LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Julius Kavaliauskas
Atšildytos bulių spermos
kapacitacijos tyrimas in vitro
Investigation of post-thaw
bull semen capacitation in
vitro
Veterinarinės medicinos vientisųjų
studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Prof.dr. Vytuolis Žilaitis
1 DARBAS ATLIKTAS STAMBIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Atšildytos bulių spermos
kapacitacijos tyrimas in vitro“:
1. yra atliktas mano paties (pačios).
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE DARBO LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ
Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba taisyklinga.
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os)
vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas,
pavardė) (paraša s)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas,
2
Turinys
SANTRUMPOS ... 3 SANTRAUKA ... 4 Master‘s Thesis ... 5 SUMMARY ... 5 ĮVADAS ... 6 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 71.1. Bulių spermatozoidų sandara ir savybės ... 7
1.2. Biocheminiai ir fiziologiniai spermatozoido pasikeitimai kapacitacijos metu ... 8
1.3. Kapacitacija in vivo ... 9
1.4. Kapacitacija in vitro ... 10
1.5. Spermatozoidų kriokonservavimo įtaka spermatozoidų judrumui ... 11
1.6. Kapacitacijos įtaka judrumui ... 11
1.7. Su kapacitacija susijusi akrosominė būklė ... 12
1.8. Akrosominė būklė kapacitacijos metu ir jos įvertinimo metodai ... 13
1.9. Kiaušialąščių paruošimas apsivaisinimui in vitro ... 13
1.10. In vitro apvaisinimas ... 15
2. MEDŽIAGOS IR METODAI... 17
2.1. Pagrindinė bandymų schema ... 17
2.2. Atšildytos spermos paruošimas tyrimams ... 18
2.3. Kiaušialąščių tyrimas ... 18
2.4. Apvaisinimo in vitro tyrimas ... 18
2.5. Tyrimus reglamentuojantys įstatymai ... 19
2.6. Duomenų statistinė analizė ... 19
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 20
3.1. Spermatozoidų vaizdas, nudažius juos su Trypan blue dažais ... 20
3.2. Akrosominės būklės įvertinimas dažant spermatozoidus su Trypan blue dažais ... 21
3.3. Spermatozoidų, kapacituotų 60 minučių, judrumo nustatymas po skirtingų centrifugavimų 21 3.4. Spermatozoidų, kapacituotų 120 minučių, judrumo nustatymas po skirtingų centrifugavimų 22 3.5. COCs kompleksų pasiskirstymo nustatymas ... 23
3.6. Spermatozoidų, kapacituotų 60 min. ir 120 min., apvaisinimo procentas in vitro naudojant skirtingų tipų kiaušialąstes ... 24
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 25
5. IŠVADOS ... 27
REKOMENDACIJOS ... 28
PADĖKA... 29
3
SANTRUMPOS
BSP – galvijų sėkliniai plazmos proteinai (angl. Bovine seminal plasma protein); cAMP – aciklinis adenozinmonofosfatas;
COCs – kumuliuso ląstelių ir kiaušialąstės kompleksas (angl. cumulus-oocyte-complexes); CTC – chlortetraciklino testas;
DNR – deoksiribonukleorūgštis;
HEPES – hidroksietilo piperazineetansulfoninė rūgštis (angl.hydroxyethyl piperazineethanesulfonic
acid);
k. – kartų;
pH – aktyvusis rūgštingumas; proc. – procentai;
ROS – reaktyvaus deguonies radikalai (angl.Reactive oxygen species); s – sekundės;
4
ATŠILDYTOS BULIŲ SPERMOS KAPACITACIJOS TYRIMAS IN VITRO
Julius Kavaliauskas
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Pagrindinis šio darbo tikslas buvo ištirti kaip spermatozoidų kapacitacijos laikas ir centrifugavimas yra susijęs su judrumu, su akrosomine būkle bei gebėjimu apvaisinti kiaušialąstę in
vitro. Užšaldyta sperma iš Holšteino bulių buvo kapacituota pirmoje grupėje – 60 min. (n=17) ir
antroji grupė – 120 min. (n=17) plovimo metodu. Po inkubacijos spermatozoidai buvo dažomi Tripano mėlio (Trypan blue) dažais (Sigma, JAV) norint įvertinti gyvybingumą ir akrosomos būklę. Nudažyti spermatozoidai buvo suskirstyti į 3 grupes: negyvybingi, su kapacitacijos reakcija bei su akrosomine reakcija. Negyvybingų spermatozoidų skaičius po 120 min. kapacitacijos buvo 20 proc. mažesnis lyginant su 60 min. kapacitacija (p<0.05). Spermatozoidų su kapacitacijos reakcija po 120 min. inkubacijos buvo 20 proc. daugiau, o akrosominė reakcija buvo pasireiškusi 4,5 proc. daugiau lyginant su 60 min. kapacitacija.
Norėdami atskirti judrius nuo nejudrių spermatozoidų buvo atliktas centrifugavimo tyrimas 4 kartus po 10 min. Buvo nustatyta, kad spermatozoidų procentinis judrumas po 60 min. ir po 120 min. kapacitacijos nuo 1 iki 3 centrifugavimo tendencingai mažėjo (atitinkamai sumažėjo 17,5 proc. ir 30,0 proc.) (p<0,05). Po 4 centrifugavimo lyginant su 3 centrifugavimu 60 min. inkubuotų spermatozoidų judrumas padidėjo 15,0 proc., o 120 min. – 2,5 proc. (p<0,05).
Pieninių karvių kiaušialąstės buvo paiimtos iš karto po jų skerdimo ir transportuotos per valandą į laboratoriją. Apie donorų sveikatos būseną žinojome tiek, kad tai buvo Lietuvos Žalmargės ir Žalosios pieninės karvės (4 laktacija). Buvo išmatuota įvairių folikulų skersmenys. Kokybės kiaušialąščių matavimai (A,B,C,D) buvo atlikti remiantis kumuliuso ląstelių išsivystymu ir citoplazmos homogeniškumu pagal Chaubal et. Al (2006). Tik morfologiškai tinkamos kiaušialąstės buvo naudojamos jų brandinimui. Po apvaisinimo kumuliuso ląstelės buvo pašalintos iš nuspėjamos (presumptive) zigotos rankiniu būdu su pipete į SOF terpę (Minitub, Vokietija). Embrioninis skilimas buvo įvertintas per 48 valandas. Šis tyrimas parodė, kad 60 min. kapacituoti spermatozoidai buvo netinkami in vitro apvaisinimui su A tipo kiaušialąste, tuo tarpu 120 min. kapacituoti spermatozoidai buvo tinkami B tipo kiaušialąstėms (p>0,05). Nepilnavertėms kiaušialąstėms reikalinga daugiau judančių spermatozoidų, kurie sugebėtų ją apvaisinti.
5 INVESTIGATION OF POST-THAW BULL SEMEN CAPACITATION IN VITRO
Julius Kavaliauskas
Master‘s Thesis
SUMMARY
The aim of this study was to investigate the ability of acrosomal reaction, motility during capacitation at different time of bovine spermatozoa in relationship to in vitro fertility.
. Frozen sperm from a Holsteins bulls were capacitated first group – 60 min., (n-17 samples) and second group – 120 min. (n-17 samles) by a swim-up methods. After incubation Trypan blue (Sigma, JAV) stained was used to evaluate viability and acrosome status of spermatozoa. Stained spermatozoides was counting and divided in three groups: non-viable, hyperactivated and with acrosomal changes. Amount of nonviable spermatozoa after 120 min. capacitation were 20 % less compared with 60 min. capacitation (p<0,05). Spermatozoo with capacitation reaction after 120 min. incubation were 20 % more and acrosomal reaction were accured 4,5 % more compared with 60 min. capacitation.
In order to separate motile and non-motile spermatozoa were accomplished centrifugation 4 times every 10 minutes. It was established, that spermatozoa motility after 60 min. and after 120 minutes capacitation from first until third centrifugation gradually decreased (Accordingly decreased 17,5 % and 30 %) (p<0.05). After fourth centrifugation compared with third, 60 min. incubated spermatoa motility increased 15 % and 120 min.- 2.5 % (p<0.05).
