LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Mantas Ţemaitis
Danijos veislynuose surinktos erţilų spermos kokybės
tyrimai
Stallion semen quality evaluation in Danish breeding
centers
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Dr. Neringa Sutkevičienė
2 DARBAS ATLIKTAS STAMBIŲJŲ GYVŪNŲKLINIKOJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Danijos veislynuose surinktos erţilų spermos kokybės tyrimai“:
1. yra atliktas mano paties.
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir uţsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Mantas Ţemaitis
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Mantas Ţemaitis
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Dr. Neringa Sutkevičienė
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE) Dr. Arūnas Rutkauskas
(aprobacijos data) (klinikos vedėjo vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 101.1. Erţilų reprodukcinių organų anatominiai ypatumai ... 10
1.2. Erţilų reproduktorių androloginis tyrimas ... 11
1.3. Erţilų sperma ir jos kokybė ... 12
1.3.1. Spermatozoido sandara ir savybės ... 12
1.3.2. Erţilų spermatogenezė ... 12
1.3.3. Hormonai ir jų įtaka erţilų reprodukcijoje ... 13
1.3.4. Spermatozoidų patologijos, judrumas bei juos lemiantys veiksniai ... 13
1.3.5. Veiksniai įtakojantys erţilų reprodukciją – aktyvumas, amţius, veislė ... 14
1.3.6. Atvėsinta sperma ... 15
1.3.7. Erţilų spermos kokybės reikalavimai ... 16
2. TYRIMO METODAI IR MEDŢIAGA ... 17
2.1. Tyrimo eiga ... 17
2.2. Subjektyvaus spermatozoidų judrumo nustatymas ... 19
2.3. Spermatozoidų koncentracija ... 19
2.4. Patologinių spermatozoidų galvučių nustatymas metileno mėlynaisiais daţais ... 20
2.5. Patologinių spermatozoidų uodegėlių nustatymas buferiniame formaline... 21
2.6. Statistinė duomenų analizė ... 21
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 22
3.1. Spermatozoidų judrumo ir koncentracijos palyginimas tarp erţilų veislės, amţiaus ir aktyvumo skiestoje atvėsintoje spermoje ... 23
3.2. Spermatozoidų patologijų palyginimas tarp skirtingų erţilų amţiaus grupių skiestoje atvėstinoje spermoje ... 26
3.3. Spermatozoidų patologijų palyginimas skirtingų erţilų veislių skiestoje atvėsintoje spermoje ... 30
3.4. Spermatozoidų patologijų palyginimas skirtingai aktyvių erţilų skiestoje atvėsintoje spermoje .... 33
3.5. Skirtingomis dienomis paruoštos skiestos atvėsintos spermos koncentracijos ir judrumo palyginimas ... 38
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 39
4 REKOMENDACIJOS ... 42 PADĖKA... 43 LITERATŪROS SĄRAŠAS... 44
5 DANIJOS VEISLYNUOSE SURINKTOS ERŢILŲ SPERMOS KOKYBĖS TYRIMAI
Mantas Ţemaitis
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Šio darbo tikslas buvo įvertinti Danijoje laikomų ir reprodukcijoje naudojamų erţilų spermos kokybės rodiklius, atsiţvelgiant į erţilų amţių, veislę, aktyvumą bei spermos surinkimo intervalą.
Tyrimas atliktas 2018 metais Danijos erţilų laikymo centruose ir LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje. Tyrimams atlikti iš 6 erţilų laikymo centrų Danijoje buvo surinkti 31 skiestos ir atvėsintos spermos mėginiai. Pradinis tyrimas – spermatozoidų subjektyvus judrumas (mikroskopuojant) atliktas Danijoje. Paruošti, konservuoti formaline, skiestos ir atvėsintos spermos mėginiai pristatyti į Lietuvą. Laboratorijoje atlikti morfologiniai spermatozoidų galvučių ir uodegėlių tyrimai. Spermatozoidų koncentracija apskaičiuota naudojant hemocitometrinę- NewBauer kamerą.
Atlikus tyrimus nustatyta neigiama erţilų amţiaus įtaka spermos kokybei (p < 0,05). Didţiausias vidutinis kiekis spermatozoidų su patologinėmis galvutėmis (16,5 ± 2,05 proc.) ir uodegėlėmis (10,5 ± 5,3 proc.) rastas erţilų, kurių amţius nuo 10 iki 17 metų, spermoje. Taip pat didţiausias vidutinis kiekis spermatozoidų patologinių galvučių (36,8 ± 1,36 proc.), kitų patologijų (7,83 ± 0,73 proc.), bei maţiausia vidutinė spermatozoidų koncentracija (45,67 ± 4,70 mln/ml), judrumas (36,66 ± 3,33 proc.) nustatytas Fryzų veislės erţilų skiestoje ir atvėsintoje spermoje, kurios kokybė buvo prasčiausia lyginant su kitų veislių erţilų spermą (p < 0,05). Aktyviausioje t.y. varţybinių erţilų grupės spermoje nustatytas didţiausias spermatozoidų uodegėlių ir kitų patologijų vidurkis (atitinkamai 11,39 ± 2,47 proc. ir 7,33 ± 1,99 proc.), (p < 0,05). Lyginant skirtingomis dienomis surinktos erţilo skiestos ir atvėsintos spermos mėginius, nustatyta didţiausia vidutinė spermatozoidų koncentracija spermoje, imant spermą trijų dienų intervalu – 100,33 ± 2,34 mln/ml, (p < 0,05).
6 STALLION SEMEN QUALITY EVALUATION IN DANISH BREEDING CENTERS
Mantas Ţemaitis Master‘s Thesis
SUMMARY
The aim of this research was to evaluate stallion semen quality depending on age, breed, activity and the semen collection interval.
The study was conducted in Danish breeding centers and LUHS VA Animal Reproduction Laboratory in 2018. The intended study involved 6 breeding centers where 31 doses of the cooled stallion semen were collected. The sperm motility was determined subjectively (by microscopy) in Denmark. The prepared semen samples with formalin were delivered to Lithuania. The semen quality was rated in the laboratory by counting pathological heads and tails of spermatozoa. The concentration of spermatozoa was counted using the hemocytometer camera.
The research revealed a negative effect on the quality of the sperm related to the age (p < 0.05). The study showed that the highest average concentration of the spermatozoa with pathological heads (16.5 ± 2.05 %) and tails (10.5 ± 5.3 %) in the stallion semen is from 10 to 17 years old. Moreover, the highest average concentration of the spermatozoa with pathological heads (36.8 ± 1.36 %), other pathologies (7.83 ± 0.73 %) and the lowest average concentration of the semen (45.67 ± 4.70 mln/ml), motility (36.66 ± 3.33 %) were found in the cooled semen of Friesian stallions. The Friesian stallion semen had the lowest quality in all breed groups (p< 0.05). In the semen of competing stallion group was found the largest average concentration of the spermatozoa with pathological tails and other pathologies (respectively – 11.39 ± 2.47 % and 7.33 ± 1.99 %), (p< 0.05). Comparing the samples of the cooled stallion semen collected in different days, the highest average concentration of the semen was found in three day’s interval – (100.33 ± 2.34 mln/ml), (p< 0.05).
7
SANTRUMPOS
NFDSM – (non-fat dried skim milk extender) – erţilų spermos skiediklis. GnRH – gonadotropinus atpalaiduojantis hormonas.
LH – liuteinizuojantis hormonas.
FSH – folikulus stimuliuojantis hormonas. IHB – inhibinas.
8
ĮVADAS
Mokslo paţanga įvykdė didelį perversmą – šiuo metu galime veisti arklius, kurie nėra matę vienas kito ar net yra skirtinguose ţemynuose. Skiesta ir atvėsinta erţilų sperma jau 20 metų įprastai naudojama pasaulyje, dauguma ţirgų veisėjų asociacijų patvirtino dirbtinį apvaisinimą, o tai lėmė didelį mokslininkų susidomėjimą skiesta ir atvėsinta sperma (1). Dirbtinis kumelių apvaisinimas šaldyta erţilų sperma tapo ekonomiškai nenaudingu: didesnės veterinarinių paslaugų išlaidos, erţilų savininkai turi pristatyti reproduktorius į specialius dirbtinio apvaisinimo centrus, kurie privalo turėti spermos kriokonservavimui reikalingą įrangą, o svarbiausia naudojant šaldytą sperma kumelių sėklinimui yra pasiekiamas maţesnis vaisingumo procentas, todėl skiestos ir atvėsintos erţilų spermos naudojimas pasiekė pripaţinimą daugelyje šalių (2). Pagrindiniai privalumai naudojant skiestą ir atvėsintą erţilų spermą tapo sumaţinti arklių transportavimo kaštai, nelaimingų atsitikimų pavojus, stresas bei ligų perdavimo rizika lyginant su natūraliu kergimu (3). Pasaulyje per metus šaldyta bei skiesta ir atvėsinta sperma dirbtinai apvaisinama virš 0,5 milijono kumelių, iš jų tik 0,1 milijono kumelių yra naudojama šaldyta erţilų sperma. Naudojant skiestą ir atvėsintą spermą, po sėkmingo dirbtinio kumelės apvaisinimo, kiekvienais metais gimsta apie 350000 kumeliukų (4).
Pasaulyje yra taikomos įvairios veisimo programos, kai kurie erţilai nedalyvauja sporte arba dėl traumos nebegali varţytis, todėl yra naudojami tik reprodukcijai. Tačiau dauguma populiarų erţilų turi dalyvauti varţybose ir būti naudojami reprodukcijoje, nes sporto pasiekimai padidina spermos vertę. Tačiau intensyviai treniruojamų arklių spermos kokybė prastėja (5). Spermos kokybė priklauso nuo erţilo genetinių savybių, veislės, sveikatos būklės, amţiaus, metų laiko, spermos surinkimo daţnio, aktyvumo ir t.t. (6).
