LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Tomas Paškevičius
Kuilių spermos kokybės kitimas skirtingomis jos
laikymo sąlygomis
Changes in the quality of boar sperm under different
conditions of storage
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: dr. Neringa Sutkevičienė
DARBAS ATLIKTAS STAMBIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO
SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „ Kuilių spermos kokybės kitimas skirtingomis jos laikymo sąlygomis“:
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
Tomas Paškevičius
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Tomas Paškevičius
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
TURINYS
SANTRUMPOS ... 4 SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 ĮVADAS ... 7 1.LITERATŪROS APŽVALGA ... 9 1.1. Spermatozoido sandara ... 9 1.2. Skiedikliai ... 11 1.3. Šalčio šokas ... 131.4. Spermatozoidų skaičius dozėje ... 13
1.5. Spermatozoidų judrumas ... 14
1.5.1. Subjektyvus judrumo vertinimas ... 14
1.5.2. Objektyvus judrumo įvertinimas ... 14
1.5.3. Spermos kokybės įvertinimas (SQA) ... 15
1.5.4. Spermos kokybės analizatorius (SQA-Vp) ... 15
1.6. Morfologija ir gyvybingumas ... 16
2.TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI ... 17
2.1. Spermatozoidų judrumo nustatymas ... 17
2.2. Spermatozoidų gyvybingumo nustatymas dažant eozino – nigrozino dažais ... 18
2.3. Spermos pH tyrimai ... 19
2.4. Spermatozoidų koncentracijos tyrimai ... 19
2.5. Patologinių spermatozoidų kiekio nustatymas – morfologiniai tyrimai ... 19
2.6. Spermatozoidų dažymas Sperm Blue dažais ... 19
2.7. Statistinė duomenų analizė. ... 20
3.TYRIMŲ REZULTATAI ... 21
3.1. Spermatozoidų judrumo palyginimas laikant spermos dozes 72h skirtingos temperatūros sąlygomis 21 3.2. Spermatozoidų judrumo, nustatyto kompiuterine SCA programa, palyginimas laikant spermos dozes 72 val. skirtingos temperatūros sąlygomis ... 26
3.3. Spermatozoidų pH palyginimas laikant spermos dozes 72h skirtingos temperatūros sąlygomis ... 31
3.4. Spermatozoidų gyvybingumo palyginimas laikant spermos dozes 72h skirtingos temperatūros sąlygomis ... 36
3.5. Spermatozoidų patologijos ir koncentracija ... 41
3.6. Spermos kokybės parametrų koreliaciniai ryšiai……… IŠVADOS ... 45
REKOMENDACIJOS ... 46
PADĖKA ... 47
SANTRUMPOS
AMP - antimikrobiniai peptidai ATP - adenozino trifosfatas
CASA - (Computer Assisted Sperm Analyzer) – kompiuterinė spermos analizės programa DA - dirbtinis apvaisinimas
DNR - dezoksiribonukleorūgštis H (HIGH) - aukšta temperatūra
HEPES – buferinis skiediklis (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfato rūgštis) K (CONTROL) - kontrolinė temperatūra
L (LOW) - žema temperatūra
ROS - reaktyvus deguonies radikalas
SCA - judrumo nustatymas kompiuterine programa SQA-Vp - spermos kokybės analizatorius
SANTRAUKA
Kuilių spermos kokybės kitimas skirtingomis jos laikymo sąlygomis
Tomas PaškevičiusMagistro baigiamasis darbas
Šio darbo tikslas buvo nustatyti temperatūros įtaką spermatozoidų gyvybingumo, judrumo ir pH kitimui per 72 valandas, įvertinti patologinius spermatozoidus bei apskaičiuoti jų koncentraciją.
Tyrimas atliktas 2017 metais LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje. Numatytiems tyrimams atlikti iš kuilių spermos gamybos įmonės gauta 50 šviežios skiestos kuilių spermos dozių. Atlikus pradinius tyrimus (nustačius pradinį judrumą, gyvybingumą, pH, įvertinus spermatozoidų koncentraciją ir morfologinius pakitimus) mėginys buvo padalintas į tris dalis ir 72 val. inkubuotas skirtingose temperatūrose: 16 ± 0,5oC; 4 ± 0,5oC ir 25 ± 0,5oC. Spermatozoidų judrumo, pH ir gyvybingumo tyrimai kiekviename skirtinguose temperatūriniuose režimuose inkubuotame mėginyje buvo atlikti dar dukartus: po 6 val. ir po 72 val.
Spermatozoidų judrumas buvo nustatomas subjektyviai (mikroskopuojant) ir objektyviai (kompiuterine spermos judrumo vertinimo programa SCA). Spermatozoidų gyvybingumui įvertinti buvo naudoti eozino - nigrozino dažai. H jonų koncentracija skiestoje kuilių spermos dozėje buvo nustatoma elektroniniu pH-matuokliu.
Didžiausias spermatozoidų judrumas po 72 val. nustatytas mėginiuose, inkubuotuose kontrolinėje 16oC temperatūroje, tiek mikroskopuojant (67,30 ± 1,13 proc.; p < 0,05), tiek SCA
programa (88,02 ± 1,44 proc.; p > 0,05). Didžiausias spermatozoidų gyvybingumas po 72 val. taip pat išliko mėginiuose, inkubuotuose kontrolinėje 16oC temperatūroje (78,3 ± 2,17 proc.; p > 0,05). Spermos pH po 72 val. labiausiai pakito mėginiuose, inkubuotuose 4oC temperatūroje, ir siekė 7,4 ± 0,01. Nustatytas statistiškai patikimas stiprus koreliacinis ryšys tarp atskirų spermatozoidų judrumo, gyvybingumo ir pH parametrų (p < 0,05).
SUMMARY
Changes in the quality of boar sperm under different conditions of storage
Tomas PaškevičiusMaster’sThesis
The aim of this thesis was to determine the effect of temperature on changes in viability, mobility and pH of spermatozoa over 72-hour period. To evaluate pathological spermatozoa and calculate their concentration.
The study was conducted in 2017 in LSMU VA Animal Reproduction Laboratory. The intended study involved 50 doses of fresh diluted boar sperm obtained from boar sperm production company. After initial studies (determination of initial mobility, vitality, pH, evaluation of spermatozoa concentration and morphological changes), the sample was divided into three parts and incubated at different temperatures: 16 ± 0,5 oC; 4 ± 0,5 oC and 25 ± 0,5 oC 72 hours. Investigations of sperm motility, pH, and vitality in each sample, incubated in different temperature regimes, were performed twice more: after 6 and 72 hours.
The sperm motility was determined subjectively (by microscopy) and objectively (computerized sperm motility analysis SCA). Sperm viability assessment was carried out using Eosin – Nigrosin staining technique. H ion concentration in the diluted boar sperm dose was determined by an electronic pH meter.
Maximum sperm mobility after 72 hours was determined in samples incubated at a control temperature of 16oC both by using microscopy (67,30 ± 1.13 %; p < 0,05) and SCA program (88,02 ± 1.44 %; p > 0,05). Maximum sperm viability after 72 hours also remained in samples incubated at a control temperature of 16oC (78,3 ± 2.17 %; p > 0,05). The highest change in sperm pH after 72 hours was found in samples incubated at 4°C and reached 7,4 ± 0,01. A statistically reliable correlation between individual sperm mobility, viability and pH parameters was established.
ĮVADAS
Per pastaruosius dešimtmečius, naudojant kuilių šviežią praskiestą spermą, dirbtinis apvaisinimas (DA) smarkiai patobulėjo. Palyginti su natūraliu kergimu, DA sumažina ligų perdavimo riziką [1]. Visame pasaulyje per metus apsėklinama virš 25 milijonų kiaulių. Europoje nustatyta, kad apie 80-90 proc. veisiamų kiaulių yra apsėklinamos [2]. Jau 1970m. buvo pradėtas kiaulių sėklinimas, o 1990 m. buvo sukurtas pirmasis spermos skiediklis, kuris galėdavo spermos gyvybines funkcijas išlaikyti iki 7 dienų [3]. Viena iš priežasčių, dėl ko vartotojai pradėjo kelti aukštesnius reikalavimus kiaulienos kokybei - liesesnės kiaulienos poreikis. Sėklinimo metodo panaudojimas gerokai pagreitino genetinį procesą ir leido žymiai efektyviau panaudoti genetiniu požiūriu vertingiausius kuilius, mažinant riebalų kiekį skerdienoje. Šiuo metu plačiausiai naudojamas sėklinimas atvėsinta (t.y., nekriokonservuota) kuilių sperma.
Kuilių sperma yra labai jautri šaltai temperatūrai dėl skirtingų fosfolipidų išsidėstymo spermos membranoje, lyginant su kitomis gyvūnų rūšimis [4]. Skiedžiant kuilių spermą, spermos temperatūra palaipsniui mažėja, kad išvengtų šalčio šoko. Dirbtiniame apvaisinime dažniausiai naudojami du skirtingi praskiedimo metodai: 1) pirmo tipo praskiedimas su iš anksto pašildytu skiedikliu (~ 33°C) arba laikant kambario temperatūroje; 2) pirmąkart praskiedžiama santykiu 1:1, po to dar kartą praskiedžiama (~ 33°C) skiedikliu arba laikoma kambario temperatūroje [5].
Kuiliai turi didelį poveikį kiaulių veislinių bandų reprodukcinei naudai. Priklausomai nuo surinkimo dažnio ir sėklinimo dozės, vieno kuilio sperma gali būti naudojama veisiant nuo 750 iki 1000 paršavedžių per metus. Rezultatas - vieno patino prastos reprodukcinės savybės daro įtaką visam būriui kiaulių.