The ovaries of dairy cows were cut out immediately after slaughter and transported within one hour. It was performed the diametre mm of various follicles measurement. Quality grading (A, B, C, D) of the oocytes was performed on the basis of cumulus cell development and homogeneity of cytoplasm according to Chaubal et al. (2006). Only normal COCs were used for maturation. After fertilization, the cumulus cells were removed from the presumptive zygotes by manual pipetting and transferred into SOF medium (Minitub, Germany). The embryonic cleavage was evaluated within 48 hours (cleavage rate). This study shows that the spermatozoa capacitated 60 min. was most suitable for in vitro fertilization A grade oocytes, while the spermatozoa capacitated 120 min. was suitable for B grade oocytes (p>0,05).
6
ĮVADAS
Įvairūs metodai su naminių gyvūnų gametomis bei spermatozoidais in vitro šiuo metu yra labiausiai pažengę biotechnologiniai metodai galvijų reprodukcijoje (8). Šiuo metu Lietuvoje telyčioms ir karvėms apsėklinti yra naudojama kriokonservuota-šiaudeliuose įšaldyta sperma, paiimta iš veislinių bulių (31). Tinkamam apvaisinimui tiek in vivo tiek in vitro spermatozoidai turi įgauti progresinį judėjimą ir apvaisinimo galimybę. Spermatozoidai turi pereiti svarbius biocheminius ir fiziologinius procesus, kurie vadinami kapacitacija (1). Spermatozoidų kapacitacija įtraukia du svarbius procesus pavadinimu hiperaktyvacija ir akrosominė reakcija (2). Šie procesai yra pamatas spermatozoidų gebėjimu apvaisinti kiaušialąstę. Tik kapacitavę spermatozoidai turi išskirtinę galimybę vykdyti akrosominę reakciją ir prasiskverbti į kiaušialąstę (18).
Atšildyta bulių sperma turi mažesnį procentinį spermatozoidų judrumą (30 proc.–70 proc.), todėl specialus dėmesys turėtų būti skiriamas spermatozoidų paruošimui procesams in
vitro (13). Būtina sąlyga efektyviam apvaisinimui in vitro yra pakankamas kiekis kapacituotų
judrių spermatozoidų, kurie galėtų apvaisinti kiaušialąstę.Vienas iš dažniausiai naudojamų metodų, norint atskirti judrius spermatozoidus iš atšildytos spermos, yra praplovimas. Šis metodas leidžia atskirti gyvybingus spermatozoidus, kurių akrosoma nėra pažeista (16).
Centrifugavimas yra vienas iš lengviausių ir dažniausiai naudojamų spermatozoidų atskyrimo metodų. Judrių spermatozoidų skaičius priklauso nuo centrifugavimo sąlygų. Vienas iš svarbiausių tikslų yra išsiaiškinti kaip kapacitacijos trukmė bei centrifugavimas yra susijęs su spermatozoidų judrumu, akrosomine būkle ir galimybe apvaisinti kiaušialąstę in vitro (11).
Darbo tikslas:
Ištirti kapacitacijos ekspozicijos (laiko) įtaką spermatozoidų judrumui, akrosomos būklei ir gebėjimui apvaisinti in vitro.
Uždaviniai:
1. Nustatyti kapacitacijos ekspozicijos laiko ir centrifugavimo įtaką spermatozoidų judrumui; 2. Nustatyti kapacitacijos ekspozicijos laiko įtaką spermatozoidų akrosomos būklei;
7
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Bulių spermatozoidų sandara ir savybės
Mikroskopų atsiradimas leido suprasti ir ištirti spermatozoidų struktūras ir funkcines savybes. Spermatozoidas yra vyriškame reprodukciniame trakte gaminama haploidinė ląstelė, kuri savo informaciją turi perduoti į kiaušialąstę. Anatomiškai spermatozoidas sudarytas iš 3 dalių: galvutės, vidurinės dalies ir uodgėlės. Nors visų žinduolių spermatozoidai sudaryti iš šių pagrindinių dalių, tačiau kaip pavyzdys galvutės forma tarp gyvūnų rūšių gali labai skirtis lyginant žinduolius ir graužikus (1).
Galvutę sudaro branduolys ir akrosoma. Akrosoma yra unikali spermatozoido organelė, susidarius iš Goldžio aparato, per ankstyvąją spermatogenezę. Kadangi akrosoma susidaro iš Goldžio aparato, ji dar vadinama specializuota lizosoma. Akrosoma uždengia didžiąją dalį (2/3) galvutės. Spermatozoidų akrosomos reikalingos saugoti ir paleisti hidrolizinius fermentus - hialuronidazė, neuromidazė, rūgštinė fosfatazė, esterazė bei tripsino tipo serininė proteazė – akrozinas. Šie fermentai yra saugomi tarp išorinės ir vidinės akrosomos membranos ir tam tikru laiku išsiskiria ir padeda prasiskverbti pro kiaušialąstės apvalkalą (zona pellucida). Branduolys saugo kondensuotą DNR, kuri turi būti perduota į kiaušialąstę. Branduolys apgaubtas specialiu citoskeletiniu kompleksu, vadinamu poakrosominiu lakštu (2).
Spermatozoido uodegelė sudaryta iš 4 segmentų – kaklelis, vidurinioji dalis, pagrindinė dalis ir galinė dalis. Visi 4 segmentai padengti plazmine membrana. Pati pagrindinė uodegos sudedamoji dalis yra aksonema, mitochondrinis apvalkalas bei tankios skaidulos. Viduriniąją dalį su pagrindine dalimi jungia struktūrinis elementas – žiedas (angl. annulus). Viduriniojoje dalyje susikaupia daugiausiai mitochondrijų, kurios reikalingos ATP gamyboje. Pagrindinė dalis ženkliai plonesnė lyginant su kakleliu ir ji atsakinga už spermatozoido stabilumą judėjimo metu (3).
Įdomu tai, kad per spermatogenezę, spermatozoidai įgauna tik tokias morfologijas ir funkcijas, kad jų tikslas būtų vienas – kuo efektyviau pasiekti ir apvaisinti kiaušialąstę. Bet lyginant su kitomis ląstelėmis spermatozoidai praradę gebėjimą vykdyti transkripciją ir transliaciją. Taip pat spermatozoidai neturi endocitozinio, egzocitozinio ar tarpląstelinio judėjimo (4).
Funkcionaliai spermatozoido galvutės paviršius skirstomas į 3 regionus: apikalinį, ekvatorinį ir poakrosominį (1).
8
1.2. Biocheminiai ir fiziologiniai spermatozoido pasikeitimai kapacitacijos
metu
Spermatozoido gyvavimas prasideda sėklidėse, kuriose jau būna morfologiškai pilnas, bet dar nesubrendęs. Antsėklidyje spermatozoidas įgauna judrumą, praranda citoplastinį lašelį ir pasibaigia chromatino kondensacija. Ejakuliacijos metu spermatozoidai susimaišo su priedinių liaukų išskirtu skysčiu bei sėkline plazma. Spermos skystyje esantys glikoproteinai prisiriša prie spermatozoidų galvučių ir tokiu būdu stabilizuoja spermatozoidų judėjimą karvės lytiniu taku (5). Spermatozoido plazminės membranos vientisumas yra labai svarbus dėl optimalios jų fukcijos bei gebėjimo apvaisinti kiaušialąstę (6). Mechanizmas nėra iki galo išaiškintas, bet spermatozoidams judant kiaušintakiu vyksta pasiruošimas kapacitacijai – tai yra pašalinami dekapacitacijos faktoriai. Dekapacitacijos faktoriai gali būti įvairūs priklausomai nuo gyvūno veislės. Vienas iš žinomesnių yra 40kDa glikoproteinas, kuris buvo atrastas Fraserio (1984). Šis proteinas veikia Ca2+ atepazę, kuri išlaiko mažą viduląstelio Ca2+ kiekį spermatozoiduose (7). In vitro šis dalykas vykdomas plaunant spermą ir ją inkubuojant įvairiose specialiose komercinėse terpėse (8).