Erţilų spermos kokybės vertinimas yra neatsiejama dalis nustatant būsimo reproduktoriaus vaisingumą bei potencialą būti perspektyviam. Pirmiausia atliekami bandymai ar spermatozoidai gali būti šaldomi, nes nevisi erţilai gali būti naudojami skirtingose spermos ruošimo technologijose. Vėliau nustatoma spermatozoidų koncentracija ejakuliate, progresyvus spermatozoidų judrumas. Spermatozoidų morfologinė analizė yra viena iš svarbiausių, parodančių patino vaisingumą (7).
Lietuvoje yra vienintelis erţilų spermos laikymo centras Vilniuje. Jame atliekamas spermos surinkimas, kriokonservavimas, ruošiama skiesta ir atvėsinta sperma. Tačiau nedidelis erţilų kiekis bei Lietuvoje vis dar auganti arklių veislininkystės šaka sąlygojo mano pasirinkimą dalį tyrimo atlikti Danijoje ir pasisemti ţinių iš toje šalyje, arklių reprodukcijos srityje, dirbančių veterinarijos gydytojų. Veterinarijos gydytojams, veisėjams aktualu ţinoti spermos kokybę ir ją įtakojančius veiksnius, norint siekti geresnių kumelių dirbtinio apvaisinimo rezultatų.
9 Pagrindinis mano darbo tikslas buvo įvertinti Danijoje laikomų ir reprodukcijoje naudojamų erţilų spermos kokybės rodiklius, atsiţvelgiant į erţilų amţių, veislę, aktyvumą bei spermos surinkimo intervalą.
Darbo uţdaviniai:
1. Įvertinti spermos kokybę, skiestoje ir atvėsintoje erţilų spermos dozėje, paruoštoje kumelių sėklinimui.
2. Įvertinti spermatozoidų judrumo, koncentracijos, morfologinių pakitimų
priklausomybę nuo erţilų amţiaus, veislės, aktyvumo, skiestoje ir atvėsintoje spermoje.
3. Įvertinti spermatozoidų judrumą ir koncentraciją, skirtingu intervalu surinktose, skiestos ir atvėsintos erţilo spermos dozėse.
10
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Erţilų reprodukcinių organų anatominiai ypatumai
Erţilo reprodukcinius organus sudaro dvi sėklidės, kiekviena iš jų yra laikoma sėklinio virţelio ir sėklidės keliamojo raumens. Dveji antsėklidţiai, du sėkliniai latakai su ampule. Porinės pūslinės liaukos, prostatos liauka, kuperio liaukos, ampulė, kopuliacijos organas – varpa (8).
Sėklidės yra porinis egzokrininę ir endokrinę funkcijas turintis organas. Egzokrininė funkcija gaminti hormoną testosteroną, endokrininė gaminti spermatozoidus. Sėklidţių dydis priklauso nuo erţilo amţiaus bei veislės. Daţniausiai sėklidės svoris svyruoja nuo 150-300 gramų, o ilgis 12 cm. Amţius ir sezonas sąlygoja sėklidţių dydį, tai lemia jų padidėjimą, tačiau to negalima teigti lyginant arklių veisles. Sėklidės stromą sudaro balzganasis dangalas, nuo kurios driekiasi jungiamojo audinio pertvarėlės. Lytinės brandos nesulaukusių erţilų sėklidţių parenchima šviesiai pigmentuota, tačiau arkliui senstant pigmentas tampa tamsesnis. Sėklidės parenchima yra viena iš svarbiausių sėklidės dalių. Ją sudaro sėkliniai kanalėliai – vingiuotieji ir tiesieji, kurie uţima apie 90 proc. sėklidţių parenchimos. Vingiuotieji kanalėliai sudaryti iš spermatogeninio epitelio, kuriuose formuojasi spermatozoidai (9). Tarp sėklinių kanalėlių, intersticiniame audinyje, randamos Leidigo ląstelės, kurios sekretuoja testosteroną, taip pat kitus steroidus. Tai veikia priedinių lytinių liaukų funkciją, seksualinį erţilų elgesį (10).
Erţilas ejakuliuoja 6-9 frakcijomis. Per pirmąsias tris frakcijas ejakuliuojama apie 70 proc. visų spermatozoidų. Sėklinė plazma sudaro didelę dalį ejakuliato. Tai skysčio mišinys gautas iš sėklidţių, antsėklidţio bei priedinių lytinių liaukų, kuris pakeičia šlaplės pH, būtinos spermatozoidų gyvybingumui, taip pat suteikia spermatozoidams energijos (11).
Erţilo kopuliacijos organas – varpa, skirstoma į tris dalis: galvą, kūną bei šaknį, kuri poilsio padėtyje įtraukta ir apsupta apyvarpės. Ţinduolių varpos kūnas sudarytas iš varpos akytkūnių ir šlaplės kempinkūnio. Erţilų varpos akytkūniuose yra didelės ertmės, lyginant su buliumi ar kuiliu, kurios priplūsta kraujo erekcijos metu. Varpa erekcijos metu padidėja apie 50 proc., varpos galva 300-400 proc. skersmeniu (8).
11
1.2. Erţilų reproduktorių androloginis tyrimas
Erţilai, lyginant su kitais ţemės ūkio gyvūnais, tapo reproduktoriais, kurie pripaţinti dėl kilmės, o svarbiausia pasirodymų varţybose. Gana maţai dėmesio kreipiama į spermos kokybę, nuoseklų androloginį tyrimą. Ţirgų versle yra daug erţilų, kurių vaisingumas yra palyginti maţas su kitais ţemės ūkio gyvuliais. Tai lėmė įtemptas 5 mėnesių apvaisinimo sezonas bei spermos pirkėjų gausa. Visi veisėjai nori sulaukti kumeliuko su tokiomis pačiomis erţilo savybėmis ir tapti pripaţinti pasaulyje. Vienas populiariausių erţilų vardu – Encosta de Laco, pasiekė rekordą, sėkmingai skiesta ir atvėsinta sperma dirbtinai apvaisinęs 240 kumelių per 2005 metų sezoną. Padidėję veisimo poreikiai, stresas, lėmė blogėjančią spermos kokybę, tačiau sąlygas nustato pirkėjai (12).
Androloginis tyrimas yra naudingas norint nustatyti erţilo vaisingumą bei pajėgumą veisimo sezonui. Daugelis draudimo kompanijų reikalauja šio tyrimo, norėdami apsisaugoti drausdami brangius reproduktorius. Androloginį tyrimą atlieka veterinarijos gydytojas.
Erţilų androloginis tyrimą sudaro:
Klinikinė gyvulio apţiūra.
Apţiūra išorinių ir vidinių lytinių organų – varpa apţiūrima palpacijos būdu. Atkreipiamas dėmesys į varpos galvutės priekiniame gale esančią duobelė – fossa glandis, kurioje yra grioveliai, juose daţnai pasitaiko ţaizdelės, kurios sukelia hemospermiją. Taip pat svarbi sėklidţių apčiuopa, sėklinis virţelis turi būti be pakitimų, neskausmingas. Rektiškai turi būti patikrinta pūslinė liauka.
Lytiškai plintančių ligų tyrimas – vienintelė lytiškai plintanti bakterija tarp arklių –
Taylorella equigenitalis, kuri sukelia kumelių endometritus. Taip pat virusinė arklių liga – arteritas.
Libido – įvertinamos erţilo galimybės uţšokti ant staklių spermos surinkimo metu. Erţilo elgesys stebimas prie kumelės, greitas kumelės troškimas, uostymas, prunkštimas, bandymas šokti rodo gerą lytinį potraukį.
Surinktos spermos kiekis ir kokybė – tikrinama ejakuliato spermatozoidų
koncentracija, spermatozoidų morfologija, gyvybingumas, judrumas, taip pat sperma testuojama dėl šaldymo, atvėsinimo technologijos (13).
12
1.3. Erţilų sperma ir jos kokybė
1.3.1. Spermatozoido sandara ir savybės
Spermatozoidą sudaro galvutė, kaklelis ir uodegėlė. Galvutė yra apsupta akrosomos, kurioje sukaupti fermentai leidţia prasiskverbti pro kiaušialąstės membraną, tačiau didţiausią galvutės dalį uţima branduolys, kuris sudarytas iš chromatino (14). Kaklelis tai nedidelis fragmentas įsiterpęs tarp galvutės ir uodegėlės. Jame išsidėsčiusios dvi centriolės, viena iš jų yra lyg pamatas spermatozoido uodegėlei. Pagrindinė kaklelio funkcija yra jungiamoji, kuri veikia kaip sąnarinė dalis judančiame spermatozoide (15). Spermatozoido uodegėlė yra atsakinga uţ energijos gamybą, jos tikslas judėti ir kuo greičiau pasiekti kiaušialąstę. Ląstelės ţiuţelis sudarytas iš pagrindinės, galinės ir vidurinės dalies, kuri yra svarbiausia, nes yra apsupta mitochondrijų, atsakingų uţ energiją uodegėlėje (16). Erţilų spermatozoidai yra sudaryti iš tokių pačių struktūrų kaip ir kitų ţinduolių – avinų, bebrų ar ţmonių. Ląstelės dydis yra maţas lyginant su erţilo kūno proporcijomis: 61-86 µm, pavyzdţiui pelės spermatozoidas beveik dvigubai didesnis– 123 µm. Pagrindinė erţilų spermatozoido formos ypatybė – elipsės formos galvutė, kurios yra dorsoventraliai suplokštėjusios. Panašiausia ląstelės forma yra triušių spermatozoidai (12).
