sąsajos su eksudacinės am

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLU UNIVERSITETAS NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS

OFTALMOLOGIJOS LABORATORIJA Medicinos fakultetas

Aistė Slavinskaitė

Genotipo SLCO1B1 rs2306283 sąsajos su eksudacinės amžinės geltonosios dėmės

degeneracijos pasireiškimu

Mokslinio darbo vadovė: Dr. Rasa Liutkevičienė

1 Turinys Santrumpos ... 2 SANTRAUKA ... 3 Summary ... 4 PADĖKA ... 5 INTERESŲ KONFLIKTAS... 5

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 5

Įvadas ... 6

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 7

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 8

1.1. Amžinė geltonosios dėmės degeneracija ... 8

1.2. Amžinės geltonosios dėmės degeneracijos rizikos veiksniai ... 8

1.3. Amžinės geltonosios dėmės degeneracijos formos ... 10

1.4. Genetinių veiksnių įtaka amžinės geltonosios dėmės degeneracijos atsiradimui ... 11

1.5. AGDD patogenezė ... 13 1.6. AGDD gydymas ... 14 1. Tyrimo metodika ... 15 2.1. Tyrimo planavimas ... 15 2.2. Tyrimo objektas ... 15 2.3. Tiriamųjų atranka ... 15

2.4. Deoksiribonukleininės rūgšties išskyrimas ... 16

2.4.1. Silikagelio kolonėlių naudojimas DNR išskyrimui ... 16

2.4.2. DNR išskyrimas magnetinių dalelių pagalba ... 17

2.5. DNR koncentracijos matavimas spektrofotometru ... 18

2.6. Vieno nukleotido polimorfizmo nustatymas tikro laiko polimerazės grandinės reakcijos metodu ... 19

2.6.1. PGR etapai ... 19

2.6.2. PGR principas ... 19

2.7. Statistinė analizė ... 21

3. Rezultatai ... 22

3.1. SLCO1B1 rs2306283 genotipų dažnis pacientų, sergančių eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje ... 22

3.2. RS 2306283 polimorfizmas, sergantiems eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje atsižvelgiant į tiriamųjų lytį ... 23

3.3. rs2306283 geno polimorfizmo sąsajos sergančių eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija amžiaus grupėse iki 65 metų bei 65 metų ir vyresnių ... 24

4. Rezultatų aptarimas ... 27

2

Santrumpos

AGDD – amžinė geltonosios dėmės degeneracija

OATP – transportuojantis organinius anijonus polipeptidas OKT – optinė koherentinė tomografija

RL – PGR – realaus laiko polimerazės grandininė reakcija mRNR – matricinė Ribonukleino rūgštis

KMI – kūno masės indeksas

TPE – tinklainės pigmentinis epitelis

KEAF – kraujagyslių endotelio augimo faktorius TPE – tinklainės pigmentinis epitelis

LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas PGR – polimerazės grandininė reakcija

3

SANTRAUKA

Baigiamojo mokslinio darbo pavadinimas: Genotipo SLCO1B1 RS 2306283 sąsajos su eksudacinės amžinės geltonosios dėmės degeneracijos pasireiškimu

Vadovė: Dr. Rasa Liutkevičienė

Amžinė geltonosios dėmės degeneracija yra pagrindinė priežastis, sukelianti vyresnių nei 60 metų amžiaus žmonių aklumą, taip pat ši liga lemia vyresnių žmonių regos silpnėjimą. Kol kas nėra žinoma tiksli ligos etiologija ir patogenezė. Anksčiau atlikti tyrimai nustatė, kad ligos atsiradimui didelę įtaką gali turėti genetiniai veiksniai. rs2306283 polimorfizmas didina OATP1B1 baltymo aktyvumą.

Darbo metu tyrėme AGDD sąsajas su OATP1B1 rs2306283 geno polimorfizmu.

Šio tyrimo tikslas: Nustatyti eksudacinės amžinės geltonosios dėmės degeneracijos sąsajas su Rs 2306283 genotipu.

1. Nustatyti rs2306283 genotipo dažnį pacientams, sergantiems eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija bei sveikiems asmenims.

2. Nustatyti rs2306283 genotipo polimorfizmus, sergantiems eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje priklausomai nuo lyties.

3. Nustatyti rs2306283 genotipo polimorfizmo sąsajas sergant eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija, pacientams iki 65 metų amžiaus ir 65 metų bei vyresniems.

Tyrimo metu buvo suformuotos dvi tiriamųjų grupės. Pirmą grupę sudarė 206 eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija sergančių asmenų. Kontrolinę grupę sudarė 206 asmenys. Buvo nustatytas genotipo SLCO1B1 rs2306283 polimorfizmas, tačiau ryšio su AGDD atsiradimu pastebėta nebuvo: A/A – 36,4%, A/G – 44,2%, G/G – 19,4% kontrolinėje grupėje, tuo tarpu A/A – 38,3%, A/G – 39,8%, G/G – 21,8% AGDD grupėje. Iki 65 metų amžiaus sergančiųjų AGDD genotipas A/A ir G/G pasiskirstė po lygiai, o vyresniems negu 65 metai, sergantiems AGDD dominavo A/A genotipas. Vyrų, jaunesnių negu 65 metai amžiaus grupėje A alelis dominavo AGDD sergantiems asmenims (83,3%), o kontrolinėje grupėje A ir G aleliai pasiskirstė po lygiai (50%).

Išvados: genotipo SLCO1B1 rs2306283 polimorfizmas nebuvo reikšmingai susijęs su AGDD pasireiškimu, lyginant su kontroline grupe. Reikšmingų skirtumų, priklausomų nuo lyties, pastebėta nebuvo. Nebuvo nustatyta sąsajų tarp amžiaus grupių, geno polimorfizmo ir AGDD pasireiškimo.

4

Summary

Full title of master thesis: Genotype SLCO1B1 rs2306283 relation with exudative age-related macular degeneration

Supervisor: Dr. Rasa Liutkevičienė

Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in 60 and older individuals while also causing deterioration of vision in others. The aetiology and pathology of AMD is not known. Past research shows that the emergence of AMD may be influenced by genetic factors. Polymorphisms of rs2306283 raises the activity of OATP1B1 protein. During this study we tried to determine AGDD relation to OATP1B1 rs2306283 gene polymorphism.

The purpose of this study: To determine if exudative age-related macular degeneration (AMD) depend on rs2306283 genotype.

1. To determine the frequency of genotype rs2306283 in patients with exudative AMD and for control group.

2. To determine polymorphisms of genotype rs2306283 in patiens with exudative AMD and in control group depending on gender.

3. To determine the relation of rs2108622 polymorphisms in different age groups (<65 and ≥65) of patients with exudative AMD.

During the research two groups of test subjects were formed. First group consisted of 206 patients with exudative age-related macular degeneration (AMD). Control group was formed from 206 individuals. SLCO1B1 rs2306283 genotype polymorphism however relationship with AMD was not determined: A/A – 36,4%, A/G – 44,2%, G/G – 19,4% in control group, while A/A – 38,3%, A/G – 39,8%, G/G – 21,8% in AMD group. In younger than 65 years old patients with AMD genotype A/A and G/G were distributed equally, in older than 65 years old with AMD A/A genotype dominated. In men group younger than 65 years old A allele dominated AMD individuals (83,3%), in control group A and G alleles were distributed equally (50%).

Conclusions: genotype SLCO1B1 rs2306283 polymorphism did not have statistically significant relationship to the emergence of AMD compared to the control group. Significant differences dependant on gender were not noticed. Relationship between age groups, gene polymorphism and emergence of AMD was not noticed.

5

PADĖKA

Nuoširžiai dėkoju už pagalbą ruošiant šį mokslinį darbą savo darbo vadovei Dr. Rasai Liutkevičienei. Už naudingus patarimus ir pagalbą laboratorijoje norėčiau padėkoti LSMU NI Oftalmologijos laboratorijos laborantei Alvitai Vilkevičiūtei.

INTERESŲ KONFLIKTAS

Autoriui interesų konflikto nebuvo.

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

6

Įvadas

Amžinė geltonosios dėmės degeneracija yra pagrindinė priežastis, sukelianti vyresnių žmonių aklumą visame pasaulyje. Kadangi vyresnių gyventojų skaičius didėja, daugėja ir sergančių AGDD. Manoma, kad sergančiųjų AGDD žmonių skaičius 2020 metais pasieks 196 milijonus, o 2040 šis skaičius išaugs iki 288 milijonų. Amžius yra vienas iš pagrindinių rizikos veiksnių. Rizika susirgti pažengusia AGDD forma išauga iki 2% 50-59 metų amžiaus žmonėms, tuo tarpu vyresniems negu 75 metai rizika susirgti AGDD siekia 30% [1]. Ankstyvos AGDD formos dažniausiai būna nepastebimos, nes nesukelia regos sutrikimo, todėl pacientai į oftalmologus nesikreipia. Manoma, kad AGDD yra daugiaveiksnės etiologijos liga, jai atsirasti turi įtakos tiek modifikuojami veiksniai (rūkymas, netinkama mityba), tiek nemodifikuojami veiksniai (amžius, genetika). Šiuolaikinių technologijų dėka galima identifikuoti genus, ištirti galimą jų ryšį su ligos atsiradimu. Tyrimo metu bandėme nustatyti eksudainės AGDD sąsajas su OATP1B1 rs2306283 geno polimorfizmu. Pasirinkome ši geną kaip naują žymenį, galintį sukelti pokyčius tinklainėje.

Tyrimo tikslas: Nustatyti eksudacinės amžinės geltonosios dėmės degeneracijos sąsajas su rs2306283 genotipu.

7

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Nustatyti eksudacinės amžinės geltonosios dėmės degeneracijos sąsajas su Rs 2306283 genotipu.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti rs2306283 genotipo dažnį pacientams, sergantiems eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija, bei sveikiems asmenims.

2. Nustatyti rs2306283 genotipo polimorfizmus, sergantiems eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje priklausomai nuo lyties.

