš pereinamojo apvalkalo, dar vadinamo poakrosominiu dangalu (42). Akrosoma – unikali organelė išsivystanti ankstyvame spermatogenezės etape iš Goldžio komplekso. Akrosoma sudaryta iš vidinės ir išorinės membranos bei proteaze pripildytos matricos (41). Akrosominė membrana, esanti po plazmine membrana, dar yra žinoma kaip išorinė akrosominė membrana, o esanti ant branduolio – vidinė akrosominė membrana (43).
Spermatozoido uodegėlė yra sudaryta iš 4 segmentų: kaklo (jungiamoji dalis), vidurinės dalies, pagrindinės dalies ir galinės dalies. Kiekvienas iš šių segmentų yra apsuptas ląsteline membrana (43). Kaklelis – trumpas jungiamasis segmentas tarp galvutės ir uodegėlės. Vidurinė dalis yra uodegos regionas tarp kaklelio ir žiedo (Dženseno žiedas). Ši žiedinė struktūra yra vienas iš spermatozoido uodegėlės elementų, kuris sujungia vidurinę ir pagrindinę dalis. Viduriniame segmente esančios mitochondrijos generuoja energiją ATP forma, kuri yra panaudojama spermatozoido judėjimui. Vidinė mitochondrinė membrana yra energijos produkcijos zona (43, 44). Pagrindinė dalis – tai ilgiausia spermatozoido dalis, kuri tęsiasi nuo vidurinės dalies žiedo iki galinės dalies. Pagrindinis segmentas yra charakterizuojamas atsižvelgiant į fibrininio apvalkalo (užtikrina susitraukiamuosius uodegėlės judesius) buvimą (43). Galinė dalis yra regionas, esantis už distalinės fibrinio dangalo dalies. Ši dalis turi tik ląstelinės membranos apvalkalą (41).
1.5.2. Spermatozoidų koncentracija
Dėl mažo ejakuliato kiekio (0,5 – 2 ml) ožių sperma paprastai yra itin koncentruota, konsistencija tirštesnė(28). Spermos koncentraciją gali paveikti patino amžius, fotoperiodas (arba sezoniškumas), temperatūra, maitinimasis, įvairios ligos (21). Derėtų nepamiršti, jog skirtingų veislių ožių spermos koncentracija taip pat varijuoja (44).
Paprastai koncentracija vyrauja nuo 2 iki 10 × 109 spermatozoidų/ml (atkreipti dėmesį į surinkimo metodą). Dažnai renkant spermos mėginius su elektroejakuliacija yra pastebėtas sumažėjęs spermos koncentracijos rodiklis (14, 45).
1.5.3. Spermatozoidų judrumas ir judėjimas
20 Progresyviai judančių spermatozoidų procentas ožių spermoje svyruoja tarp 70 ir 90 proc. (vidutiniškai 80 proc.). Vidutiniškai pažeisti spermatozoidai dažniausiai juda ratais arba atbuline eiga, stipriau pažeisti ar žūvantys spermatozoidai – vartosi (16, 46).
Norint objektyviai įvertinti spermatozoidų judrumą rekomenduojama taikyti kompiuterinę spermatozoidų analizę (CASA). Ši įranga nagrinėja didelio spermatozoidų kiekio judesius ir iš šios analizės išskiria daugybę skirtingų parametrų, tarp kurių yra judrių spermatozoidų procentas, progresyviai judančių spermatozoidų procentas, galvučių lokacijos pakitimai, vidutinis spermatozoido kelio greitis ir kreivalinijinis greitis (28). Naudojant CASA analizę buvo nustatyta, jog skirtingų ožių ejakuliato subpopuliacijų spermatozoidai gali būti atpažinti pagal skirtingus judėjimo modelius (47). CASA sistema turi kompiuterinę SCA® Motility and Concentration programą, kuri identifikuoja ir išmatuoja spermatozoidų judėjimo parametrus (judrumo procentas, sugrupuoti spermatozoidai į progresyviai, neprogresyviai judančius, nejudrius, suskirsto spermatozoidus į greitai, vidutiniškai, lėtai judančius bei nejudančius), taip pat pateikia spermos koncentraciją (48). Neigiamas šios sistemos naudojimosi aspektas – prieinamumo apsunkinimas dėl CASA įrengimo ir kainos, dėl šių priežasčių subjektyvus judrumo vertinimas mikroskopuojant išlieka pagrindiniu praktikoje naudojamu metodu (28).
1.5.4. Spermatozoidų plazminės membranos vientisumas ir gyvybingumas
Spermatozoidų membranos vientisumo įvertinimas dar yra vadinamas spermos gyvybingumo įvertinimu (49). Plazmos membranos vientisumas yra būtinas išlaikyti funkcionavimą patelės reprodukciniame trakte. Kriokonservavimo metu pagrindiniai ląsteliniai pažeidimai tenka spermatozoidų plazminei membranai. Kuomet spermos vėsinimo proceso metu temperatūra pamažu žemėja, fosfolipidų ribotas judėjimas lateraliai sukelia pokyčius skysčiui virstant geliu ir dėl šios priežasties membrana tampa nelanksti ir trapi (50, 24).