1.3.2. Erţilų spermatogenezė
Spermatogenezė – egzokrininė sėklidţių funkcija, kurios metu vyksta subrendusios vyriškos gametos formavimasis, sėkliniuose vamzdeliuose. Ląstelės dauginasi ir bręsta iš diploidinių lytinių ląstelių – spermatogonijų į haploidines – spermatozoidus. Spermatozoidai yra išskiriami iš Sertoli ląstelių apikalinio poliaus, kurios yra sėklinių vingiuotųjų kanalėlių epitelio komponentas (17). Vienas gramas erţilo sėklidės parenchimos produkuoja 16 milijonų spermatozoidų kiekvieną dieną. Dauguma spermatozoidų yra nepilnaverčiai, todėl yra eliminuojami apoptozės ar Sertoli ląstelių fagocitozės, tačiau likusieji pasiekia ejakuliatą. Buvo įrodyta, kad spermatogenezė erţilų sėklidėse trunka 57 dienas. Per devynias dienas spermatozoidai pasieka ištekamuosius latakėlius (18). Spermatozoidai nuo aštuonių iki dešimties dienų bręsta antsėklidyje, tačiau tik antsėklidţio uodegėlės dalyje įgauna judrumo savybes. Apie šešiasdešimt procentų spermatozoidų yra pašalinama ejakuliacijos metu iš antsėklidţio uodegėlės dalies ir tik septyni procentai iš sėklinio latako, kuriuose yra pagrindinė subrendusių spermatozoidų saugykla (19).
13 1.3.3. Hormonai ir jų įtaka erţilų reprodukcijoje
Anatominės struktūros, kurios dalyvauja erţilo hormonų reguliavime yra konkorėţinė liauka, pagumburys, hipofizė, seklidės (20). Spermatogenezę, steroidogenezę ir sėklidţių veiklą reguliuoja kompleksas autokrininių, parakrininių ir endokrininių signalų (21). Konkorėţinė liauka gamina melatoniną, kuris veikdamas skatina pagumburį išskirti gonadotropinus atpalaiduojantį hormoną – GnRH. GnRH stimuliuoja hipofizę išskirti liuteinizuojantį hormoną (LH) ir folikulus stimuliuojantį hormoną (FSH), kurie pradeda reguliuoti sėklidţių veiklą. Galiausiai sėklidţių hormonai: inhibinas (IHB), estrogenas, testosteronas yra sekretuojami atgal į kraujo sistemą ir grįţtamuoju ryšiu veikia pagumburį bei hipofizę (22). Sėklidţių apimtis, svoris padidėja pavasarį ir vasarą, tai lemia padidintą spermos gamybą, libido, plazmos hormonų koncentraciją. Pokyčius lemia šviesos sukeltas melatonino išskyrimo iš konkorėţinės liaukos slopinimas, kuris leidţia padidinti pagumburio aktyvų GnRH išskyrimą (23). Atlikto tyrimo metu įrodyta, kad testosterono, liuteinizuojančio hormonų koncentracijas, reproduktorių erţilų kraujo plazmoje, lemia ne tik sezonas, bet ir seksualinis aktyvumas. Penkių mėnesių laikotarpyje, erţilai naudojami spermos surinkimui nuo vieno iki šešių kartų per savaitę turėjo maţesnes LH, testosterono bazines koncentracijas lyginant su seksualiai neaktyviais erţilais. Veisimo sezonas erţilų reproduktorių hormonų koncentracijas stipriai sumaţino, tai lėmė prastesnę spermos kokybę (24).
1.3.4. Spermatozoidų patologijos, judrumas bei juos lemiantys veiksniai
Spermatozoidai yra skirstomi į sveikus ir patologinius. Spermatozoidų sandaros pakitimai ir jų skaičius ejakuliate leidţia spręsti apie spermos kokybę ir numatomą erţilų vaisingumą. Dauguma pakitusių spermatozoidų negali pasiekti ar apvaisinti kiaušialąstės (25). Morfologiniai ląstelių pakitimai yra skirstomi į grupes: spermatozoido galvutės patologijos ir spermatozoido uodegėlės patologijos. Kai kurios patologijos yra labai svarbios, turinčios didelę reikšmę kiaušialąstės apvaisinimui. Paţeidimų prieţastis daţniausiai atsiranda dėl spermatogeninio epitelio esančio sėkliniuose kanalėliuose funkcijos sutrikimo. Taip pat patologinių spermatozoidų skaičių atspindi antseklidţio funkcionalumas (26). Svarbios spermatozoidų patologijos – nenormali galvutės forma, proksimaliniai lašeliai, neišsivysčiusios ar dvigubos ląstelės, kurios daugiausiai siejasi su apvaisinimo sėkme kyla iš spermatogenezės sutrikimų. Maţiau svarbūs pakitimai – maţos, siauros, didelės galvutės, distaliniai lašeliai ar paprastai uţlinkusios uodegėlės neturi didelės reikšmės (27). Erţilų sperma, kurioje yra 65 proc. ar daugiau sveikų spermatozoidų yra priimtina naudoti sėklinimui (28). Sėklinio latako paţeidimai yra daţniausiai randami pas erţilus, tai parodo didelė
14 spermatozoidų koncentracija (>500 mln/ml), judrumo sumaţėjimas bei didelis kiekis spermatozoidų galvučių be uodegėlės ejakuliate (29).
Spermatozoidų judrumas – tai savybė judėti tiesia eiga patelės lytiniuose organuose ir pasiekti kiaušialąstę. Yra nustatyta spermatozoidų aktyvumo priklausomybė nuo apvaisinimo sėkmės (30). Skiestoje ir atvėsintoje spermoje judrumas turėtų būti nemaţesnis nei 35 proc. per pirmąsias 24 valandas (31). Kumelių dirbtinis apvaisinimas skiesta ir atvėsinta sperma yra pranašesnis uţ apvaisinimą šaldyta sperma. Geresni apvaisinimo rezultatai pastebėti apsėklinus kumelę per 24 valandas po spermos paėmimo ir atvėsinimo lyginant su šaldyta sperma (32).
1.3.5. Veiksniai įtakojantys erţilų reprodukciją – aktyvumas, amţius, veislė
Kaip ir ţmonių populiacijoje vyrai, kurie treniruojasi, gyvena sveikai, spermos kokybė yra geresnė (25). Populiariausi erţilai tarp veisėjų, kurių spermos surinkimo sezonas yra labai įtemptas, daţniausiai yra pasiekę aukštus rezultatus tarptautinėse varţybose. Tokie ţirgai daţniausiai yra treniruojami 5 kartus per savaitę, taip pat turi įtemptą varţybų grafiką. Fiziologiniai ir endokrininiai faktoriai susiję su sportu parodė, kad treniruojamų erţilų spermos kokybė yra blogesnė, negu erţilų reproduktorių, kurie yra naudojami tik spermos surinkimui ir kumelių sėklinimui (5). Janett vertino įtempto darbo įtaką spermos kokybei vienuolikai erţilų, 7-19 metų amţiaus. Ejakuliatas buvo surenkamas kiekvieną savaitę. Pirmąją savaitę erţilai buvo vedţiojami ant bėgimo takelio 5 min. 1,5 m/s, 0 proc. nuolydţiu, risčia 3,5 m/s , 3 ir 6 proc. nuolydţiu. Antrąją ir trečiąją savaitę krūvis didėjo, risčia – 4,5 m/s, nuolydis 9 proc. Širdies ritmas uţfiksuotas ėjimo metu 70-90 kartų per minutę, po treniruotės risčia pakildavo iki 166-190 kartų per minutę. Tyrimo metu buvo matuojami plazmos kortizolio, testosterono, laktatų koncentracijos, kurios po intensyvaus treniravimo ţymiai padidėjo. Intensyvus darbas neigiamai paveikė spermos kokybę, akrosomų, galvučių defektai atsirado po trijų savaičių nuo tyrimo pabaigos. Spermatozoidų koncentracijos ejakuliate kitimas uţfiksuotas kiekvieną savaitę: pirmoji – 7,0 mlrd., antroji – 6,8 mlrd., trečioji – 6,1 mlrd. ir ketvirtoji – 6,6 mlrd. Fizinis stresas didina gliukokortikoidų kiekį kraujyje, taip pat intensyviai treniruojamų erţilų pakilusi kūno temperatūra sutrikdo fiziologinę sėklidţių termoreguliaciją. Temperatūros pokyčiai neigiamai veikia spermatogenines ląsteles. O tiesiogiai padidėjus gliukokortikoidų kiekiui kraujyje yra sutrikdoma normali spermatogenezė (33).
Spermos kokybė priklauso nuo gyvūno amţiaus. Beveik pas visus ţinduolius sėklidţių dydis ir spermos gamyba pakyla iki maksimalios ribos po lytinės brandos. Vėliau tam tikru laiku spermos kokybė prastėja dėl senėjimo procesų. Jaunesni gyvūnai nesulaukę lytinės brandos turi maţesnes sėklides, maţesnį spermatogeninio epitelio produktyvumą (29). Lytinę brandą erţilai pasiekia būdami 2 metų amţiaus. Tyrime atskleista, kad jaunesni nei 2 metų erţilai produkuoja prastesnės
15 kokybės spermą negu lytiškai subrendę erţilai (34). Būdingiausi pokyčiai sėklidėse atsiradę senėjimo pasekoje nustatyti dėl sėklinių vingiuotojų kanalėlių fibrozės ir atrofijos (35). Kitos studijos parodė, kad geriausia spermos kokybė nustatyta erţiluose, kurie yra tarp 3-14 metų. Jauni erţilai daţniausiai išskiria daugiau nesubrendusių spermatozoidų, tuo tarpu senesni yra siejami su prasidedančiais sėklidţių pakitimais, nenormalia antsėklidţio funkcija (36).
Hanoverio universiteto atliktame tyrime dalyvavo 9 erţilų veisles. Tyrimo tikslas buvo nustatyti ar erţilo veislė įtakoja spermos kokybę. Tirta Arabų, Trakėnų, grynakraujų jojamųjų, Hanoverių, Holšteinų, Oldenburgų, Vokiečių, Reino šiltakraujų bei Reino – Vokiečių šaltakraujų erţilų spermos mėginiai. Nustatyta, kad Arabų veislės erţilai turėjo didţiausias spermos koncentracijas ejakuliate. Reino šaltakraujai turėjo maţiausias spermatozoidų koncentracijas ir judrumo rodiklius ejakuliate (37). Fryzų veislės arkliai yra veisiami grynuoju veisimu- kumelės yra sėklinamos tos pačios veislės erţilų sperma. Vidutinė spermos kokybė fryzų veislės erţilų yra ţema dėl maţos populiacijos, kuri lemia giminingą veisimą – inbrydingą. Tyrimas atliktas su 1146 Fryzų veislės erţilais parodė, kad ejakuliate spermatozoidų koncentracija yra maţesnė, taip pat rastas didesnis patologinių spermatozoidų skaičius lyginant su kitos veislės erţilais (38).