3. Nustatyti rs2306283 genotipo polimorfizmo sąsajas sergant eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija, pacientams iki 65 metų amžiaus ir 65 metų bei vyresniems.

8

1. LITERATŪROS APŽVALGA

Amžinė geltonosios dėmės degeneracija (AGDD) yra progresuojanti degeneracinė tinklainės liga. AGDD serga išsivysčiusių pasaulio šalių vyresnio amžiaus žmonės. AGDD metu pažeidžiama už regėjimo aštrumą ir spalvų matymą atsakinga sritis – geltonoji dėmė. Geltonoji dėmė yra centrinėje tinklainės dalyje, kur dominuoja kūgeliai. Ji yra atsakinga už regėjimo aštrumą ir spalvinį matymą. Geltonoji dėmė susideda iš neurosensorinės tinklainės dalies, tinklainės pigmentinio epitelio, Brucho membranos ir gyslainės. Klinicistai geltonąją dėmę apibūdina kaip 6 mm diametro laukelį, esantį tarp pagrindinio tinklainės kraujagyslinio sluoksnio, tuo tarpu anatomai geltonąją dėmę apibūdina kaip tinklainės dalį, kuri apima daugiau negu vieną sluoksnį ganglinių ląstelių branduolių. Tinklainės pigmentis epitelis atlieka daug funkcijų, tokių kaip nebeveiksnių fotoreceptorių fagocitavimas, šviesos sugertis, šilumos „mainai“, vitamino A metabolizmas. Drūzų formavimasis tarp tinklainės pigmentinio epitelio ir Brucho membranos lemia ankstyvuosius AGDD požymius ir nedidelio laipsnio regėjimo sumažėjimą. Tačiau liga gali būti ir pažengusi – eksudacinė AGDD (pasireiškia patologiniai pokyčiai Brucho membranoje ir tinklainės pigmentiniame epitelyje, kurie leidžia gyslainės kraujagyslėms patekti į tinklainę). Pažengusi AGDD gali pasireikšti ir geografine atrofija (apibūdinama tinklainės fotoreceptorių netekimu). Regėjimo praradimas blogina gyvenimo kokybę – žmogus negali aktyviai gyventi, vairuoti, o tai lemia ir psichologinių būklių pablogėjimą, depresiją. Kadangi prasidėjus AGDD, ji progresuoja iš lėto iki visiško regos netekimo ir nėra atrasta priemonių regėjimo sugrąžinimui, žmonės nerimauja jau nuo pirmųjų požymių atsiradimo nė kiek ne mažiau, negu tie, kuriems ši liga yra sukėlusi visišką aklumą [3]. AGDD yra daugiaveiksnė liga, jai atsirasti turi įtakos tiek aplinkos, tiek genetiniai faktoriai, tiek jų tarpusavio sąsajų visuma. AGDD skirstoma į: neeksudacinę (sausoji) ir eksudacinę (šlapioji) formas. Kai geografinė atrofija apima centrinę duobutę (lot. fovea), tai jau yra rimtas regėjimo sutrikimas. Dažniausiai yra pažeidžiamos abi akys.

1.2. Amžinės geltonosios dėmės degeneracijos rizikos veiksniai

Labiausiai ši liga paveikia išsivysčiusių pasaulio šalių gyventojus. Rizika susirgti didėja su amžiumi. Tai yra polietiologinė liga. Rizikos faktoriai yra skirstomi į nemodifikuojamus – tokie kaip amžius, lytis ir modifikuojamus – gyvenimo būdas. Didžiausias nemodifikuojamas rizikos veiksnys yra amžius – su kiekvienais metais virš 50 metų amžiaus rizika susirgti AGDD didėja. Christine Curcio teorija teigia, kad tinklainės pigmentinis epitelis sintezuoja ir išskiria mažo tankio lipoproteinus. Šie lipoproteinai keliauja per tinklainės pigmentinį epitelį ir Brucho membraną į linijinius tinklelius. Būtent dėl amžiaus nulemtų pokyčių Brucho membranos elastiniame sluoksnyje, lipoproteinai pirmiausiai patenka į vidinį kolageninį sluoksnį, gretimą elastiniui sluoksniui, toliau eina link tinklainės pigmentinio epitelio, formuodami „lipidų sieną“. Lipidų siena apsaugo nuo būtinų

9 patekti medžiagų, tokių kaip baltymai ir deguonis, reikalingų normaliai akies funkcijai, tačiau tuo pačiu ši siena apsaugo ir nuo toksinių metabolitų [4]. Didžiausias modifikuojamas veiksnys yra rūkymas [5]. Rūkymas daro įtaką tiek ligos atsiradimui, tiek jos progresavimui [6]. Rūkantys asmenys turi didesnę riziką susirgti AGDD už tuos, kurie yra metę rūkyti ir už tuos, kurie niekada nerūkė [7]. Tarp metusių rūkyti ir niekada nerūkusių žmonių nebuvo pastebėta skirtinga rizika susirgti AGDD [7]. Asmenys, surūkantys 20 cigarečių per dieną, turėjo 2,5 kartus didesnę riziką susirgti AGDD [5]. Tikslus mechanizmas, kaip rūkymas paveikia tinklainę, pigmentinį epitelį ir gyslainę yra nežinomas. Tačiau yra iškelta hipotezė, kad AGDD yra rezultatas kumuliacinio oksidacinio insulto išorinėje tinklainės dalyje. Taip pat yra žinoma, kad rūkymas sumažina cirkuliuojančių antioksidantų kiekį. Vyrai, kurie surūkydavo vieną pakelį cigarečių per dieną, turėjo tik 72% plazmos beta karoteno [8]. Rūkymas sumažina liuteinininių pigmentų kiekį žmogaus tinklainėje [9]. Sumažėjusi galimybė sudaryti junginius su antioksidantinėmis medžiagomis mažina tinklainės atsparumą oksidaciniam pažeidimui. Rūkymas gali pažeisti gyslainės kraujagysles sukeldamas aterosklerozę ar hipoksiją gyslainės kraujagyslėse ir sukeldamas vazokonstrikciją [10]. Padidėjusio bendrojo kraujo cholesterolio įtaka AGDD atsiradimui nėra įrodyta, tačiau yra pastebėtas ryšys tarp išeminės širdies ligos ir padidėjusios rizikos sirgti AGDD [11]. Įtakos AGDD atsiradimui taip pat turi dieta, didelis kūno svoris, aukštas kraujo spaudimas, širdies ir kraujagyslių ligos, intensyvi saulės šviesa. Yra apskaičiuota, kad maždaug 8 milijonai žmonių, vyresnių negu 55 metai Jungtinėse Valstijose turi progresuojančią arba pežengusią geltonosios dėmės degeneraciją [12]. Ryški saulės šviesa, šeiminė anamnezė kol kas yra pagrindiniai rizikos veiksniai. AGDD dažniau serga baltaodžiai, negu juodaodžiai gyventojai. Atliktuose tyrimuose buvo pastebėta, kad raudonos mėsos vartojimas, žuvies vartojimas ir rainelės spalva neturėjo reikšmės AGDD atsirasti [13]. Kai kuriuose tyrimuose buvo nustatyta, kad AGDD rizika yra didesnė asmenims, turintiems toliaregystę, tačiau patvirtinimui reiktų išsamesnių tyrimų [14]. Didelis kūno masės indeksas ir nutukimas turi ryšį su neovaskuliarizuota AGDD. Oulu studijos nustatė, kad nutukimas riziką sirgti didina dėl padidėjusio oksidacinio pažeidimo [15].

Remiantis Beaver Dam studija, didesnis KMI yra susijęs su ankstyvųjų AGDD požymiu atsiradimu, o ne su neovaskuline AGDD [16]. Taniguchi ir bendrauaotorių naujausi tyrimai taip pat parodė, kad neovaskulinė AGDD turi ryšį su ateroskleroze [17]. Taip pat yra nustatytas ryšys tarp ankstyvos AGDD ir padidėjusios rizikos sirgti insultu [18]. Pastebėta, kad arterinė hipertenzija yra susijusi su sumažėjusia kraujotaka gyslainėje, todėl greičiau vystosi AGDD. Hyman ir bendraautoriai nustatė stiprų ryšį tarp neovaskulinės AGDD ir didelio diastolinio kraujo spaudimo [19]. Kiti tyrimai nustatė sąsajas tarp aukšto sistolinio kraujo spaudimo ir tinklainės pigmentinio epitelio pigmentacijos pokyčiais ir neovaskulinės AGDD atsiradimu [20]. Atiktose Munch ir bendraautorių tyrimo duomenimis buvo nustatyta padidėjusi rizika pasireikšti didelėms drūzoms geltonojoje dėmėje

10 moterims su padidėjusiu serumo trigliceridų kiekiu, tačiau vyrams, turintiems didesnį serumo trigliceridų kiekį, nebuvo pastebėta daugiau didelių drūzų. Tačiau padidėjęs serumo trigliceridų kiekis tiek moterims, tiek vyrams lėmė didesnį (20+) smulkių, kietų drūzų skaičių. Tokį patį efektą sukėlė ir padidėjęs mažo tankio lipoproteinų skaičius. Pabrėžtina, kad drūzų skaičiaus didėjimą lėmė didesnė trigliceridų koncentracija, tačiau asmenys, turintys didžiausią serumo trigliceridų kiekį, tokios rizikos neturėjo ir asmenys, turintys didžiausią mažo tankio lipoproteinų skaičių taip pat nebuvo siejami su didesniu didelių drūzų skaičiumi. Tarp bendrojo cholesterolio kiekio, didelio tankio lipoproteinų kiekio ir drūzų skaičiaus padidėjimo ryšys nebuvo nustatytas [21]. 65% AGDD sirgusių asmenų 2010 metais buvo moterys [22]. Tai galima paaiškinti tuo, kad moterys pasižymi ilgesne gyvenimo trukme, todėl ir senatvinių ligų tikimybė moterims yra didesnė. Tačiau kai kurios moterys vartoja hormoninius preparatus, o estrogenai turi antioksidacinių savybių, kurios saugo nuo AGDD atsiradimo [23]. Geltonoji dėmė yra aplinkoje, kurioje vyrauja aukštas oksidacinio streso lygis, dėl didelio kiekio šaltinių, turinčių daug reaktyvaus deguonies rūšių. Esant regos pažeidimui, geltonojoje dėmėje pagreitėja metabolizmas, kurio dėka daugėja reaktyvaus deguonies. Tinklainės pigmentinis epitelis yra neapsaugotas nuo aukšto aplinkos deguonies dalelių spaudimo (70-90mmHg), todėl rega blogėja. 1.3. Amžinės geltonosios dėmės degeneracijos formos

Sausa AGDD gali komplikuotis į eksudacinę AGDD. Rizika susirgti eksudacine AGDD, sergant sausąja ligos forma yra nuo 1% iki 4,7% per vienerius metus ir nuo 13% iki 18% praėjus 3 metams nuo pirmųjų AGDD požymių. Ankstyvosios ligos stadijos yra dažnesnės negu pažengusi liga.