Norint kuo tiksliau įvertinti gyvų ir negyvų spermatozoidų santykį dozėje privalu kuo geriau apsaugoti mėginį nuo temperatūros pokyčių. Atliekant šį tyrimą reikia laikytis griežtų laboratorinių protokolų norint gauti tiksliausius rezultatus (reagento kokybė, išlaikyti optimalią temperatūrą, tikslus laiko planavimas). Surinkta sperma turi būti iš karto patalpinama į 37° C temperatūros vandens vonelę (13). Didelis negyvų spermatozoidų santykis randamas jaunų ožių spermoje, ypač pavasario ir vasaros sezonais (lyginant su rudenio ir žiemos periodu) (17).
1.5.5. Spermatozoidų morfologija
Morfologiškai nepakitusių spermatozoidų svarba apvaisinimo sėkmingumui buvo laikoma svarbiu veiksniu nuo XX amžiaus pradžios (51). Daugiau nei 80 metų yra tyrinėjamas ryšys tarp spermatozoidų struktūrinių pakitimų ir apvaisinimo (52).
21 aplinkos ar panaudojimo veiksnių. Galvutės ir vidurinės dalies patologijos dažniausiai yra klasifikuojamos kaip pirminės (proksimalinis lašelis, vidurinės dalies pakitimai, galvutės patologijos) – susiformavusios spermatogenezės metu. Su uodega susijusios patologijos yra laikomos antrinėmis (distalinis lašelis, paprastai perlenktos, susisukusios uodegėlės, spermatozoidas be uodegos, akrosomos pakitimai, kuomet spermoje yra kitų objektų – raudonieji kraujo kūneliai, baltieji kraujo kūneliai, bakterijos, epitelio ląstelės ir kitos), atsiradusios dėl nepakankamo spermos subrandinimo, aplinkos faktorių, kitų veiksnių spermos surinkimo ir apdorojimo metu (28).
Nepaisant spermatozoidų gyvybingumo ir judrumo, jie yra trapios ląstelės, kurios gali būti lengvai pažeistos pakitusių išorinių sąlygų. Didžiausią įtaką pakitimams atsirasti gali turėti toksiniai chemikalai ir šilumos stresas. Taip pat spermatozoidų morfologiją gali paveikti individo amžius, sezonas bei reprodukcinės sistemos ligos (28). Galimi morfologiniai spermatozoidų pokyčiai varijuoja priklausomai nuo skirtingų reprodukcinės sistemos ar infekcinių ligų. Lytiškai nesubrendusio patino spermos morfologijai yra būdingi galvučių pakitimai, netaisyklinga vidurinė dalis (sudvigubėjusi, spirališka, perlenkta, kilpiška), proksimaliniai lašeliai. Pasiekus 8 mėnesių amžių, dažniausiai pasitaikanti spermatozoidų morfologijos patologija – vidurinės dalies pakitimai. Lytiškai subrendusių, vyresnių ožių spermatozoidų morfologijai sezoniškumas neturi įtakos. Tačiau buvo pastebėtas didesnis negyvų spermatozoidų procentas sausuoju metų periodu lyginant su lietinguoju laikotarpiu (17).
22
2. MEDŽIAGOS IR METODAI
Laboratorinis šaldytos ožių spermos tyrimas buvo atliktas 2019 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje.
Buvo tirta 7 ožių sperma – Zaaneno ir Alpių veislių. Šaldytos spermos šiaudeliai buvo įsigyti iš „X veislininkystės įmonės“, kurie spermos mėginius gabeno iš Prancūzijos. Sperma buvo šaldyta taikant kriokonservavimą. Šaldytos spermos mėginiai transportuojami į laboratoriją bei iki tyrimo atlikimo buvo laikomi Diuaro inde (–196°C temperatūroje).
Buvo tirta 4 Zaaneno veislės ir 3 Alpių veislės ožių sperma. Kiekvieno ožio spermos buvo po 2 šiaudelius. Pirmos mėginių grupės tyrimas buvo atliktas iš karto po atšildymo, kitos grupės – praėjus 2 valandoms inkubavimo 37°C temperatūros vandens vonelėje. Tyrimo schema pavaizduota 1 pav.
1 pav. Tyrimo atlikimo schema
Šaldyta ožių sperma (n = 14)
Zaaneno veislė (n = 8) Alpių veislė (n = 6)
Tyrimai
Iš karto po atšildymo 2 val. po inkubavimo 37°C vandens vonelėje
1. Spermatozoidų koncentracijos įvertinimas
2. Spermatozoidų morfologinių pakitimų tyrimas
3. Subjektyvus ir objektyvus spermatozoidų judrumo ir progresyvaus judėjimo
įvertinimas
23
2.1. Spermos atšildymas
Šaldytos spermos šiaudeliai buvo išimami iš Diuaro indo, nuvalomi skysto azoto lašeliai ir talpinami į 37°C temperatūros vandens vonelę. Vienas kiekvieno ožio spermos mėginys buvo išimtas po 15 sekundžių laikymo vonelėje, šiaudelis tuomet buvo nusausintas popieriniu rankšluosčiu ir purtomas kaip medicininis termometras tam, kad oro tarpelis būtų nustumtas iš vidurio į šiaudelio galą. Žirklėmis nukirpus šiaudelio galą, sperma išleidžiama į Eppendorf tipo mėgintuvėlį. Toks paruoštas mėginys buvo tiriamas toliau. Kiti ožių spermos šiaudeliai buvo laikomi 37°C temperatūros vonelėje dar 2 valandas ir tiriami tokiais pačiais metodais kaip pirmieji.
