LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA
GYVULININKYSTĖS TECHNOLOGIJOS
FAKULTETAS
GYVŪNŲ VEISIMO IR GENETIKOS KATEDRA
K.Janušausko gyvūnų genetikos laboratorija
Laura Riaubaitė
GALVIJŲ PROLAKTINO GENO POLIMORFIZMO TYRIMAI
LIETUVOS PIENINIŲ GALVIJŲ POPULIACIJOJE
Magistro darbas
Darbo vadovas:
doc.dr.Ilona Miceikienė
Magistro darbas atliktas 2003 – 2005 metais Lietuvos veterinarijos akademijoje, Gyvūnų veisimo ir genetikos katedroje, K.Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje.
Magistro darbą paruošė: Laura Riaubaitė
(v., pavardė) (parašas)
Magistro darbo vadovas: doc.dr.Ilona Miceikienė
(LVA, Gyvūnų veisimo ir genetikos katedra)
(parašas)
Recenzentas: dr.SauliusTušas (LVA, Gyvulininkystės katedra)
TURINYS
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS 4
ĮVADAS 5
1. LITERATŪROS APŽVALGA 8
1.1 Genetinio polimorfizmo apibūdinimas 8
1.2 Kazeino genai 9 1.2.1 αs1-kazeino genas 9 1.2.2 αs2-kazeino genas 10 1.2.3 β-kazeino genas 11 1.2.4 κ-kazeino genas 12 1.3 α-laktoglobulino genas 13 1.4 β-laktoglobulino genas 14
1.5 Augimo hormono genas (GH) 16 1.6 STAT5 genai 17
1.7 DGAT1 genas 18
1.8 Pieno produkcijos kiekybinių požymių lokusai (QTL) 19 1.9 Prolaktino genas 20
1.9.1 Genetinis pagrindimas 20
1.9.2 Prolaktino hormono struktūra, funkcijos ir veikimo mechanizmas 20 2. TYRIMŲ METODAI IR MEDŽIAGA 24
2.1 Tyrimų medžiaga 24 2.2 DNR skyrimas 25
2.2.1 DNR skyrimas iš plauko svogūnėlio ląstelių 25
2.2.2 DNR skyrimas iš kraujo. Chloroforminis - fenolinis metodas 25
2.3 DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas 26 2.4 Polimerazės grandininė reakcija (PGR) 26
2.5 Karpymas fermentais ir elektroforezė 27 2.6 Prolaktino geno variantų ištyrimas 28
2.7 Statistinė analizė 29
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS 31
4. IŠVADOS 37
5. SUMMARY 39
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS 40
Santrumpų sąrašas
bp – bazių pora CN - kazeinas DNR – dezoksiribonukleininė rūgštis GH – augimo hormonas LA – laktoalbuminas LB – Lietuvos baltnugariai LG – laktoglobulinas LJ – Lietuvos juodmargiai LŠ – Lietuvos šėmi LŽ – Lietuvos žaliejiMAS - selekcija genetinių markerių pagalba PGR – polimerazinė grandininė reakcija PRL – prolaktino genas
QTL – kiekybinių požymių DNR lokusai RFLP – restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas
Įvadas
Pieno gamyba yra viena iš sudėtingiausių žemės ūkio gamybos šakų. Pieno ūkio pelningumą apsprendžia daugybė veiksnių. Neveltui Jungtinių Amerikos valstijų fermeriai mėgsta sakyti, kad gaminant pieną smulkmenų nėra. Bet kurio sudėtingos pieno gamybos technologijos elemento ignoravimas mažina gamybos pelningumą.
Svarbiausieji veiksniai apsprendžiantys pieno gamybos ekonominį efektyvumą yra: • gyvulių genetinis potencialas;
• pašarai ir šėrimas;
• laikymo ir priežiūros technologijos.
Atskirų šių elementų reikšmė nevienoda. Daugelio autorių duomenimis didžiausią įtaką karvių pieno produkcijai turi pašarai ir šėrimas. Jie įtakoja apie 50 – 60 procentų, genetiniams faktoriams tenka apie 25 – 27 procentai, o likusi dalis tenka laikymo ir priežiūros technologijoms.