Sausa AGDD apima drūzų formavimąsi, židininę ar plačiau išplitusią tinklainės pigmentinio epitelio geografinę atrofiją. Drūzos yra ekstraląstelinės medžiagos sankaupos, susikoncentravusios geltonojoje dėmėje, oftalmoskopuojant matomos kaip maži, šviesūs geltoni objektai. Drūzos gali būti minkštos, gali būti kietos, kristalizuotos ir kalcifikuotos.

11 Pažengusios AGDD progresavimo rizika didėja kartu su didėjančiu minkštų drūzų skaičiumi ir didėjančia jų apimtimi. Keletas smulkių kietų drūzų yra randama beveik visiems žmonėms, vyresniems negu 50 metų – tai yra normalus, amžiaus sukeltas padarinys. Kietos drūzos nėra susijusios su AGDD komplikacijomis. Pažengusi sausa AGDD yra taip pat susijusi su geografine atrofija, kuri apibūdinama kaip ląstelių ir fotoreceptorių žūtis tam tikrose tinklainės pigmentinio epitelio vietose. Tai nulemia maždaug 10% aklumo, susijusio su AGDD. Eksudacinė AGDD vystosi atsirandant gyslainės naujadarinėms kraujagyslėms, kurios dėl savo pokyčių praleidžia tekantį kraują ir jį sudarančias skystas medžiagas tarp gyslainės ir tinklainės. Šis ligos tipas dar kitaip vadinamas gyslainės neovaskulizacija. Ši būklė gali sukelti TPE atšoką.

2 pav. Eksudacinė amžinė geltonosios dėmės degeneracija [24]

1.4. Genetinių veiksnių įtaka amžinės geltonosios dėmės degeneracijos atsiradimui

Yra ištirta, kad ligos atsiradimui didelę reikšmę turi genetiniai veiksniai. Remiantis skaičiavimų duomenimis, ligos sunkumas net 71% priklauso nuo genetinių veiksnių[25]. Monozigotiniams dvyniams daug dažniau pasireikšdavo AGDD abiems kartu, negu dizigotiniams [26]. Yra manoma, kad specifiniai genotipų polimorfizmai gali turėti įtakos ligos atsiradimui, prisidėti prie modifikuojamų ir nemodifikuojamų rizikos faktorių [27]. Buvo nustatyta, kad genų polimorfizmas keliuose genuose gali būti daugiau negu 50% AGDD priežastimi [28]. Stipriausia hipotezė keliama genams, esantiems komplemento sistemoje, taip pat genetiniams faktoriams, apimantiems imuninį procesą, lipidų metabolizmą, kolageno ir ekstraceliulinio matrikso mechanizmą ir angiogenezės kelius. Genetiniai faktoriai gali turėti įtakos AGDD prasidėjimui ar progresavimui, taip pat lemti skirtingą atsaką į gydymą.

SLC01B1 genas priklauso organinių anijonų transporterių šeimos genams. Jis koduoja polipeptidą OATP1B1 (transportuojantį organinius anijonus). Šis baltymas susideda iš 691 amino rūgšties, randasi bazolateralinėje hepatocitų membranoje ir plonųjų žarnų enterocituose. OATP1B1

12 reguliuoja didelį kiekį egzogeninių ir endogeninių medžiagų eksportą hepatocituose, įskaitant ir statinų, pvz atorvastatinų. Rs2306283 polimorfizmas (c.388A>G) didina OATP1B1 baltymo aktyvumą, todėl mažėja statinų koncentracija plazmoje [29]. Šis baltymas išskiriamas tik kepenyse [30]. Šis baltymas transportuoja endogenines medžiagas, tokias kaip tulžies rūgštis, skydliaukės hormonus, steroidų sulfatai, glukuronidų konjugatai ir peptidai [31]. Transportiniai baltymai yra reikalingi absorbcijai, ekskrecijai įvairių medžiagų, kurios negali laisvai difunduoti per ląstelės membranas. OATP priklauso superšeimai, kuri atlieka įvairių medžiagų transportą ir yra klasifikuojama į šeimas, pvz. SLCO genų šeima. Yra žinoma 11 žmogaus OATP superšeimų, kurios yra padalintos į 6 šeimas pagal amino rūgščių seką [32]. Šeimos pagal amino rūgščių seką padalinamos į pošeimius. OATP1 šeima yra geriausiai ištirta tarp OATP šeimų. Ši šeima turi multispecifinius transporterius OATP1A2, OATP1B1, OATP1B3 ir OATP1C1. OATP3A1, OATP5A1 ir OATP6A1 yra vieninteliai nariai OATP3, OATP5 ir OATP6 šeimų [33]. OATP4 šeima susideda iš OATP4A1 ir OATP4C1. OATP baltymų struktūra turi 12 transmembraninių domenų su viduląstelinėmis amino ir karboksi dalelėmis. Kai kurie struktūriniai bruožai yra svarbūs membranos lokalizacijai ir transporto funkcijai, pavyzdžiui: daugelis OATP turi PDZ seką, kuri yra svarbi membranos įsitvirtinimui. OATP1B1 yra svarbus pirminio substrato atpažinimui ir perkėlimui per membraną [34]. OATP funkcija apima junginių įsisavinimą ląstelėje ir gali būti tiek audiniams specifinė, tiek ekspresuojama daugelyje kūno audinių. Kai kurios studijos nurodo, kad OATP eksprecijos didėjimą ar mažėjimą gali lemti vėžinės ligos. OATP1 šeimoje OATP1A2 mRNA ekspresija yra didžiausia smegenyse, taip pat ekspresija vyksta ir inkstuose, kepenyse, plaučiuose [35,36]. Eksprecija vyksta kraujo – smegenų barjere, distalinio nefrono dalies apikalinėje membranoje, enterocitų apikalinėje membranoje. OATP1B1 ir OATP1B3 yra audiniams specifiniai OATP. OATP1B1 eksprecija vyksta hepatocitų bazolateralinėje membranoje, visoje kepenų skiltelėje. Atlikus studijas, naudojant RT-PCR analizę buvo nustatyta OATP1B3 mRNA ekspresija tinklainėje, tačiau baltymų ekspresija patvirtinta nebuvo. OATP1C1 baltymas nustatytas bazolateralinėje membranoje krumplyno kūno epitelyje [2].

3 pav. SLCO1B3 geno vieta genome [37].

Šis baltymas transportuoja medžiagas iš kraujo į kepenis taip, kad jos būtų pašalintos iš organizmo. Mutacijos SLCO1B1 gene taip pat gali sukelti Rotoriaus sindromą. Šios mutacijos metu pažeidžiamas ir SLCO1B3 genas, todėl neprodukuojamas tinkamas OATP1B3 baltymas. Baltymai

13 tampa nenormalūs, trumpi ir nefunkcionuojantys. Be šio geno funkcijos, bilirubinas yra mažiau šalinamas kepenyse, padidėja jo koncentracija kraujyje [38,39].

1.5. AGDD patogenezė

Sausos AGDD patogenezė nėra aiški. Yra atlikta tyrimų, rodančių, kad svarbų vaidmenį galimai atlieka pakitimai Brucho membranoje esančiame sluoksnyje. Uždegimas ir lėtinė infekcija taip pat atlieka svarbų vaidmenį [40]. Yra siūloma keletas sausos AGDD atsiradimo mechanizmų: fotoreceptorių ir tinklainės pigmentinio epitelio išemija dėl sumažėjusios gyslainės ir Brucho membranos perfuzijos [41], tinklainės pigmentinio epitelio apoptozė dėl uždegimo metu vykstančių komponentų aktyvavimo [42]. Taip pat galimi genetiniai sutrikimai, paveikiantys fotoreceptorių išorinį sluoksnį ar tinklainės pigmentinį epitelį. Dėl šių anomalijų galimai formuojasi drūzos, lemiančios regos prastėjimą ir AGDD atsiradimą. Yra nustatyta, kad sausoji amžinė geltonosios dėmės degeneracija pasižymi drūzų formavimusi po tinklainės pigmentiniu epiteliu ties Brucho membrana. Brucho membrana yra neląstelinė membrana po TPE, suformuota iš 5 sluoksnių, kurie veikia kaip barjeras tarp tinklainės ir gyslainės. Maistinės medžiagos ir deguonis difunduoja iš gyslainės kapiliarų per Brucho membraną į TPE ir tinklainę, o susidarę metaboliniai produktai šalinami atvirkščiai – iš tinklainės keliaujant metabolitams į gyslainę. Brucho membraną paveikia tokie veiksniai, kaip amžius, plonėjimas, kalcifikacija, kolageno ir elastino degeneracija. Per Brucho membraną pilnai nepraeina lipidų turinčios metabolinės medžiagos, o iš jų formuojasi drūzos. Tokios drūzos gali būti matomos kaip balkšvai gelsvi taškeliai akių dugno nuotraukoje [43]. Yra dviejų tipų drūzos – minkštos ir kietos. Minkštos drūzos yra siejamos su ryškiu regėjimo silpnėjimu. Vystantis eksudacinei AGDD kraujagyslių endotelio augimo faktorius (KEAF) stimuliuoja naujų kraujagyslių augimą gyslainėje, kurios patenka į tinklainę po geltonąja dėme. Gyslainės neovaskulizacija yra kontroliuojama dinaminio balanso tarp membranos ir pro ją difunduojančių medžiagų, kurios arba didina arba slopina kraujagyslių vystymąsi. Angiogenezė prasideda vazodilatacija ir padidėjusiu kraujagyslių pralaidumu, kas lemia kraujagyslių endotelio ląstelių aktyvaciją ir proliferaciją. Ekstraceliulinio matrikso degeneracija palengvina endotelio ląstelių migraciją. Gyslainės neovaskulizacija pažeidžia normalų anatominį Brucho membranos barjerą ir užima naujas pigmentinio epitelio vietas [44]. Šios naujai susiformavusios kraujagyslės yra pralaidžios ir iš jų dažnai kraujuoja, kinta geltonosios dėmės forma, ji tampa apsupta mažų kraujosruvų, audinių randėjimo [45]. Tai lemia Brucho membranos atsiskyrimą, tinklainės pigmentinis epitelis atsiskiria nuo tinklainės, todėl tinklainės viduje pradeda kauptis skysčiai, tinklainė sustorėja, formuojasi cistinės erdvės. Dėl šių patologinių pokyčių vyksta fotoreceptorių degeneraciniai pokyčiai su ląstelių praradimu ir galima fibroze [46]. Šie pokyčiai kliniškai pasireiškia centriniu matymo netekimu ir juodų taškų regėjimo lauke atsiradimu. Sausoji