2.2. Spermatozoidų koncentracijos nustatymas
Spermatozoidų koncentracija yra nustatoma naudojant fazių kontrastinį mikroskopą (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija). Mikroskopuojama 100 kartų padidinimu ir naudojama New Bauer hematocitometrinę kamerą. 10 µl atšildytos spermos yra skiedžiama su 190 µl distiliuotu vandeniu Eppendorf tippo mėgintuvėlyje ir gerai išmaišoma (skiedimo santykis 1:20). Tuomet prie New Bauer kameros pirštais yra pritvirtinamas dengiamasis stikliukas, po juo įlašinamas lašas skiestos spermos ir kamera yra mikroskopuojama (×100 padidinimu). Spermatozoidai kameroje yra skaičiuojami įstrižai 5 dideliuose kvadratuose (arba 80 mažų kvadratėlių). Registruojamos spermatozoidų galvutės, kurios yra kvadrato viduryje ir ant kairės bei viršutinės didelio kvadrato linijų. Spermatozoidai skaičiuojami tris kartus skirtinguose kvadratėliuose ir išvedamas skirtingų skaičiavimų vidurkis(53).
Spermatozoidų koncentracija yra apskaičiuojama pagal formulę: 𝐾 = 𝑆 × 𝑃 × 5 × 10 × 10000
K – koncentracija dozės mililitre, S – spermatozoidų skaičius 5 kvadratuose (arba 80 mažų kvadratėlių), P – praskiedimo laipsnis, 5 – koeficientas (spermatozoidai skaičiuoti 0,2 mm2 kameros
plote), 10000 – daugiklis, kai kameros gylis yra 0,1 mm ir skaičiuojama koncentracija 1,0 ml (53). Norint nustatyti spermatozoidų koncentraciją spermos dozėje, apskaičiuotas spermatozoidų kiekis mililitre yra dauginamas iš spermos dozės tūrio (mililitrais). Apskaičiuojama pagal formulę:
𝑆𝐾 = 𝐾 × 0,25
24
2.3. Subjektyvus (mikroskopu) ir objektyvus (SCA) spermatozoidų judrumo
nustatymas
Spermos judrumo parametrams apskaičiuoti buvo taikomi du metodai: subjektyvus (mikroskopavimas) ir objektyvus (kompiuterinė spermos judrumo vertinimo programa Sperm Class Analyzer® (sutr. SCA, Microptic, Ispanija). Programa gali apskaičiuoti bendrus ejakuliato parametrus: bendrą judrumą, progresyvų judėjimą, taip pat spermatozoidų greitį, tiesiaeigiškumą, trajektoriją. Ožių spermatozoidų judrumas buvo tiriamas, kuomet jie yra aktyviausi – 37° ± 0,5° C temperatūroje (53, 50).
Subjektyvus vertinimas mikroskopu: ant šilto objektinio stiklelio (laikomo ant šildomojo stalelio, palaikančio 37°C temperatūrą) yra užlašinama 5 µl skiestos spermos, tuomet uždengiama dengiamuoju stikleliu ir mikroskopuojama fazių kontrastiniu mikroskopu (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija), 100 kartų padidinant. Spermatozoidų judrumas yra vertinamas procentais (apvalinant 5 proc. tikslumu), stebint tiesiai judančius spermatozoidus trijuose – penkiuose matymo laukeliuose, iš gautų matavimų išvedamas vidurkis (53).
Objektyvus spermatozoidų judrumo nustatymas buvo atliekamas naudojant mikroskopą bei prie jo įmontuotą kamerą. Vaizdo įrašas perduodamas į kompiuterį, kuriame įdiegta kompiuterinė spermos judrumo vertinimo sistema Sperm Class Analyzer (sutr. SCA) (MICROPTIC S.L., Ispanija). Kiekviename mėginyje buvo išanalizuota ne mažiau kaip 1500 spermatozoidų (ne mažiau nei trijuose matymo laukuose). SCA sistema fiksavo bendrą spermatozoidų judrumą procentais ir progresyvų spermatozoidų judėjimą (53). Šis tyrimas buvo atliekamas objektinį stiklelį laikant ant 37°C temperatūrą išlaikančio stalelio. Mėginys mikroskopuojamas fazių kontrastiniu mikroskopu (100 kartų padidinant). Buvo fiksuojami 3 regėjimo laikai, vedamas nustatytų rezultatų vidurkis.
2.4. Spermatozoidų gyvybingumo nustatymas naudojant eozino – nigrozino ir
SYBR–14/PI dažus
Spermatozoidų gyvybingumas buvo vertinamas dažant mėginius eozino ir nigrozino dažais, taip buvo nustatomas spermatozoido plazminės membranos vientisumas. Esant plazminės membranos nevientisumui eozino dažai prasiskverbia pro pažeistasspermatozoidų membranas ir nudažo ląstelę rausva spalva. Spermatozoidai su sveikomis membranomis išlieka nenusidažę – balti tamsiame nigrozino dažų fone.