1.3.6. Atvėsinta sperma
Erţilai atrenkami būti reproduktoriais pagal tris svarbiausius kriterijus: kilmę, varţybų rezultatus, eksterjerą. Atvėsinta sperma pradėta transportuoti nuo 1980 metų. Svarbiausias faktorius, kuris lėmė, kad atvėsinta sperma tapo tokia populiari – patogumas. Atvėsinta sperma pristatoma į vietą specialiuose transportinėse dėţutėse palaikančiose + 5 oC temperatūrą. Veisėjams nebereikia veţti kumelių kergti natūraliu būdu, taip pat didelis norimų erţilų pasirinkimas iš visos Europos tapo tikra sensacija, kuri šiomis dienomis tapo įprasta rutina. Sustabdytas lytinių keliu plintančių ligų pavojus, kadangi erţilų reproduktorių sperma yra privalomai tikrinama laboratorijose (39).
Sperma yra skiedţiama ir atvėsinama norint išsaugoti jos gyvybingumą transportavimo metu. Spermos skiedikliai apsaugo spermatozoidus nuo išorinių faktorių pavojaus, svarbiausio iš jų – terminio šoko. Lipoproteinai, pieno ar kiaušinio trynio, apsaugo spermatozoidus nuo temperatūrų pokyčių. Metabolizuojantys substratai tokie kaip gliukozė, suteikia spermatozoidams energijos judėti. Naudojami antibiotikai apsaugo spermą nuo bakterijų augimo, daţniausiai naudojamas derinys fenoksimetilpenicilinas su amikacino sulfatu išsaugo spermatozoidų gyvybingumą ir turi platų veikimo spektrą (40). Švieţia sperma yra sumaišoma su šiltu – 37o
C skiedikliu. Geriausias rezultatas gaunamas praskiedus skiedikliu santykiu 3:1. Švieţią spermą su skiedikliu galima atvėsinti gana greitai iki 20o
C temperatūros, nesukeliant ląstelių membranos paţeidimų. Tačiau pavojingiausias atvėsinimas yra nuo 20o
16 aušinimas, kuris maţiausiai paveikia spermatozoidus yra 0,05-0,1o
C/min. Skiesta ir atvėsinta sperma turi būti pristatyta veterinarijos gydytojui pasiruošusiam dirbtinai apvaisinti kumelę per 24-36 valandas (41). Geriausias apvaisinimo procentas – 60-70 proc. nustatytas sėklinant 5oC temperatūros skiesta ir atvėsinta sperma per 24 valandas nuo skiestos ir atvėsintos spermos pagaminimo bei pristatymo (42).
1.3.7. Erţilų spermos kokybės reikalavimai
Ejakuliato tūris bei spermatozoidų koncentracija yra vienas iš svarbiausių poţymių vertinant erţilo vaisingumą. Spermatozoidų koncentracija ejakuliate yra skirtinga ir gali kisti dėl daugelio prieţasčių – amţiaus, spermos ėmimo daţnumo, veislės, metų laiko bei infekcinių ligų. Atliktame tyrime, kuriame buvo tirti 168 erţilai, 9 skirtingų veislių, nustatytas vidutinis ejakuliato tūris – 33,7 ml, spermatozoidų koncentracija – 164 mln/ml, judrumas 76 proc. (43). Ejakuliate, kurio gauta 60-100 ml, turi būti nuo 7 iki 15 milijardų spermatozoidų(31). Erţilo ejakuliato tūris svyruoja nuo 20 iki 250 ml. priklausomai nuo erţilo veislės, amţiaus, sezono (44).
Pasaulinė sportinių ţirgų veisėjų asociacija, sukūrė erţilų spermos kokybės standartą, siekiant apsaugoti kumelių savininkų interesus.
1. Švieţia sperma – rekomenduojama 300 milijonų progresyviai judančių spermatozoidų
dozėje.
2. Atvėsinta sperma (maksimali dozė 40 ml) – rekomenduojamakoncentracija, 600
milijonų progresyviai judančių spermatozoidų prieš spermos skiedimą. Kumelės turi būti dirbtinai apvaisintos, skiesta ir atvėsinta sperma, per 24-36 valandas nuo spermos surinkimo. Prieš dirbtinį apvaisinimą, po skiestos ir atvėsintos spermos transportavimo, rekomenduojamas judrumas – ne maţesnis 35 proc. progresyviai judančių spermatozoidųspermosdozėje.
3. Šaldyta sperma (šiaudelio tūris – 5ml) – po šiaudelio atšildymo rekomenduojamas judrumas – ne maţesnis 35 proc. progresyviai judančių spermatozoidų. Taip pat rekomenduojama spermatozoidų koncentracija, po šiaudelio atšildymo, ne maţesnė 250 milijonų progresyviai judančių spermatozoidų (45).
17
2. TYRIMO METODAI IR MEDŢIAGA
2.1.
Tyrimo eiga
Tyrimas atliktas 2018 metais Danijos erţilų laikymo centruose ir LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje (1 pav.). Danijoje buvo aplankyti 5 erţilų laikymo centrai, kurie išsidėstę Danijos ţemyninėje dalyje, Jutlandijoje. Kiekviename erţilų centre laikomas skirtingas kiekis erţilų. Trijuose iš jų laikomi erţilai, kurie naudojami tik reprodukcijai ir iš jų reguliariai imama ir ruošiama sperma kumelių dirbtiniam sėklinimui – Danijoje, t.y. Šetlando ponių ir Fryzų veislės arkliai. Kituose dvejuose centruose yra laikomi erţilai, kurie treniruojami, ruošiami dailiojo jojimo varţyboms. Juose yra laikomi ne tik erţilai, bet ir kumelės, kumeliukai, klientų ţirgai. Hanoverių, Holšteinų, Danų šiltakraujų veislės erţilai yra laikomi atskirame pastate, kuriame įrengta maţa laboratorija. Čia paimta, skiesta atvėsinta sperma transportuojama ne tik po visą Danijos teritoriją, bet ir eksportuojama į kitas Europos šalis. Visuose erţilų centruose buvo surinkti 22 skiestos ir atvėsintos spermos mėginiai. Visi mėginiai buvo imti skirtingomis dienomis, pagal išanksto suplanuotą planą iš transportinių dėţučių, kuriuose palaikoma 5oC temperatūra. Mėginiai buvo surinkti vienodomis sąlygomis 1 valanda po švieţios spermos surinkimo. Visi erţilų spermos mėginiai buvo skiesti komerciniu NFDSM skiedikliu, skiedimo santykis 1:4.
18 1 pav. Tyrimo schema
2018 m. birţelio mėnesį buvo paruošti dar 9 mėginiai iš Danų šiltakraujų veislės, 8 metų erţilo, kurio sperma buvo surinkta 1, 2, 3 dienų intervalu.
Per 1 val. nuo spermos paėmimo ir paruošimo,erţilų laikymo centruose buvo nustatytas subjektyvus spermatozoidų judrumas ir paruošti transportiniai mėginiai, t.y. 1,5 ml talpos mėgintuvėliai su 190 µl formalino buvo pripildomi 10 µl skiestos atvėsintos, paruoštos kumelių sėklinimui, erţilų spermos. Surinkti spermos mėginiai pristatyti į LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratoriją, kurioje atlikti spermatozoidų morfologiniai tyrimai bei koncentracijos skaičiavimai.
22 erţilai buvo suskirstyti į skirtingas grupes pagal amţių, veislę bei aktyvumą. Erţilai pagal amţių suskirstyti į tris grupes: 1-4 metų amţiaus (1 grupė, n=5); 4-10 metų amţiaus (2 grupė, n=13); 10-17 metų amţiaus (3 grupė, n=4).
Pagal veislę erţilai buvo suskirstyti į 5 grupes: Šetlando poniai (n=3), Danų šiltakraujai (n=10), Hanoveriai (n= 3), Holšteinai (n=3), Fryzai (n=3).
Taip pat erţilai buvo suskirstyti pagal aktyvumą į 3 grupes:
Reproduktoriai (n=6) – laikomi veislynuose tik dėl spermos paėmimo, pramogos. Erţilai kiekvieną dieną po 6 valandas praleidţia lauko levadoje.
19 Treniruojami (n=7) – daţniausiai jauni arkliai, kurie treniruojami dailiajam jojimui 4 kartus per savaitę po 30 minučių, per dieną apie 5 valandas praleidţia lauko levadoje. Savaitgaliais netreniruojami.
Varţybiniai (n=9) –arkliai, kurie treniruojami dailiajam jojimui, 5 kartus per savaitę po 45 minutes, tačiau nemaţiau du kartus per mėnesį dalyvauja dailiojo jojimo varţybose. Savaitgaliais netreniruojami, išskyrus suplanuotas varţybas. Lauko levadoje praleidţia nemaţiau 5 valandas per dieną.
Iš Danijos privataus ūkininko, kuris uţsiima erţilų spermos ruošimu ir laiko 8 erţilus, buvo papildomai surinkti 9 skiestos atvėsintos spermos mėginiai. Tiriamasis erţilas– aštuonių metų, Danų šiltakraujis, kuris yra intensyviai treniruojamas, dalyvauja įvairaus lygio varţybose. Erţilas paklausus tarp veisėjų, turi įtemptą spermos ėmimo grafiką, tačiau tai turi būti derinama su varţybomis. Dėl varţybų grafiko ir klientų poreikių spermos ėmimo laikas skyrėsi. Iš viso surinkti 9 mėginiai, skirtingomis dienomis: birţelio 11, 12, 13 dienomis (vienos dienos intervalas); birţelio 18, 20, 22 dienomis (dviejų dienų intervalas); birţelio 5, 8 ir 10 dienomis (trijų dienų intervalas).