Paviršiaus pokyčiai kapacitacijos metu: cholesterolis yra oksiduojamas ir pašalinamas nuo spermatozoidų paviršiaus serumo albuminų pagalba. Cholesterolis yra vienas didžiausių plazminės membranos komponentų, kuris reguliuoja membraninį pralaidumą. Antsėklidžio baltymai susirenka į spermatozoido galvos zoną ir likusieji proteinai kovoja dėl tos pačios vietos. Šis proteinų persiskirstymas akrosomoje leidžia spermatozoidams sąveikauti su kiaušialąstės apvalkalu (9). Spermatozoidų akrosomos reikalingos saugoti ir paleisti hidrolizinius fermentus – hialuronidazė, neuromidazė, rūgštinė fosfatazė bei tripsino tipo serininė protease – akrozinas. Šie fermentai yra saugomi tarp išorinės ir vidinės akrosomos membranos ir tam tikru laiku išsiskiria ir padeda prasiskverbti pro kiaušialąstės apvalkalą (10).
9 1 pav. Spermatozoido morfologiniai pasikeitimai nuo atsiradimo iki galimybės apvaisinti
kiaušialąstę (13). (Modifikuota autoriaus)
1.3. Kapacitacija in vivo
Min Chuech Chang ir Colin Russell Austin (1951) pirmieji apibrėžė kas yra kapacitacija, atlikdami tyrimus su žiurkėmis ir triušiais. Tačiau pačią sąvoką kapacitaciją pasiūlė Austin (1952). Kapacitacija yra nuoseklus procesas įtraukiantis pasikeitimus spermatozoidų akrosomoje tokius kaip lipidų persiskirstymas spermatozoido galvutėje. Ejakuliuoti buliaus spermatozoidai pirmiausiai turi būti kapacituoti, kad galėtų apvaisinti kaušialąstę (11). Kapacitacija karvės lytiniuose takuose trunka apie 4 valandas (12). Tyrimais yra įrodyta, kad kuo giliau sperma yra įvedama į patelės lytinius takus tuo mažesnio kiekio jos reikia. Imunologinis atsakas įvyksta spermatozoidams patekus į gimdą, kai pradeda plūsti polimorfiniai neutrofilai. Šie leukocitai, esantys gimdos skystyje, sumažina spermatozoidų kiekį patenkantį toliau į kiaušintakį fagozitozės būdu. Nėra dar duomenų ar spermatozoidų fagocitozė vyksta selektyviai ar tiesiog atsitiktinai (13).
Kapacitacija vyksta nuosekliai spermai judant moteriškaisiais lytiniais takais, daugiausiai kiaušintakyje. Kapacitacija in vivo yra sąveika tarp spermatozoidų ir kiaušintakio epitelio. Ne tik kiaušintakių epitelis, bet ir vidulatakėlinis (intraluminalinis) skystis vykdo svarbias funkcija kapacitacijos procese. Netgi perivitelinė erdvė (ang. perivitelline space), kuri yra tarp skaidriojo dangalo ir oolemos, užpildyta komponentais, kurie turi įtakos spermatozoido ir kiaušialąstės sąveikoje (11). Daugelis medžiagų esančių kiaušintakio skysčio sudėtyje yra laikomi spermatozoidų kapacitacijos agentais įtraukiant bikarbonatus, glikozaminglikanus, kalcio jonus, noradrenaliną ir
10
progesteroną (14). Kiaušintakio skystyje, esanti katalazė, apsaugo nuo peroksidacijos poveikio. In
vivo vykstantį procesą vietoje heparino pakeičia heparano sulfatas esantis kiaušintakio skystyje.
Įdomu tai, kad kiaušintakio skystis turi mažiau gliukozės, kuris trukdo kalcio pasisavinimui (15). Kiaušintakio sąsmaukoje, esantis mažas kiekis kapacituotų spermatozoidų surišami, ir paleidžiami po ovuliacijos, kurie keliauja į kiaušintakio ampulę, kurioje vyksta apvaisinimas. Po akrosominės reakcijos spermatozoidas pasiekia perivitelinę erdvę, kurioje spermatozoidas įgauna membranos fragmentus CD9. Ši žinduolių kiaušialąščių savybė leidžia pirmą spermatozoidą, patekusį po akrosominės reakcijos į perivitelinę erdvę, surišti ant jo paviršiaus proteinus (16).
Nepaisant jonų judėjimo stimuliuojant ir stabdant kapacitaciją, steroidiniai hormonai taip pat yra reikalingi kapacitacijos procese. Daugiausiai tyrimų yra atlikta su progesterono ir estradiolio įtaka kapacitacijai. Progesteronas sukelia spermatozoidų hiperaktyvaciją, suaktyvina kai kuriuos jonų kanalus. Tiek estradiolis tiek progesteronas padidina Ca2+ jonų patekimą į spermatozoidą ir taip pat padidina tirozino fosforilizaciją (17).
1.4. Kapacitacija in vitro
Iki 1980 m. tyrimų susijusių su kapacitacija nebuvo atlikta (11). Visgi vėlesni tyrimai įrodė, kad natūralią kiaušintakio terpę gali pakeisti specialios terpės, kuriose yra bikarbonatai, kalcio jonai, heparinas, HEPES (9). Pradžioje šviežią arba atšildytą spermą reikia praplauti norint atskirti judrius spermatozoidus nuo nejudrių, pašalinti sėklinį skystį, krioprotektorius ir infekcijos agentus, nuosėdas ir tuo pačiu metu inicijuoti kapacitacijos procesą. Proceso metu dažniausiai pašalinama yra spermatozoidai su uodegėlės ir galvutės patologijomis. Praplovimui naudojama fosfato buferinės druskos tirpalas (PBS, pH 7,4) centrifuguojant 3000 k. per minutę 10 – 20 min. (18).
Heparinas – dažniausiai naudojamas glikozaminglikanas spermatozoidų kapacitacijoje in vitro. Heparinas rišasi su sėkliniais plazmos proteinais (BSP’s). Šie proteinai bendrauja su cholesteroliu, fosfolipidais ir su spermos plazminėmis ląstelėmis (19). Vykstantys pasikeitimai sukelti heparino kapacitacijos metu sąlygoja cholesterolio ir fosfolipidų kiekio sumažėjimo bei membranos pasikeitimo (20). Susirišę BSP baltymai su heparinu padidina spermos vidulastelinį aktyvųjį rūgštingumą bei vidulastelinio kalcio jonų kiekį. Ilgalaikių tyrimų metu buvo nustatyta, kad heparino sukeltai kapacitacijai didelę įtaka turi gliukozė (21). Sąveiką tarp heparino ir gliukozės pirmasis pastebėjo Parrish (1986). Gliukozės sukelta glikolizė arba panašūs substratai lydintys prie buliaus spermos parūgštėjimo sąlygoja kapacitacijos blokavimo, kurį sukelia heparinas. Glikolizės metu išsiskyrę protonai (H+), rūgštinantys spermos terpę, priešinasi heparino sukeltam spermos šarmėjimui. Kad gliukozės efektas nesutrukdytų kapacitacijos procesui, į spermą yra pridedama izobutilmetilksantino komponentų, kurie padidina 8 – bromo ciklinio adenozino monofosfato (cAMP) kiekį. Kitas būdas yra suteikti spermai pakankamai laiko, kad visa gliukozė būtų
11
metabolizuota. cAMP padidėjimas yra reikalingas heparino indukuotai kapacitacijai (22).