25 38°C temperatūros. Tuomet ant 37°C temperatūros objektinio stiklelio dedama 10 µl eozino – nigrozino dažų ir 10 µl skiestos spermos, atsargiai išmaišoma, padaromas tepinėlis ir išdžiovinama ore. Mikroskopavimas vyksta naudojant fazių kontrastinį mikroskopą (Olympus BH2, Olympus Optical Co., Ltd., Japonija), 1000 kartų padidinimą su imersija. Gyvybingumas buvo vertinamas skaičiuojant, kiek spermatozoidų buvo su pažeista (rausva ar raudona) bei kiek buvo su nepažeista (balta) membrana iš 200 vertinamų ląstelių. Apskaičiuojamas gyvų spermatozoidų procentas mėginyje – spermatozoidų gyvybingumas (53).
Naudojant fluorescencinį dažymą su LIVE/DEAD Sperm Viability Kit (molecular Probes) yra nustatoma ar yra spermatozoido plazminės membranos pažeidimų. Tyrimo esmė – fluorescenciniai SYBR–14/PI dažai pereina per nepažeistą spermatozoido plazminę membraną, susijungia su nukleininėmis rūgštimis ir nudažo spermatozoidą žalia spalva, tuo tarpu propidžio jodidas pereina tik per pažeistą membraną ir nudažo spermatozoidą raudona spalva. Atlikimo eiga: pirmiausia paruošiamas 1:50 santykio SYBR–14/PI dažų skiedimas su dimetilsulfoksidu (sutr. DMSO), tuomet 5 µl skiestų SYBR–14/PI dažų lašinama ant 1 ml skiestos ožio spermos. Mišinys inkubuojamas 5 – 10 min. 36°C temp. Į spermos ir SYBR–14/PI dažų mišinį pridedami 5 µl propidžio jodido ir inkubuojama papildomai 5 – 10 min. 36°C temp. (54). Tuomet mikroskopuojama fluorescenciniu mikroskopu padidinus 200 kartų. Vertinama 100 spermatozoidų, 2 kartus skaičiuojant žalius (gyvus) ir raudonus (negyvus) spermatozoidus. Apskaičiuojamas rezultatų vidurkis ir nustatomas bendras spermatozoidų gyvybingumas procentais.
2.5. Spermatozoidų morfologiniai pakitimai
Spermatozoidų galvučių ir uodegėlių patologijos buvo vertinamos atskirai. Tam, kad būtų tinkamai įvertintos galvučių patologijos, spermatozoidai buvo dažomi metileno mėlynaisiais dažais pagal gamintojo instrukcijas (Sperm Blue, MICROPTIC S.L., Ispanija). Pirmiausia ant objektinio stiklelio padaromas tepinėlis ir jis džiovinamas ore, stiklelis yra merkiamas į fiksavimo tirpalą ir 10 min. laikomas. Toliau stiklelis 20 – 30 min. yra merkiamas į dažus. Po šio etapo nudažytas stiklelis 3 sekundėms įmerkiamas į distiliuotą vandenį ir tuomet išdžiovinamas ore. Mikroskopavimui naudotas fazių kontrastinis mikroskopas (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija), su 1000 kartų padidinimu ir imersija.
26 Spermatozoidų uodegėlių patologijoms vertinti buvo naudotas Hancock‘o (šlapio preparato) metodas. Sperma skiedžiama 1:10 santykiu buferiniu formalino tirpalu. Tuomet lašas atskiestos spermos (5 – 10 µl) dedamas ant objektinio stiklelio ir uždengiamas dengiamuoju stikleliu. Stiklelis lengvai nusausinamas naudojant filtrinį popierių. Kelias minutes spermetozoidams yra leidžiama nusėsti ant stiklelio dugno ir tuomet mikroskopuojama fazių kontrastiniu mikroskopu (Olympus BH2, Olympus Optical Co., Ltd., Japonija), 400 kartų padidinant. Uodegėlių patologijos vertinamos skaičiuojant 200 spermatozoidų iš įvairių tepinėlio vietų. Prie šių patologijų priskiriami proksimaliniai ir distaliniai lašeliai, spermatozoidų galvutės be uodegėlių, akrosomų pakitimai ir defektai, vakuolės, paprastai susisukusios, dvigubai sulinkusios, susisukusios po galva uodegėlės. Apskaičiuojamas bendras uodegėlių patologijų procentas. Tuomet apskaičiuojamas bendras kitų patologijų procentas ir galiausiai bendras visų patologijų (galvučių, uodegėlių ir kitų) kiekis procentais.