Kuilių sperma paprastai surenkama specialiose spermos gamybos įmonėse. Čia atliekami svarbiausi spermos kokybės tyrimai, sperma skiedžiama, fasuojama į dozes ir pristatoma kiaulininkystės įmonėms, kur panaudojama paršavedžių sėklinimui. Spermos dozės į ūkius vežamos tiek atskiru transportu, tiek siunčiamos tarpmiestinių maršrutų autobusais, kada kelionė užtrunka iki 6 val. Spermos dozės ransportuojamos tam skirtose termodėžėse ir labai karštomis vasaros, ir šaltomis žiemos dienomis.
Literatūroje mažai duomenų apie spermos transportavimo skirtingose temperatūrose įtaką pačių spermatozoidų kokybei ir gyvybingumui, todėl reikėjo detalesnio tyrimo.
Darbo tikslas: atlikti šviežios skiestos kuilių spermos kokybės tyrimus, laikant spermos dozes skirtingomis temperatūrinėmis sąlygomis.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti spermatozoidų judrumo pokyčius laikant spermos dozes 72 val. skirtingomis temperatūrinėmis sąlygomis.
2. Įvertinti spermatozoidų gyvybingumo pokyčius laikant spermos dozes 72 val. skirtingomis temperatūrinėmis sąlygomis.
3. Įvertinti spermos pH pokyčius laikant spermos dozes 72 val. skirtingomis temperatūrinėmis sąlygomis.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Spermatozoido sandara
Spermatozoidus (iš graikų kalbos „ spermatozoidas “ sperma – sėkla, zoon – gyvulys , eidos – panašus) [6].
Atradus spermatozoidus iš karto buvo pradėta tirti ir jų sudėtis. Spermatozoidas pradėtas laikyti ląstele 1865m., kadangi jis atsiranda iš ląstelės ir turi visas jos dalis [7].
Kuilio spermatozoidų galvutės yra ovalios lygios formos. Užpakalinės galvutės dalyje yra branduolys, o priekinėje - akrosoma, kuri kartu su branduoliu yra padengta plona citoplazmos membrana. Branduolys užima didžiausią galvutės dalį [8].
Visa spermatozoido uodegėlė yra apsupta protoplazmos, išskyrus uodegėlės galiuką, ir sudaryta iš pagrindinės gijos. Ašinė uodegėlės dalis apsupta spirale, kuri yra atspari įvairiems tirpalams. Ši spiralė atsakinga už spermatozoido uodegėlės sutvirtinimą ir nesumažina jos lankstumo.
Spermatozoido kūnelis susideda iš pagrindinės gijos, kuri yra apsupta protoplazmos ir spiralinės gijos. Pagrindinė gija susideda iš 20 fibrilių, iš kurių 18 išsidėsčiusios ratu aplink centre esančias dvi fibriles. Kiekviena fibrilė susideda iš tvirtai sujungtų plonos vidurinės ir storos išorinės dalių [9].
Kuilių spermatozoidų bendras ilgis 50 µm. Galvutės ilgis 8,7 µm. Plotis 5,2 µm. Storis 1,4 µm. Spermatozoido masė: 34-42 milijonai sausos buliaus spermos arba 11-12 milijonų neišdžiovintų spermatozoidų sveria 1 mg. Spermatozoido galvutė sudaro apie 50%, kūnelis - 15% ir uodegėlė - 35% spermatozoido masės. 1 ml yra apie 12 milijardų spermatozoidų.
Pagrindinės spermatozoidų savybės: 1. Judėjimas.
2. Išsilaikymo trukmė. 3. Apvaisinimo galia.
Kai spermatozoiduose būna nenormali akrosoma, per didelis arba per mažas dezoksiribonukleininės rūgšties kiekis, tai spermatozoidai neturi apvaisinimo galios arba ji yra labai silpna [10].
Prie 0 laipsnių temperatūros spermatozoidai gyvena 80-100 kartų ilgiau nei prie 40°C. Staigiai bandant atšaldyti šviežią spermą iki 0°C temperatūros, daugelis spermatozoidų žūdavo temperatūrai nukritus 15-18 laipsnių žemiau. Šalčio smūgis - staigus spermatozoidų žuvimas atšaldžius spermą iki 15-18 laipsnių temperatūros. Atšaldžius iki 10°C spermatoziodai tampa ypač jautrūs šalčio smūgiui.
1. Sulėtintas atšaldymas.
2. Į skiediklį pridedant lipoproteinų (dažniausiai naudojamas būdas praktikoje). 3. Trijų valandų spermos laikymas kambario temperatūroje.
Labai aukštai temperatūrai spermatozoidai nėra atsparūs. Pvz., 45-47 °C spermatozoidai praranda apvaisinimo galią, 52-53 °C - visiškai nustoja judėti. Pasak V. Milovanovo, nukritus temperatūrai, spermatozoidai nepradeda judėti dėl baltymų koaguliacijos ir fermentų suirimo.
Idealus spermos išlaikymo pavyzdys (atvėsinant ar šaldant) yra, kuomet išlaikoma aukšta spermos koncentracija, mažas sėklinės plazmos bei spermatozoidų santykis ir didelis kiekis progresyviai judrios spermos su maža morfologinių patologijų tikimybe. Tai galima įvykdyti palaikant kuilio spermos surinkimo dažnumą (pakankamas poilsio dienų skaičius prieš paėmimą), gaunant optimalų ejakuliatą su norimomis charakteristikomis ir ribojant seksualinę stimuliaciją prieš surinkimą.
Faktoriai, galintys neigiamai veikti spermos judrumą:
1. Toksiškos nuosėdos ant surinkimo įrangos, pvz., muilo likučiai ir mineralai čiaupo vandenyje. Norint to išvengti, rekomenduojama naudoti spermos konteinerius. Norint pašalinti nuosėdas nuo daugkartinio naudojimo latekso įdėklų, šie turi būti kruopščiai skalaujami ir valomi distiliuotu vandeniu.
2. Spermos užteršimas aukšto osmosinio slėgio vandenyje tirpstančiais lubrikantais.
To galima išvengti naudojant vandenyje tirpius lubrikantus, osmosiškai subalansuotus su sperma. Taip pat naudojant minimalius lubrikanto kiekius ir keičiant sėklos surinkimo konteinerius po kiekvieno nesėkmingo mėginimo (kuomet ejakuliatui surinkti reikalingi keli bandymai).
3. Temperatūros šokas. Jis įvyksta dėl spermos paveikimo per aukšta ar per žema temperatūra. Derėtų apsaugoti surinktą spermą nuo didesnių temperatūros pokyčių negu optimali 34-37°C temperatūra, nes spermatozoidai yra labai jautrūs karščio ir šalčio šokui prieš spermą atskiedžiant. Po skiedimo sperma neturėtų būti brandinama 37°C temperatūroje, nes tai mažina judrumą.
4. Pernelyg didelis užteršimas bakterijomis. Ypač svarbu laikytis tinkamos higienos surenkant ejakuliatą, siekiant išvengti užteršimo bakterijomis dėl netinkamo naudojamos įrangos valymo (fantomo, plovimo indo ir t.t.).
Tikslesnis ir objektyvesnis kompiuterinis spermos judrumo analizatorius (spermograma, angl. CASA) gali būti naudojamas siekiant nustatyti procentinį judrumą, taip pat greitį ir daugelį kitų kinetinių savybių. Egzistuoja kitos spermos kokybės analizės, tačiau jos nėra dažnai naudojamos, kai sperma yra apdorojama norint atšaldytą transportuoti. Sėkmingas atvėsintos
kuilio spermatozoidų gebėjimo išgyventi žemoje temperatūroje ir kelių kitų sėklos apdorojimo faktorių. Transportuojamos atvėsintos spermos kokybės faktoriai - skiediklio tipas, atskiedimo rodiklis, pervežimo konteineris, laikymo temperatūra, laikymo laikas ir spermos kiekis.
Taip pat aukšta temperatūra turi įtakos kuilių spermos kokybei. Kuiliai, laikyti 34,5°C temperatūroje 8 valandas ir 31°C temperatūroje 16 valandų, 90 dienų iš eilės turi mažesnį spermos judrumą. Taip pat paveikiamos spermos morfologinės savybės, būdingas sumažėjęs vaisingumas palyginus su kontroliniais kuiliais, laikytais 23°C temperatūroje. Aukštesnei temperatūrai jautresnės ir grynakraujės patelės. Be nuolatinės aukštos temperatūros, spermos produkciją gali sumažinti temperatūros šuoliai, aukštesni nei 10°C (25-35°C) dienos ir nakties metu, bei didesnė nei 90% drėgmė.
Atskiesta sperma turi būti sandėliuojama 17°C temperatūroje. Tokiu būdu yra sumažinama spermos medžiagų apykaita – sąlyga, reikalinga prailginti laikymo laiką. Žemiausia kritinė temperatūra kuilių ejakuliato laikymui yra 12°C. Laikymas 15-17°C temperatūroje neparodė žalingo pokyčio spermos judrumui ir gyvybingumui. Sėklos senėjimo mechanizmas buvo tiriamas analizuojant šviežią spermą.
Rezultatai atskleidė, jog tai susiję (tarp kitų faktorių) su riebalų peroksidacija ir takumo pakitimais spermos membranoje (pokyčiais spermatozoidų gebėjime apvaisinti kiaušialąstę kiaušintakyje).
Derėtų vengti ventiliacijos sandėliuojant spermą, nes tai padidina pH. Dėl to galimi neigiami spermos judrumo pokyčiai. Gali būti taikoma daugelis įvairių buferinių sistemų, siekiant stabilizuoti pH [11].