14 AGDD progresuoja iš lėto metų metais, tuo tarpu eksudacinė AGDD gali progresuoti labai greitai – mėnesiais ar net savaitėmis.

1.6. AGDD gydymas

Ankstyvosioms AGDD stadijoms gydymas kol kas nėra atrastas. Ankstyvosiose stadijose daugeliui žmonių dar nepasireiškia simptomų ir regos sutrikimo. Pradinėse stadijose rekomenduojama mažiausiai kartą per metus apsilankyti pas oftalmologą, kad būtų nuodugniai ištirtos akys ir stebima dėl ligos progresavimo. Kaip prevencinės priemonės rekomenduojama reguliariai mankštintis, nerūkyti arba mesti rūkyti, valgyti mažai riebalų turintį maistą, žuvį ir daug daržovių. Šie pokyčiai padeda pristabdyti jau atsiradusios AGDD progresavimą. Vitaminų C, E, beta- karoteno, cinko ir vario kombinacija gali sumažinti vėlyvos AGDD riziką 25% [47]. Rekomenduojama per dieną suvartoti 500 mg vitamino C, 10mg Liuteino (jis kaupiasi geltonojoje dėmėje ir veikia kaip antioksidantas), 2 mg Zeaksantino, 80 mg cinko ir 2 mg vario [48].

Naujausi tyrimai rodo, kad kaulų čiulpų ląstelių terapija pelėms, turinčioms AGDD požymių galimai padėjo sustiprinti tinklainės struktūrą ir regėjimą. Autoriai naudojo kaulų čiulpų ląsteles, kurios išskirdavo RPE65 baltymą. RPE65 yra tinklainės pigmentinio epitelio markeris, kuris degeneruoja AGDD metu. Patekęs į pažeistą tinklainės pigmentinį epitelį, RPE65 jį galimai sustiprina [49]. Pažengusioms formoms gydyti taikoma tinklainės fotokoaguliacija lazeriu. Šios procedūros metu yra naudojama intensyvi šviesa, kurios dėka yra nudeginami maži tinklainės ploteliai ir nenormalios kraujagyslės po geltonąja dėme. Formuojasi randinis audinys, kuris sutvirtina kraujagysles ir apsaugo nuo skysčių prasiskverbimo iš jų po geltonąja dėme. Tačiau šis gydymo būdas nesugrąžina prarasto regėjimo, jis tik pristabdo ligos progresavimą. Eksudacinė AGDD gali būti gydoma vartojant kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus inhibitorius – Bevacizumabą, Ranibizumabą, Pegaptanibą. Šie preparatai yra injekuojami į stiklakūnį. KEAF inhibitoriai gali apsaugoti nuo staigaus regėjimo netekimo [50,51]. KEAF stimuliuoja nenormalių kraujagyslių augimą. Jis yra citokinas, išskiriamas kaip atsakas į hipoksiją, kuris jungiasi prie endotelio ląstelių ir skatina kraujagyslių nuosrūvį. KEAF mažina AGDD progresavimą ir gali net pagerinti regėjimą.

15 1.

Tyrimo metodika

2.1. Tyrimo planavimas

Planuojant šį tyrimą buvo ieškoma informacija, pagal kurią būtų labiausiai tikėtina, jog geno polimorfizmas turėtų įtakos ligos atsiradimui. Buvo ieškoma literatūros, skaitomi naujausi straipsniai. Buvo pasirinktas genas, kurio polimorfizmas AGDD atveju dar nebuvo tirtas. Baigiamojo mokslinio darbo tyrimai atlikti LSMU NI Oftalmologijos laboratorijoje. Planavimo eigoje buvo susipažįstama su laboratorijos įranga, galimybėmis. Pradėjus atlikinėti tyrimą buvo užsakomi reikiami reagentai.

2.2. Tyrimo objektas

Tyrimo metu buvo ištirtas rs2306283 geno polimorfizmas, sergantiems eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinei grupėms.

2.3. Tiriamųjų atranka

Buvo gautas Kauno regioninio biomedicinių tyrimų etikos komiteto leidimas nr. Nr. P1- BE-2-13/2008.2015-06-05.

Tyrime dalyvaujantys pacientai pasirašė informuoto asmens sutikimo formą. Tyrimo metu buvo suformuotos dvi tiriamųjų grupės. Pirmą grupę sudarė 206 eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija sergančių asmenų: iš jų 42 vyrai (28 proc.) ir 108 moterys (72 proc.), tiriamųjų amžiaus vidurkis – 68,83 metai. Kontrolinę grupę sudarė 206 asmenys, 76 vyrai (25,68 proc.) ir 220 (74,32 proc.) moterys, amžiaus vidurkis siekė 68,22 metus.

Eksudacine AGDD sergančių pacientų įtraukimo į tyrimą kriterijai:

1. Moterys ir vyrai ≥50 metų, kuriems diagnuozuota eksudacinė amžinė geltonosios dėmės degeneracija.

2. Eksudacinė AGDD nustatyta, ištyrus dviems oftalmologams, kurie yra atlikę spalvotą akių dugno fotografiją, optinę koherentinę tomografiją (OKT) ir/ar fluorescencinę angiografiją.

3. Turi būti pasirašyta informuota asmens sutikimo anketa bei sutikimas dalyvauti tyrime.

Sergančiųjų eksudacine AGDD pacientų neįtraukimo į tyrimą kriterijai:

1. Gretutinės akių ligos (didelio laipsnio refrakcijos ydos, ragenos drumstys, lęšiuko drumstys, keratitai, glaukoma, regos nervo ligos).

2. Sisteminės ligos (cukrinis diabetas, onkologinės ligos, sisteminės jungiamojo audinio ligos, lėtinės infekcinės ligos, būklės po audinių ar organų transplantacijos).

3. Nustatyta pradinė amžinės geltonosios dėmės degeneracijos forma be tinklainės novaskuliarizacijos. 4. Neatlikta OKT ar fluorescencinės angiografijos tyrimų.

16 Kontrolinės grupės įtraukimo į tyrimą kriterijai:

1. Asmenys turi būti oftalmologiškai sveiki.

2. Asmenys turi nesirgti ūmiais ar lėtiniais infekciniais ar neinfekciniais susirgimais. 3. Turi būti pasirašyta informuoto asmens sutikimo anketa.

2.4. Deoksiribonukleininės rūgšties išskyrimas

Pirmiausia kraujas buvo paimtas į vakuuminius mėgintuvėlius, kuriuose buvo ir etilendiamintetraacetato (EDTA), kuris apsaugo kraują nuo mikrokrešulių formavimosi ir apsaugo DNR nuo degradacijos. Iš periferinio kraujo baltųjų kraujo ląstelių, tokių kaip leukocitai, buvo išskirta genominė DNR. Genominė DNR buvo išskirta naudojant dviejų tipų rinkinius: ,,Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit’’ ir ,,Thermo Scientific MagJET Genomic DNA Kit’’

2.4.1. Silikagelio kolonėlių naudojimas DNR išskyrimui

Buvo panaudojas rinkinys ,,Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit’’ ir išskirta DNR silikagelio kolonėlių metodu. Šiuo metu galima išskirti geros kokybės DNR, kuri gali būti panaudojama tolimesniems RL – PGR tyrimams.

Rinkinį sudaro:

Proteinazės K tirpalas

Lizavimo tirpalas (Lysis solution) RNazės A tirpalas

Eliucijos buferis (Elution buffer) Plovimo buferis II (Wash buffer II) Plovimo buferis I (Wash buffer I) Skaidymo tirpalas (Digestion solution) Silikagelio kolonėlės

DNR išskyrimo etapai Ląstelių lizė

Į sterilų, 2 ml tūrio, Eppendorf tipo mėgintuvėlį įpilama 200 µl veninio kraujo, 400 µl lizavimo tirpalo ir 20 µl proteinazės K tirpalo. Susidaręs mišinys sumaišomas ir inkubuojamas 10 min. 56 ºC temperatūroje. Viduje esantis lizavimo tirpalas suardo išorinę ląstelių membraną, proteinazė K suardo ląstelės baltymus, branduolio membraną ir tuo pačiu inaktyvuoja nukleazes, ardančias DNR.

17 DNR nusodinimas ant silikagelio kolonėlės membranos

Į tirpalą įpilama 200 µl 96 proc. etanolio, mėginys sumaišomas. DNR sąveikauja su etanoliu, todėl precipituoja – taip ji negali pereiti per kolonėlės membraną ir lieka ant membranos. Mišinys pilamas į surenkamąjį mėgintuvėlį ir centrifuguojamas 1 min. 6000 aps./min. greičiu. Centrifugavimo metu DNR prikimba prie kolonėlės membranos.