2.6. Statistiniai skaičiavimai
27
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1. Atšildytos ožių spermos spermatozoidų koncentracijos vertinimas
Įvertinus visų ožių šaldytos spermos koncentraciją iš karto po atšildymo buvo nustatyta, kad vidutinis spermatozoidų kiekis dozės mililitre buvo 424,71 ± 15,11 × 106 spermatozoidų, o spermos
dozėje – 106 × 106 spermatozoidų. Atskirai vertinant Alpių veislės ožių spermos koncentraciją, šios
veislės ožių vidurkis buvo 34,29 proc. didesnis(459,00 ± 2,31 × 106 dozės mililitre) (p < 0,05) nei
visų ožių koncentracijos vidurkis, spermatozoidų koncentracija dozėje – 114,75 × 106
spermatozoidų. Taip pat vertinant Zaaneno veislės ožių spermą, po atšildymo spermatozoidų koncentracija dozės mililitre buvo 25,71 proc. mažesnė (399,00 ± 16,79 × 106 dozės mililitre) (p < 0,05) nei visų ožių vidurkis, Zaaneno ožių vidutinės spermatozoidų koncentracija dozėje – 99,75 × 106 spermatozoidų. Zaaneno veislės ožių spermos koncentracijos vidurkis buvo 60 × 106 spermatozoidų dozės mililitre mažesnis nei Alpių veislės ožių. Iš visų tirtų ožių spermos mėginių didžiausia nustatyta dozės koncentracija po atšildymo buvo Alpių veislės ožio – 463,00 × 106
spermatozoidų kiekis dozės mililitre, o mažiausia nustatyta Zaaneno veislės ožio – 365,00 × 106
spermatozoidų dozės mililitre. Spermatozoidų koncentracijos vidurkiai pateikiami 2 pav.
2 pav. Spermatozoidų koncentracijos mililitre ir spermos dozėje palyginimas tarp Alpių ir Zaaneno
veislių bei bendro visų tirtų ožių koncentracijos vidurkių
90 95 100 105 110 115 120 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470
Visi ožiai Alpių veislė Zaaneno veislė
K on ce nt ra ci ja x 10 6 do zė je (0 ,25 m l) K on ce nt ra ci ja x 106 do zė s m l
28
3.2. Spermatozoidų judrumas ir judėjimo parametrai vertinant subjektyviu
(mikroskopu) metodu ir objektyviu (SCA)
Subjektyviai vertinant spermatozoidų judrumą (mikroskopuojant) po atšildymo buvo nustatyta, jog bendras visų ožių spermatozoidų judrumo vidurkis buvo 57,14 proc. (± 1,55 proc.), po 2 valandų inkubavimo parametras buvo 6,43 proc. mažesnis (50,71 ± 4,17 proc.) (p < 0,05). Alpių veislės subjektyvus spermatozoidų vidurkio įvertinimas tiek po atšildymo, tiek praėjus 2 valandoms buvo toks pat – 60,00 ± 1,15 proc. Tarp Zaaneno veislės ožių šis rodiklis po atšildymo buvo 55,00 ± 2,04 proc., o praėjus 2 valandoms – 11,25 proc. mažesnis (43,75 ± 4,73 proc.) (p < 0,05). Alpių veislės ožių judrumo vidurkis po atšildymo buvo 5 proc. didesnis nei Zaaneno ir 2,86 proc. didesnis nei bendras ožių vidurkis (p < 0,05). Praėjus 2 valandoms inkubavimo, šis Alpių ožių rodiklis, vis dar buvo aukščiausias – 16,25 proc. didesnis nei Zaaneno ir 9,29 proc. didesnis nei bendras visų ožių vidurkis (p < 0,05).
Analizuojant spermatozoidų judrumą objektyviu (SCA) metodu, programa apskaičiavo, jog vidutinis visų ožių bendras judrumo vidurkis buvo 96,80 ± 1,15 proc. iš karto po atšildymo. Reiktų atkreipti dėmesį, jog šiuo atveju buvo registruojami visi judantys spermatozoidai (progresyviai ir neprogresyviai) (3 pav.).
29
3 pav. Spermatozoidų judrumo vertinimas iš karto po atšildymo ir praėjus 2 valandoms
inkubacijos 37°C temperatūros vandens vonelėje naudojant objektyvų (SCA) ir subjektyvų (mikroskopavimą) metodą
4 pav. Spermatozoidų progresyvaus judėjimo vertinimas iš karto po atšildymo ir praėjus 2
valandoms inkubacijos 37°C temperatūros vandens vonelėje naudojant objektyvų (SCA) metodą
0 20 40 60 80 100 120
Visi ožiai Alpių veislė Zaaneno veislė
Spe rm at oz oi dų judr um as , pr oc .
Objekt. po 5 min Objekt. po 2 val. Subjekt. po 5 min. Subjekt. po 2 val.