1.5. Spermatozoidų kriokonservavimo įtaka spermatozoidų judrumui
Spermos kriokonservavimas yra pamatinis dalykas norint išsaugoti spermatozoidus ilgesniam laikui. Tačiau nepaisant didelės naudos, kriokonservavimas turi ir trūkumų. Viena iš didžiausių problemų yra ta, kad didelis kiekis spermatozoidų tiek užšaldant, tiek atšildant tampa nepajėgūs apvaisinti kiaušialąstės (23). Norint pasiekti vienodą apvaisinimo laipsnį, kriokonservuotos spermos reikia paiimti 8 kartus daugiau negu šviežios. Plazminė membrana yra pagrindinė vietą, kurią pažeidžia kriokonservavimas. Šios struktūros pažeidimas yra viena iš pagrindinių priežasčių lemiančių spermatozoido gyvybingumą ir buliaus vaisingumą. Temperatūros pasikeitimas ir ledo kristalų susiformavimas yra pagridinės priežastys, kurios neigiamai veikia spermatozoidus. Norint sumažinti temperatūrinio šoko sukeliamus padarinius į spermą yra dedama krioprotektoriai, kaip pavyzdžiui glicerolis. Nustatyta, kad glicerolio ir fosfolipidų santykis yra pagrindinis faktorius, kuris daro įtaką spermatozoidų plazminės membranos pralaidumui ir stabilumui. Kriokonservavimo metu pažeisti spermatozoidai negali kapacituoti ir vėliau apvaisinti kiaušialąstės (24).
1.6. Kapacitacijos įtaka judrumui
Buliaus sperma gali būti inkubuota terpėje, kuri išaukia spermatozoidų kapacitaciją nesukuriant hiperaktyvuoto judrumo. Hiperaktyvaciją galima sukelti ir nekapacituotuose spermatozoiduose pridedant į terpę prokaino arba kofeino. Hiperaktyvacija susijusi su kapacitacija yra priklausoma nuo cAMP/PKA reguliuojamu baltymo tirozino fosforilizacija (25).
Aktyvusis rūgštingumas (ph) taip pat vaidina didelį vaidmenį spermatozoidų kapacitacijoje. Intraląstelinė alkalinizacija yra reikalingas procesas prieš kapacitaciją. Spermos aktyvusis rūgštingumas palaipsniui kyla spermatozoidams keliaujant patelės lytiniu taku. Yao (2000) atliko bandymą su skirting ph terpe, norint palyginti spermatozoidų judrumą. Terpėje, kurioje aktyvusis rūgštingumas buvo 7,5 spermatozoidų judrumas buvo ženkliai didesnis nei terpėje, kurioje ph buvo 6. Taip pat akrosominė reakcija nėįvyksta be spermos alkalinizacijos. Dauguma jonų kanalų yra reguliuojami aktyvaus rūgštingumo, kurio padidėjimas ar sumažėjimas atitinkamai suaktyvina ar pristabdo jonų judėjimą į ir iš spermatozoido (26).
Tosic and Walton (1950) nustatė, kad bulių spermatozoidai gamina reaktyviuosius deguonies junginius (ROS), kurie išsiskiria spermatozoidų kapacitacijos metu. ROS daugiausiai sudaro superoksidų anijonai (O2), vandenilio peroksidas (H2O2), hidroksi radikalai (OH). Vienas iš svarbių mitochondrijos komponentų yra citochromas C (cytC), kuris dalyvauja sukeldamas elektrocheminį gradientą ATP produkcijoje. Kai mitochondrijos vidinė plazminė membrana yra pažeista, išsiskiria fosfolipidas kardiolipinas, kuris prisitvirtina prie cytC. Rezultate cytC/CL kompleksas gamina
12
peroksidus (27). Dalis ROS yra laisvieji radikalai. Jie turi galimybę laisvai pereiti plazminę membraną ir pakenkti daugumai ląstelinių molekulių ir struktūrų, tokių kaip lipidai, proteinai, nukleininės rūgštys. ROS priklausomai nuo dozės yra raktas į cholesterolio efliuksą, cAMP gamybą, kai tuo tarpu per didelis kiekis yra toksiškas. Toksiškumas pasireiškia polinesočiųjų riebalų rūgščių naikinimu ant spermatozoido paviršiaus, spermatozoido ir kiaušialąstės skaidriojo sluoksnio sąveikos sutrikimu. Peroksidacinis poveikis spermatozoido plazminei membranai sukelia oksidacinį stresą, kuris iššaukia nepataisomus spermatozoidų funkcijos sutrikimus. Dėl visų šių per didelio ROS kiekio padarinių skiedžiant spermą į ją įdedama vitamino E, kuris pasižymi teigiamu poveikiu išlaikant kokybinius spermatozoidų rodiklius (28). Amritas Bansalas (2010) savo tyrimuose nustatė šio vitamino svarbą kapacitacijos procese. Jis nustatė, kad vitaminas E slopina peroksidacinį procesą spermos membranoje, sukeltą ROS (29).
1.7. Su kapacitacija susijusi akrosominė būklė
Kalcis yra reikalingas spermatozoidų kapacitacijos procese. Ejakuliuoti buliaus spermatozoidai turi aktyvias plazminės membranos kalcio ATPazes, kurios išskiria kalcį. Kapacitaciją, sukelta heparino, reikalauja tarpląstelinio kalcio, kuris siurbiamas iš sperminio skysčio ir tai priveda prie kalcio jonų kaupimosi spermatozoido galvutėje (11). Būtent dėl šių jonų atsiradimo galvutėje, keičiasi jos morfologinė sandara ir spermatozoido akrosoma tampa apvalesnė. Gliukozė blokuoja kalcio įsisavinimą, tačiau ši problema išsprendžiama pridėjus ląstelinio cAMP. Šio aciklinio fosfato padidėjimas kapacitacijos metu dažniausiai neįvyksta dėl bikarbonatų nebuvimo, todėl jie yra reikalingi cAMP produkcijoje ir sukelia spermatozoidų judrumą. Yra pastebėta, kad HCO-3 koncentracija padidėja, kai K+ kiekis reikšmingai sumažėja, kad spermoje turi būti bent jau 10 mmol/L bikarbonatų, kad spermatozoidai įgautų judėjimą. Tyrimais yra įrodyta, kad bikarbonatai yra reikšmingas agentas in vitro kapacitacijoje (12).
Įdomu tai, kad heparinas sukelia kalcio įsisavinimą, iš pradžių kalcio jonų galvoje būna 102+-13 nmol/L, bet vėliau po 4 valandų inkubacijos pakyla iki 184+-21 nmol/L, kai spermatozoidai būna kapacituoti. Tyrimais įrodyta, kad kalcio įsisavinimas yra kritiškas kapacitacijai per 2 pirmas heparino poveikio valandas. Per šį laikotarpį spermatozoido akrosoma akumuliuoja kalcį ir tokiu būdu apsaugo nuo kalcio jonų padidėjimo citoplazmoje. Kai tik akrosomos dalys užsipildo, kalcio jonų padidėja, ir jeigu spermatozoidas nėra stimuliuojamas apvaisinti kiaušialąstės, spontaninė akrosominė reakcija įvyksta ir spermatozoidas žūva. Ilgalaikių tyrimų metu buvo įrodyta, kad spermatozoidų akrosomose, kuriose padidėjęs kalcio kiekis gali vykdyti akrosominę reakciją – tai yra įsiskverbti per kiaušialąstės apvalkalą (11).
13
1.8. Akrosominė būklė kapacitacijos metu ir jos įvertinimo metodai
Daugelį metodų yra atlikta, norint įvertinti membraninius pasikeitimus, kurie įvyksta kapacitacijos metu. Dažnai pasitaikantis metodas norint įvertinti kapacitaciją yra chlortetraciklino testas (CTC). Šis fluorescuojantis antibiotikas suriša su membrana susijusius katijonus, ypač kalcio jonus (Ca2+), ir tada fluorescencija parodo, kur jie yra susikaupę. Buvo atlikti CTC testai su įvairių rūšių žinduoliais (18).Kitas metodas nustatyti kapacitaciją yra tėkmės citometrija. Ankstyvus spermatozoidų membranos lipidų pokyčius galime aptikti su hidrofobiškais merocianiniais – 54 dažais. Kuo daugiau spermatozoiduose yra lipidų netvarkos, tuo didesnis merocianino – 54 dažų kiekis suriša šiuos fosfolipidus. Tyrimais yra nustatyta, kad su šiais merocianinino – 54 dažais galime indentifikuoti ankstesnes kapacitacijos stadijas, prieš tai katijonų persiskirstymui, kuriuos galime aptikti su CTC testu (16).