1.2. Skiedikliai
Šviežiai ejakuliuotoje kuilio spermoje pH varijuoja tarp 7,2 – 7,5, žemiau šios ribos spermos judrumas ir spermatozoidų metabolizmas palaipsniui mažėja. Didelis gliukozės kiekis daugelyje kuilių spermos skiediklių daro įtaką žymiam tarpląstelinio pH kritimui žemiau 6,0. Ši tarpląstelinė acidozė leidžia ląstelėms išgyventi kelias dienas aplinkos temperatūroje. Kuilių spermatozoidų glikolizinis metabolizmas yra labai silpnas palyginus su kitomis rūšimis. Skiestas ejakuliatas įprastai yra laikomas plastikiniuose konteineriuose, turinčiuose mažai arba visai neturinčiuose sąlyčio su deguonimi, dėl to spermos judrumas mažėja santykinai aukštose temperatūrose.
Naujesni skiedikliai yra grindžiami zviterioniniu organinių buferių, ypač TES ir HEPES, veikimu, kurie fiksuoja sunkiuosius metalus ir kontroliuoja pH. Kuilių spermatozoidai gerai toleruoja osmosiškumą (240 – 380 mosM), tačiau izotoniniai ar šiek tiek hipertoninės terpės tirpalai sudaro geresnes apvaisinimo sąlygas negu hipertoniniai skiedikliai.
Kuilio ejakuliatas turi būti išlaikomas skystas esant 15 - 18°C aplinkos temperatūrai, dėl to buvo sukurtų daugybė skiediklių, skirtų sumažinti metabolinį spermatozoidų aktyvumą pasitelkiant aplinką, kurioje yra daug CO2. Daugiausia naudojamos skirtingos modifikacijos
gliukozės – natrio citrato terpė. Ilinojaus Kintamosios Temperatūros (angl. Illinois Variable Temperature - IVT) skiediklis, sukurtas 1950-aisiais jaučių spermos laikymui aplinkos temperatūroje, yra sudarytas iš gliukozės – citrato – bikarbonato – kiaušinio trynio tirpalo, prisotinto CO2, ir modifikuotoje formoje kuilių spermai buvo naudojamas mokslininkų Mesnil du
Buisson ir Dauzier (1959). Kalio chloridu papildytas variantas yra vis dar naudojamas kaip tirpalas po skiediklio dviejų žingsnių prailgintoje sistemoje [12].
Antimikrobiniai vaistai yra nepaprastai svarbūs kontroliuojant bakterijų augimą skystame kuilio ejekuliate. Kad būtų išvengta didėjančio bakterijų atsparumo įprastiems antibiotikams, reikia sukurti naujus, skirtingą sudėtį turinčius vaistus. Per pastaruosius kelis dešimtmečius buvo siekiama sukurti antimikrobinius peptidus (AMP) [13].
Siekiant išlaikyti spermos kokybę, antimikrobiniai priedai turi atitikti šiuos reikalavimus: 1) platus antimikrobinio poveikio spektras [14];
2) spermatozoidų toksiškumo nebuvimas; 3) vaisingumo neveiksnumas;
4) aukštas stabilumas [15];
5) spermos laikymo temperatūros įtaka jos aktyvumui [16]; 6) mažas atsparumo ugdymo potencialas;
7) naudojimo paprastumas; 8) ekonominis pagrįstumas [17].
Kaip pagrindiniai tikslai, spermos suderinamumo ir antimikrobinio aktyvumo tyrimai yra labai svarbūs, norint sukurti naujų priedų, skirtų kuilių spermos išsaugojimui.
Panašiai į žemesniųjų organizmų gynybinius mechanizmus, aukštesni organizmai palaiko įgimtą imuninę sistemą, kurios svarbūs komponentai yra endogeniniai AMP. Antimikrobiniai peptidai turi daug funkcijų, kurie padeda kovoti su daugybe patogenų [18]. Endogeniniai AMP yra žinomi kaip šeimos gynimo peptidai, esminiai ankstyvojo įgimto imuninio atsako komponentai [19]. Šie peptidai gali:
1) neutralizuoti daugybę mikroorganizmų, grybų, virusų ir parazitų [20]; 2) turėti imunomoduliatorinius veiksmus;
3) veikti kaip chemokinai [21]; 4) skatinti žaizdų gijimą [22];
Praktiškai gebėjimo apvaisinti sumažėjimas spermos sandėliavimo metu yra neišvengiamas, net jei naudojama ilgalaikė terpė. Vis dėlto specialūs terpės komponentai, tokie kaip BSA bei įvairūs buferiai, sumažina nuo laikymo priklausantį brendimo procesą, tuo pačiu sumažindami ir apvaisinimo gebą. Apvaisinimo sėkmingumą, susijusį su sandėliavimu, padidina didesnis spermatozoidų kiekis dozėje, spermos plazmos kiekis, žemas skiedimo santykis. Šiame kontekste turi būti apsvarstyti ryškūs vaisingumo tarp skirtingų kuilių skirtumai, kurie tik iš dalies yra susiję su skirtingomis spermatozoidų savybėmis, judrumu ir morfologija [24].
1.3. Šalčio šokas
Yra žinoma, jog kuilių spermatozoidai yra labai jautrūs šalčio šokui. Tai pasireiškia, kai šviežiai surinktas kuilio ejakuliatas yra greitai atšaldomas nuo kūno temperatūros iki temperatūros žemiau 15°C. Dėl to didelis spermatozoidų kiekis praranda gyvybingumą, ypač kai šaldymas tęsiamas iki 1 – 2°C.
Kai spermos mėginiai (prieš atskiedimą) kelias valandas yra laikomi aukštesnėje nei 15°C temperatūroje, spermatozoidai palaipsniui įgyja atsparumą šalčio šokui [25]. Staigus šviežiai atskiestos spermos atšaldymas nuo 35°C iki 15°C veda prie žymaus judrumo sumažėjimo. O vėsinimas didelėmis talpomis (100 ml) pamažu, po 10°C kaskart, didina atsparumą šalčiui. Preinkubacija bent 24 val. prieš galimą temperatūros sumažėjimą žemiau 15°C padidina atsparumą šalčiui, tai yra reakcija, reikalaujanti dėmesio kasdieniame darbe [26].
Labai svarbu yra tai, jog kuilių spermatozoidų jautrumas šalčio šokui keičiasi atsižvelgus į laiką ir temperatūrą. Svarbūs faktoriai yra šie: subrendimo būsena, spermos plazma, atskiedimas bei brendimas inkubacijos metu. Spermatozoidų brendimui įtakos neturi spermos plazma ar laikotarpis, kai surinkta sperma yra naudojama [27]. Tiriant nuo temperatūros priklausomą vidurinės membranos sąveiką inkubacijos ir laikymo metu galima patobulinti žinias, kaip užkirsti kelią arba sumažinti pokyčius spermą šaldant [28].
1.4. Spermatozoidų skaičius dozėje
Spermatozoidų kiekis yra svarbus faktorius norint sėkmingai apvaisinti, nes vaisingumas gerinamas su didėjančiu spermatozoidų skaičiumi iki tam tikros ribos. Ši riba varijuoja priklausomai nuo ejakuliato kokybės [29], skirtumai apvaisinimo procedūrose (pavyzdžiui, skiediklis, spermos amžius) gali būti vertinami tik tuomet, kai spermatozoidų skaičius apsėklinant yra mažesnis negu ribinis [30].
Komercinėmis sąlygomis tikslas yra išlaikyti spermatozoidus gyvybingus nepastovų laiko tarpą tam, kad būtų galima apvaisinti didelį kiekį kiaušinėlių su minimalia spermos doze [31]. Šių reikalavimų vis dar nėralaikomasi naudojant bet kokį prieinamą kuilių spermos skiediklį, kuomet sandėliavimo laikas yra ilgesnis nei 3 dienos. Daugelis atliktų praktinių tyrimų, kuomet sperma
sandėliuojama ilgesniais periodais naudojant įvairius skiediklius, rodo sumažėjusį apvaisinimą. Vis dėlto padvigubinus spermos dozę iki 6×109 ketvirtą laikymo dieną [32], taip pat naudojant kuilius su gera spermos kokybe, galima užkirsti kelią sandėliuojamos spermos vaisingumo mažėjimui. Šis variantas paprastai nėra naudojamas komercinėmis sąlygomis, tačiau suteikia vertingą informaciją apie spermatozoidų kiekio ir kokybės sąveiką. Kai spermatozoidų skaičius spermoje buvo sumažintas nuo 2 iki 0,5×109, buvo pastebėtas ženklus vaisingumo sumažėjimas
nuo 90,2 iki 58,3 proc. [33]. Gimdos išankstinis apdorojimas spermos plazma ar fiziologiniu tirpalu prieš apsėklinimą (0,5×109 spermatozoidai vienai kiaulaitei) neparodė vaisingumo padidėjimo. Atsižvelgiant į mažą naudotų spermatozoidų skaičių, pridėtiniai spermatozoidai ir vaisingumo rodiklis abiejose grupėse buvo stebėtinai aukšti. Tai priskiriama prie optimalių dirbtinio sėklinimo (angl. artificial insemination - AI) sąlygų: žiemos sezonas, artimas kuilių kontaktas, profesionali gyvulių priežiūra, rujos nustatymas bei aukšta spermos kokybė. Spermatozoidų kiekio sumažinimas ejakuliato dozėje iki 0,3×109 parodė normalaus embriono vystymosi rodiklio nukritimą iki 60 proc. Tai įvyko dėl procentiškai didesnio kiekio degeneruotų embrionų ir patvirtino [34] spėjimą, jog mažas spermatozoidų skaičius apvaisinimo vietoje sumažina jų tarpusavio konkurenciją ir taip sudaro sąlygas apvaisinti kiaušinėlį prastesnės kokybės spermatozoidams.
Skysto gyvulių ejakuliato bakterijų augimo kontrolei ypatingai svarbios yra antimikrobinės medžiagos. Siekiant neutralizuoti didėjantį bakterijų atsparumą įprastiniams antibiotikams, privalu atrasti naujų agentų su veiksmingais mechanizmais. Per paskutiniuosius dešimtmečius daugiau dėmesio buvo skiriama išvystyti antimikrobinius peptidus (angl. - AMPs), skirtus pritaikyti kliniškai. Kol kas didžiausias pasisekimas buvo vietinis tokių medžiagų naudojimas. Iki šių dienų reprodukcinėje medicinoje AMP kūrimas buvo sutelktas ties kontraceptine panauda. AMP, kaip pridėtinio skiediklio, realizavimas reprezentuoja naujoves valdant dirbtinį sėklinimą.