DNR išgryninimas nuo baltyminių liekanų, druskų ir ląstelių lizavimui panaudotų reagentų. Buvo naudojami du buferiai –plovimo buferis I, kurio buvo pilama į kolonėlę 500 µl, tuomet mėginys centrifuguojamas 1 min. 8000 aps./min. greičiu. Vėliau pilama buferio II 500 µl ir centrifuguojama 3 min. 12000 aps./min. greičiu.

DNR išplovimas iš kolonėlės

DNR išplovimo principas remiasi adsorbcija ant kieto paviršiaus. Lizuojamos biologinio objekto ląstelės tvirtinasi ant filtrų dėl aukštos joninės jėgos chaotropinių tirpalų, o nuo filtro nuplaunamos pateikiamu buferiu. Sąveikai įtakos turi ir pH, taip pat druskos, esančios eliucijos buferyje.Į mišinį pilama 75 µl eliucijos buferio, inkubuojama 2 min. tuomet centrifuguojama 1 min. 8000 aps./min. greičiu. Eliucijos buferyje DNR ištirpsta, tuomet ji surenkama į kriomėgintuvėlius ir saugoma -20 ̊ C temperatūroje.

2.4.2. DNR išskyrimas magnetinių dalelių pagalba

,,Thermo Scientific GenJET Genomic DNA Purtification Kit’’ rinkinio veikimas pagrįstas magnetinėmis dalelėmis, todėl galima gauti aukštos kokybės DNR. Tokia DNR tinkama naudoti tolimesniems tyrimams, tokiems kaip RL – PGR.

Rinkinį sudaro:

RNazės A tirpalas

Lizavimo tirpalas (Lysis solution) Proteinazės K tirpalas

Plovimo buferis I (Wash buffer I) Plovimo buferis II (Wash buffer II) Eliucijos buferis (Elution buffer) Skaidymo tirpalas (Digestion solution) RNazės A tirpalas

Magnetinės dalelės Magnetinis stovelis

18 DNR gryninimo etapai:

Ląstelių lizė

Pirmiausia į sterilų, 2 ml tūrio, Eppendorf tipo mėgintuvėlį įpilama 200 µl veninio kraujo, 200 µl skaidymo tirpalo 20 µl proteinazės K tirpalo. Gautas mišinys sumaišomas ir inkubuojamas 10 min. 56ºC temperatūroje. Skaidymo tirpalas suardo išorinę ląstelių membraną. Proteinazė K suardo ląstelės baltymus, branduolio membraną ir inaktyvuoja nukleazes, ardančias DNR.

RNR inaktyvacija

RNR inaktyvacijai yra skirtas RNazės A tirpalas. Į lizatą įpilama 20 µl RNazės A, gerai sumaišoma ir inkubuojama 10 min. kambario temperatūroje.

DNR surišimas su magnetinėmis dalelėmis

Į mėginį įpilama 300 µl lizės buferio, tuomet mėginys yra sumaišomas. Turinys perpilamas į naują mėgintuvėlį, kuris turi 400 µl 96 proc. etanolio ir 25 µl magnetinių dalelių. Viskas vėl sumaišoma ir pastatoma į magnetinį stovelį. Magnetiniame stovelyje mėginys laikomas 3 minutes. Tuo metu DNR su magnetinėmis dalelėmis prisitvirtina prie mėgintuvėlio sienelės. Mėgintuvėlio sienelė yra prie magneto.

Iš DNR pašalinimas baltyminių liekanų, druskų ir reagentų, kurie buvo panaudoti ląstelių lizavimui

DNR išvalymui buvo panaudoti du buferiai – plovimo buferis I ir plovimo buferis II. Plovimo buferio I įpilta 800 µl, tuomet mėginys sumaišytas ir plautas du kartus, taip pat buvo įpilta 800 µl plovimo buferio II. Mėginys įstatomas ir palaikomas 2 – 3 min. magnetiniame stovelyje.

DNR išgryninimas

Norint išgryninti DNR buvo įpilta eliucijos buferio. Buvo įpilta 75 µl eliucijos buferio ir viskas gerai sumaišyta. Mėginys buvo inkubuojamas 72ºC temperatūroje 5 min. DNR, kuri buvo ištirpusi Eliucijos buferyje, surinkta į kriomėgintuvėlius ir saugota -20 ̊ C temperatūroje.

2.5. DNR koncentracijos matavimas spektrofotometru

Prieš atliekant RL – PGR, reikėjo išmatuoti išskirtos DNR koncentraciją, todėl tyrimo metu ji buvo išmatuota spektrofotometru ,,Agilent Technologies, Cary 60 UV – Vis“. DNR, RNR, oligonukleotidų ir mononukleotidų kiekis yra nustatomas naudojant vandeninius tirpalus, kuomet yra matuojama tirpalo absorbcija (optinis tankis) ultravioletinių bangų ilgyje. Panaudojus 260 nm UV šviesos bangos ilgio spindulius buvo vykdomas nukleino rūgščių nustatymas. Išmatavus optinių tankių santykį, esant 260 nm ir 280 nm UV šviesos bangos ilgiams, buvo įvertintos baltyminės tirpalo priemaišos. Grynos DNR santykis turi būti apie 1,8.

19 2.6. Vieno nukleotido polimorfizmo nustatymas tikro laiko polimerazės grandinės reakcijos metodu

Genų polimorfizmų tyrimai RS 2306283 buvo atlikti tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu.

2.6.1. PGR etapai

Yra keli PGR etapai. Pirmojo etapo metu vyksta iniciacija – Taq polimerazės aktyvacija. Reakcija vykdoma 95ºC temperatūroje, 10 min. Po to vyksta cikliškai pasikartojantys etapai:

1. Pirmas etapas – DNR denatūracija. Denatūracija yra vykdoma 92ºC temperatūroje, 15 sek. Jos metu yra nutraukiamos vandenilinės jungtys tarp azotinių bazių, todėl DNR grandinės atsiskiria viena nuo kitos.

2. Antras etapas – pradmenų hibridizacija ir elongacija. Šis etapas yra vykdomas 60ºC temperatūroje, 1 min.Vandenilinėmis jungtimis pradmenys jungiasi prie jiems komplementarių dauginamos DNR sričių. Šią reakciją katalizuoja fermentas Taq polimerazė. Antrąjame etape polimerazė sintetina komplementarią matricinei DNR grandinę. Yra eksponentiškas didėjimas DNR kiekio, kai kartojama denatūracija, hibridizacija ir elongacija.

2.6.2. PGR principas

Genotipavimui buvo panaudotas tikro laiko PGR gausintuvas ,,Rotor – Gene Q“. Šiam etapui įvykdyti buvo skirti pradmenys ir molekuliniai žibukai, kurie yra sukurti kompanijos ,,Applied Biosystems“. Reakcijoms atlikti buvo naudojama 2 µl genominė DNR (~10 ng) ir 10 µl PGR reakcijos mišinio. Šio mišinio sudėtis yra nurodoma 1 lentelėje. PGR vykdymui reikalingos sąlygos yra aprašytos 2 lentelėje.

20

1 lentelė. Realaus laiko PGR mišinio paruošimas

Reagentai 1 pvz., µl 76 pvz., µl

TaqMan Universal Master Mix II (,,Applied Biosystems‘‘, Lietuva)

6,25 µl 475 µl

„Applied Biosystems“ genotipavimo rinkiniai (Rs2108622 1347 C>T)

0,625 µl 47,5 µl

Sterilus ddH2O

(,,Thermo Fisher Scientific’’, Lietuva)

3,5 µl 266 µl

Viso (PGR mišinio) 10,375 µl 788,5 µl

DNR 2 µl

Viso 12 µl

2 lentelė. Optimalios genotipavimo reakcijos sąlygos, nustatant RS 2306283 genotipą tikro laiko PGR gausintuvu ,,Rotor – Gene Q“

Genotipavimo rinkinys PGR sąlygų

protokolai

Produkto dydis RS 2306283

“Applied Biosystem” patentas. 95ºC 10 min 40 ciklų: 92ºC 15s 60ºC 60s Nenurodyta Metodas:

1. Pirmiausiai 76 mėginiams yra paruošiamas PGR mišinys. 2. Mišinys išpilstomas po 10 µl į 0,1 ml tūrio mėgintuvėlius.

3. Į kiekvieną iš 72 mėgintuvėlių yra įpilama po 2 µl DNR, o paskutiniame yra paliekama kontrolė, todėl įpilama sterilaus vandens.

4. Paruošti mėgintuvėliai sudedami į 72 mėgintuvėliams skirtą diską, o ant jo viršaus uždedamas apsauginis žiedas.

5. Pasirenkama ir nustatoma programa vienam iš polimorfizmų identifikuoti. Genotipuojant naudota ,,Alelių nustatymo“ programa(angl. Allelic Discrimination“).

6. Programa pasibaigia praėjus 2,5 val, rezultatų pavyzdys pateikiamas 4 paveiksle. Pagal skirtingų detektorių fluorescencijos intensyvumo santykį, programa nustato individų genotipus. Nustatymui

21 naudojami fluorescenciniais VIC ir FAM dažais žymėti molekuliniai žibukai. Gautiems rezultatams toliau įvertinti yra naudojami statiniai skaičiavimai.

4 pav. „Alelių nustatymo“ programos rezultatų diagrama.