Su kapacitacija susijusius pokyčius taip pat identifikuoja hiperaktyvuotas spermatozoidų judėjimas, akrosomos vientisumas, hipoosmotinio slėgio testas, aspartato aminotransferazės (AST), ir alanintrasferazės (ALT) aktyvumas, spermatozoidų membranos baltymų ir cholesterolio kiekis. Kapacituotų spermatozoidų hiperaktyvus judėjimas yra įvertinamas paėmus spermatozoidų paruoštos suspensijos ir dedama ant stiklelio ir ant pašildomo pado yra stebima su 40x padidinimu per optinį mikroskopą. Hiperaktyvus judėjimas laikomas tada, kai spermatozoidas juda energingais aštuoniukės formos judesiais (2).
Akrosomos membraninis vientisumas yra nustatomas dažant specialiais Trypano mėlio (Trypan
blue) ir Gimza (Eosino nigrozino) dažais. Dažant Gimza dažais imama lašas spermos ir 2 lašai dažo
ir dedama ant pašildyto (35°C) stiklelio. Po 30 s sausas tepinėlis yra fiksuojamas fosfato buferyje ir laikomas 10 minučių. Fiksuotas tepinėlis plaunamas po lėtai tekančiu krano vandeniu ir džiovinama ore. Dedama imersinio aliejaus lašas ir 1000x padidinimu stebima spermatozoidai per optinį mikroskopą. Trypano mėliu dažant reikalingas lašas spermos ir lašas dažo. Viskas dedama ant pašildyto stiklelio. Tiek dažant su vienais dažais tiek su kitais – reikalingas minimalus 200 spermatozoidų skaičius, norint juos įvertinti. Dažant su Gimza spermatozoidai suskirstomi į 4 grupes: gyvų spermatozoidų akrosoma pažeista/nepažeista, negyvų spermatozoidų akrosoma pažeista/nepažeista. Dažant su Trypano mėliu spermatozoidai skirstomi į negyvybingas, su kapacitacijos reakcija ir su akrosomine reakcija (5).
1.9. Kiaušialąščių paruošimas apsivaisinimui in vitro
In vitro kiaušialąstės brendimas yra biotechnologinis pamatinis dalykas, kalbant apie in vitro
apvaisinimą, klonavimą, kamieninių ląstelių auginimą. Kiaušialąstės imamos iš karvių kiaušidžių aspiracijos, išpjovimo ir punkcijos metodais. Dažniausiai kiaušialąstės yra imamos iš skerdyklose
14
esančių karvių. Pats didžiausias minusas šios procedūros, kad paskerdus karvę jokie darbų tęstinumai negalimi (8).
Gautą kiaušialąstę reikia patalpinti į tam skirtą komercinę terpę, praturtintą BSA (angl. bovine
serume albumine) ir laikyti 37°C temperatūroje. Priklausomai nuo kumuliuso ląstelių sluoksnių
skaičiaus ir ooplazmos išvaizdos, kiaušialąstės yra skirstomas į 4 klases: A, B, C ir D. A tipo kiaušialąstės yra priskiriamos kai kumuliuso ląstelių yra daugiau nei 5 sluoksniai ir tolygi ooplazmos granuliacija (2 pav. ir 3 pav.). B tipo kiaušialėstė yra su 3 – 5 pilnais kumulusio ląstelių sluoksniais ir tolygia ooplazmos granuliacija (4 pav.). C tipo kiaušialąstės su 1,2 pilna kumulusio ląstelių sluoksniais su tolygia ooplazmos granuliacija ir paskutinė D klasė apnuoginta kiaušialąstė, be kumulusio ląstelių sluoksnio.
2 pav. A tipo kiaušialąstė (autorių nuotrauka)
15 4 pav. B tipo kiaušialąstė (autorių nuotrauka)
5 pav. D tipo kiaušialąstė (autorių nuotrauka)
Pati kiaušialąstės maturacija yra vykstanti kumuliuso ląstelių proliferacija, mejozės tęsinys ir citoplazminių organėlių persiskirstymas. Sėkmingas kiaušialąstės brendimas yra matuojamas morfologiniu ląstelių ir spindulinio vainiko (corona radiata) proliferacijos įvertinimu. Laipsniškas brendimo įvertinimas yra matuojamas procentais kiaušialąsčių esančių metafazės II (MII) stadijoje su pirmuoju pašalintu poliariniu kūnu. Pagal Lonergan (2009) kiaušialąsčių brendimo sėkmingumas siekia 90 proc., bet tik 30 proc. kiaušialasčių pasiekia blastocistos stadiją (31).
1.10.
In vitro apvaisinimas
Apvaisinimas yra lemiamas momentas gyvenime, kai susilieja dvi haploidinės gametos ir iš jų susidaro zigota. In vitro apvaisinimas yra subrendusios kiaušialąstės ir kapacituotų spermatozoidų kultivavimas kartu, griežtai laikantis labaratorinių sąlygų. Inkubavimas spermatozoidų ir kiaušialąstės kartu trunka 24 valandas, 39°C temperatūroje su 5 proc. CO2 ore ir 80 proc. drėgme, kol pirma zigotos mitozė įvyksta. In vitro sėkmingas apsivaisinimas yra tikrinamas po 48 valandų
16
kiek užuomazgų yra skilusių. Apvaisinta kiaušialąstė laikoma tada, kai ji pasiekia blastocistos stadiją.
In vitro procese zigota praeina 4 svarbius vystymosi etapus – pirmoji mitozė, zigotos genomo
aktyvacija, morulės stadijos sutankėjimas, blastocistos formavimasis. Nepalankios sąlygos embriono brendime in vitro gali paveikti kurią nors iš šių išvardintų stadijų ir taip sustabdyti blastocistos susiformavimą (31).
Keičiant dedamų spermatozoidų kiekį į subrendusią kiaušialąstę taip pat gali paveikti apvaisinimą. Dažnai sutinkama problema yra polispermija – kai į vieną kiaušialąstę patenka keli spermatozoidai. Kai apsivaisinimo procentas viršija 80 proc. polispermijos atvejai pradeda dažnėti (19).
17
2.
MEDŽIAGOS IR METODAI
2.1. Pagrindinė bandymų schema
Tyrimas atliktas 2019 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje.
Tyrimams buvo naudota kriokonservuota sperma įsigyta iš Lietuvos veislininkystės įmonės X. Sperma buvo saugoma Diuaro inde, kol buvo atlikti tyrimai.
6 pav. Principinė bandymų atlikimo schema Lietuvos Juodmargės ir Žalosios
pieninės karvės (4 laktacija)
Holšteino veislės buliai
Aspiruotos kiaušialąstės(COCs) mėginiai (n=112)
Buliaus šaldytos spermos mėginiai (n=34)
60 min. kapacitacija (n=17)
120 min. kapacitacija (n=17)
COCs suskirstymas į tipus(A,B,C,D) pagal kumuliuso
ląstelių skaičių ir citoplazmos
homogeniškumą Akrosomos būklės nustatymas su Tripano mėlio (Trypan blue) dažais. Judrumo nustatymas po skirtingų (10 min.) 4 centrifugavimų.