1.5.Spermatozoidų judrumas
1.5.1. Subjektyvus judrumo vertinimasJudrumas yra viena iš svarbiausių savybių, garantuojančių vaisingumą ejakuliate. [35] Nors ir apvaisinti spermatozoidai yra nukreipiami į apvaisinimo vietą (kiaušintakį) dėl gimdos susitraukimų [36], tačiau spermatozoidai turi išvystyti didelį judrumo greitį, kad pasiektų oocitą ir jį įsiskverbtų. Vyt ir kt. (2008) įrodė, kad 1 proc. judrumo padidėjimas praskiestoje spermoje buvo susijęs su didesniu 0,14 paršelių atsivedimu vienoje vadoje. Pagal reikalavimus spermatozoidų judrumas negali būti mažesnis kaip 60% [37].
1.5.2. Objektyvus judrumo įvertinimas
Objektyvus judrumo skaičiavimas su CASA sistema yra pagrįstas daugybe skaitmeninių vaizdų, iš kurių galima rekonstruoti atskirus spermos kelius bei apskaičiuoti judrumą su programine įranga [38]. Tokiu būdu galima pastebėti skirtingus judrumo modelius, pvz., progresuojantis judėjimas, spermatozoidų hiperaktyvumas ir skirtinga spermatozoidų subpopuliacija ejakuliate. Išsami informacija apie spermos judrumo ir greičio modelius gali būti naudinga norint nustatyti nedidelius skirtumus tarp kruopščiai atrinktų kuilių, naudojamų dirbtiniame apvaisinime [39]. Be to, spermatozoidų talpa gali būti tiriama naudojant CASA. Pavyzdžiui, buvo įrodyta, kad kuilių sperma, kurioje vyksta talpos pokyčiai, rodo didelį vidutinį greitį (VAP) ir mažą tiesiškumą [40]. 1.5.3. Spermos kokybės įvertinimas (SQA)
SQA sistemos konvertuoja optinio tankio pokyčius į elektrinius signalus, kad nustatytų spermos koncentraciją ir judrumą. Šie elektroniniai signalai yra analizuojami pagal SQA programinės įrangos algoritmus ir konvertuojami į spermos kokybės parametrus. Skirtingų SQA sistemų veiksmingumas spermos analizei buvo tiriamas tiek žmonėms, tiek gyvūnams, o kiekvienai rūšiai reikia skirtingų algoritmų. Ankstesnė SQA versija, t.y. SQA-IIC, buvo nuosekli ir tinkama įvertinti kuilių spermos kokybę [42]. Tarp SQA-IIC gautų spermos judrumo indekso (SMI) ir keleto CASA parametrų, ypač su judančių spermatozių (r = 0,71; p < 0,05) - ir tiesiosios linijos greitis (VSL) (r = 0,64; p < 0,05). Tačiau SQA-IIC pagrįsta palyginti senomis technologijomis, kurios iš pradžių buvo skirtos naudoti žmogaus spermos analizei. Be to, SMI vertybės pateikia pasaulinę spermos kokybės informaciją ir nediskriminuoja koncentracijos, morfologijos ir judrumo parametrų [41].
1.5.4. Spermos kokybės analizatorius (SQA-Vp)
Spermos kokybės analizatorius (SQA-Vp) buvo tinkamas kuilių spermos koncentracijos ir judrumo įvertinimui. Buvo ištirta tiek šviežios, tiek praskiestos spermos iš 50 skirtingų kuilių iš komercinio DA centro. Dėl šviežios ejakuliato koncentracijos, gautos naudojant SQA-Vp, buvo lyginama su fotometru ir hemocitometru. Praskiestų mėginių koncentracija ir judrumas buvo palyginti su kompiuterine spermos analize (CASA) ir vizualia spermos analize [42].
Progresyvus spermatozoidų judrumas yra nepažeisto metabolizmo ir sveikų membranų indikatorius. Judrumo įvertinimas turi fundamentalią svarbą kasdienei kuilių spermos kokybės kontrolei. Judrių spermatozoidų procentas yra naudojamas apskaičiuoti reikalingą skiedimo mastą bei įvertinti nepažeistų spermatozoidų skaičių apsėklinimui naudojamoje dozėje. Reguliarūs judrumo patikrinimai po skiedimo ir laikymo periodų suteikia informaciją apie kiekvieno kuilio spermos išlaikymą bei individualias ypatybes. Kadangi kuilių spermatozoidai demonstruoja santykinai didesnį judėjimą ratu (palyginus su kitomis rūšimis), rekomenduojama įvertinti skirtingas judrumo formas, įskaitant progresuojančią spermatozoidų dalį. Tokie skaičiavimai, atlikti
naudojant kontrastinį mikroskopavimą 20 - 30 min. po atskiedimo, nėra lengvai integruojami į gamybinį procesą. Sandėliuojama sperma turėtų būti tiriama kasdien ir turėti spermos judrumo vertę virš 60 proc [43].
1.6. Morfologija ir gyvybingumas
Kuilių sperma, turinti blogas spermos morfologines savybes, sumažina ne tik apvaisinimo procentą, bet ir vados dydį [44], todėl morfologija turi būti analizuojama, norint nustatyti vaisingus kuilius. Spermos morfologiniai nukrypimai paprastai klasifikuojami kaip pirminės, antrinės ar tretinės anomalijos [45]. Pirmoji grupė apima galvos formos nukrypimus, kurie turi įtakos genetinės informacijos sužalojimui. Citoplazminiai lašeliai laikomi antrinėmis anomalijomis. Morfologinės anomalijos, atsiradusios dėl netinkamo spermos apdorojimo (pvz., vingiuotos uodegėlės), yra laikomos tretiniais sutrikimais. Antrinių ir tretinių anomalijų įmanoma išvengti didinant spermos kiekį dozėje. Nors ir toliau yra svarstoma, kokia tiksli ribinė ejakuliato norma, tačiau šiuo metu yra priimami keli pripažinti kriterijai ir bent 80 proc. normalios morfologijos laikoma būtina vaisingai spermai [46].
Kompiuterinė spermos analizė buvo pradėta naudoti andrologijos laboratorijose 1980 m. Nuo to laiko paskelbta daugiau nei 1000 darbų naudojant šią technologiją tiek žmonių, tiek veterinarinėje medicinoje. Kompiuterinė spermos analizė pateikia objektyvius spermos judrumo kriterijus. Šiomis sistemomis nustatomi optimalūs spermos greičio bei kinetikos parametrai. Neseniai buvo nustatyti nauji judrumo matai ir morfometrijos analizė, kurie įvesti į daugelį analizės sistemų. Be to, įdiegtas procentinis spermos gyvybingumo ir mirtingumo įvertinimas, siekiant nustatyti DNR vientisumą. Taip pat yra prieinamos specifinės sistemos, sukurtos spermos produkcijos centrams.
Lyginant žmonių andrologijos laboratorijas, kurių spermos analizės standartai yra gaunami iš Pasaulio Sveikatos Organizacijos (liet. PSO, angl. WHO), veterinarinės andrologijos laboratorijose vis dar trūksta adekvataus parametrų standartizavimo. Be to, rūšims būdingi spermos judrumo ir kinetikos bruožų skirtumai komplikuoja normų apibrėžimą veterinarijos laboratorijose. Taip pat CASA sistemos skiriasi tarpusavyje priklausomai nuo naudojamos technikos. Nepaisant šių apribojimų, spermogramos yra ypač svarbios siekiant objektyviai nustatyti spermos judrumą. Pagrindinis spermogramos pranašumas yra objektyvumas, tačiau tai pasiekiama tik tuo atveju, jei žmogiškasis faktorius nedaro įtakos. Automatizuoti etapai bei tikslus parametrų standartizavimas yra esminiai faktoriai norint padidinti šių sistemų privalumus.
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI
Tyrimо eigа. Tyrimаs аtliktаs 2017 metаis LSMU VА Gyvūnų reprоdukcijоs lаborаtоrijoje. Numatytiems tyrimаms аtlikti iš kuilių spermоs gаmybоs įmоnės gаutа 50 šviežiоs skiestоs (paruоštоs kiаulių sėklinimui) kuilių spermоs dоzių. Pаruоštos spermоs dоzės per 1 vаlandą specialiоje pоlistirolо/termоdėžėje buvо pristatytоs į lаbоratoriją tyrimаms.
Gаvus spermоs dоzę, lаbоratorijoje pirmiausiа ji buvо gerаi išmаišoma, švelniаi flаkoną pаvartant. Nusukus kаmštelį dоzės turinys buvо pаdаlinamas į tris dаlis, t. y. į tris 50 ml tūriо mėgintuvėlius (BD Fаlcon, JAV). Atliekami pradiniai tyrimai (tiriamas pradinis judrumas, gyvybingumas, pH, vertinama spermatozoidų koncentracija ir atliekami spermatozoidų morfologijos tyrimai). Spermatozoidų koncentracija ir spermatozoidų morfologijos tyrimai mėginyje atlikti tik vieną kartą – tik gavus spermos mėginius. Spermatozoidų judrumo, pH ir gyvybingumo tyrimai kiekviename skirtinguose temperatūriniuose režimuose inkubuotame mėginyje buvo atlikti dar dukartus: po 6 val. ir po 72 val.
Viena spermos dozės dalis (CONTROL) inkubuojama šaldomajame termostate (Friocell 111, Vokietija) 16 ± 0,5 oC temperatūroje 72 val. Spermatozoidų judrumo, pH ir gyvybingumo tyrimai buvo atlikti po 6 ir po 72 val. inkubavimo.