2.2. Subjektyvaus spermatozoidų judrumo nustatymas
Subjektyvus spermatozoidų judrumas buvo nustatinėjamas erţilų laikymo centruose. Spermos mėginiai buvo paruošti transportavimui, todėl praskiesti su skiedikliu nebuvo koncentruoti. Judrumas buvo vertinamas 37 ± 0,5oC temperatūroje, kadangi norima pamatyti maksimalų spermatozoidų judėjimą. Mėginiai buvo tiriami su mikroskopu, kuris turi integruotą šildomąjį stalelį, palaikantį 37oC temperatūrą. Ant šilto objektinio stiklelio, uţlašinus 10 µl paruoštos spermos ir uţdengus šiltu dengiamuoju stikleliu buvo vertinamas spermatozoidų judrumas × 200 kartų padidinimu. Vertinimas buvo subjektyvus, stebimi progresyviai, t.y. tiesiai judantys spermatozoidai penkiuose matymo laukuose. Nustatytas tiesiai judančių spermatozoidų kiekis lygintas 100 proc. skalėje.
2.3. Spermatozoidų koncentracija
Visi mėginiai buvo surinkti ir pristatyti į LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratoriją. Paruošti, uţkonservuoti formalinu, mėginiai buvo laikomi transportiniuose mėgintuvėliuose. Kurie prieš tyrimą sumaišyti, kad ląstelės pasiskirstytų tolygiai mėginyje. Paruošiama hemocitometrinė – NewBauer skaičiavimo kamera, ant kurios papučiamas oras ir atsargiai prilipinamas dengiamasis stiklelis, kol pasirodo Niutono ţiedai. Skaičiavimo kamera uţpildyta kruopščiai išmaišytos spermos – mikroskopuojama. Spermatozoidai skaičiuojami 5 dideliuose kameros kvadratėliuose, kurie
20 sudaryti iš 80 maţesnių kvadratėlių įstriţai arba 0,2 mm2
ploto. Skaičiuojamos spermatozoidų galvutės, kurios yra kvadrato viduje bei ant viršutinės ir dešinės kraštinės. Spermatozoidų koncentracija skaičiuojama pagal formulę:
K= S × PL × 5 × 10 × 1000
K – spermatozoidų koncentracija 1 ml; S – spermatozoidų skaičius 80-yje maţų kvadratėlių; PL – praskiedimo laipsnis; 5 – koeficientas, kuris parodo, kad spermatozoidai buvo skaičiuoti 0,2 mm2 kameros ploto; 10 – daugiklis, nurodantis kameros gylį – 0,1 mm.; 1000 – daugiklis perskaičiuoti spermatozoidų koncentraciją į 1 ml.
2.4. Patologinių spermatozoidų galvučių nustatymas metileno
mėlynaisiais daţais
Morfologinis spermatozoidų galvučių nustatymui buvo paruošiamas spermos tepinėlis ir nudaţomas metileno mėlynaisiais daţais. Ant objektinio stiklelio uţlašinamas lašas (10 µl) spermos, padaromas tepinėlis ir išdţiovinamas ore. Vėliau preparatas fiksuojamas 99 etanolyje ir vėl išdţiovinamas ore. Tepinėlis daţomas metileno mėlynaisias daţais 10 min. Nudaţytas objektinis stiklelis nuplaunamas distiliuotu vandeniu keturias sekundes ir išdţiovinamas ore.
Vertinimas atliktas šviesiniu mikroskopu su aliejine imersija, naudojant 1000 kartų padidinimą. Skaičiuojama 500 spermatozoidų iš įvairių tepinėlio vietų atsitiktine tvarka, apskaičiuojamas patologinių galvučių kiekis procentais. Spermatozoidų galvučių patologijos buvo skirstomos į tokias kategorijas:
1. Kriaušės formos galvutės.
2. Siauro pagrindo galvutės.
3. Nenormalių kontūrų galvutės.
4. Neišsivysčiusios galvutės.
5. Laisvos galvutės be uodegėlės.
6. Siauros galvutės.
7. Didelės galvutės.
8. Maţos normalios formos galvutės.
9. Trumpos – plačios galvutės.
21
2.5. Patologinių spermatozoidų uodegėlių nustatymas buferiniame
formaline
Sperma skiedţiama buferiniu formalino tirpalu santykiu 1:10. Atskiestos spermos lašas (5 µl) dedamas ant objektinio stiklelio ir uţdengiamas dengiamuoju stikleliu. Preparatas lengvai nusausinamas popieriumi ir keletą minučių leidţiama spermatozoidams nusėsti ant stiklelio dugno. Mikroskopuojama fazių kontrastiniu mikroskopu 400 kartų padidinimu. Skaičiuojame 200 atsitiktine tvarka preparate pasirinktų spermatozoidų, apskaičiuojamas patologinių uodegėlių kiekis procentais. Spermatozoidų uodegėlių ir kitos patologijos buvo skirstomos į tokias grafas:
Spermatozoidų uodegėlių patologijos:
1. Vidurinės dalies pakitimai.
2. Paprastai susisukusios uodegėlės.
3. Uodegėlės susisukusios po galva.
4. Dvigubai susisukusios uodegėlės.
Spermatozoidų kitos patologijos: 1. Proksimaliniai lašeliai. 2. Distaliniai lašeliai.
3. Spermatozoidų galvutės be uodegėlių.
4. Akrosomos defektai.
5. Akrosomos pakitimai.
6. Vakuolės.
2.6. Statistinė duomenų analizė
Statistinė analizė apskaičiuota naudojantis „Microsoft Excel 2003” programa. Apskaičiuoti aritmetiniai vidurkiai (AVARAGE), standartinis nuokrypis (STDEV), paklaidos (SQRT), statistinis reikšmingumas (TTEST).
22
3.
TYRIMŲ REZULTATAI
Tyrime dalyvavo 22 erţilai, kurių skiestos ir atvėsintos spermos kokybė buvo lyginama tarp skirtingų amţiaus, veislės, aktyvumo grupių. Apskaičiavus spermatozoidų kiekį dozėse buvo nustatyta vidutinė spermatozoidų koncentracija skiestoje ir atvėsintoje erţilų spermoje – 94,67 ± 3,45 mln/ml. Taip pat nustatytas vidutinis spermatozoidų subjektyvus judrumas erţilų skiestos ir atvėsintos spermos dozėse, kuris siekė – 51,82 ± 2,15 proc.
Schemoje (2 pav.) matome sveikų (71,34 ± 2,95 proc.) ir patologinių (28,66 ± 2,86 proc.) spermatozoidų vidurkio pasiskirstymą skiestoje ir atvėsintoje erţilų spermoje. Didţiausią patologinių spermatozoidų procentinę išraišką sudarė galvučių patologijos – 15,45 ± 2,25 proc., maţesnes dalis: uodegėlių patologijos – 7,73 ± 1,25 proc. ir kitos patologijos – 5,48 ± 0,93 proc.
2pav. Ištirtų eržilų sveikų ir patologinių spermatozoidų pasiskirstymas skiestoje atvėsintoje
spermoje 71,34% 15,45% 7,73% 5,48% 28,66%
23
3.1. Spermatozoidų judrumo ir koncentracijos palyginimas tarp erţilų
veislės, amţiaus ir aktyvumo skiestoje atvėsintoje spermoje
3 pav.Spermatozoidų koncentracijos ir judrumo palyginimas tarp eržilų skirtingų amžiaus
grupių,skiestos atvėsintos spermos dozėje
Analizuojant erţilus tarp skirtingų amţiaus grupių, nustatėme spermatozoidų koncentracijos vidurkius (3 pav.). Maţiausios spermatozoidų koncentracijos buvo pirmojoje grupėje erţilų (n=5) iki 4 metų amţiaus –79 ± 11,5 mln/ml. ir antrojoje grupėje erţilų (n=13) nuo 4 iki 10 metų amţiaus – 78,84 ± 10,09 mln/ml. Trečiojoje amţiaus grupėje (n=4) nuo 10 iki 17 metų nustatyta didţiausia spermatozoidų koncentracija dozėje – 83,25 ± 9,99 mln/ml. Patikimų spermatozoidų koncentracijos skirtumų tarp erţilų amţiaus grupių nenustatyta (p > 0,05).
Atvėsintoje spermos dozėje skaičiuojant subjektyvų spermatozoidų judrumą ir lyginat su erţilų amţiumi: 1-4 metų amţiaus grupėje nustatyta – 52 ± 2 proc. Progresyviai judrių spermatozoidų, 4-10 metų–51,54 ± 4,05 proc., o 10-17 metų erţilų grupėje–52,5 ± 2,5 proc. Erţilų amţiaus grupėje nuo 10 iki 17 metų nustatytas didţiausias spermatozoidų judrumas, kuris buvo 0,96 proc. didesnis negu antrojoje, t.y. 4-10 metų amţiaus grupėje, tačiau statistiškai patikimo skirtumo nenustatyta (p > 0,05). 46 48 50 52 54 56 58 60 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0
1-4 metų 4-10 metų 10-17 metų Sp
er m ato zo id ų ju du rm o vid ur kis , p ro c. Sp er m ato zo id ų ko nce ntr ac ij os v id u rk is , m ln /m l.
Erţilų amţiaus grupės
24 4 pav.Spermatozoidų koncentracijos ir judrumo palyginimas tarp skirtingų eržilų veislių,
skiestos atvėsintos spermos dozėje
Įvertinus vidutinį spermatozoidų koncentracijos pasiskirstymą, skiestos ir atvėsintos spermos dozėje, tarp skirtingų erţilų veisliųnustatyta, kad Hanoverio veislės erţilai (n=3) turėjo didţiausią spermatozoidų koncentraciją – 120,66 ± 17,19 mln/ml. Maţesnės koncentracijos pavaizduotos grafike (4 pav.): Danų šiltakraujų (n=10) veislės erţilų – 85,4 ± 5,99 mln/ml., Holšteino veislės (n=3) erţilų – 76 ± 8,33 mln/ml., Šetlando ponių (n=3), 57,33 ± 2,85 mln/ml., Fryzų veislės (n=3) erţilų – 45,67 ± 4,70 mln/ml. Skirtumai tarp grupių statistiškai patikimi (p < 0,05).