COCs kompleksų apvaisinimas skirtingai kapacituotais spermatozoidas in vitro
18
2.2. Atšildytos spermos paruošimas tyrimams
Šiaudelis su sperma ištraukiamas iš Duaro indo. Spermos kokybės rodiklius deklaruoja ir užtikrina gamintojas. Nuo šiaudelio nupurtomi skysti azoto lašai. Holšteino bulių sperma atšildoma 38°C vandens vonelėje 10 sekundžių. Po atšildymo šiaudeliai nusausinami popieriumi ir nupurtomi, tam, kad esantis oro burbuliukas nusistumtų į šiaudelio galą. Kerpamas šiaudelio galas statmenai išilginei ašiai. Sperma atsargiai dedama į modifikuotą BO – SemenPrep (Bioscience, JAV) terpę spermatozoidų izoliacijai ir inkubuojama 38,8°C 5 proc. CO2 60 min. ir 120 min.
Po inkubacijos imama 20µl spermos mėginio ir 20 µl Tripano mėlio (Trypan blue) dažų. 40 µl mišinio sumaišoma ir paskleidžiama ant objektinio stiklelio (76x26mm), kuris uždengiamas yra dengiamuoju stikeliu (20x20mm). Mėginių ir dažų ėmimui naudojama 5 – 10µl tūrio mikropipetės,
viekartiniai 2 – 200 µl antgaliai. Per mikroskopą vertinama spermatozoidų gyvybingumas ir
akrosomos būsena. Nusidažę spermatozoidai skaičiuojami ir padalinami į 3 grupes: negyvybingi, su įvykusia kapacitacijos reakcija ir su akrosomine reakcija.
2.3. Kiaušialąščių tyrimas
Pieninių karvių kiaušidės buvo paiimtos iš karto po skerdimo ir transportuojamos per vieną valandą. Apie donorų sveikatos būseną žinojome tiek, kad tai buvo Lietuvos Žalmargės ir Žalosios pieninės karvės (4 laktacija). Kokybės kiaušialąščių matavimai (A,B,C,D) buvo atlikti remiantis kumuliuso ląstelių išsivystymu ir citoplazmos homogeniškumu pagal Chaubal (2006). Iš viso buvo aspiruota 94 kumuliuso ląstelių ir kiaušialąstės kompleksų (COCs) iš 29 kiaušidžių. Tarp 94 COCs, 49 buvo normalūs (A ir B tipo) ir 45 buvo nenormalūs (C ir D tipo). Tik normalūs COCs kompleksai buvo naudojami brandinimui. Visos kiaušialąstės (COCs) buvo plaunamos 5 kartus BO – IVM terpėje (Bioscience, JAV). Grupė COCs buvo brandinamos 400µL BO – IVM terpėje (Bioscience, JAV), padengtoje mineraliniu aliejumi, 4 lėkštelėse (Minitub, Vokietija) 24 valandomis 38,5°C su 5 proc. CO2 ore. Po maturacijos, kiaušialąstės buvo plaunamos ir vertinamos pagal kumuliuso ląstelių sluoksnius.
2.4. Apvaisinimo in vitro tyrimas
Apvaisinimas buvo atliktas su FERT – TL (Minitub, Vokietija) terpe, pripildyta su 0,3 proc.
BSA, 22 µg/mL natrio hidrokarbonato, and 10 µg/mL heparino. Fert-TL terpė buvo įdėta į apvaisinimo
lėkšteles (Minitub, Vokietija) ir naudojami spermatozoidai (koncentracija 1x106 sperm/mL). Viskas buvo inkubuojama 24 val. 38,5°C temperatūroje 5proc. CO2 ore su maksimalia aplinkos drėgme.
Po apvaisinimo (1 diena), kumuliuso ląstelės buvo pašalintos nuo nuspėjamos zigotos rankiniu būdu su pipete ir pernešta į 100uL SOF terpę (Minitub, Vokietija). Terpė buvo papildyta su 8mg/ml BSA ir 22mikrog/ml sodos piruvatu ir inkubuota 24 valandomis 38,5°C temperatūroje 5 proc. CO2
19
ore su maksimalia drėgme. Zigotos dalijimasis buvo skaičiuojamas per 48 valandas (skilimo laipsnis).
2.5. Tyrimus reglamentuojantys įstatymai
Moksliniai tyrimai atlikti laikantis 1997 m. 11 mėn. 06 d. Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo Nr. 8 – 500 („Valstybės žinios“, 1997 11 28, Nr. 108) bei poįstatyminių aktų – LR valstybinės tarnybos įsakymų „Dėl laboratorinių gyvūnų veisimo, dauginimo, priežiūros ir transportavimo veterinarinių reikalavimų“ (1998 12 31, Nr. 4 – 361) ir „Dėl laboratorinių gyvūnų naudojimo moksliniams bandymams“ (1999 01 18, Nr. 4 – 16); taip pat atitinka ES Direktyvą 86/609/EEC ir EK rekomendacijas 2007/526 EC „Gyvūnų naudojimas ir laikymas eksperimentiniais ir kitais tikslais“.
2.6. Duomenų statistinė analizė
Siekiant išsiaiškinti kapacitacijos ekspozicijos laiko ir centrifugavimo įtaką spermatozoidų judrumui, akrosominei būklei bei apvaisinimui in vitro buvo atlikta statistinė analizė. Naudojantis kompiuterinėmis programomis „Microsoft Office Excel 2010” ir statistinių duomenų skaičiavimo programa SPSS (angl. Statistical Package for Social Science) buvo gauti ir pateikti diagramose apskaičiuoti rezultatai. Gauti duomenys laikomi statistiškai patikimi, kai p<0,05.
20
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1. Spermatozoidų vaizdas, nudažius juos su Trypan blue dažais
Nuotraukose (7 pav. Ir 8 pav.) pavaizduota spermatozoidų pasikeitimai dažant juos Tripano mėlio (Trypan blue) dažais. Paveiksliuke numeris 7 pavaizduota spermatozoidas, kuris yra kapacituotas. Nenusidažiusi galvutė rodo, kad jis yra gyvybingas. Paveikslėlyje numeris 8 pavaizduota spermatozoidas su įvykusia krosomine reakcija.
7 pav. Kapacituotas spermatozoidas (nurodyta rodykle) (asmeninė nuotrauka)
21
3.2. Akrosominės būklės įvertinimas dažant spermatozoidus su
Trypan blue dažais
Didelę įtaką spermatozoidų kapacitacijai turėjo laikas. Padidėjęs inkubacijos laikas visuose mėginiuose padidino gyvų spermatozoidų kiekį. Lyginant inkubacijos laikus, po 120 min. inkubacijos, kapacitavusių spermatozoidų skaičius padidėjo 20 proc., ir akrosominės reakcijos padidėjo 5 proc. Lyginant spermatozoidų kiekį po 120 min. inkubacijos, negyvybingų spermatozoidų skaičius sumažėjo 23,5 proc. (p<0,05) (9 pav.).
9 pav. Inkubuotų 60 min. ir 120 min. spermatozoidų akrosominės būklės įvertinimas Trypan blue
dažais
3.3. Spermatozoidų, kapacituotų 60 minučių, judrumo nustatymas
po skirtingų centrifugavimų
Didžiausias procentinis spermatozoidų judrumas nustatytas po 60 min. kapacitacijos be centrifugavimo (50 proc. judrumas). Pradėjus centrifuguoti spermatozoidus iki 3 centrifugavimo matomas tendencingas spermatozoidų judrumo mažėjimas. Po 3 centrifugavimo spermatozoidų judrumas sumažėjo 17,5 proc. lyginant su 1 centrifugavimu. Lyginant spermatozoidų judrumą po 60 min. be centrifugavimo ir po 4 centrifugavimo jis sumažėjo 27,5 proc. (p>0.05) (10 pav.).
45.00 35.00 15.00 25.00 55.00 20.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 Negyvybingi spermatozoidai Kapacitacijos reakcija Akrosominė reakcija S p er m a toz o id ų ju dr um as, p roc . Spermatozoidų būsena 60 min kapacitacija 120 min kapacitacija
22 10 pav. Spermatozoidų judrumas po 60 min. kapacitacijos po skirtingų centrifugavimų
3.4. Spermatozoidų, kapacituotų 120 minučių, judrumo
nustatymas po skirtingų centrifugavimų
Didžiausias procentinis spermatozoidų judrumas nustatytas po 1 centrifugavimo (58 proc. judrumas). Pradėjus centrifuguoti spermatozoidus iki 3 centrifugavimo matomas tendencingas spermatozoidų judrumo mažėjimas. Po 3 centrifugavimo spermatozoidų judrumas sumažėjo 27,5 proc. lyginant su 1 centrifugavimu. Lyginant spermatozoidų judrumą po 60 minučių be centrifugavimo ir po 4 centrifugavimo jis sumažėjo 17,5 proc. (p>0.05) (11 pav.).