Yra žinoma, kad gyvulių produktyvumo bei kiti ūkiniai požymiai, tokie kaip pieno kiekis, pieno sudėtis, pieno riebalų bei baltymų kiekis ir cheminė sudėtis, pieno tinkamumas perdirbti bei atskiriems pieno produktams gaminti, pieno atleidimo greitis melžimo metu, veršelių augimo sparta, mėsingumas ir kiti, yra paveldimi iš kartos į kartą, o jų formavimąsi bei funkcines savybes lemia genai. Žinoma, jog pieno kokybę bei kiekį didele dalimi lemia šėrimo, laikymo, melžimo technologijos bei daugelis kitų veiksnių, tačiau netgi sudarius optimalias minėtas sąlygas, ta produktyvumo dalis, kuri priklauso nuo paveldimų gyvulio savybių, lieka nepakitusi.
Vienas iš būdų per trumpesnį laiką pasiekti šiuos tikslus yra naujų biotechnologinių metodų, pavyzdžiui, genetinių žymeklių MAS (Marker-Assisted Selection), diegimas ir taikymas selekcijoje. Genetiniai žymekliai – tai genai susiję, su kiekybiniais ir kokybiniais požymiais, jų grupės arba DNR grandinės fragmentai, leidžiantys nustatyti požymių kintamumo pobūdį ir paveldėjimo dėsningumus
Kiekybinių požymių, tokių kaip reprodukcinės savybės, augimo greitis, priesvoriai, pieningumas, pieno baltymų ir riebalų kiekis bei procentinės išraiškos priklauso nuo genų, esančių atskirose chromosomų vietose – lokusuose, veiklos. Kiekybinių požymių paveldėjimas yra nenutrūkstamas ir pasižymi laipsnišku pasireiškimu nuo silpniausio iki maksimalaus, kuris pastebimas pas atskirus individus ar net visoje populiacijoje.
Kiekybinių požymių paveldėjimas iš esmės yra nulemtas polimerinių (poligeninių) genų veiklos, tai yra vienodu ar panašiu poveikiu daugelio dominantinių nepriklausomų arba daugelio alelinių genų į tam tikrą požymį. Kuo daugiau genų porų lemia vieno ar kelių kiekybinių požymių pasireiškimą, tuo rečiau pasitaiko individai su maksimaliai išreikštu požymiu. Kuo daugiau polimerinių genų įeina į genotipą, tuo daugiau genotipų klasių pasireiškia įvairiose kartose ir tuo mažiau įmanoma sulaukti pageidaujamo požymio maksimalaus pasireiškimo.
Tiriant žemės ūkio gyvulių genomą, susiduriama su kiekybinių požymių kintamumo problema. Todėl, norint išvengti laukiamo požymio nepageidaujamo variavimo ir didinant selekcijos efektyvumą, yra tikslinga atlikti QTL (kiekybinių požymių DNR lokusų) analizę žemės ūkio gyvulių genome. Nustačius QTL (chromosomoje esantį žinomą kiekybinių požymių) lokusą, kuriame esančio geno aleliai tam tikroje būklėje lemia vieno ar kelių kiekybinių požymių pasireiškimą, atsiranda galimybės nuosekliau vykdyti kryptingą žemės ūkio gyvulių atranką pagal pageidaujamą kiekybinį požymį ir galima tikėtis maksimalaus laukiamo požymio pasireiškimo.
Darbo tikslas
• Prolaktino geno polimorfizmo bei skirtingų alelių paplitimo ištyrimas Lietuvos galvijų (LŽ, LJ, LB, LŠ) veislėse
• Prolaktino geno įtakos pieno produkcijai ištyrimas
Darbo uždaviniai
• Įdiegti galvijų prolaktino geno tyrimo metodiką LVA K.Janušausko Gyvūnų genetikos laboratorijoje
• Ištirti prolaktino geno polimorfizmą LŽ, LJ, LB ir LŠ galvijų veislėse molekuliniu PGR-RFLP tyrimo metodu
• Nustatyti prolaktino geno alelių ir genotipų dažnį LŽ, LJ, LB ir LŠ galvijų veislėse • Sudaryti tiriamos galvijų populiacijos pieno produkcijos rodiklių duomenų bazę • Ištirti prolaktino geno įtaką pieno kiekiui, riebumui bei baltymingumui
Darbo naujumas
• LVA gyvūnų genetikos laboratorijoje įdiegta galvijų prolaktino geno ištyrimo metodika • Pirmą kartą ištirtas prolaktino geno polimorfizmas bei jo variantų paplitimas Lietuvos
galvijų veislėse.