Antra dozės dalis (LOW) buvo dedama į šaldytuvą (Eiron EI 220, Italija) 4 ± 0,5oC šešioms valandoms. Po šešių valandų atliekami spermatozoidų judrumo, pH ir gyvybingumo tyrimai. Po to dedama į šaldomąjį termostatą (Friocell 111, Vokietija) 16 ± 0,5oC temperatūroje ir po 72 val. vėl
atliekami spermatozoidų judrumo, pH ir gyvybingumo tyrimai.
Trečia dozės dalis (HIGH) buvo dedama į šildomąjį termostatą (Incucell 111, Vokietija) 25 ± 0,5oC temperatūroje šešioms valandoms. Po šešių valandų atliekami spermatozoidų judrumo, pH ir gyvybingumo tyrimai. Po to inkubuojama šaldomajame termostate (Friocell 111, Vokietija) 16 ± 0,5oC temperatūroje ir po 72 val. vėl atliekami spermatozoidų judrumo, pH ir gyvybingumo tyrimai.
2.1. Spermatozoidų judrumo nustatymas
Spermatozoidų judrumo nustatymas buvo atliekamas dviem būdais: subjektyviai (mikroskopuojant) ir objektyviai (kompiuterine spermos judrumo vertinimo programa Sperm Class Analyzer (SCA, Microptic, Ispanija)).
Pradinis subjektyvus kuilių spermatozoidų judrumas po 0 val. buvo nustatomas 37 ± 0,5oC temperatūroje, kai spermatozoidai yra maksimaliai aktyvūs. Prieš tyrimą mėgintuvėliai su kuilių sperma buvo įstatomi į vandens vonią (Memmert, Vokietija), palaikančią pastovią 37 ± 0,5oC temperatūrą, 5 minutėms. Spermatozoidų judrumo vertinimui buvo naudojamas fazių kontrastinis mikroskopas (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija) su integruotu šildomuoju staleliu, palaikančiu
nekintančią 37оC temperatūrą. Spermatozoidų judrumo tyrimams naudojami pašildyti dengiamieji ir objektiniai stikleliai, pipečių antgaliai. Ant šilto 37oC temperatūros objektinio stiklelio užlašinamas šiltos spermos lašas ir uždengiamas šiltu dengiamuoju stikleliu. Spermatozoidų judrumas vertinamas subjektyviai, akimi, nustatant judančių spermatozoidų kiekį procentais penkiuose mikroskopo matymo laukuose. Galutiniam rezultatui gauti apskaičiuojamas 5 matavimų aritmetinis vidurkis. Analogiškas kuilių spermatozoidų judrumo tyrimas buvo atliekamas CONTROL, HIGH ir LOW mėginiuose po 6 ir 72 val. inkubavimo įvairiuose teperatūriniuose režimuose.
Objektyvus spermatozoidų judrumas buvo nustatomas su prie mikroskopo, kuriuo vertinome subjektyvų spermatozoidų judrumą, įrengta kamera. Ja mikroskopo vaizdas perduodamas į kompiuterį, kuriame instaliuota kompiuterinė spermos judrumo vertinimo sistema SCA (MICROPTIC S.L., Ispanija). Kompiuteriu kiekviename mėginyje buvo išanalizuota ne mažiau kaip 1500 spermatozoidų (ne mažiau kaip 3 matymo laukuose). Kompiuteriu buvo fiksuojamas bendras spermatozoidų judrumas procentais. Objektyvaus, kaip ir subjektyvaus, spermatozoidų judrumo tyrimai buvo atlikti CONTROL, HIGH ir LOW mėginiuose po 6 ir po 72 val. inkubavimo įvairiuose temperatūriniuose režimuose (ir pradinis tyrimas atliktas tik gavus mėginius).
2.2. Spermatozoidų gyvybingumo nustatymas dažant eozino – nigrozino dažais Spermatozoidų gyvybingumui įvertinti buvo naudojami eozino – nigrozino dažai.
Pagrindinis dažų tirpalas: 5 proc. eozino (bluish) tirpalas distiliuotame vandenyje,10 proc. nigrozino tirpalas distiliuotame vandenyje.
Darbinis tirpalas: 1 dalis 5% eozino tirpalo ir 4 dalys 10 proc. nigrozino tirpalo. Pagamintas darbinis tirpalas gali būti laikomas 2 – 3 metus kambario temperatūroje ir naudojamas rutininiams spermatozoidų morfologijos ir gyvybingumo tyrimams. Dažas eozinas prasiskverbia pro pažeistas (sutrūkusias ar plyšusias) spermatozoidų membranas, dėl to ląstelė nusidažo rausvai. Spermatozoidai su sveikomis (nepralaidžiomis, nepažeistomis) membranomis išlieka nenusidažę, balti tamsiame nigrozino dažų fone.
Prieš dažymą tirpalas pašildomas iki 37–38oC. Ant pašildyto objektinio stiklelio (37oC) dedame 10 µl eozino - nigrozino dažų ir 10 µl skiestos spermos. Dažus ir spermą atsargiai išmaišome, padarome tepinėlį ir išdžioviname ore. Mikroskopuojame fazių kontrastiniu mikroskopu (Olympus BH2, Olympus Optical Co., Ltd., Japonija), naudodami 1000 kartų padidinimą su imersija. Stebint mikroskopu matomi balti (gyvi) ir rausvi ar raudoni (negyvi) spermatozoidai tamsiame nigrozino dažų fone. Suskaičiuojama 200 spermatozoidų, skirstant į gyvus ir negyvus. Apskaičiuojamas gyvų spermatozoidų procentas mėginyje – spermatozoidų gyvybingumas.
Spermatozoidų gyvybingumo tyrimai taip pat buvo atlikti tyrimo pradžioje, tik gavus mėginius, ir CONTROL, HIGH ir LOW mėginiuose po 6 ir po 72 val. inkubavimo įvairiuose temperatūriniuose režimuose.
2.3. Spermos pH tyrimai
H jonų koncentracija skiestoje kuilių spermos dozėje buvo nustatoma elektroniniu pH-matuokliu (WTW 526, Vokietija) su skaitmenine prietaiso indikacija, naudojant standartinį H jonų elektrodą. Prieš tyrimą mėgintuvėliai su kuilių spermos mėginiais buvo įstatomi į vandens vonią (Memmert, Vokietija), palaikančią pastovią 37 ± 0,5oC temperatūrą, 5 minutėms. Vėliau į mėgintuvėlį buvo įmerkiamas elektrodas ir fiksuojama ekrane nurodoma pH reikšmė. Atlikti pirminiai spermos pH tyrimai tik gavus mėginius ir pH buvo nustatinėjama HIGH ir LOW mėginiuose po 6 ir po 72 val. inkubavimo įvairiuose temperatūriniuose režimuose.
2.4. Spermatozoidų koncentracijos tyrimai
Spermatozoidų koncentracija nustatoma fazių kontrastiniu mikroskopu (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija), naudojant 100 kartų padidinantį objektyvą ir hematocitometrinę (NewBauer) kamerą. Sperma praskiedžiama distiliuotu vandeniu santykiu 1:20 ir kruopščiai išmaišoma. Užpildoma hematocitometrinė kamera. Spermatozoidai skaičiuojami 5 dideliuose kvadratuose (80 mažų kvadratėlių) arba 0,2 mm2 plote. Spermatozoidai skaičiuojami tris kartus skirtinguose kvadratuose ir suskaičiuojamas trijų skaičiavimų vidurkis. Spermatozoidų koncentracija nustatoma pagal formulę:
K = S × Pr × 5 ×10 × 1000
K – spermatozoidų skaičius viename spermos mililitre (koncentracija), S – spermatozoidų skaičius 80-tyje mažų kvadratų,
Pr – praskiedimo laipsnis,
5 – koeficientas, nes spermatozoidai buvo skaičiuoti 0,2 mm2 kameros plote, 10 – daugiklis, nes kameros gylis yra 0,1 mm,
1000 – daugiklis, spermatozoidus perskaičiuojant į 1 ml.
Spermatozoidų koncentracijai spermos dozėje nustatyti apskaičiuotas spermatozoidų kiekis mililitre dauginamas iš spermos dozės tūrio (mililitrais).
Spermatozoidų koncentracija kuilių spermos dozėje apskaičiuojama pagal formulę: SK = K × 100
K – spermatozoidų skaičius viename spermos mililitre, 100 – daugiklis, nes spermos dozės tūris yra 100 ml.
2.5. Patologinių spermatozoidų kiekio nustatymas – morfologiniai tyrimai
Spermatozoidų galvučių patologijos ir spermatozoidų su patologinėmis uodegėlėmis kiekis vertinamas atskirai. Norint įvertinti spermatozoidų galvučių patologijas, spermatozoidai buvo
dažomi metileno mėlynaisiais dažais pagal gamintojo instrukcijas (Sperm Blue, MICROPTIC S.L., Ispanija).
2.6. Spermatozoidų dažymas Sperm Blue dažais 1. Ant objektinio stiklelio padaromas tepinėlis ir išdžiovinamas ore.
2. Stiklelis merkiamas į fiksavimo tirpalą 10 min. 3. Stiklelis merkiamas į dažus 20 – 30 min.
4. Nudažytas stiklelis trims sekundėms įmerkiamas į distiliuotą vandenį ir išdžiovinamas ore.
Mikroskopuojama fazių kontrastiniu mikroskopu (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija), naudojant 1000 kartų padidinimą su imersija. Spermatozoidų morfologinių pažeidimų nustatymui vertinama 500 spermatozoidų iš įvairių tepinėlio vietų. Registruojamos tokios spermatozoidų galvučių patologijos: kriaušės formos, siauru pagrindu, nenormaliais kontūrais, neišsivysčiusios, nenormalios galvutės be uodegėlių, siauros, didelės, mažos normalios, trumpos plačios galvutės ir spermatozoidai su paracentriniu viduriniosios dalies prisitvirtinimu. Įvertinus 500 spermatozoidų būklę apskaičiuojamas bendras patologinių galvučių procentas.