50.00 25.00 20.00 7.50 22.50 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 S pe rm at o zo id ų judr um as , pr oc . 60 min kapacitacija
23 11 pav. Spermatozoidų judrumas po 60 min. kapacitacijos po skirtingų centrifugavimų (turi būti po
pav.)
3.5. COCs kompleksų pasiskirstymo nustatymas
Pateiktoje diagriamoje matome kaip COCs kiaušialąsčių kompleksai yra pasiskirstę pagal tipus. Iš viso nustatyta 94 COCs kompleksai. Didžiausią dalį užėmė C tipo COCs kompleksai – 31 (33 proc.), antroje vietoje A tipo – 29 (30,9 proc.). Mažiausiai nustatyta D tipo kiaušialąsčių – 14 (14,9 proc.). Lyginant A ir B tipą, kurie buvo naudojami kiaušialąsčių brandinimui, buvo 2,2 proc. daugiau nei netinkamų C ir D tipo kiaušialąsčių (12 pav.).
12 pav. Skirtingų COCs kompleksų tipų pasiskirstymas
29 20 31 14 5 10 15 20 25 30 35
A tipas B tipas C tipas D tipas
C OCs k om pl ek sų sk aič iu s, vnt .
COCs komplekso tipas
47.50 57.50 35.00 27.50 30.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 S per m at o zo id ų judr um as , pr oc . 120 min kapacitacija
24
3.6. Spermatozoidų, kapacituotų 60 min. ir 120 min.,
apvaisinimo procentas in vitro naudojant skirtingų tipų
kiaušialąstes
Pagal gautus duomenis A tipo COCs kompleksų kiaušialąstės buvo geriau (5 proc.) apvaisintos su 60 min. kapacituotais spermatozoidais, bet B tipo COCs kompleksų kiaušialąstės buvo labiau linkusios 5 proc. apsivaisinti su 120 min. kapacituotais spermatozoidais. Deja, skirtumai nebuvo dideli ir statistiškai nepatikimi (p>0,05) (12 pav.).
13 pav. COCs kompleksų apvaisinimas išreikštas procentais naudojant skirtingos inkubacijos
spermatozoidų grupes 50.00 45.00 35.00 40.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 A tipas B tipas C O C s k om p le sų a pva isi ni m as, p roc .
COCs kompleksų tipas
60 min kapacitacija 120 min kapacitacija
25
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Kapacitacijos procesas įtraukia sudėtingus biocheminius pasikeitimus, įtraukiant membranos baltymų persiskirstymą, fosfolipidų metabolizmą, cholesterolio kiekio sumažėjimą bei spermatozoidų judrumo atsiradimą (1).
D. Talukdar (2015) savo bandyme įrodė, kad didžiausias procentinis spermatozoidų judrumas buvo užfiksuotas po 4 val. spermatozoidų inkubacijos. Spermatozoidų akrosominė reakcija palaipsniui didėjo su kiekviena valanda inkubacijos iki 4 val., o po to buvo pastebimas mažėjimas. Po 2 valandų kapacituotų spermatozoidų judrumas padidėjo 17,12 proc. ir akrosominės reakcijos pasireiškimas padidėjo 6,85 proc. lyginant su 1 val. inkubacija (9). C.K. Dhanju (2006) pademonstravo skirting bulių akrosominės reakcijos pasireiškimo proporciją po 2 val. inkubacijos, kuri varijuoja nuo 62 proc. ir 87 proc. Tų pačių bulių po 1 valandos kapacituotų spermatozoidų akrosominė reakcija pasireiškė nuo 44,5 proc. iki 84.5 proc. intervaluose. Mūsų rezultatai parodė, kad spermos mėginiuose, kurie buvo inkubuoti 2 val. kapacitacijos reakcija pasireiškė 20 proc. ir akrosominė reakcija 5 proc. daugiau nei po 1 val. kapacitacijos.
Visgi dalis autorių pateikia, kad naudojant atšildytą buliaus spermą didesnė dalis spermatozoidų žūsta dėl kriokenservavimo faktorių lyginant rezultatus su šviežia sperma. Todėl daugiau negyvybingų spermatozoidų komplikuoja rezultatų interpretaciją prieš ir po inkubacijos (6).
Pagal M.P. Kakkassery (2010), kiaušialąsčių brandinimo procentas paremtas pagal kumuliuso ląstelių sluoksnį ir citoplazmos homogeniškumą buvo suskirstytą taip: A – 83,08 proc., B – 68,29 proc. ir C tipas 44,74 proc. Mūsų tyrime daugiausiai buvo nustatyta C tipo kiaušialąsčių (31 proc.), o mažiausiai D tipo – 14 (14,9 proc.).
Centrifugavimas yra vienas iš lengviausių ir dažniausiai naudojamų metodų norint atskirti judrius ir nejudrius spermatozoidus. Centrifugavimo rodiklių pakeitimas turi įtakos spermatozoidų judrumui (27). Mūsų gautuose rezultatuose 60 min. inkubuotuose spermatozoiduose pats didžiausias judrumas buvo be centrifugavimo (50 proc.), o 120 min. kapacituotuose spermatozoiduose po 1 centrifugavimo (57.5 proc.). Abejose skirtingų laikų spermatozoidų inkubacijos grupėse nuo pirmo ir trečio centrifugavimo spermatozoidų procentinis judrumas tendencingai mažėjo (p>0,05), o ties 4 centrifugavimu matomas judrumo padidėjimas. Šis pasikeitimas aiškinamas, kad ilgiau centrifuguojant spermatozoidus juos veikia gravitacijos jėga, kuri būtent ir sukelia judrumo padidėjimą.
Pagal A.S. Lequarre (2005) duomenis kiaušialąstės skilimo laipsnis buvo 38,63 proc. ir 58,69 proc. atitinkamai po 1 ir 2 valandų spermatozoidus inkubuojant. Mūsų gauti rezultatai parodė, kad 60 minučių kapacituotų spermatozoidų kiaušialasčių apvaisinimo procentas in vitro buvo 47,5 proc., tuo tarpu 120 minučių – 37,5 proc. A ir B tipo COCs kompleksų tipas turėjo įtakos in vitro apvaisinimo
26
rezultatui. Pagal gautus duomenis A tipo COCs kompleksų kiaušialąstės buvo geriau (5 proc.) apvaisintos su 60 min. kapacituotais spermatozoidais, bet B tipo COCs kompleksų kiaušialąstės buvo labiau linkusios 5 proc. apsivaisinti su 120 min. kapacituotais spermatozoidais.
Išanalizavus mūsų tyrimo rezultatus ir literatūros šaltinius nustatėme, kad 120 min. inkubuoti spermatozoidai labiau linkę išreikšti akrosominę bei kapacitacijos reakciją, bei nustatyta daugiau gyvybingų spermatozoidų lyginant su 60 minučių inkubacija. Didesnis judrumas (5 proc.) nustatytas po 60 min. kapacitacijos lyginant su 120 min kapacitacija.
27
5. IŠVADOS
1. Spermatozoidų procentinis judrumas tiek po 60 min. tiek po 120 min. kapacitacijos nuo 1 iki 3 centrifugavimo tendencingai mažėjo (atitinkamai sumažėjo 17,5 proc. ir 30,0 proc.) (p<0,05). Po 4 centrifugavimo lyginant su 3 centrifugavimu 60 min. inkubuotų spermatozoidų judrumas padidėjo 15,0 proc., o 120 min. – 2,5 proc. (p<0,05).