Vertinant vidutinį spermatozoidų judrumą tarp skirtingų erţilų veislių skiestos ir atvėsintos spermos dozėje: Danų šiltakraujų veislės arklių atvėsinta sperma buvo judriausia – 57 ± 3,33 proc., (p > 0,05). Lyginant su Hanoverio veislės erţilais, kurių spermatozoidų judrumas buvo – 56,66 ± 3,33 proc., o tai 0,33 proc. maţesnis negu Danų šiltakraujų veislės. Kitose veislėse nustatytas judrumas: Holšteinų – 50 ± 0,00 proc., Šetlando ponių – 46,66 ± 3,33 proc., tačiau maţiausias spermatozoidų vidutinis judrumas skiestoje ir atvėsintoje spermoje registruotas Fryzų veislės erţilų – 36,66 ± 3,33 proc., (p < 0,05). 0 10 20 30 40 50 60 0 20 40 60 80 100 120 140 160
Fryzai Šetlando poniai Holšteinai Danų
šiltakraujai Hanoveriai Sp er m ato zo id ų ju dr um as, pr oc. Sp er m ato zo id ų ko nce ntr ac ij os v id u rk is , m ln /m l. Koncentracija Judrumas
25 5 pav.Spermatozoidų koncentracijos ir judrumo palyginimas tarp skirtingo eržilų
aktyvumo,skiestoje atvėsintoje spermoje
Lyginant erţilų spermatozoidų koncentracijas (5 pav.), tarp skirtingo aktyvumo grupių, skiestoje ir atvėsintoje spermoje, trečiojoje varţybinių erţilų grupėje (n=9) nustatyta didţiausia vidutinė spermatozoidų koncentracija – 87 ± 5,09 mln/ml., (p > 0,05) ir didţiausias vidutinis spermatozoidų judrumas – 58,88 ± 3,68 proc., kuris buvo statistiškai patikimas (p < 0,05). Antrojoje grupėje treniruojamų erţilų (n=7) nustatyta maţiausia vidutinė spermatozoidų koncentracija – 72,43 ± 11,01 mln/ml. (p > 0,05), taip pat maţiausias vidutinis spermatozoidų judrumas – 45,71 ± 1,66 proc., (p < 0,05). Pirmosios erţilų reproduktorių grupės (n=6) vidutinė spermatozoidų koncentracija – 77,17 ± 15,79 mln/ml. (p > 0,05), ir vidutinis judrumas – 48,33 ± 3,09 proc.buvo didesnis lyginant su treniruojamų erţilų grupe (p < 0,05).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Treniruojami Reproduktoriai Varţybiniai
Sp er m ato zo id ų ju dr um o vid ur kis , p ro c. Sp er m ato zo id ų ko nce ntr ac ij os v id u rk is , m lrd /m l.
Erţilų grupės pagal aktyvumą
26
3.2. Spermatozoidų patologijų palyginimas tarp skirtingų erţilų amţiaus
grupių skiestoje atvėstinoje spermoje
Analizuojant skirtingas erţilų amţiaus grupes, spermatozoidų patologinių galvučių vidurkis buvo didţiausias trečiojoje amţiaus grupėje (6 pav.) nuo dešimties iki septyniolikos metų –16,5 ± 2,05 proc., antrojoje amţiaus grupėje nuo keturių iki dešimties metų – 2,3 ± 2,3 proc., patologinių galvučių vidurkis buvo maţesnis – 4,2 proc. lyginant su trečiąja grupe. Maţiausias patologinių galvučių vidurkis nustatytas pirmojoje erţilų amţiaus grupėje iki keturių metų amţiaus –10,3 ± 3,6 proc. Tačiau tarp grupių statistiškai patikimo skirtumo nenustatyta (p > 0,05).
6 pav.Spermatozoidų patologinių galvučių kiekis skirtingose eržilų amžiaus grupėse,
skiestoje atvėsintoje spermoje
Suskirstytos spermatozoidų galvutės pagal morfologinius pakitimus trečiojoje amţiaus grupėje (7 pav.) parodė, kad daugiausiai buvo registruojama spermatozoidų galvučių su nenormaliais kontūrais – 4,23 ± 1,48 proc., siauro pagrindo galvučių – 3,69 ± 0,64 proc., siaurų – 3 ± 0,56 proc., kriaušės formos – 2,65 ± 0,64 proc., paracentrinės implantacijos – 2,46 ± 0,76 proc., neišsivysčiusių – 0,85 ± 0,24 proc., maţų normalių – 0,42 ± 0,19 proc., trumpų plačių – 0,12 ± 0,12 proc., palaidų galvučių – 0,12 ± 0,08 proc.,maţiausiai registruota didelių spermatozoidų galvučių – 0,08 ± 0,05 proc. Statistiškai įvertinus spermatozoidų patologinių galvučių pasiskirstymą trečiosios amţiaus grupės erţilų spermoje, rezultatai yra statistiškai patikimi (p < 0,05).
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
1-4 metų 4-10 metų 10-17metų
Sp er m ato zo id ų pato lo gin ių g alv učių v id u rk is , p ro c.
27 7 pav. Skirtingos spermatozoidų galvučių patologijos trečiosios amžiaus grupės eržilų (10-17
metų), skiestoje atvėsintoje spermoje
Lyginant spermatozoidų patologinių uodegėlių pasiskirstymą tarp erţilų amţiaus grupių skiestoje atvėsintoje spermoje (8 pav.), daugiausiai registruota trečiojoje erţilų amţiaus grupėje nuo dešimties iki septyniolikos metų –10,5 ± 5,3 proc., maţiau antrojoje erţilų amţiaus grupėje nuo keturių iki dešimties metų –7,85 ± 1,51 proc., maţiausias spermatozoidų patologinių uodegėlių vidutinis kiekis nustatytas pirmosios amţiaus grupės erţilų spermojeiki keturių metų – 5,2 ± 1,6 proc., tačiau patikimų skirtumų tarp amţiaus grupių nenustatyta (p > 0,05).
8 pav. Spermatozoidų patologinių uodegėlių kiekis skirtingose eržilų amžiaus grupėse,
skiestoje atvėsintoje spermoje
0 1 2 3 4 5 Didelės Palaidos Trumpos-plačios Maţos normalios Neišsivysčiusios Paracentrinės Kriaušės formos Siauros Siauro pagrindo Nenormalių kontūrų
Spermatozoidų galvučių morfologinių pakitimų vidurkis, proc
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
1-4 metų 4-10 metų 10-17 metų
Sp er m ato zo id ų pato lo gin ių u od eg ėlių v id u rk is , p ro c.
28 Pateikta analizė, trečiosios grupės erţilų spermos (9 pav.), kurių amţius nuo dešimties iki septyniolikos metų atskleidė spermatozoidų patologinių uodegėlių skirtingus pakitimus. Daugiausiai buvo uţregistruota paprastai susisukusių uodegėlių, kurios sudarė – 6 ± 3,86 proc., vidurinės dalies pakitimai – 2,75 ± 0,85 proc., uodegėlės susisukusios po spermatozoido galva – 1,63 ± 0,83 proc., tačiau dvigubai susisukusios uodegėles sudarė maţiausią spermatozoidų patologinių uodegėlių dalį – 0,13 ± 0,13 proc., (p > 0,05).
9 pav. Skirtingos spermatozoidų uodegėlių patologijos trečiojoje amžiaus grupėje (10-17
metų)
Suskaičiavus procentiškai registruotas kitas spermatozoidų patologijas erţilų spermoje (10 pav.) daugiausia jų buvo nustatyta antrosios amţiaus grupės erţilų spermoje nuo keturių iki dešimties metų – 7,08 ± 1,61 proc., pirmojoje grupėje iki keturių metų buvo registruota maţiau kitų spermatozoidų patologijų – 3,4 ± 0,33 proc., tačiau maţiausias kiekis nustatytas trečiosios amţiaus grupės erţilų spermoje nuo dešimties iki septyniolikos metų amţiaus – 2,88 ± 0,52 proc. (p > 0,05).
0 1 2 3 4 5 6 7
Vidurinės dalies pakitimai Paprastai susisukusios uodegėlės Uodegėlės susisukusios po galva Dvigubai susisukusios uodegėlės
29 10pav. Kitų spermatozoidų patologijų kiekis skirtingose eržilų amžiaus grupėse, skiestoje
atvėsintoje spermoje
Išanalizavus kokių kitų spermatozoidų patologijų buvo rasta antrosios amţiaus grupės spermoje (11 pav.), kurių amţius nuo keturių iki dešimties metų, nustatyta, kad didţiausią dalį sudarė proksimaliniai lašeliai – 3,73 ± 0,78 proc. ir distaliniai lašeliai – 3,12 ± 0,91 proc., maţiausiai buvo registruota spermatozoidų galvučių be uodegėlių – 0,19 ± 0,13 proc. ir akrosomos defektų – 0,04 ± 0,04 proc., (p < 0,05). Akrosomų pakitimų bei vakuolių nebuvo rasta antrojoje amţiaus grupėje.
11 pav. Skirtingos kitos spermatozoidų patologijos antrojoje eržilų amžiaus grupėje (4-10
metų), skiestoje atvėsintoje spermoje
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
10-17 metų 1-4 metų 4-10 metų
Kitų s per m ato zo id ų pato lo gij ų v id u rk is , p ro c.