Spermatozoidų uodegėlių įvertinimui buvo naudojamas Hancock’o (šlapio preparato) metodas. Sperma skiedžiama buferinio formalino tirpalu santykiu 1:10. Lašas atskiestos spermos (5 – 10 µl) dedamas ant objektinio stiklelio, uždengiamas dengiamuoju stikleliu. Iš viršaus lengvai nusausinamas filtriniu popieriumi. Keletą minučių leidžiama nusėsti spermatozoidams ant stiklelio dugno, tada mikroskopuojama fazių kontrastiniu mikroskopu (Olympus BH2, Olympus Optical Co., Ltd., Japonija), naudojant 400 kartų padidinimą. Įvertinama 200 spermatozoidų. Registruojami tokie spermatozoidų uodegėlių pažeidimai: vidurinės dalies pakitimai, paprastai ir po galva susisukusios bei dvigubai sulinkusios uodegėlės bei kitos patologijos (proksimaliniai ir distaliniai lašeliai, spermatozoidų galvutės be uodegėlių, akrosomų defektai ir pakitimai, vakuolės). Apskaičiuojamas bendras uodegėlių patologijų ir bendras kitų patologijų procentas bei bendras visų patologijų (galvučių, uodegėlių ir kitų) kiekis procentais.
2.7. Statistinė duomenų analizė
Gauti duomenys buvo apdoroti „Microsoft Excel“ (Microsoft Office Excell, 2003) programa. Statistinė duomenų analizė buvo atlikta SPSS statistinio paketo Nr. 13 versija (SPSS for Windows 13.0, SPSS Inc., Chicago, IL, JAV, 1989–1999). Analizuojant duomenis buvo atliekamas jų aprašymas naudojantis aprašomąja statistika (aritmetinis vidurkis, standartinis nuokrypis, minimalios ir maksimalios reikšmės). Skirtumai tarp grupių buvo analizuoti LSD daugybinio palyginimo metodu. Duomenys buvo laikomi statistiškai patikimi, kai * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1. Spermatozoidų judrumo palyginimas laikant spermos dozes 72h skirtingose
temperatūrose
1 pav. Spermatozoidų judrumo palyginimas laikant spermos dozes 72 valandas kontrolinėje
16°C temperatūroje.
Įvertinus spermatozoidų judrumą nustatyta, kad 16° temperatūroje skirtingomis valandomis vidutiniškai buvo 71,93 ± 0,70 proc. Didžiausias pradinis spermatozoidų judrumas nustatytas tiriant iškart gavus spermos dozes – vidurkis 75,2 ± 1,01 proc., o mažiausias spermatozoidų judrumas – vidurkis 67,3 ± 1,13 proc. – nustatytas po 72 valandų spermos dozių laikymo (1 pav). Spermatozoidų judrumo vidurkių skirtumas po 72 valandų yra 1,12 karto arba 7,9 proc. mažesnis lyginant su pradiniu judrumu.
Skirtumas tarp spermatozoidų judrumo skirtingomis valandomis yra statistiškai patikimas (p ≤ 0,05).
2 pav. Spermatozoidų judrumo palyginimas laikant spermos dozes 72 valandas žemoje 4°C
temperatūroje.
Įvertinus spermatozoidų judrumą nustatyta, kad 4°C temperatūroje skirtingomis valandomis buvo vidutiniškai 57 ± 0,85 proc. Skirtumas tarp spermatozoidų judrumo žemoje 4°C temperatūroje po 6 ir 72 valandų yra p=0,009, t.y. statistiškai patikimas (p ≤ 0,05).
Lyginant judrumą po 6 val. su pradiniu judrumu iš iš karto ištrauktos iš termodėžės spermos, jis buvo 10,5 proc. mažesnis, o po 72 val. skirtumas dar labiau išaugo - iki 15,4 proc.
Spermatozoidų judrumas žemoje 4°C temperatūroje po 6 valandų (64,7 ± 1,11 proc.) yra 1,3 karto didesnis (25,9 proc.) nei po 72 valandų (49,3 ± 1,83 proc.) (2 pav.) 2 paveikslas rodo, kad spermatozoidų judrumas mažėja didėjant valandų kiekiui.
3 pav. Spermatozoidų judrumo palyginimas laikant spermos dozes 72 valandas aukštoje
25°C temperatūroje.
Įvertinus spermatozoidų judrumą nustatyta, kad 25°C temperatūroje skirtingomis laikymo valandomis jis vidutiniškai buvo 69,68 ± 0,85 proc. Spermatozoidų judrumas aukštoje 25°C temperatūroje 1,12 karto didesnis po 6 valandų (73,66 ± 1,00 proc.) nei po 72 valandų (65,7 ± 1,2 proc.) laikymo (3 pav.). 3 paveikslas rodo, kad spermatozoidų judrumas aukštoje 25°C temperatūroje mažėja didėjant valandų skaičiui.
Lyginant rezultatus su kontroline 16°C temperatūra po 6 val. judrumas buvo didesnis 1,6 proc., o po 72h buvo 9,5 proc. didesnis.
Skirtumas tarp spermatozoidų judrumo aukštoje 16°C temperatūroje po 6 ir 72 valandų yra statistiškai patikimas (p ≤ 0,05).
4 pav. Spermatozoidų judrumo palyginimas laikant spermos dozes 6 valandas kontrolinėje
16°C, žemoje 4°C ir aukštoje 25°C temperatūroje.
Įvertinus spermatozoidų judrumą nustatyta, jog po 6h, laikant spermos dozes skirtingose temperatūrose, spermatozoidų judrumo vidurkis buvo 70,55 ± 0,70 proc. Didžiausias spermatozoidų judrumas nustatytas aukštoje 25°C temperatūroje, t.y. 73,66 ± 1 proc. (4pav.). Mažiausias spermatozoidų judrumas nustatytas žemoje 4°C temperatūroje - 64,70 ± 1,11 proc. (4 pav.). Spermatozoidų judrumas po 6h žemoje 4°C temperatūroje buvo 8,6 proc. mažesnis lyginant su spermatozoidų judrumu kontrolinėje 16°C temperatūroje (p ≤ 0,05) ir 8,96 proc. mažesnis nei laikant aukštoje temperatūroje (p ≤ 0,05). Aukštoje temperatūroje laikomų spermatozoidų judrumas buvo tik 0,33 proc. didesnis lyginant su kontrolinėje 16°C temperatūroje nustatytu spermatozoidų judrumu, tačiau šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p > 0,05).
5 pav. Spermatozoidų judrumo palyginimas laikant spermos dozes 72 valandas kontrolinėje
16°C, žemoje 4°C ir aukštoje 25°C temperatūroje.
Įvertinus spermatozoidų judrumą nustatyta, jog po 72 val. spermos dozių laikymo skirtingose temperatūrose spermatozoidų judrumo vidurkis buvo 60,76 ± 0,70 proc. Didžiausias spermatozoidų judrumas nustatytas kontrolinėje 16°C temperatūroje, t.y. 67,3 ± 1,13 proc. (5 pav.). Mažiausias spermatozoidų judrumas nustatytas žemoje 4°C temperatūroje – 49,3 ± 1,83 proc. Spermatozoidų judrumas po 6 val. žemoje 4°C temperatūroje buvo 18 proc. mažesnis lyginant su spermatozoidų judrumu kontrolinėje 16°C temperatūroje (p ≤ 0,05) ir 16,4 proc. mažesnis nei laikant aukštoje 25°C temperatūroje (p ≤ 0,05). Aukštoje temperatūroje laikomų spermatozoidų judrumas buvo 1,6 proc. mažesnis lyginant su kontrolinėje 16°C temperatūroje nustatytu spermatozoidų judrumu, tačiau šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p > 0,05).
3.2. Spermatozoidų judrumo nustatyto kompiuterine SCA programa
palyginimas laikant spermos dozes 72 val. skirtingose temperatūrose
6 pav. Spermatozoidų judrumo nustatyto kompiuterine SCA programa palyginimas laikant
spermos dozes 72 valandas kontrolinėje 16°C temperatūroje.
Įvertinus spermatozoidų judrumą kompiuterine SCA programa nustatyta, kad 16°C temperatūroje skirtingomis valandomis judrumas vidutiniškai buvo 89,44 ± 1,07 proc. Didžiausias spermatozoidų judrumas (SCA proc.) yra iškart gavus spermos dozes – 92,62 ± 0,59 proc., o mažiausias po 6 valandų spermos laikymo – vidurkis 87,69 ± 1,3 proc. (6 pav). Spermatozoidų judrumo vidurkių skirtumas po 6 valandų yra nedidelis lyginant SCA iškart gavus spermos dozes (1,05 karto mažesnis) ir beveik nepastebimas po 72 valandų (1,003 karto mažesnis).
Skirtumas tarp spermatozoidų judrumo skirtingomis valandomis yra statistiškai patikimas (p ≤ 0,05).
6 paveikslas rodo, kad spermą laikant 72 val. spermatozoidų judrumas mažėja, tačiau skirtumas tarp spermatozoidų po 6 ir 72 val. buvo labia nežymus, t.y. tik 0,33 proc. didesnis po 72 val.
7 pav. Spermatozoidų judrumo nustatyto kompiuterine SCA programa palyginimas laikant
spermos dozes 6 ir 72 valandas žemoje 4°C temperatūroje.