2. Negyvybingų spermatozoidų skaičius po 120 min. kapacitacijos yra 20 proc. mažesnis lyginant su 60 min. kapacitacija (p<0.05). Spermatozoidų su kapacitacijos reakcija po 120 min. inkubacijos yra 20 proc. daugiau, o akrosominė reakcija pasireiškusi 4,5 proc. daugiau lyginant su 60 min. kapacitacija.
3. Pagal gautus duomenis. A tipo COCs kompleksų kiaušialąstės buvo geriau (5 proc.) apvaisintos su 60 min. kapacituotais spermatozoidais, bet B tipo COCs kompleksų kiaušialąstės buvo labiau linkusios 5 proc. apsivaisinti su 120 min. kapacituotais spermatozoidais (p>0,05).
28
REKOMENDACIJOS
Pagal gautus duomenis ir pagal analizuotą literatūrą, rekomenduočiau, norint gauti daugiau gyvybingų, daugiau kapacituotų spermatozoidų su akrosomine reakcija, reikia spermatozoidus inkubuoti bent jau 120 min.
29
PADĖKA
Baigiamojo darbo vadovui prof.dr. Vytuoliui Žilaičiui už rūpestingumą ir visokeriopą pagalbą.
30
LITERATŪROS ŠALTINIAI
1. Parkinson T. Normal reproduction in male animals. In: Noakes DE, Parkinson TJ, England GCW, editors. Veterinary Reproduction and Obstetrics. Edinburgh: Saunders Elsevier; 2010. p. 681-682, 698.
2. Jin, SK and Yang, WX (2017). Factors and pathways involved in capacitation: how are they regulated? Oncotarget., 8(2) PP: 3600-3627.
3. Lojkić M, Čavlek M, Bačić G, Getz I, Samardžija M, Maćešić N, et al. Morphology evaluation of bovine embryos produced in vitro. Vet. stn. 2014;45(3):187-193.
4. Pons-Rejraji H, Bailey JL, Leclerc P. Cryopreservation affects bovine sperm intracellular parameters associated with capacitation and acrosome exocytosis. Reprod Fertil Dev 2009;21:525-37;
5. Morell JM, Rodriguez-Martinez H. Practical Applications of Sperm Selection Techniques as a Tool for Improving Reproductive Efficiency. Vet Med Int. 2010;2011:894767. doi: 10.4061/2011/894767.
6. Agarwal A, Sekhon LH. The role of antioxidant therapy in the treatment of male infertility. Hum Fertil (Camb) 2010;13:217-225. doi: 10.3109/ 647273.2010.532279;
7. Breininger E, Cetica PD, Beconi MT. Capacitation inducers act through diverse intracellular mechanisms in cryopreserved bovine sperm. Theriogenology 2010;74:1036-49;
8. Marcias Garcia B, Morrell JM, Ortega-Ferrusola C, Gonzalez-Fernandez L, Tapia JA, Rodriguez-Martinez H, et al. Centrifugation on a single layer of colloid selects improved quality spermatozoa from frozen thawed stallion semen. Anim Reprod Sci. 2009;114:193-202. doi: 10.1016/j.anireprosci.2008.08.025.
9. Dhanju, CK; Toor, G and Cheema, RS (2009). Effect of seminal plasma on quantity and quality of proteins leaked during heparin-induced in vitro capacitation of bull sperm. Indian J Anim Res., 43: 136–138.
10. Parrish, JJ (2014). Bovine In vitro fertilization: In vitro oocyte maturation and sperm capacitation with heparin. Theriogenology., 1:81(1).
31
Sperm for In vitro Production of Bovine Embryos. SOJ Vet Sci., 1(2): 1-7.
12. Talukdar, D; Ahmed, K; Deori, S and Das, GC (2015). Heparin-induced in vitro capacitation changes of swamp buffalo spermatozoa. Turk J Vet Anim Sci., 39: 629-633
13. .Natali I. Sperm Preparation Techniques for Artificial Insemination - Comparison of Sperm Washing,Swim Up, and Density Gradient Centrifugation Methods. In: Dr. MiladManafi, editor. Artificial Insemination in Farm Animals, 2011. ISBN: 978-953-307-312- 5, InTech, Available from: http://www.intechopen.com/books/ artificial-insemination-in-farm-
animals/sperm-preparationtechniques-for-artificial-insemination-comparison-of-spermwashing-swim-up-and-den.;
14. Bailey JL. Factors regulating sperm capacitation. Systems Biology in Reproductive Medicine 2010;56:334–48;
15. Leahy T, Gadella BM. Sperm surface changes and physiological consequences induced by sperm handling and storage. Reproduc-tion 2011;142:759–78;
16. Gadella BM, Luna C. Cell biology and functional dynamics of the mammalian sperm surface. Theriogenology 2014;81:74–84;
17. Stroud B. The year 2011 worldwide statistics of embryo transfer indomestic farm animals. Report of the IETS 2012 Statistics and DataRetrieval Committee, International Embryo Transfer Society. 2012:1–25.J.J. Parrish / Theriogenology 81 (2014) 67–7373;
18. Gangwar DK, Atreja SK. Signalling events and associated pathways related to the mammalian sperm capacitation. Reprod Domest Anim 2015;50:705-11;
19. Visconti PE, Krapf D, de la Vega-Beltran JL, Acevedo JJ, Darszon A. Ion channels, phosphorylation and mammalian sperm capacitation. Asian J Androl 2011;13: 395-405;
20. De Lamirande E, O'Flaherty C. Sperm activation: role of reactive oxygen species and kinases. Biochim Biophys Acta Protein Proteonomics 2008;1784: 106-15;
21. Leal ACMS, Caldas-Bussiere MC, Paes de Carvalho CS, Viana KS, Quirino CR. Role of nitric oxide on quality of freshly ejaculated bull spermatozoa during heparin-induced in
vitro capacitation. Anim Reprod Sci 2009;116:38-49;
22. Aguiar GB, Caldas-Bussiere MC, Torres NF, Maciel Júnior VL, Souza CLM. In vitro sperm capacitation with L-arginine and heparin in the absence of cumulus-oocyte complexes and its impact on embryo production. Anim Reprod 2015;12. 679-679;
32
23. Baker MA, Reeves G, Hetherington L, Aitken RJ. Analysis of proteomic changes associated with sperm capacitation through the combined use of IPG-strip prefractionation followed by RP chromatography LC-MS/MS analysis. Proteomics 2010;10:482-95;
24. Zilli L, Schiavone R, Storelli C, Vilella S. Effect of cryopreservation on phosphorylation state of proteins involved in sperm motility initiation in sea bream. Cryobiology 2008;57:150-5.
25. Dhanju CK, Toor G, Cheema RS. Effect of seminal plasma on quantity and quality of proteins leaked during heparin-induced in vitro capacitation of bull sperm. Indian J Anim Res 2009; 43: 136–138;
26. Visconti PE. Understanding the molecular basis of sperm capacitation through kinase design. P Natl Acad Sci 2009; 106: 667–668;
27. . Srivastava N, Srivastava SK, Ghosh SK, Amit K, Perumal P, Jerome A. Acrosome membrane integrity and cryocapacitation are related to cholesterol content of bull spermatozoa. Asian Pac J Reprod 2013; 2: 126–131;
28. Bansal A. In vitro capacitation of bull spermatozoa: role of vitamin E. Webmed Central Reproduction 2010; 1: 1–10;
29. Florman HM, Jungnickel MK, Sutton KA: Regulating the acrosome reaction. Int J Dev Biol 2008, 52:503-510;
30. Jingsheng Xia and Dejian Ren. The BSA-induced Ca (2+) influx during sperm capacitation is CATSPER channel-dependent. Reproductive Biology and Endocrinology. 2009m.
31. Kakkassery, MP; Vijayakumaran, V and Sreekumaran, T (2010). Effect of cumulus oocyte complex morphology on in vitro maturation of bovine oocytes. J. Vet. Anim. Sci., 41: 12-17.