Erţilų amţiaus grupės
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Proksimaliniai lašeliai Distaliniai lašeliai Galvutės be uodegėlių Akrosomos defektai
30
3.3. Spermatozoidų patologijų palyginimas skirtingų erţilų veislių
skiestoje atvėsintoje spermoje
Analizuojant spermatozoidų patologinių galvučių vidurkius 5veislių erţilų spermoje: Šetlando ponių (n=3), Danų šiltakraujų (n=10), Hanoverių (n=3), Holšteinų (n=3), Fryzų (n=3), maţiausias kiekis nustatytas Šetlando ponių veislės erţilų skiestoje atvėsintoje spermoje – 5,5 ± 1,44 proc., kitų veislių: Danų šiltakraujų – 12,3 ± 2,3 proc., Holšteinų – 13,5 ± 2,02 proc., Hanoverių – 16,5 ± 2,36 proc. Didţiausias vidutinis spermatozoidų patologinių galvučių kiekis nustatytas Fryzų veislės erţilų spermoje, kuris siekė – 36,8 ± 1,36 proc. (12 pav.). Statistiškai reikšmingas skirtumas rastas lyginant Fryzų veislės erţilus su visomis erţilų grupėmis (p < 0,05).
12 pav. Spermatozoidų patologinių galvučių kiekis skirtingų eržilų veislių skiestoje atvėsintoje
spermoje
Analizuojant Fryzų veislės arklius, kurie turėjo didţiausią spermatozoidų patologinių galvučių kiekį, nustatyta kokių morfologinių pakitimų rasta daugiausiai (13 pav.). Siauros spermatozoidų galvutės uţėmė didţiausią dalį – 13,83 ± 0,6 proc., (p < 0,05), po jų sekė nenormalių kontūrų galvutės – 13 ± 1,04 proc., paracentrinės implantacijos – 4 ± 0,29 proc., kriaušės formos – 2,5 ± 0,76 proc., neišsivysčiusių spermatozoidų galvučių rasta – 1,63 ± 0,44 proc., maţų normalių galvučių – 1,33 ± 0,44 proc., siauro pagrindo galvučių – 0,5 ± 0,29 proc., (p > 0,05). Fryzų veislės erţilų spermoje nebuvo rasta palaidų, didelių bei trumpų-plačių spermatozoidų galvučių patologijų.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Šetlando poniai Danų šiltakraujai Holšteinai Hanoveriai Fryzai
Sp er m ato zo id ų pato lo gin ių g alv učių v id u rk is , p ro c. Erţilų veislės
31 13 pav. Skirtingos spermatozoidų galvučių patologijos Fryzų veislės eržilų grupės skiestoje ir
atvėsintoje spermoje
Vertinant erţilų spermatozoidų patologinių uodegėlių vidutinį kiekį skiestoje atvėsintoje spermoje (14 pav.), daugiausiai buvo registruojama Hanoverio veislės erţilų spermoje – 15 ± 4,5 proc., kitų veislių: Šetlando ponių – 8 ± 1,3 proc., Danų šiltakraujų – 7,2 ± 1,7 proc., Holšteinų – 5 ± 1,69 proc., maţiausias procentas nustatytas Fryzų veislės arklių skiestoje atvėsintoje spermoje – 4 ± 0,17 proc., tačiau patikimų skirtumų tarp erţilų amţiaus grupių nenustatyta (p > 0,05).
14 pav. Spermatozoidų patologinių uodegėlių kiekis skirtingų eržilų veislių skiestoje
atvėsintoje spermoje 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Siauro pagrindo Maţos normalios Neišsivysčiusios Kriaušės formos Paracententrinės Nenormalių kontūrų Siauros
Spermatozoidų galvučių morfologinių pakitimų vidurkis, proc
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Fryzai Holšteinai Danų šiltakraujai Šetlando poniai Hanoveriai
Sp er m ato zo id ų pato lo gin ių u od eg ėlių v id u rk is , p ro c. Erţilų veislės
32 Hanoverių veislės erţilų spermojebuvo rastas didţiausias kiekis spermatozoidų su patologinėmis uodegėlėmis. Išanalizavus kokios patologijos buvo registruojamos daţniausiai, grafike matome (15 pav.), kad didţiausią kiekį sudarė paprastai susisukusios uodegėlės – 8,83 ± 4,48 proc., maţesnis kiekis suskaičiuotas vidurinės dalies pakitimų – 4,17 ± 1,17 proc., uodegėlių susisukusių po spermatozoido galvute – 1,83 ± 1,17 proc., maţiausią dalį sudarė dvigubai susisukusios uodegėlės – 0,17 ± 0,17 proc., (p < 0,05).
15 pav. Skirtingos spermatozoidų uodegėlių patologijos Hanoverių veislės eržilų skiestoje
atvėsintoje spermoje
Suskaičiavus vidutinį kitų spermatozoidų patologijų kiekį skirtingų erţilų veislių spermoje (16 pav.), daugiausia buvo registruojama Fryzų veislės erţilų spermoje –7,83 ± 0,73 proc., (p < 0,05) kitų veislių pasiskirstymas grafike: Danų šiltakraujai – 6,7 ± 1,82 proc., Šetlando poniai – 3,5 ± 0,5 proc., Holšteinai – 3,33 ± 0,33 proc., maţiausias kiekis nustatytas Hanoverio veislės erţilų spermoje – 3,17 ± 1,39 proc., (p < 0,05).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Dvigubai susisukusios uodegėlės Uodegėlės susisukusios po galva Vidurinės dalies pakitimai Paprastai susisukusios uodegėlės
33 16 pav. Kitų patologinių spermatozoidų kiekis skirtingų eržilų veislių skiestoje atvėsintoje
spermoje
Fryzų veislės arklių skiestoje atvėsintoje spermoje buvo daugiausiai rasta kitų spermatozoidų patologijų, kurių didţiausią dalį sudarė proksimaliniai lašeliai –6 ± 0,58 proc. ir distaliniai lašeliai – 1,83 ± 0,17 proc. Laisvų spermatozoidų galvučių be uodegėlių, akrosomos defektų, akrosomos pakitimų, vakuolių nebuvo rasta šioje arklių grupėje.
3.4. Spermatozoidų patologijų palyginimas skirtingai aktyvių erţilų
skiestoje atvėsintoje spermoje
Vertinant vidutinį spermatozoidų patologinių galvučių kiekį skirtingo aktyvumo erţilų spermoje (17 pav.) daugiausiajų nustatyta treniruojamų erţilų grupėje – 23,14 ± 0,79 proc., varţybiniai erţilai turėjo maţesnį kieki – 12,56 ± 2,47 proc., tačiau maţiausias kiekis registruotas reproduktorių grupėje – 10,83 ± 1,17 proc. Skirtumai tarp grupių nebuvo statistiškai reikšmingi (p > 0,05). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hanoveriai Holšteinai Šetlando poniai Danų šiltakraujai Fryzai
Kitų p ato lo gin ių s per m ato zo id ų v id u rk is , p ro c. Erţilų veislės
34 17 pav. Spermatozoidų patologinių galvučių kiekis skirtingai aktyvių eržilų skiestoje
atvėsintoje spermoje
Treniruojamų erţilų grupėje buvo rastas didţiausias kiekis spermatozoidų patologinių galvučių. Didţiausią dalį sudarė nenormalių kontūrų spermatozoidų galvutės – 6,43 ± 2,39 proc. ir siauros galvutės – 6,21 ± 2,71 proc., kiti morfologiniai pakitimai išsidėstė maţėjančia tvarka: paracentrinės implantacijos – 3,79 ± 0,78 proc., siauro pagrindo – 2,43 ± 1,48 proc., kriaušės formos – 2,29 ± 0,31 proc., neišsivysčiusios galvutės – 1,36 ± 0,30 proc., maţos normalios galvutės – 0,57 ± 0,32 proc., didelės galvutės – 0,07 ± 0,07 proc. Palaidų ir trumpų-plačių galvučių treniruojamų erţilų spermoje nenustatyta (18 pav.).
18 pav. Skirtingos spermatozoidų galvučių patologijos treniruojamų eržilų skiestoje
atvėsintoje spermoje 0 5 10 15 20 25 30
Reproduktoriai Varţybiniai Treniruojami
Sp er m ato zo id ų p ato lo gin ių g alv učių v id u rk is , p ro c.
Erţilų grupės pagal aktyvumą
0 1 2 3 4 5 6 7 Didelės Maţos normalios Neišsivysčiusios Kriaušės formos Siauro pagrindo Paracentrinės Siauros Nenormalių kontūrų
35 Varţybinių erţilų grupės spermoje, nustatytas didţiausias vidutinis spermatozoidų patologinių uodegėlių kiekis – 11,39 ± 2,47 proc., (p < 0,05), reproduktorių grupėje registruotas maţesnis patologinių uodegėlių kiekis – 6,33 ± 1,17 proc., tačiau grafike matoma (19 pav.), kad maţiausias kiekis buvo registruotas treniruojamų erţilų grupėje – 4,21 ± 0,79 proc., (p > 0,05).
19 pav. Spermatozoidų patologinių uodegėlių kiekis skirtingai aktyvių eržilų skiestoje
atvėsintoje spermoje
Varţybinių erţilųspermoje, kurioje didţiausią dalį sudarė spermatozoidų patologinių uodegėlių kiekis, pavaizduotas grafike (20 pav.), kuris parodė, kad didţiausią dalį sudarė paprastai susisukusios uodegėlės – 7,33 ± 1,47 proc., maţiau buvo rasta vidurinės dalies pakitimų – 2,61 ± 0,60 proc., uodegėlių susisukusių po galva – 1,22 ± 0,65 proc. ir dvigubai susisukusių uodegėlių – 0,22 ± 0,17 proc. 0 2 4 6 8 10 12 14 16
Treniruojami Reproduktoriai Varţybiniai
Sp er m ato zo id ų pato lo gin ių u od eg ėlių v id u rk is , p ro c.