2.7. Statistinė analizė

Statistinei duomenų analizei buvo naudojama kompiuterinė programa „IBM SPSS Statistics“. Duomenys yra pateikti kaip realieji skaičiai (procentai), vidutiniai dydžiai ir standartiniai nuokrypiai (SN). Norint nustatyti skirtumą tarp dviejų nepriklausomų grupių buvo naudotas Mann-Whitney U kriterijus. Skirtumai vertinti kaip statistiškai reikšmingi, kai p<0,05. Geno polimorfizmo pasiskirstymas sergantiems eksudacine AGDD bei referentinėje grupėje vertintas pagal Hardy – Weinberg ekvilibriumą. Sergančiųjų eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir referentinės grupės genų polimorfizmo pasiskirstymo homogeniškumo palyginimui taikytas χ² ir Fisher kriterijų skaičiavimas. Atlikus dvinarę logistinę regresinę analizę, įvertintas galimybių santykis (GS) eksudacinei AGDD pasireikšti, nurodant GS su 95 proc. patikimumo intervalu (PI). Pasirenkant geriausią paveldėjimo modelį buvo vertinamas Akaike informacinis kriterijus (AIC), kurio mažiausia vertė nurodo tinkamiausią modelį.

22

3. Rezultatai

Tyrimo metu buvo suformuotos dvi tiriamųjų grupės. Pirmą grupę sudarė 206 eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija sergančių asmenų: iš jų 42 vyrai (28 proc.) ir 108 moterys (72 proc.), tiriamųjų amžiaus vidurkis – 68,83 metai. Kontrolinę grupę sudarė 206 asmenys, 76 vyrai (25,68 proc.) ir 220 (74,32 proc.) moterys, amžiaus vidurkis siekė 68,22 metus. Tiriamųjų charakteristika pateikta 3 lentelėje.

3 lentelė. Tiriamųjų charakteristika Charakteristika Tiriamieji sergantys

eksudacine AGDD (I grupė) n = 206 Kontrolinė grupė (II grupė) n = 206 P reikšmė Vyrai, n (proc.) 71 (34,5) 53 (25,7) 0,053 Moterys, n (proc.) 135 (65,5) 153 (74,3) Amžiaus vidurkis (SN) 76,12 (7,626) 50,48 (21,710) <0,001

3.1. SLCO1B1 rs2306283 genotipų dažnis pacientų, sergančių eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje

Buvo įvertintas SLCO1B1 geno rs2306283 polimorfizmo dažnis pacientų, sergančių eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje (4 lentelė). rs2306283 genotipų pasiskirstymas kontrolinėje grupėje atitiko Hardžio-Veinbergo dėsnį (p>0,05), tačiau AGDD grupėje neatitiko (p<0,05). Statistiškai reikšmingų skirtumų, lyginant sergančius tiriamuosius su kontroline grupe, nebuvo nustatyta.

4 lentelė. SLCO1B1 rs2306283 polimorfizmų dažnis pacientų, sergančių eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje

Genas Genotipas/ alelis Dažnis (proc.) Kontrolinė grupė N(proc.) (n=206) p vertė HWE AGDD grupė N(proc.) (n=206) p vertė HWE p vertė SLCO1B1 rs2306283 Genotipas A/A A/G G/G Iš viso Alelis A G 75 (36,4) 91 (44,2) 40 (19,4) 206 (100) 241 (58,5) 171 (41,5) 0,195 79 (38,3) 82 (39,8) 45 (21,8) 206 (100) 240 (58,3) 172 (41,7) 0,009 0,648 0,944 AGDD – amžinė geltonosios dėmės degeneracija, p vertė – reikšmingumo lygmuo, p vertė HWE – reikšmingumo lygmuo pagal Hardžio-Veinbergo dėsnį, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.

23 Taip pat atlikome dvinarę logistinę regresinę analizę, tiriamųjų sergančių AGDD ir kontrolinės grupės, pavaizduota 5 lentelėje. rs2306283 polimorfizmo analizėje, statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo.

5 lentelė. SLCO1B1 rs2306283 genotipo dvinarė logistinė regresijos analizė

Modelis Genotipas GS (95proc. PI) p reikšmė AIC

Kodominantinis A/G G/G 0,855 (0,554;1,321) 1,068 (0,628;1,815) 0,481 0,808 574,29 Dominantinis A/G+G/G 0,920 (0,617;1,372) 0,684 572,99 Recesyvinis G/G 1,160 (0,719;1,871) 0,543 572,78 Overdominantinis A/G 0,836 (0,565;1,236) 0,369 572,35 Adityvinis --- 1,009 (0,778;1,308) 0,947 573,15

GS–galimybių santykis, AIC-akaike, p–reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.

3.2. RS 2306283 polimorfizmas, sergantiems eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje atsižvelgiant į tiriamųjų lytį

Antrasis tyrimo uždavinys buvo įvertinti rs2306283 polimorfizmą, sergantiems eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį.

Statistiškai reikšmingų skirtumų rs2306283 tiriamiesiems nebuvo nustatyta.

6 lentelė. SLCO1B1 rs2306283 polimorfizmo dažnis pacientų, sergančių eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį

Genotipas Vyrai P Reikšmė Moterys P Reikšmė AGDD grupė n (proc.) (n=71) Kontrolinė grupė n (proc.) (n=53) AGDD grupė n (proc.) (n=135) Kontrolinė grupė n (proc.) (n=153) AA (proc.) 23 (32,4) 16 (30,2) _0,847 56 (41,5) 59 (38,6) _0,631 AG (proc.) 35 (49,3) 27 (50,9) 0,858 47 (34,8) 64 (41,8) 0,228 GG (proc.) 13 (18,3) 10 (18,9) 1 32 (23,7) 30 (19,6) 0,473 Alelis A G 81 (57,0) 61 (43,0) 59 (75,7) 47 (24,3) 0,828 159 (58,9) 111 (41,1) 182 (59,5) 124 (40,5) 0,932

AGDD – amžinė geltonosios dėmės degeneracija, p–reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.

24 3.3. rs2306283 geno polimorfizmo sąsajos sergančių eksudacine amžine geltonosios dėmės

degeneracija amžiaus grupėse iki 65 metų bei 65 metų ir vyresnių

Trečiasis darbo uždavinys buvo įvertinti polimorfizmo sąsajas tiriamiesiems atsižvelgiant į amžiaus grupes. Genotipų dažnių palyginimai pavaizduoti 7 lentelėje. Nebuvo nustatyta jokių statistiškai reikšmingų skirtumų.

7 lentelė. SLCO1B1 rs2306283 genotipo dažnis, tiriamųjų sergančių eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinės grupės, atsižvelgiant į tiriamųjų amžių

Genotipas <65 metai p reikšmė ≥65 metai p reikšmė AGDD grupė n (proc.) (n=15) Kontrolinė grupė n (proc.) (n=137) AGDD grupė n (proc.) (n=191) Kontrolinė grupė n (proc) (n=69) AA 4 (26,7) 50 (36,7) 0,675 75 (39,3) 25 (36,2) 0,828 AG 7 (46,7) 61 (44,5) 75 (39,3) 30 (43,5) GG 4 (26,7) 26 (19,0) 41 (21,5) 14 (20,3) Alelis A G 15 (50,0) 15 (50,0) 161 (58,8) 113 (41,2) 0,437 225 (58,9) 157 (41,1) 80 (58,0) 58 (32,0) 0,920

AGDD-amžinė geltonosios dėmės degeneracija, p-reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.

8 lentelė. SLCO1B1 rs2306283 genotipo, pagal amžiaus grupes, dvinarė logistinė regresijos analizė

Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) p

reikšmė AIC <65 Kodominantinis A/G G/G 1,432 (0,397;5,180) 1,923 (0,445;8,320) 0,582 0,382 101,16 Dominantinis A/G+G/G 1,580 (0,478;5,227) 0,453 93,35 Recesyvinis G/G 1,552 (0,458;5,266) 0,999 99,47

Over dominant A/G 1,090 (0,374;3,175) 0,874 99,92

Additive --- 1,387 (0,670;2,872) 0,378 99,17 ≥65 Kodominantinis A/G G/G 0,833 (0,448;1,549) 0,564 304,50 0,976 (0,458;2,081) 0,950 Dominantinis A/G+G/G 0,879 (0,497;1,554) 0,657 302,68 Recesyvinis G/G 1,074 (0,544;2,121) 0,838 302,84

Over dominant A/G 0,841 (0,481;1,468) 0,541 302,51

Additive --- 0,968 (0,672;1,394) 0,860 302,85

25 Taip pat, atlikome rs2306283 polimorfizmo genotipų dažnių palyginimus bei atlikę logistinę regresiją įvertinomę galimybę susirgti eksudacine AGDD atsižvelgiant į tiriamųjų amžių ir lytį (rezultatai pateikiami 9, 10, 11 ir 12 lentelėse), tačiau statistiškai reikšmingų skirtumų nustatyta nebuvo.

9 lentelė. SLCO1B1 rs2306283 genotipo dažnis, tiriamųjų moterų sergančių eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinės grupės moterų, atsižvelgiant į amžių

Genotipas <65 metai p reikšmė ≥65 metai p reikšmė AGDD grupė n (proc.) (n=12) Kontrolinė grupė n (proc.) (n=103) AGDD grupė n (proc.) (n=123) Kontrolinė grupė n (proc.) (n=50) AA 2 (16,7) 41 (39,8) 0,192 54 (43,9) 18 (36,0) 0,633 AG 6 (50,0) 45 (43,7) 41 (33,3) 19 (38,0) GG 4 (33,3) 17 (16,7) 28 (22,8) 13 (26,0) Alelis A G 10 (41,7) 14 (58,3) 127 (61,7) 79 (38,3) 0,078 149 (60,6) 97 (39,4) 55 (55,0) 45(45,0) 0,399

AGDD-amžinė geltonosios dėmės degeneracija, p-reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.