0 10 20 30 40 50 60 70
Visi ožiai Alpių veislė Zaaneno veislė
30
3.3. Spermatozoidų gyvybingumo vertinimas su eozino – nigrozino dažais ir
Sybr–14/PI po atšildymo ir praėjus 2 val. inkubacijos 37°C temperatūros
vandens vonelėje
Vertinant visų ožių spermatozoidų membranos vientisumo rodiklį naudojant eozino – nigrozino dažus buvo nustatyta, jog iš karto po atšildymo vidutinis spermatozoidų, su nepažeistomis plazmos membranomis, procentas buvo 68,00 ± 2,50 proc. Toks pats vidurkis buvo apskaičiuotas vertinant Alpių ir Zaaneno veislių ožių spermatozoidų gyvybingumą (Alpių – 68,00 ± 2,31 proc., Zaaneno 68,00 ± 4,38 proc.). Bendras visų ožių membranos vientisumo parametras po 2 valandų inkubavimo vandens vonelėje sumažėjo 11,29 proc. (56,71 ± 4,93 proc.) (p < 0,05). Atskirai vertinant ožių veislių spermatozoidų gyvybingumo rodiklį, buvo nustatyta, jog Alpių veislės ožių spermatozoidų plazminės membranos vientisumas po atšildymo praėjus 2 valandoms buvo pažeistas mažiau nei Zaaneno veislės ožių spermatozoidų. Alpių veislės ožių vidurkis po 2 valandų inkubavimo vandens vonelėje nukrito 4 proc. (iki 64 ± 1,15 proc.), o Zaaneno veislės – 16,75 proc. (iki 51,25 ± 7,82 proc.) (p < 0,05) (5 pav.). Maksimalus užfiksuotas gyvybingumo rodiklis buvo Zaaneno veislės ožio (74,00 proc.), mažiausia reikšmė taip pat priklauso Zaaneno veislės ožiui – 55,00 proc.
31
5 pav. Spermatozoidų gyvybingumo (membranos vientisumo) vertinimas iš karto po atšildymo
ir praėjus 2 valandoms inkubacijos 37°C temperatūros vandens vonelėje naudojant eozino – nigrozino dažus
6 pav. Spermatozoidų gyvybingumo (membranos vientisumo) vertinimas iš karto po atšildymo
ir praėjus 2 valandoms inkubacijos 37°C temperatūros vandens vonelėje naudojant fluorescencinius SYBR–14/PI dažus
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Visi ožiai Alpių veislė Zaaneno veislė
Spe rm at oz oi dų gy vy bi ngum as , pr oc .
Iš karto po atšildymo Praėjus 2 val. inkubacijos
65 70 75 80 85 90
Visi ožiai Alpių veislė Zaaneno veislė
Spe rm at oz oi dų gy vy bi ngum as , pr oc .
32
3.4. Spermatozoidų morfologinių pakitimų vertinimas
Atlikus morfologinius spermatozoidų tyrimus ožių spermoje, buvo nustatyta, kad vidutinis bendras patologinių spermatozoidų kiekis vienoje spermos dozėje po atšildymo buvo 9,43 ± 2,80 proc. Vidutinis bendras spermatozoidų su patologiniais galvučių pakitimais procentas siekė 2,43 ± 0,30 proc. (nuo 1 iki 4 proc. vienoje spermos dozėje). Dažniausiai pasitaikiusi spermatozoidų galvučių patologija buvo nenormalių kontūrų galvutė (1.43 ± 0,30 proc.). Vidutinis bendras spermatozoidų su patologinėmis uodegėlėmis kiekis vyravo nuo 1 iki 4 proc. vienoje spermos dozėje (nustatytas vidurkis 1,86 ± 0,51 proc.). Iš pakitimų susijusių su uodegėlėmis daugiausia pasitaikė vidurinės dalies patologijų (1,14 ± 0,34 proc.). Vidutinis bendras spermatozoidų su kitomis patologijomis kiekis buvo 5,14 ± 2,11 proc., iš šių pakitimų daugiausia pasitaikė palaidos patologinės galvutės (1,71 ± 0,57 proc.) (7 ir 8pav.).
Daugiausia buvo rasta kitų spermatozoidų pakitimų (proksimaliniai ir distaliniai lašeliai, palaidos patologinės galvutės, akrosomos pakitimai ir defektai bei vakuolės). Toliau pateikiami kiekvienos spermatozoidų patologijų grupės rasti pakitimai skirtingose pakitimų grupėse įvertinti procentais (9a, 9b, 9c pav.).
7 pav. Spermatozoidų morfologinių pakitimų vertinimas veislių atžvilgiu 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Visų ožių Alpino veislė Zaaneno veislė
Pa to lo gi jų spe rm os do zė je v idur ki s, pr oc .
33
8 pav. Bendras spermatozoidų morfologinių pakitimų vidurkis spermos dozės mililitre
9a pav. Spermatozoidų morfologiniai galvučių pakitimai pakitimų tipų atžvilgiu įvertinti
procentais (patologijos, kurių nebuvo rasta – neįtrauktos į diagramą)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 Visi ožiai Alpių veislė Zaaneno veislė Procentai 0,08 proc. 0,67 proc. 0,04 proc. 0,08 proc. 0,08 proc. 0,04 proc.
Siauro pagrindo galvutės Nenormalių kontūrų galvutės Neišsivysčiusios galvutės Siauros galvutės
Didelės galvutės
34
9b pav. Spermatozoidų morfologiniai uodegėlių pakitimai patologijų tipų atžvilgiu įvertinti
procentais (pakitimai, kurių nebuvo rasta – neįtrauktos į diagramą)
9c pav. Kiti morfologiniai spermatozoidų pakitimai patologijos tipų atžvilgiu įvertinti procentais
(pakitimai, kurių nebuvo rasta – neįtrauktos į diagramą) 0,59 proc. 0,23 proc.