Praktinis pritaikymas
• Prolaktino genas gali būti naudojamas selekcijos procese kaip veislinių gyvulių pieningumo genetinio potencialo gerinimo kriterijus
• Vykdant selekciją prolaktino geno polimorfizmo atžvilgiu galima smarkiai paspartinti selekcijos procesą.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Genetinio polimorfizmo apibūdinimas
Terminas „genetinis polimorfizmas“ apibūdina faktą, kad požymis turi dvi ar daugiau formų, kurias genetiškai nulemia aleliai. Homozigotiniai individai elektroforogramoje turi tik vieną variantą kiekvienam požymiui, kai tuo tarpu heterozigotiniai – abu variantus, tad apskaičiuoti genų pasikartojimus populiacijoje nesunku.
Genetinis polimorfizmas yra labai svarbus taikomosiose srityse, tokiose kaip zootechniniai mokslai ir ypač pienininkystė. Tyrimais siekiama išaiškinti galimas asociacijas tarp genetinių variantų ir charakteringų produkcijai požymių, reprodukcijos efektyvumą ir galvijų adaptacijos galimybes, o taip pat nustatyti galimą įtaką pieno kiekiui, sudėčiai, maistingosioms bei technologinėms savybėms (Russo V. ir Mariani P., 1978).
Yra atrasta visa eilė genų, kurie įtakoja pieno kiekį, pieno baltymų ir riebalų kiekį, pieno baltymų kokybinę sudėtį – tai kazeinų genai, β laktoglobulinas, prolaktino genas, GH (augimo hormono) genas, Stat5 genas.
Pavyzdžiui, į pieno sudėtį įeinantys pagrindiniai pieno baltymai – kazeinas (CN), laktoalbuminas (LA) ir laktoglobulinas (LG) pasižymi polimorfiškumu, tai yra kiekvienas iš šių baltymų turi po keletą ar netgi keliolika skirtingų struktūrinių atmainų. Yra nustatyta, kad prolaktino polimorfizmą lemiantis genas turi įtakos tokiems kiekybiniams požymiams, kaip pieno, pieno baltymų ir riebalų kiekis. Tokių genų išaiškinimas galvijų genome leidžia vykdyti kryptingą galvijų selekciją pagal pieno kokybę ir jo perdirbamąsias savybes bei gauti palikuonis, turinčius didžiausią pageidaujamo požymio pasireiškimo laipsnį.
1.2 Kazeinų genai
1 paveikslas. 6-ta galvijų chromosoma, kurioje lokalizuoti pieno baltymo kazeino
genai
Kazeinas (CN) sudaro 80% bendro baltymų kiekio piene ir apie 2.5% visų sudėtinių pieno dalių, t.y. jo piene yra apie 5 kartus daugiau negu kitų pieno baltymų. Kazeinas – labai sudėtingas baltymas. Į jo sudėtį įeina daug įvairių nepakeičiamų aminorūgščių (valino, cistino, metionino, leucino, lizino, prolino, oksiprolino, histidino ir kt.), todėl jis pilnavertis baltymas. Kazeinas, veikiamas šliužo fermento, chimozino, pepsino arba įvairių fermentinių preparatų, turi savybę susitraukti. Ši savybė panaudojama gaminat rūgščius pieno produktus – varškę, varškės ir fermentinius sūrius.