10 lentelė. SLCO1B1 rs2306283 genotipo dažnis, tiriamųjų vyrų sergančių eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinės grupės vyrų, atsižvelgiant į amžių

Genotipas <65 metai p reikšmė ≥65 metai p reikšmė AGDD grupė n (proc.) (n=3) Kontrolinė grupė n (proc.) (n=34) AGDD grupė n (proc.) (n=68) Kontrolinė grupė n (proc.) (n=19) AA 2 (66,7) 9 (26,5) 0,300 21 (30,9) 7 (36,8) 0,347 AG 1 (33,3) 16 (47,1) 34 (50,0) 11 (57,9) GG 0 (0) 9 (26,5) 13 (19,1) 1 (5,3) Alelis A G 5 (83,3) 1 (16,7) 34 (50,0) 34 (50,0) 0,203 76 (55,9) 60 (44,1) 25 (65,8) 13 (34,2) 0,272

26 11 lentelė. SLCO1B1 rs2306283 genotipo, moterų imties, pagal amžiaus grupes, dvinarė logistinė

regresijos analizė

Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) p

reikšmė AIC <65 Kodominantinis A/G G/G 2,733 (0,522;14,308) 4,824 (0,806;28,863) 0,234 0,085 77,57 Dominantinis A/G+G/G 3,306 (0,689;15,871) 0,135 76,20 Recesyvinis G/G 2,529 (0,684;9,357) 0,164 77,17

Over dominant A/G 1,289 (0,389;4,265) 0,678 78,77

Additive --- 2,139 (0,921;4,967) 0,077 75,69 ≥65 Kodominantinis A/G G/G 0,719 (0,336;1,541) 0,718 (0,308;1,675) 0,397 0,443 209,12 Dominantinis A/G+G/G 0,719 (0,365;1,417) 0,340 209,12 Recesyvinis G/G 0,839 (0,392;1,739) 0,650 209,84

Over dominant A/G 0,816 (0,412;1,615) 0,559 209,70

Additive --- 0,837 (0,553;1,267) 0,400 209,33

GS–galimybių santykis, AIC-akaike , p–reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.

12 lentelė. SLCO1B1 rs2306283 genotipo, vyrų imties, pagal amžiaus grupes, dvinarė logistinė regresijos analizė

Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) p

reikšmė AIC <65 Kodominantinis A/G G/G 0,281 (0,022;3,550) - 0,327 0,999 22,04 Dominantinis A/G+G/G 0,180 (0,015;2,234) 0,182 20,91 Recesyvinis G/G - 0,999 21,07 Overdominantinis A/G 0,563 (0,046;6,806) 0,651 22,61 Adityvinis --- 0,213 (0,023;1,936) 0,170 20,28 ≥65 Kodominantinis A/G G/G 1,030 (0,345;3,073) 4,333 (0,477;39,364) 0,957 0,193 92,75 Dominantinis A/G+G/G 1,306 (0,450;3,786) 0,624 93,09 Recesyvinis G/G 4,255 (0,520;34,828) 0,177 90,75 Overdominantinis A/G 0,727 (0,260;2,032) 0,543 92,95 Adityvinis --- 1,565 (0,715;3,423) 0,408 92,03

27

4. Rezultatų aptarimas

Tyrimo rezultatai parodė, kad SLCO1B1 rs2306283 polimorfizmas nėra susijęs su AGDD atsiradimu (A/A – 36,4%, A/G – 44,2%, G/G – 19,4% kontrolinėje grupėje, tuo tarpu A/A – 38,3%, A/G – 39,8%, G/G – 21,8% AGDD grupėje). Tiek pas vyrus, tiek pas moteris, sergančius AGDD ir kontrolinėje grupėje dominavo A alelis. Iki 65 metų amžiaus sergančiųjų AGDD genotipas A/A ir G/G pasiskirstė po lygiai, o vyresniems negu 65 metai, sergantiems AGDD dominavo A/A genotipas. Moterų, jaunesnių negu 65 metai amžiaus kontrolinėje grupėje dominavo A alelis (61,7%), tuo tarpu sergančių AGDD grupėje nežymiai dominavo G alelis (58,3%). Vyresnių nei 65 metai moterų amžiaus grupėje dominavo A alelis tiek sergančiųjų AGDD (60,6%), tiek kontrolinėje (55,0%) grupėje. Vyrų, jaunesnių negu 65 metai amžiaus grupėje A alelis dominavo AGDD sergantiems asmenims (83,3%), o kontrolinėje grupėje A ir G aleliai pasiskirstė po lygiai (50%). Vyresnių negu 65 metai amžiaus vyrų grupėje, tiek kontrolinėje, tiek AGDD dominavo A alelis atitinkamai 65,8% ir 55,9%.

Iki šiol nėra atlikta jokių kitų tyrimų, kurie tirtų SLCO1B1 RS 2306283 geno polimorfizmo įtaką sirgti AGDD. Yra nustatyta, kad CFH, LOC387715, HTRA1 polimorfizmai yra susiję su AGDD atsiradimu, todėl buvo bandyta surasti daugiau genų polimorfizmų, kurie galėtų turėti įtakos AGDD atsiradimui ir progresavimui (52).

Amžinės geltonosios dėmės degeneracijos atsiradimas yra siejamas su drūzų formavimusi. Didžiąją dalį drūzų sudėties sudaro lipidai. Anksčiau atliktų tyrimų duomenys skiriasi. Vieni tyrimai rodo, kad padidėjęs didelio tankio lipoproteinų kiekis yra susijęs išaugusia rizika sirgti AGDD. Tuo tarpu padidėjęs mažo tankio lipoproteinų ir trigliceridų kiekis lemia sumažėjusią riziką sirgti AGDD [53]. Kituose atliktuose tyrimuose nėra nustatyta ryšio tarp didelio tankio lipoproteinų ir bendrojo cholesterolio padidėjimo ir AGDD. [54] Dar kiti tyrimai skelbia, jog padidėjęs didelio tankio lipoproteinų kiekis yra susijęs su sumažėjusia rizika sirgti AGDD, o padidėjusi mažo tankio lipoproteinų koncentracija lemia didesnę riziką sirgti AGDD [55]. Tikslus AGDD mechanizmas yra neišaiškintas, jis siejamas su lipidais – manoma, kad senstant tarp Brucho membranos ir tinklainės pigmentinio epitelio kaupiasi lipidai. Lipidų metabolizmą gali nulemti įvairūs genai. Yra įrodyta, jog sumažėjus OATP1B1 ekspresijai, sumažėja transportinio baltymo funkcija, todėl padidėja kraujyje cirkuliuojančių statinų koncentracija. Keičiantis statinų koncentracijai, keičiasi ir kraujo lipidų koncentracija, todėl gali pasikeisti ir drūzų formavimosi intensyvumas [56]. Naujausi tyrimai atskleidė, kad SLCO1B1 polimorfizmas yra susijęs su padidėjusia plazmos cholesterolio koncentracija, nes polimorfizmo metu ženkliai padidėja plazmos cholesterolio sintezės markerių koncentracija [57]. Besikeičianti plazmos cholesterolio koncentracija gali daryti įtaką drūzų formavimuisi ir AGDD atsiradimui, bei vystymuisi. SLCO1B1 genas yra 12 chromosomoje, 12p12 geno lokuse. Šiame gene

28 yra nustatyta daug vieno nukleotido polimorfizmų. Keletas iš jų paveikia transpotrinę funkciją tiek in vitro, tiek in vivo.

OATP substratai yra anijoninės mokelukės su ganėtinai aukštu molekuliniu svoriu - > 450 ir dideliu albumino kiekiu. OATP1B1 substratai yra daugelis endogeninių junginių, tokių kaip tulžies rūgštys, steroidų konjugatai, bilirubino glukuronidai, skydliaukės hormonai, eikosanoidai ir cikliniai peptidai. Substratai paveikia tokias medžiagas kaip enalaprilį ir temokaprilį, angiotenzino II receptorių antagonistus olmesartaną ir valsartaną, priešgrybinį agentą kaspofunginą, antibiotikus rifampiciną ir benzilpeniciliną, metotreksatą, endotelino receptorių antagonistus atrasentaną ir bosentaną, troglitazono sulfatą, priešvėžinio faktoriaus irinotekano aktyvų metabolitą SN-38, feksofenadiną, cholesterolį mažinančių vaistų ezetimibo glukuronidą ir statinus - atorvastatiną, cerivastatiną, fluvastatiną, pitavastatiną, pravastatiną, rosuvastatiną ir simvastatino rūgštį.

Alelis c.521C ir haplotipai 5 ir 15 yra susiję su žymiai sumažėjusiu įsisiavinimu kai kurių OATP1B1 substratų: oestrono-3-sulfato, estradiolio-17u-D-glukuronido, atorvastatino, cerivastatino, pravastatino. c.388A>G nukleotido polimorfizmo atveju studijos yra prieštaringos: viena in vitro studija rodo sumažėjusį OATP1B1 aktyvumą pernešant rimfapiciną, tačiau kita studija parodė, kad sumažėjęs aktyvumas yra nestebimas kitiems substratams. Iš kitos pusės: 1B haplotipas yra susijęs su padidėjusiu OATP1B1 aktyvumu in vivo, todėl pravastatino ir repaglinido plazmos koncentracija buvo maždaug 30–35% mažesnė individams su 1B haplotipu, negu individams su 1A/1A genotipu. SLCO1B1 geno polimorfizmo efektas statinams yra vis dar diskutuojamas objektas, ypač statinų farmakogenomika. Yra ir kitų, mažiau ištirtų SLCO1B1 variantų: c.467A>G (p.Glu156Gly), c.1058T>C (p.Ile353Thr), c.1463G>C (p.Gly488Ala) ir c.1964A>G (p.Asp655Gly), kurie yra susiję su sumažėjusia OATP1B1 transporto funkcija in vitro.

Imunosupresinis vaistas Cyklosporinas žymiai padidina OATP1B1 substratų (tokių kaip statinų ir repaglinido) plazmos koncentraciją. Nors CYP3A4 slopinimas galimai paaiškina Cyklosporino efektą, tai nepaaiškina rosuvastatino, pitavastatino ir pravastatino farmakokinetikos, kuri nėra ženkliai susijusi su CYP3A4. Yra manoma, kad OATP1B1 yra susijęs su šių vaistinių medžiagų įsisavinimu. Gemfibrozilis ir jo glukuronido metabolitas slopina OATP1B1 ir ženkliai padidina kai kurių OATP1B1 substratų plazmos koncentraciją, tokių kaip simvastatino rūgšties, lovastatino rūgšties, cerivastatino, pravastatino, repaglinido, rosuvastatino ir atorvastatino [57].