0,09 proc.
0,09 proc. Vidurinės dalies pakitimai
Paprastai suktos uodegėlės Uodegėlės susisukusios po galvute
Dvigubai sulinkusios uodegėlės
0,13 proc. 0,22 proc. 0,39 proc. 0,26 proc. Proksimaliniai lašeliai Distaliniai lašeliai
35
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Šio darbo tikslas buvo įvertinti ožių spermos kokybinius rodiklius po spermos atšildymo bei praėjus 2 valandoms inkubavimo 37°C temperatūroje. Taip pat palyginti gautus rezultatus tarp dviejų tirtų ožių veislių. Iš viso ištirta 14 spermos mėginių, 2 šiaudeliai kiekvieno patino spermos (4 Zaaneno ir 3 Alpių veislės). Buvo analizuojami šie parametrai: spermatozoidų koncentracija, spermatozoidų judrumas ir progresyvus judėjimas, spermatozoidų gyvybingumas ir spermatozoidų morfologinių patologijų pasireiškimas.
Pagal 1999 metais Karagiannidis A. et. al (19) atliktus Alpių ir Zaaneno ožių veislių spermos tyrimus, Alpių veislės ožiai produkuoja didesnį kiekį (tiek tūriu, tiek spermatozoidų skaičiumi vienoje dozėje), bet prastesnės kokybės (bendrų judrių spermatozoidų skaičius, spermatozoidų progresyvaus judėjimo procentas, didesnis procentas pakitusios morfologijos spermatozoidų) spermos. Pagal mūsų atliktus tyrimus, po kriokonservuotos spermos atšildymo, Alpių veislės ožių sperma visais aspektais (koncentracijos, judrumo, progresyvaus judėjimo, gyvybingumo ir morfologijos) buvo geresnės kokybės nei tirtų Zaaneno ožių sperma.
Pagal atliktus tyrimus galima matyti, jog po spermos kriokonservavimo ir atšildymo vidutinė tirtų ožių spermatozoidų koncentracija yra 424,71 ± 15,11 × 106 spermatozoidai dozės mililitre arba
106,18 × 106 spermatozoidų spermos dozėje. Mokslinėje literatūroje teigiama, jog sėkmingas sėklinimas (didesnis nei 60 proc.) gali būti pasiekiamas naudojant mėginius su 100 × 106
spermatozoidų koncentracija viename dozės mililitre (55). Atsižvelgiant į vykdytą tyrimą, tirta sperma po atšildymo buvo nuo 4,25 karto didesnės koncentracijos nei minimali reikalinga užtikrinti sėkmingą apsėklinimą. Pagal kitą mokslinį šaltinį, 15 Zaaneno ožių vidutinė šaldytos (skiesta kiaušinio pagrindo skiedikliu su gliceroliu) spermos koncentracija po atšildymo buvo 407,3 ± 129,3 × 106 (25), pagal mūsų atliktus tyrimus, šis rodiklis buvo 17,41 proc. didesnis (p < 0,05).
Pagal 1999 metais atliktus šviežios spermos kokybinius tyrimus, buvo nustatyta, jog Zaaneno veislės ožių spermoje judrių spermatozoidų buvo 64,40 proc., o Alpių – 59,88 proc. (19). Pagal mūsų tyrimo duomenis rezultatai išsiskyrė. Zaaneno veislės ožių judrumas buvo 9,4 proc. mažesnis, o Alpių – 5,12 proc. didesnis nei nagrinėtame šaltinyje (p < 0,05). Derėtų atsižvelgti, jog ankstesnieji tyrimai buvo atlikti su šviežia sperma, dėl šios priežasties tokie vidurkių skirtumai neatrodo keliantys susirūpinimą platinamos spermos kokybe.
36 Mūsų atliktų tyrimų duomenimis Zaaneno veisės ožių spermatozoidų membranos vientisumas po atšildymo buvo 68 ± 4,38 proc., tuo tarpu pagal Vidal A.H. et al. (57) atliktus ožių spermos tyrimus, šis parametras buvo 22,83 proc. mažesnis (45,17 ± 14,74 proc.) (p < 0,05). Labiau mūsų tyrimo rezultatus atitinkantis buvo šviežios spermos gyvybingumo procentas – 65,75 ± 2,89 proc., kuris buvo 2,25 proc. mažesnis (p < 0,05) nei mūsų nustatytas.
Atsižvelgiant į 1999 tirtus šviežios spermos tyrimus analizavusius spermatozoidus su morfologinėmis patologijomis, buvo nustatyta 8,41 proc. patologinių spermatozoidų Zaaneno veislės spermoje ir 10,27 proc. Alpių ožių spermoje. Lyginant su mūsų skaičiavimais, Zaaneno veislės spermoje spermatozoidų patologijų rasta 14 ± 3,24 proc. (5,59 proc. daugiau (p < 0,05)). Taip pat vertinant Alpių veislės rezultatus– rodiklis buvo 6,94 proc. mažesnis (3,33 ± 1,20 proc.) (p < 0,05) nei matavimų pateiktų mokslinėje literatūroje (19).