36 20 pav. Skirtingos spermatozoidų uodegėlių patologijos varžybinių arklių skiestoje
atvėsintoje spermoje
Lyginant erţilų skirtingo aktyvumo grupių spermą ir kitų patologinių spermatozoidų vidutinį kiekį, grafike matoma (21 pav.), kad varţybinių erţilųsperma, turėjo didţiausią kiekį spermatozoidų su kitomis patologijomis – 7,33 ± 1,99 proc., maţiausias kitų patologinių spermatozoidų kiekis registruotas reproduktorių erţilų spermoje – 2,92 ± 0,45 proc. Treniruojamų erţilų skiestoje atvėsintoje spermoje nustatytas – 5,29 ± 0,96 proc. vidutinis kiekis kitų spermatozoidų patologijų. Gauti statistiniai duomenys patikimi (p < 0,05).
21 pav. Kitų patologinių spermatozoidų kiekis skirtingai aktyvių eržilų skiestoje atvėsintoje
spermoje
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Dvigubai susisukusios uodegėlės Uodegėlės susisukusios po galva Vidurinės dalies pakitimai Paprastai susisukusios uodegėlės
Spermatozoidų uodegėlių morfologinių patikimų vidurkis, proc.
0 2 4 6 8 10
Reproduktoriai Treniruojami Varţybiniai
Kitų s per m ato zo id ų pato lo gij ų v id u rk is , p ro c.
37 Išanalizavus varţybinių erţilų grupės spermą nustatėme, kad kitų spermatozoidų patologijų didţiausias vidutinis kiekis buvo proksimalinių lašelių – 3,39 ± 0,93 proc. ir distalinių lašelių –3,72 ± 1,28 proc., maţesnę dalį sudarė palaidos patologinės galvutės – 0,17 ± 0,17 proc. ir akrosomos defektai – 0,06 ± 0,06 proc. Akrosomų pakitimų ir vakuolių spermatozoiduose varţybinių erţilų grupės skiestoje atvėsintoje spermoje nustatyta nebuvo.
38
3.5. Skirtingomis dienomis paruoštos skiestos atvėsintos spermos
koncentracijos ir judrumo palyginimas
Grafike pavaizduota erţilo spermos vidutinė koncentracija ir judrumas, kuri buvo surinkta vienos, dviejų ir trijų dienų intervalais (22 pav.). Nustatyta didţiausia vidutinė spermatozoidų koncentracija dozėje, kai sperma buvo imta trijų dienų intervalu – 100,33 ± 2,34 mln/ml.Spermatozoidų koncentracijos skirtumas lyginant su vienos dienos spermos ėmimo intervalu – 36 mln/ml.spermatozoidų (p < 0,05), tačiau su dviejų dienų intervalu skirtumas statistiškai nereikšmingas.
Spermatozoidų judrumas skiestoje atvėsintoje spermoje, trijų dienų erţilų spermos ėmimo intervale, buvo maţiausias – 53,33 ± 3,33 proc. Spermos dozėje, kuri buvo surinkta dviejų dienų intervalu, turėjo didţiausią vidutinį spermatozoidų judrumo procentą – 66,66 ± 3,33 proc. (p > 0,05), bet maţesnę vidutinę spermatozoidų koncentraciją – 90 ± 3,61 mln/ml., lyginant su spermos doze surinkta trijų dienų intervalu. Maţiausia vidutinė spermatozoidų koncentracija nustatyta spermos dozėje, kuri buvo surinkta vienos dienos intervalu – 64,33 ± 6,22 mln/ml. Taip pat vidutinis judrių spermatozoidų kiekis buvo nustatytas maţiausias – 63,33 ± 3,33 proc., lyginant su dviejų ir trijų dienų intervalais (p < 0,05).
22 pav. Spermatozoidų koncentracijos ir judrumo palyginimas skirtingu intervalu surinktos
eržilo atvėsintos spermos dozėse
0 10 20 30 40 50 60 70 0 20 40 60 80 100 120
1 diena 2 dienos 3 dienos
Sp er m ato zo id ų ju dr um o vid ur kis , p ro c. Sp er m ato zo id ų k o n ce n tr ac ij o s v id u rk is , m ln /m l. koncentracija judrumas
39
4.
REZULTATŲ APTARIMAS
Mokslinėje literatūroje nėra aiškiai suformuluoto paruoštos skiestos ir atvėsintos erţilų spermos kokybės standarto. Įvairiuose literatūros šaltiniuse pateikiama, kad ideali erţilų sperma tinkama sėklinimui, jei joje ne daugiau 35-40 proc. patologinių spermatozoidų, spermatozoidų koncentracija dozėje, paruoštoje kumelių sėklinimui turi būti ne maţiau 25-50 × 106
mln/ml., spermatozoidų judrumas negali būti maţesnis nei 35 proc. (46). Apibendrinant mūsų tyrimo gautus rezultatus, nustatyta, kad vidutinė spermatozoidų koncentracija skiestose ir atvėsintose erţilų dozėse buvo – 94,67 ± 3,45 mln/ml, vidutinis judrumas siekė – 51,82 ± 2,15 proc., patologinių spermatozoidų kiekis vidutiniškai sudarė – 28,66 ± 2,86 proc. Tai rodo, kad Danijos veislininkystės centruose surinkta atvėsinta erţilų sperma, paruošta kumelių sėklinimui, yra gana aukštos kokybės ir atitinka mokslininkų rekomendacijas.
Atlikto tyrimo metu, vertinant spermos kokybę tarp skirtingų amţiaus grupių, parodė, kad 10-17 metų erţilų sperma turėjo didţiausią spermatozoidų koncentraciją ir judrumą. K.F. Dowsett ištyręs 198 skirtingo amţiaus erţilus nustatė, kad didţiausia spermatozoidų koncentracija buvo pastebėta erţiluose, kurie buvo 12 ir 13 metų amţiaus. Taip pat mokslininkas tyrime aprašė patologinių spermatozoidų kiekį tarp skirtingų amţiaus grupių ir išvadose pateikė, kad daugiausia morfologiškai pakitusių spermatozoidų buvo randama erţiluose iki 3 metų ir po 10 metų amţiaus (36). Mūsų tyrime, 10-17 metų erţilai turėjo didţiausią spermatozoidų patologinių galvučių ir uodegėlių skaičių. Iš kurių daugiausiai identifikuota nenormalių kontūrų spermatozoidų galvutės ir paprastai susisukusios uodegėlės. Kitos spermatozoidų patologijos, kurių daugiausia buvo registruota erţilų grupėje nuo keturių iki dešimties metų nesutampa su mokslininkų nuomone, galbūt dėl gana maţo (n=4) narių skaičiaus grupėje. Christa R. Darr, kartu su bendraautoriais teigia, kad spermatozoide esančios mitochondrijos funkcijos, kurios pamatuotos deguonies panaudojimu ir nuo kurių priklauso spermatozoido judėjimas yra didţiausios erţiluose iki trylikos metų amţiaus (47). Gauti rezultatai parodė, kad didţiausias erţilų spermatozoidų judrumas nustatytas amţiaus grupėje nuo dešimties iki septyniolikos metų amţiaus.
Maţiausia spermatozoidų koncentracija bei judrumas nustatytas Fryzų veislės erţiluose. Taip pat šios veislės erţilų spermoje nustatytas didţiausias patologinių spermatozoidų galvučių ir kitų patologijų skaičius. Didţiausia dalis rasta siaurų patologinių galvučių bei proksimalinių lašelių. M.Boer teigia, kad Fryzų bei Šetlando ponių veislės arklių sperma yra prastesnės kokybės dėl aukšto inbrydingo laipsnio. Fryzų veislės erţilų spermoje patologinių spermatozoidų skaičius gali sudaryti 65 proc., judrumas bei koncentracija 0,22 karto maţesnis lyginant su kitomis erţilų veislėmis (38).
40 Lyginant erţilų grupes suskirstytas pagal aktyvumą, varţybinių arklių grupėje buvo nustatyta didţiausia vidutinė spermatozoidų koncentracija bei judrumas. Taip pat didţiausias kitų patologinių spermatozoidų ir jų uodegėlių skaičius. F.Jannet su mokslininkų komanda tyrė kaip intensyvus darbas veikia spermos kokybę. Nustatyta, kad intensyviai treniruojamų erţilų grupėje spermatozoidų judrumas buvo maţesnis negu kitų grupių arklių, bet koncentracija didesnė. Tačiau patologinių spermatozoidų skaičius buvo didesnis ypač tokių kaip akrosomų defektų. Padaryta išvada, jog intensyvus darbas blogina spermos kokybę (33). Ištirta varţybinių arklių sperma, patvirtino F.Jannet išvadas, dėl didesnio patologinių spermatozoidų kiekio. Vienintelėje grupėje iš visų, varţybinių arklių grupėje buvo rasta akrosomų defektų, kurie yra vieni iš svarbiausių vertinant erţilo vaisingumą. Akrosomos defektai uţkerta kelia normaliam spermatozoido prasiskverbimui į kiaušialąstę.
Vertinant skirtingomis dienomis paruoštos skiestos atvėsintos spermos koncentracijos ir judrumo duomenis, nustatyta, kad didţiausia spermatozoidų koncentracija buvo sperma imant trijų dienų intervalu, o didţiausias spermatozoidų vidutinis judrumas nustatytas vienos dienos intervale. H.Sieme su mokslininkų grupe iš Hanoverio universiteto, tyrė spermos ėmimo intervalų įtaką spermos kokybei. Vienos ir dviejų dienos intervalas tarp spermos surinkimo parodė didţiausias spermatozoidų koncentracijas lyginant su trijų dienų intervalu. Spermatozoidų judrumo pokytis nepastebėtas tiriant skirtingas grupes (48). Tačiau H.Sieme tyrimas buvo atliktas viso sezono metu, erţilams nekeičiant spermos ėmimo daţnumo. Mano tyrime panaudotaserţilas nėra naudojamas tik reprodukcijai, sperma yra surenkama tik pagal poreikius. Todėl duomenis gauti nepatvirtino H. Sieme tyrimo rezultatų. Didţiausia vidutinė spermatozoidų koncentracija nustatyta spermą imant trijų dienų intervalu. Didţiausias vidutinis spermatozoidų judrumas nustatytas spermą imant dviejų dienų intervalu.