Įvertinus žemoje temperatūroje inkubuotos spermos judrumą nustatyta, kad skirtingomis valandomis judrumas vidutiniškai buvo 70,09 ± 1,31 proc. Skirtumas tarp spermatozoidų judrumo, nustatyto SCA programa žemoje 4°C temperatūroje po 6 ir 72 valandų, yra statistiškai patikimas (p ≤ 0,05). Spermatozoidų judrumas, nustatytas SCA programa žemoje 4° temperatūroje po 6 valandų (75,73 ± 2,5 proc.), yra 1,17 karto arba 11,3 proc. didesnis nei po 72 valandų (64,46 ± 3,29 proc.) (7 pav.).
Lyginant rezultatus su kontroline 16°C temperatūra po 6 val. judrumas buvo 16,9 proc. didesnis, o po 72 valandų - 28,2 proc. didesnis.
8 pav. Spermatozoidų judrumo, nustatyto kompiuterine SCA programa, palyginimas laikant
spermos dozes po 6 ir 72 valandų aukštoje 25°C temperatūroje.
Bendras spermatozoidų judrumo (SCA proc.) vidurkis 25°C temperatūroje skirtingomis laikymo valandomis yra 89,86 ± 1,31 proc. Skirtumas tarp spermatozoidų judrumo, nustatyto SCA programa aukštoje 25°C temperatūroje po 6 ir 72 valandų, yra statistiškai patikimas (p ≤ 0,05). Spermatozoidų SCA judrumas aukštoje 25° temperatūroje 1,04 karto, t.y. 4,4 proc., didesnis po 6 valandų (92,05 ± 1,11 proc.) nei po 72 valandų (87,68 ± 1,25 proc.) (6 pav.).
Grafinis duomenų vaizdas rodo, kad spermatozoidų judrumas aukštoje 25°C temperatūroje mažėja didėjant valandų skaičiui (8 pav.).
Lyginant rezultatus su kontroline 16°C temperatūra po 6 val.judrumas buvo nežymiai - 0,55 proc. - didesnis. Atitinkamai ir po 72 valandų judrumas buvo 5 proc. didesnis.
9 pav. Spermatozoidų judrumo, nustatyto kompiuterine SCA programa, palyginimas laikant
spermos dozes 6 valandas kontrolinėje 16°C, žemoje 4°C ir aukštoje 25°C temperatūroje.
Nustatytas bendras spermatozoidų judrumo SCA vidurkis po 6h laikant spermos dozes skirtingose temperatūrose buvo 85,16 ± 1,07 proc. Didžiausias spermatozoidų judrumo SCA nustatytas aukštoje 25°C temperatūroje – 92,05 ± 1,11 proc., mažiausias žemoje 4°C temperatūroje – 75,73 ± 2,51 proc. (9 pav.). Spermatozoidų SCA judrumas po 6 valandų žemoje 4°C temperatūroje buvo 11,96 proc. mažesnis lyginant su spermatozoidų judrumo SCA kontrolinėje 16°C temperatūroje (p ≤ 0,05) ir 16,32 proc. mažesnis nei laikant aukštoje 25°C temperatūroje (p ≤ 0,05). Aukštoje 25°C temperatūroje laikomų spermatozoidų SCA buvo 4,36 proc. didesnis lyginant su kontrolinėje 16°C temperatūroje nustatytu spermatozoidų judrumo SCA, tačiau šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p > 0,05).
10 pav. Spermatozoidų judrumo, nustatyto kompiuterine SCA programa, palyginimas
laikant spermos dozes 72 valandas kontrolinėje 16°C, žemoje 4°C ir aukštoje 25°C temperatūroje.
Nustatytas bendras spermatozoidų judrumo SCA vidurkis po 72 val. laikant spermos dozes skirtingose temperatūrose buvo 80,05 ± 1,07 proc. Didžiausias spermatozoidų judrumo SCA nustatytas kontrolinėje 16°C temperatūroje – 88,02 ± 1,44 proc., mažiausias žemoje 4°C temperatūroje – 64,4 6 ± 3,29 proc. (10 pav.). Spermatozoidų judrumo SCA po 6 valandų žemoje 4°C temperatūroje buvo 23,56 proc. mažesnis lyginant su spermatozoidų judrumo SCA kontrolinėje 16°C temperatūroje (p ≤ 0,05) ir 23,22 proc. mažesnis nei laikant aukštoje 25°C temperatūroje (p ≤ 0,05). Aukštoje 25°C temperatūroje laikomų spermatozoidų judrumo SCA buvo tik 0,34 proc. mažesnis lyginant su kontrolinėje 16°C temperatūroje nustatytu spermatozoidų SCA, tačiau šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p> 0,05).
3.3. Spermatozoidų pH palyginimas laikant spermos dozes 72h skirtingose
temperatūrose
11 pav. Spermatozoidų pH palyginimas laikant spermos dozes 72 valandas kontrolinėje
16°C temperatūroje.
Įvertinus spermatozoidų pH nustatyta, kad 16°C temperatūroje skirtingomis valandomis bendras pH rodiklis buvo 7,29 ± 0,008. Aukščiausias spermatozoidų pH rodiklis nustatytas po 6 ir 72 valandų spermos dozių laikymo - 7,33, mažiausias – pradinis pH – 7,21 ± 0,15. (11 pav).
Skirtumas tarp spermatozoidų pH skirtingomis valandomis yra statistiškai patikimas (p ≤ 0,005) tik lyginant spermatozoidų pH iškart gavus spermos dozes su likusiomis grupėmis (𝑝"=0,005; 𝑝#= 0,001). Skirtumo tarp spermatozoidų pH po 6 ir 72 valandų nėra (p > 0,05).
12 pav. Spermatozoidų pH palyginimas laikant spermos dozes po 6 ir 72 valandas žemoje
4°C temperatūroje.
Įvertinus spermatozoidų pH nustatyta, kad 4°C temperatūroje skirtingomis valandomis bendras pH vidurkis buvo 7,37 ± 0,01. Spermatozoidų pH po 72 valandų (7,41 ± 0,00) yra nežymus, vos 0,06 didesnis nei po 6 valandų (7,35± 0,01) (11 pav.). Skirtumas tarp spermatozoidų pH žemoje 4°C temperatūroje po 6 ir 72 valandų nėra statistiškai patikimas (p > 0,05).
Lyginant rezultatus su kontroline 16° temperatūra po 6 val. pH buvo gautas 0,14 vienetais mažesnis. Tokia pati tendencija įvyko ir po 72 valandų, kuomet pH buvo 0,2 vienetais mažesnis.
13 pav. Spermatozoidų pH palyginimas laikant spermos dozes po 6 ir 72 valandų aukštoje
25°C temperatūroje.
Įvertinus spermatozoidų pH nustatyta, kad 16°C temperatūroje skirtingomis valandomis vidutiniškai buvo 7,26 ± 0,01. Skirtumas tarp spermatozoidų pH aukštoje 25°C temperatūroje po 6 ir 72 valandų yra statistiškai patikimas (p ≤ 0,005), vidurkiai skiriasi 0,03 vieneto. (13 pav.).
Lyginant rezultatus su kontroline 16°C temperatūra po 6 val. pH buvo nežymiai mažesnis - vos 0,07. Atitinkamai ir po 72 valandų pH buvo 0,04 vieneto mažesnis.
14 pav. Spermatozoidų pH palyginimas laikant spermos dozes 6 valandas kontrolinėje 16°C,
žemoje 4°C ir aukštoje 25°C temperatūroje.
Įvertinus spermatozoidų pH nustatyta, jog po 6 val., laikant spermos dozes skirtingose temperatūrose, bendras spermatozoidų pH vidurkis buvo 7,32 ± 0,008. Didžiausias spermatozoidų pH nustatytas žemoje 4°C temperatūroje t.y. 7,35 ± 0,01 (14 pav.) Mažiausias spermatozoidų pH buvo aukštoje 25°C temperatūroje – 7,28 ± 0,01. Spermatozoidų pH po 6 val. žemoje 4°C temperatūroje buvo tik 0,02 vienetais didesnis lyginant su spermatozoidų pH kontrolinėje 16° temperatūroje (p ≤ 0,05), 0,07 vienetais didesnis nei laikant aukštoje temperatūroje (p ≤ 0,05). Aukštoje temperatūroje laikomų spermatozoidų pH buvo tik 0,05 mažesnis lyginant su kontrolinėje 16°C temperatūroje nustatytu spermatozoidų pH, tačiau šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p > 0,05).
15 pav. Spermatozoidų pH palyginimas laikant spermos dozes 72 valandas kontrolinėje
16°C, žemoje 4°C ir aukštoje 25°C temperatūroje.
Įvertinus spermatozoidų pH nustatyta, jog po 72 val., laikant spermos dozes skirtingose temperatūrose, bendras spermatozoidų pH vidurkis buvo 7,33 ± 0,008. Didžiausias spermatozoidų pH nustatytas žemoje 4°C temperatūroje - 7,41 ± 0,01. Mažiausias spermatozoidų pH buvo aukštoje 25°C temperatūroje – 7,25 ± 0,01 (15 pav.) Spermatozoidų pH po 72 val. žemoje 4°C temperatūroje buvo tik 0,08 vienetais didesnis lyginant su spermatozoidų pH kontrolinėje 16°C temperatūroje (p ≤ 0,05) ir 0,16 vienetų didesnis nei laikant aukštoje temperatūroje (p ≤ 0,05). Aukštoje temperatūroje laikomų spermatozoidų pH buvo tik 0,08 proc. mažesnis lyginant su kontrolinėje 16°C temperatūroje nustatytu spermatozoidų pH, tačiau šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p > 0,05).
3.4. Spermatozoidų gyvybingumo palyginimas laikant spermos dozes 72h
skirtingose temperatūrose
16 pav. Spermatozoidų gyvybingumo palyginimas laikant spermos dozes 72 valandas
kontrolinėje 16°C temperatūroje.