Yra žinoma ir daugiau genų polimorfizmų, susijusių su AGDD atsiradimu: ApoE2, ApoE4, CFH (Y420H, 1061170), ARMS2 (A69S, s10490924), LIPC (rs104680178), LIPC (rs493258), LPL (rs12678919), ABCA1 (rs1883025), CETP (rs3764261) [57].

29

Išvados

1. Ištyrus SLCO1B1 rs2306283 genotipo dažnį pacientams, sergantiems eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija bei sveikiems asmenims reikšmingų skirtumų nustatyta nebuvo.

2. Ištyrus SLCO1B1 rs2306283 genotipo polimorfizmus, sergantiems eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje reikšmingų skirtumų, priklausomų nuo lyties, pastebėta nebuvo.

3. Ištyrus SLCO1B1 rs2306283 genotipo polimorfizmo sąsajas sergant eksudacine amžine geltonosios dėmės degeneracija, pacientams iki 65 metų amžiaus ir 65 metų bei vyresniems, reikšmingų skirtumų stebėta nebuvo.

30

Literatūros sąrašas

1. [elektroninis išteklius] [žiūrėta 2017 m. kovo 10 d.]. Prieiga per internetą: http://www.brightfocus.org/macular/article/age-related-macular-facts-figures

2. Gao B, Huber RD, Wenzel A, Vavricka SR, Ismair MG, Remé C. et al. Localization of organic anion transporting polypeptides in the rat and human ciliary body epithelium. Exp. Eye Res. 2005;80:61–72.

3. K. Berman and H. Brodaty, Psychosocial effects of age-related macular degeneration. International Psychogeriatrics. Volume 18, Issue 3 September 2006, pp. 415-428

4. Tinghuai Wu, Jane Tian, Roy G Cutler, Richard S Telljohann, David A Bernlohr, Mark P Mattson. Knockdown of FABP5 mRNA decreases cellular cholesterol levels and results in decreased apoB100 secretion and triglyceride accumulation in ARPE-19 cells. Laboratory Investigation (2010) 90, 963–965

5. Smith, W., Assink, J., Klein, R. Mitchell P, Klaver CC, Klein BE, et al. Risk factors for age-related macular degeneration: Pooled findings from three continents . Ophthalmology. 2001; 108: 697–704

6. Khan JC, Thurlby DA, Shahid H, D G Clayton, J R W Yates, M Bradley et al. Smoking and age related macular degeneration: the number of pack years of cigarette smoking is a major determinant of risk for both geographic atrophy and choroidal neovascularisation British Journal of Ophthalmology 2006;90:75-80.

7. Sandra C. Tomany, Jie Jin Wang, Redmer van Leeuwen, Ronald Klein, Ronald Klein, Paul Mitchell et al. Risk factors for incident age-related macular degeneration. July 2004, Volume 111, Issue 7, Pages 1280–1287.

8. Stryker WS, Kaplan LA, Stein EA, Stampfer MJ, Sober A, Willett WC, et al. The relation of diet, cigarette smoking, and alcohol consumption to plasma beta-carotene and alpha-tocopherol levels. Am J Epidemiol. 1988;127:283–96.

9. Hammond BR Jr, Wooten BR, Snodderly DM. Cigarette smoking and retinal carotenoids: implications for age-related macular degeneration. Vision Res. 1996;18:3003–9.

10. Vingerling JR, Dielemans I, Bots ML, Hofman A, Grobbee DE, de Jong PT, et al. Age-related macular degeneration is associated with atherosclerosis. The Rotterdam Study. Am J Epidemiol. 1995;142:404–9.

11. Jennifer S.L. Tan, Paul Mitchell, Wayne Smith, Jie Jin Wang. Cardiovascular Risk Factors and the Long-term Incidence of Age-Related Macular Degeneration. June 2007Volume 114, Issue 6, Pages 1143–1150.

31 12. Bressler NM, Bressler SB, Fine SL. Age-related macular degeneration. Surv Ophthalmol 1988;

32: 375–413.

13. Nano ME, Lansingh VC, Pighin MS, Zarate N, Nano H, Carter MJ, et al. Risk factors of age-related macular degeneration in Argentina. Arq Bras Oftalmol. 2013 Mar-Apr;76(2):80-4.

14. Klein R, Berger JW, Fine SL, Maguire MG. Age-related Macular Degeneration. St. Louis; Mosby: 1998. Epidemiology; pp. 31–55.

15. Hirvelaä H, Luukinen H, Laäaäraä E, Laatikainen L. Risk factors of age-related maculopathy in a population 70 years of age or older. Ophthalmology. 1996;103:871–7.

16. Klein R, Klein BEK, Franke T. The relationship of cardiovascular disease and its risk factors to age-related maculopathy. The Beaver Dam Eye Study. Ophthalmology. 1993;100:406–14.

17. Taniguchi H, Shiba T, Maeno T, Takahashi M. Evaluation of Carotid Atherosclerosis, Peripheral Arterial Disease, and Chronic Kidney Disease in Patients with Exudative Age-Related Macular Degeneration without Coronary Artery Disease or Stroke. Ophthalmologica. 2015;233:128–133. 18. Ikram MK, Mitchell P, Klein R, Sharrett AR, Couper DJ, Wong TY. Age-related macular

degeneration and long-term risk of stroke subtypes. Stroke. 2012;43:1681–1683.

19. Hyman L, Schachat AP, He Q, Leske MC. Hypertension, cardiovascular disease, and age-related macular degeneration. Age-Related Macular Degeneration Risk Factors Study Group. Arch Ophthalmol. 2000;118:351–358.

20. Klein R, Klein BE, Tomany SC, Cruickshanks KJ. The association of cardiovascular disease with the long-term incidence of age-related maculopathy: the Beaver Dam Eye Study. Ophthalmology. 2003;110:1273–1280.

21. Munch IC, Linneberg A, Larsen M. Precursors of age-related macular degeneration: associations with physical activity, obesity, and serum lipids in the inter99 eye study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2013;54:3932–3940.

22. Age-Related Macular Degeneration (AMD) | National Eye Institute. [elektroninis išteklius] [žiūrėta 2017 m. vasario 4 d.]. Prieiga per internetą: https://nei.nih.gov/eyedata/amd#4. Accessed 23 Nov 2015

23. Zetterberg M. Age-related eye disease and gender. Maturitas. 2016;83:19–26.

24. Liutkevičienė R. Amžinės geltonosios dėmės degeneracijos ir išeminės širdies ligos sąsajos su matrikso metaloproteinazių genų polimorfizmu. Daktaro disertacija, Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, 2011Hendrik P.N. Scholl, Monika Fleckenstein, Peter Charbel Issa, Claudia Keilhauer, Frank G. Holz, and Bernhard H.F. Weber. An update on the genetics of age-related macular degeneration. Mol Vis. 2007; 13: 196–205

25. Hammond CJ, Webster AR, Snieder H, Bird AC, Gilbert CE, Spector TD. (2002) Genetic influence on early age-related maculopathy: a twin study. Ophthalmology 109:730–736

32 26. Hampton T. Genetic research provides insights into age-related macular degeneration. JAMA

2010; 304:1541.

27. Despriet DD, van Duijn CM, Oostra BA, et al. Complement component C3 and risk of age-related macular degeneration. Ophthalmology 2009; 116:474.

28. Prado, Y.; Saavedra, N.; Zambrano, T.; Lagos, J.; Rosales, A.; Salazar, L.A. SLCO1B1 c.388A>G Polymorphism Is Associated with HDL-C Levels in Response to Atorvastatin in Chilean Individuals. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 20609-20619.

29. Kuan-wei Peng, James Bacon, Ming Zheng, Yingying Guo and Michael Zhuo Wang. Ethnic Variability in the Expression of Hepatic Drug Transporters: Absolute Quantification by an Optimized Targeted Quantitative Proteomic Approach. Drug Metabolism and Disposition July 2015, 43 (7) 1045-1055.

30. Gerd A. Kullak-Ublick, Manfred G. Ismair, Bruno Stieger, Lukas Landmann, Robert Huber, Flavia Pizzagalli, et al., Organic anion-transporting polypeptide B (OATP-B) and its functional comparison with three other OATPs of human liver. Gastroenterology 2001. 120(2): p. 525-33. 31. Hagenbuch B, Meier PJ. The superfamily of organic anion transporting polypeptides. Biochim.

Biophys. Acta. 2003;1609:1–18.

32. Hagenbuch B, Meier PJ. Organic anion transporting polypeptides of the OATP/ SLC21 family: phylogenetic classification as OATP/ SLCO superfamily, new nomenclature and molecular/functional properties. Pflügers Arch. 2004;447:653–65.

33. Pijun Wang, Jin J. Wang, Yansen Xiao, John W. Murray, Phyllis M. Novikoff, Ruth Hogue Angeletti, et al. Interaction with PDZK1 is required for expression of organic anion transporting protein 1A1 on the hepatocyte surface. J. Biol. Chem. 2005;280:30143–49.

34. Kullak-Ublick GA1, Hagenbuch B, Stieger B, Schteingart CD, Hofmann AF, Wolkoff AW, et al. Molecular and functional characterization of an organic anion transporting polypeptide cloned from human liver. Gastroenterology. 1995;109:1274–82.

35. Steckelbroeck S, Nassen A, Ugele B, Ludwig M, Watzka M, Reissinger A. et al. Steroid sulfatase (STS) expression in the human temporal lobe: enzyme activity, mRNA expression and immunohistochemistry study. J. Neurochem. 2004;89:403–17.

36. [elektroninis išteklius] [žiūrėta 2017 m. kovo 9 d.]. Prieiga per internetą: http: //www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=SLCO1B3.

37. Cui Y, König J, Leier I, Buchholz U, Keppler D. Hepatic uptake of bilirubin and its conjugates by the human organic anion transporter SLC21A6. J Biol Chem. 2001 Mar 30;276(13):9626-30. Epub 2000 Dec 27.