37
IŠVADOS
1. Visų tirtų ožių spermatozoidų koncentracijos vidurkis po atšildymo buvo 424,71 ± 15,11 × 106 spermatozoidai dozės mililitre. Geriausi rezultatai buvo Alpių ožių spermos tyrimų –
459,00 ± 2,31 × 106 spermatozoidai dozės mililitre (34,29 proc. didesnis nei bendras visų
ožių ir 60 proc. didesnis nei Zaaneno veislės ožių vidurkis (p < 0,05)).
2. Po atšildymo visų ožių bendras spermatozoidų judrumo vidurkis buvo 57,14 ± 1,55 proc. Alpių veislės ožių spermos judrumas abiejų tyrimų metu buvo didesnis (60 ± 1,15 proc.) ir nekito, lyginant su Zaaneno veislės ožių rezultatais. Vidutinis visų ožių spermatozoidų progresyvus judėjimas po atšildymo buvo 52,57 ± 2,19 proc. Iš karto po atšildymo ir praėjus 2 valandoms inkubavimo geresni spermatozoidų progresyvaus judėjimo rezultatai buvo nustatyti tiriant Alpių veislės ožių spermą.
3. Analizuojant spermatozoidų gyvybingumą mėginius dažant eozino nigrozino dažais, apskaičiuotas vidutinis visų ožių spermos gyvybingumas – 68,00 ± 2,50 proc. Praėjus 2 valandoms inkubavimo 37°C temperatūros vandens vonelėje Alpių ožių spermos gyvybingumas buvo paveiktas mažiau nei Zaaneno. Tą patį rodiklį analizuojant su SYBR– 14/PI gauti šiek tiek kitokie rezultatai: bendras gyvybingumo vidurkis po atšildymo 81,57 ± 2,85 proc. Alpių ožių gyvybingumo procentas nustatytas didesnis (7,72 proc. (p < 0,05)) nei Zaaneno ožių spermos rodiklis.
38
REKOMENDACIJOS
1. Siekiant gauti aukščiausius sėklinimo rezultatus naudojant šaldytą spermą, rekomenduojama augintojams reguliariai tirti reproduktorių spermą prieš ir po spermos kriokonservavimo.
39
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. HaenleinG.F.W.About the evolution of goat and sheep milk production.Small Rumin Res. 2007. ISSN: 0921-4488; 68(1–2): 3 – 6.
2. Amoah E.A., GelayeS.Biotechnological Advances in Goat Reproduction. Journal of Animal Science, 1997.https://doi.org/10.2527/1997.752578x; 75(2): 578.
3. Pulina G., M.J. Milan, Lavin M.P., Theodoridis A., Morin E., Capote J. et al.Current production trends, farm structures, and economics of the dairy sheep and goat sectors. J Dairy Sci. 2018. ISSN: 00220302; 101(8): 6715 – 30.
4. Valstybinė gyvulių veislininkystės priežiūros tarnyba prie Žemės Ūkio Ministerijos.2017 metų tarnybos veiklos ataskaita (Vilnius), Nr. 3R–1. 2018.
5. 5.Europos Bendrijų Taryba.Tarybos direktyva nustatanti gyvūnų sveikatos reikalavimus, reglamentuojančius prekybą Bendrijoje gyvūnais. Europos Sąjungos oficialus leidinys, 1992. 01992L0065-20130718.
6. Lietuvos standartizacijos departamentas.Bulių sperma. Bendrieji reikalavimai. (Vilnius), 2006. LST 1467:2006.
7. Clark S., Garcia M.B.M. A 100-Year Review: Advances in goat milk research., J Dairy Sci. 2017. ISSN: 0022-0302; 100(12): 10026 – 44.
8. Shipley C.F.B., Buckrell B.C., Mylne M.J.A. Artificial Insemination and Embryo Transfer in Sheep. In: Threlfall W.R. Younhquist R.S. Current therapy in large animal theriogenology, 2nd edition. Saunders - Elsevier; 2007. p. 629 – 41.
9. Solaiman S. G. Goat Science and Production. Wiley - Blackwell, 2010.
10. Glowatzki-Mullis M.L., Muntwyler J., Baumle E., Gaillard C. Genetic diversity measures of Swiss goat breeds as decision-making support for conservation policy. Small Rumin Res. 2008. ISSN: 0921-4488; 1(74): 202 – 11.
11. Umar S., Ahmad M., Ahmad I., Zubair M., Umar Z., Quereshi A.S.et al. Correlation of biochemical constituents of seminal plasma with semen quality in Teddy goat (Capra hircus) bucks. Andrologia, 2018. ISSN: 0303-4569.50(3).
12. Zarazaga L.A., Guzman J.L., Dominguez M.C., Perez M.C., Prieto R. Effect of plane of nutrition on seasonality of reproduction in Spanish Payoya goats. Anim Reprod Sci, 2005. ISSN: 0378-4320; 87(3): 253 – 67.
13. Pugh D. G., BairdA. N. Sheep and Goat Medicine, 2nd edition. Elsevier, 2012. 14. Harwood D., Mueller K. Goat medicine and Surgery. CRC Press, 2018.