Įvertinus spermatozoidų gyvybingumą nustatyta, kad 16°C temperatūroje skirtingomis valandomis jis vidutiniškai buvo 81,65 ± 1,38 proc. Didžiausias spermatozoidų gyvybingumas nustatytas tiriant iškart gavus spermos dozes – vidurkis 84,94 ± 1,27 proc., o mažiausias spermatozoidų gyvybingumas – vidurkis 78,3 ± 7,17 proc. – nustatytas po 72 valandų spermos dozių laikymo (16 pav). Spermatozoidų gyvybingumo vidurkių skirtumas po 72 valandų yra 1,08 karto arba 6,42 proc. mažesnis lyginant su pradiniu. Skirtumas tarp spermatozoidų gyvybingumo skirtingomis valandomis yra statistiškai patikimas (p ≤ 0,05).
17 pav. Spermatozoidų gyvybingumo palyginimas laikant spermos dozes 72 valandas žemoje
4°C temperatūroje.
Įvertinus spermatozoidų gyvybingumą nustatyta, kad 4° temperatūroje skirtingomis valandomis jis vidutiniškai buvo 74,86 ± 1,60 proc. Po 6 valandų gyvybingumas (75,52 ± 3,22 proc.) buvo didesnis 1,32 proc. nei po 72 valandų (74,2 ± 2,27 proc.) (17 pav.). Spermatozoidų gyvybingumas žemoje 4°C temperatūroje po 6 valandų yra 6,42 proc. mažesnis lyginant su pradiniu (p ≤ 0,05), o po 72 valandų yra 8,68 proc. mažesnis lyginant su pradiniu (p ≤ 0,05). Skirtumas tarp spermatozoidų gyvybingumo po 6 ir 72 valandų statistiškai nėra patikimas (p > 0,05).
18 pav. Spermatozoidų gyvybingumo palyginimas laikant spermos dozes 72 valandas
aukštoje 25°C temperatūroje.
Įvertinus spermatozoidų gyvybingumą nustatyta, kad 25°C temperatūroje skirtingomis valandomis jis vidutiniškai buvo 72,04 ± 1,6 proc. Po 6 valandų gyvybingumas (74,46 ± 2,21 proc.) buvo didesnis 7,48 proc. nei po 72 valandų (69,62 ± 2,6 proc.) (18 pav.). Spermatozoidų gyvybingumas aukštoje 25°C temperatūroje po 6 valandų yra 7,48 proc. mažesnis lyginant su pradiniu (p ≤ 0,05), o po 72 valandų - 8,68 proc., vadinasi, taip pat išlieka mažesnis lyginant su pradiniu (p ≤ 0,05). Skirtumas tarp spermatozoidų gyvybingumo po 6 ir 72 valandų statistiškai nėra patikimas (p > 0,05).
19 pav. Spermatozoidų gyvybingumo palyginimas laikant spermos dozes 6 valandas
kontrolinėje 16°, žemoje 4° ir aukštoje 25° temperatūroje.
Įvertinus spermatozoidų gyvybingumą nustatyta, kad po 6h, laikant spermos dozes skirtingose temperatūrose, bendras spermatozoidų gyvybingumo vidurkis buvo 77,3±1,308%. Didžiausias spermatozoidų gyvybingumas nustatytas kontrolinėje 16° temperatūroje - 81,94±1,41%. Mažiausias spermatozoidų gyvybingumas nustatytas aukštoje 25° temperatūroje – 74,46±2,21% (19 pav.). Spermatozoidų gyvybingumas po 6h kontrolinėje 16° temperatūroje buvo 6,42% didesnis lyginant su spermatozoidų gyvybingumu žemoje 4° temperatūroje (p ≤ 0,05) ir 7,48% didesnis nei laikant aukštoje 25° temperatūroje (p ≤ 0,05). Žemoje 4° temperatūroje laikomų spermatozoidų gyvybingumas buvo tik 1,06% didesnis lyginant su aukštoje 25° temperatūroje nustatytu spermatozoidų gyvybingumu, tačiau šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p > 0,05).
20 pav. Spermatozoidų gyvybingumo palyginimas laikant spermos dozes 72 valandas
kontrolinėje 16°C, žemoje 4°C ir aukštoje 25°C temperatūroje.
Įvertinus spermatozoidų gyvybingumą nustatyta, kad po 72 val., laikant spermos dozes skirtingose temperatūrose, bendras spermatozoidų gyvybingumo vidurkis buvo 74,04 ± 1,30 proc. Didžiausias spermatozoidų gyvybingumas nustatytas kontrolinėje 16°C temperatūroje - 78,3 ± 2,17 proc. (20 pav.). Mažiausias spermatozoidų gyvybingumas nustatytas aukštoje 25°C temperatūroje – 69,62 ± 2,67 proc. Spermatozoidų gyvybingumas po 72 val. kontrolinėje 16°C temperatūroje buvo 4,1 proc. didesnis lyginant su spermatozoidų gyvybingumu žemoje 4°C temperatūroje (p ≤ 0,05) ir 8,68 proc. didesnis nei laikant aukštoje 25°C temperatūroje (p ≤ 0,05). Žemoje 4°C temperatūroje laikomų spermatozoidų gyvybingumas buvo 4,58 proc. didesnis lyginant su aukštoje 25°C temperatūroje laikytų spermatozoidų gyvybingumu, tačiau šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p > 0,05).
3.5. Spermatozoidų patologijos ir koncentracija
21 pav. Patologinių spermatozoidų kiekis tirtose spermos dozėse.
Ištyrus 50 skirtingų kuilių spermos dozių nustatyta, kad galvučių patologijų vidutinis kiekis spermos dozėje buvo 2,82 ± 0,89 proc., iš kurių didžiausias kiekis vienoje dozėje buvo 10 proc. Vidutinis uodegėlių patologijų kiekis spermos dozėje buvo 4,46 ± 2,26proc., o bendras patologijų kiekis spermos dozėje buvo 7,86 ± 4,34 proc.(21 pav.).
Apskaičiavus spermatozoidų kiekį dozėse buvo nustatyta vidutinė spermatozoidų koncentracija dozėje t.y. 1,5 mlrd.
3.6. Spermos kokybės parametrų koreliaciniai ryšiai
Nustatytas spermatozoidų judrumo, SCA, gyvybingumo ir pH tarpusavio ryšys. Nustatyta, kad ryšys tarp spermatozoidų judrumo ir SCA yra patikimas, teigiamas, stiprus (r = 0,637, p < 0,05). Didžiausia koreliacija nustatyta tarp spermatozoidų judrumo ir SCA laikant spermos dozes 72 valandas žemoje 4°C temperatūroje (r = 0,662, p < 0,05). Kontrolinėje 16°C temperatūroje didžiausia koreliacija nustatyta tarp spermatozoidų judrumo ir SCA iškart gavus spermos dozes (r = 0,482, p < 0,05). Ryšiai tarp spermatozoidų judrumo ir pH ir spermatozoidų SCA su pH, patikimi, neigiami, silpni (r = -0,370; -0,302 p < 0,05). Tai reiškia, kad didėjant spermos pH nežymiai mažėja spermatozoidų judrumas ir SCA. Spermatozoidų gyvybingumo rodikliai tik silpnai koreliuoja su spermatozoidų SCA. Žemoje 4°C temperatūroje didžiausia koreliacija tarp spermatozoidų gyvybingumo ir SCA nustatyta laikant spermos dozes 6 valandas (r = 0,328, p < 0,05). Taigi, galima daryti išvadą, kad didesnis spermatozoidų judrumas siejasi su didesniu jų SCA, gyvybingumu bei mažesniu spermos pH.
Nustatytas spermatozoidų judrumo, SCA, gyvybingumo ir pH tarpusavio ryšys. Nustatyta, kad ryšys tarp spermatozoidų judrumo ir SCA 16°C temperatūroje skirtingomis valandomis yra patikimas, teigiamas, silpnas (r = 0,340, p < 0,05). Kontrolinėje 16°C temperatūroje didžiausia koreliacija nustatyta tarp spermatozoidų judrumo ir SCA iškart gavus spermos dozes (r = 0,482, p < 0,05). Ryšiai tarp spermatozoidų judrumo ir pH ir spermatozoidų SCA su pH patikimi, neigiami, silpni (r = -0,234; -0,276 p < 0,05;). Tai reiškia, kad didėjant spermos pH mažėja spermatozoidų judrumas, SCA. Ryšys tarp spermatozoidų gyvybingumo ir kitų spermos kokybės parametrų kontrolinėje 16°C temperatūroje nenustatytas.
Koreliacija tarp spermatozoidų judrumo ir SCA žemoje 4°C temperatūroje skirtingomis valandomis yra patikima, teigiama, stipri (r = 0,599, p < 0,05). žemoje 4°C temperatūroje didžiausia koreliacija nustatyta tarp spermatozoidų judrumo ir SCA laikant spermos dozes 72 valandas (r = 0,662, p < 0,05). Ryšys tarp spermatozoidų judrumo ir pH patikimas, neigiamas, silpnas (r = -0,262; p < 0,05). Tai reiškia, kad didėjant spermos pH nežymiai mažėja spermatozoidų judrumas. Ryšys tarp spermatozoidų gyvybingumo ir SCA žemoje 4°C temperatūroje patikimas, teigiamas, silpnas (r = 0,251; p < 0,05). žemoje 4°C temperatūroje didžiausia koreliacija tarp spermatozoidų gyvybingumo ir SCA nustatyta laikant spermos dozes 6 valandas (r = 0,328, p < 0,05).
Koreliacija tarp spermatozoidų judrumo ir SCA aukštoje 25°C temperatūroje skirtingomis valandomis yra patikima, teigiama, silpna (r = 0,361, p < 0,05). Ryšys tarp spermatozoidų judrumo ir pH patikimas, neigiamas, silpnas (r = -0,234; p < 0,05). Spermos dozes laikant aukštoje 25°C, nustatyta patikima, neigiama, silpna koreliacija tarp spermatozoidų gyvybingumo ir SCA (r = -0,238, p < 0,05).