Kazeinas gali būti keturių tipų: kapa kazeinas (κ-CN), beta kazeinas (β-CN ), alfa S1 (αs1-CN) ir alfa S2 (αs2-CN), o aleliniai genai lemia vienokią ar kitokią struktūrinę atmainą turinčio baltymo tipo formavimąsi. Daugelio tyrimų pagalba yra nustatyta, kad skirtingos atmainos netgi to paties tipo baltymai lemia ne tik pieno kokybinę sudėtį, bet ir pieno tinkamumą technologiniam perdirbimui.
1.2.1 α s1-kazeino genas
Genas lokalizuotas 6 galvijų chromosomoje. Yra sutinkama net 9 šio geno variantai. Labiausiai paplitęs αs1-kazeino variantas yra B, esantis visose veislėse 90-95% dažnumu, o kartais ir 100%; tik kai kuriose veislėse, tokiose kaip Džersių, Guernsay, Normandų, Italijos
variantui. Pas zebu ir jakus, atvirkščiai, alelis C dominuoja prieš B, su maždaug 90% dažnumo pirmajame ir maždaug 63% pastarajame (Srosclaude F., Mahe M.F. ir kt., 1976). Stebina tai, kad C variantas yra dažnas Švedijos Holšteinų veislėje (Lunden A. ir kt., 1997).
αs1-Cn D variantas nėra labai dažnas, tačiau, po Flamande (Grosclaude F. ir kt., 1966), taip pat buvo pastebėtas Danijos žalųjų ir Lenkijos žalųjų (MichalakW. 1969), Džersių (Corradini C. 1969), Italijos žalųjų (Russo V. ir Mariani P. 1971; Mariani P. 1987), Reggiana (Mariani P. ir Russo V. 1971), Podolijos (Chianese L. ir kt., 1988) ir kitose Italijos veislėse.
Taip pat A alelis, po atradimo Holšteinų-fryzų veislėse, buvo aptiktas ir Danijos žalųjų (Larsen B. ir kt., 1986), Kostromos (Petrushko S.A., 1970), kitose Fryzų veislėse (Petrushko S.A., 1970; Corradini C., 1970; Bianchini F. ir kt., 1973), bei neseniai Vokietijos fryzų tarpe (Erhardt G. 1993).
αs1-Cn G alelis buvo taip pat pastebėtas kitose italų veislėse, tokiose kaip Agerolese ir Modicana (Rando A. ir kt., 1993; Rando A. ir kt., 1995; Marletta D. ir kt., 1996), bei neseniai Reggiana, Italijos žalmargių, Sarda ir Bruna-Sarda veislėse (Dovoli R. ir kt., 1998).
Lietuvos galvijų tarpe αs1-CN B alelis buvo rastas labai dideliu dažniu , kuris įvairavo nuo 0,888 (LJ) iki 0,989 (LŽ) visose keturiose (LB, LŠ, LŽ, LJ) tirtose populiacijose. αs1-CN C alelis buvo rastas visose keturiose populiacijose labai mažu dažniu. αs1-CN A, D, ir F aleliai nebuvo rasti nė vienoje tirtoje populiacijoje (Baltrėnaitė L., 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).
αs1-CN BB genotipas buvo dideliu dažniu rastas visose keturiose populiacijose. BC genotipas αs1-CN buvo rastas mažu dažniu taip pat visose keturiose Lietuvos galvijų veislėse ir įvairavo nuo 2,13% (LŽ) iki 22,44% (LJ) (Baltrėnaitė L., 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).
1.2.2
α
s2-kazeino genasGenas lokalizuotas 6 galvijų chromosomoje. αs2-CN atveju žinomi tik keturi variantai: pirmą polimorfizmo atvejį 1976 m. Grosclaude ir kt. aptiko nepalietiškame B. taurus ir B. indicus populiacijose; šiose veislėse rasti tiek A, tiek ir B variantai. Tame pačiame darbe Grosclaude ir kt. pastebėjo trečiojo varianto (C) atradimą mongolų jake. αs2-CN C būdingas B. grunniens, kai tuo tarpu B variantas niekada nebuvo aptiktas šioje veislėje Pirmasis B varianto buvimą Vakarų B. taurus veislėse įrodė Chianese ir kt., radęs šį alelį Podolės
galvijuose. Tolesni tyrimai, turėję atrasti amino rūgščių pasikeitimas, kuris atskyrė B variantą nuo A, atlikti nebuvo; αs2-CN B lieka necharakterizuotu variantu.
Paskutinis aptiktas variantas, αs2-CN D, rastas dviejose prancūzų galvijų veislėse (Grosclaude F ir kt., 1976; Grosclaude F., ir kt.1978) D alelis taip pat rastas kai kuriose vokiečių veislėse (Erhardt G., 1993) bei Suomijos airšyrų (Ikonen T. ir kt., 1996) veislėje.
Lietuvos galvijų tarpe labiausiai paplitęs αs2-CN A alelis buvo rastas dažniu, įvairuojančiu nuo 0,890 (LŽ) iki 1,000 (LJ) visose Lietuvos galvijų veislėse. Šiame lokuse polimorfiškos buvo tik trys tirtos veislės. Lietuvos juodmargių populiacijoje αs2-CN D alelis nebuvo rastas (Baltrėnaitė L. 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).
αs2-CN didžiausiu dažniu buvo rastas homozigotinis AA genotipas. AD genotipas nebuvo rastas Lietuvos juodmargių populiacijoje. DD genotipas buvo rastas tik Lietuvos žalųjų veislėje. αs2-CN lokuse Lietuvos juodmargiai galvijai yra monomorfiški (Baltrėnaitė L. 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).
1.2.3
β
-kazeino genasGenas lokalizuotas 6-oje galvijų chromosomoje. Yra sutinkama net 16 šio geno variantų. A1 ir A2 yra labiausiai paplitę β-kazeino variantai; daugumoje veislių kiek labiau paplitęs pastarasis. B variantas taip pat labai išplitęs, tačiau paprastai kiek mažiau nei A1 ir A2. Normandų ir Džersių veislės turi didžiausias β-kazeino dažnumo vertes (30-45%), po jų seka Montbeliarde, Italijos žalųjų, Reggiana. Modenese ir Italijos žalmargių (10-25%); daugumoje veislių paplitimas yra beveik 10%. Taip pat β-kazeinas C yra gan paplitęs, tačiau mažiau nei B variantas bei mažesniu dažnumu; jake ir zebu C variantas dar nebuvo aptiktas.
β-kazeinas A3 nėra įprastas variantas, bet itin retai buvo randamas keliose veislėse: Italijos fryzų (Di Stasio L., 1983) ir Vokietijos fryzų, Džersių ir kitose vokiečių veislėse (Erhardt G., 1993) Simentalų (Seibert B. ir kt., 1987) ir Alpių pilkųjų (Di Stasio L. ir kt., 1979). Kiti β-CN variantai reti ir buvo aptikti tik vienoje veislėje, išskyrus β-CN F, kurį rado taip pat ir Italijos fryzų veislėje.
Lietuvos galvijų tarpe β-CN A1 ir A2 aleliai buvo rasti visose keturiose Lietuvos galvijų populiacijose panašiu dažniu. β-CN retai sutinkamas B alelis buvo aptiktas keturiose veislėse labai mažu dažniu. C alelis nebuvo rastas nei vienoje tirtų veislių (Baltrėnaitė L. 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).
Homozigotinis A1A1 β-CN genotipas buvo dažniausiai sutinkamas Lietuvos žalųjų populiacijoje. Labiausiai pageidaujamas genotipas A2A2 įtakojantis didesnį primilžį didžiausiu dažniu rastas Lietuvos baltnugarių ir Lietuvos juodmargių galvijų tarpe. Lietuvos šėmų galvijų tarpe dažniausiai sutinkamas A1A2 genotipas (Baltrėnaitė L. 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).
1.2.4 κ-kazeino genas
Genas lokalizuotas 6-oje galvijų chromosomoje. Yra sutinkama 13 šio geno variantų. Labiausiai išplitę κ-kazeino aleliai yra A ir B, esantys visose veislėse kintančiu dažnumu. A variantas vyrauja Fryzų, Airšyrų, Danijos žalųjų ir Indijos zebu veislėse; Airijos Kerry veislėje jo dažnumas siekia beveik 93% (Murphy R.F. ir kt., 1969). B variantas vyrauja Džersių, Normandų ir Afrikos zebu. Galvijų veislėse aiškiai vyrauja B variantas (Russo V. ir kt., 1978).
κ-kazeinas C, nors mažiau paplitęs, buvo rastas daugelyje veislių. Be Grey Alpine ir Italijos žalųjų, jis buvo aptiktas Vokietijos simentalų (Seibert B. ir kt., 1987), Vokietijos Fleckvieh (Erhardt G. ir kt.,1989), Murnau-Werdenfelser (Krause I. ir kt., 1988) ir Holšteinų-žalųjų (Bovenhuis H. ir kt., 1991) veislėse.
κ-kazeinas C, nors ir nelaikomas dažnai pasitaikančiu variantu, buvo rastas dideliu dažnumu (apie 30%) Suomijos airšyrų veislėje; neseniai šį variantą taip pat aptiko ir Italijos žalųjų ir fryzų veislėse (Murphy RF. ir kt., 1969; Caroli A. ir kt., 2000).
Lietuvos galvijų tarpe κ CN abu aleliai ir A, labiausiai paplitęs visose veislėse, ir B, labiausiai pageidaujamas, buvo rasti visose keturiose Lietuvos galvijų veislėse. Retesni κ CN C ir G aleliai nebuvo rasti nei vienoje tirtoje populiacijoje. Retai sutinkamas κ CN E alelis buvo rastas labai mažu dažniu (Baltrėnaitė L. 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).
κ CN AA ir AB genotipai buvo rasti visose tirtose Lietuvos galvijų veislėse, vidutiniu dažniu. AE ir BE genotipai rasti nedideliu dažniu visose populiacijose. κ CN BB genotipas, kuris labiausiai įtakoja pieno perdirbamąsias savybes, rastas gana dideliu t.y. 11,37% dažniu Lietuvos baltnugarių galvijų veislėje ir visai nerastas Lietuvos juodmargių (Baltrėnaitė L. 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).
Kapa kazeino (κ-CN) B alelis lemia didelį bendrą, o ypač kazeino tipo, baltymų kiekį piene, didesnę sūrių bei varškės gamybos išeigą, nes gerina pieno sutraukinimo savybes bei pieno sausųjų medžiagų panaudojimą gaminant varškę. Nustatyta, kad iš karvių, turinčių BB
genotipą kapa kazeino atžvilgiu, to paties pieno kiekio galima pagaminti apie 10% daugiau varškės, nei iš karvių, turinčių AA genotipą. Taip pat kieti sūriai, pagaminti iš tokio pieno, pasižymi geresne konsistencija ir kompozicija. Praktika rodo, kad kietų sūrių gamybai labiausiai tinka pienas gautas iš karvių, turinčių būtent BB genotipą ir iš tokio pieno galima pagaminti 6% daugiau sūrio. Tuo tarpu karvės, turinčios AA genotipą, pasižymi didesniu pieningumu. Teigiamą poveikį pieno baltymų ir riebalų kiekiui turi alfa S1 kazeino (αs1-CN) BC genotipas, tuo tarpu BB genotipą turinčios karvės yra pieningesnės. Beta kazeino (β-CN ) B alelis didina kazeino tipo baltymų kiekį piene, gerina pieno sutraukinimo savybes bei sūrių gamybos išeigą.
1.3 α-laktoalbumino genas
2 paveikslas. 5-ta galvijų chromosoma, kurioje lokalizuotas α-laktoalbumino
genas
Genas lokalizuotas 5-oje galvijų chromosomoje. Yra žinomi 3 genetiniai variantai. α-laktoalbuminas yra sudėtinė dalis laktozės sintetato, fermento, dėl kurio sintetinama laktozė paskutinėje stadijoje, kurios metu gliukozė susiejama su galaktoze.
Pirmą kartą α-LA A buvimą B. taurus veislėje įrodė Osterhoff ir Pretorius (1966), kurie rado šį alelį europietiškose veislėse, atvežtose iš Pietų Afrikos. Bettini ir Masina, remdamiesi α-LA A alelių pasitaikymu veislėse, auginamose Pietų Italijoje (kaip Podolijos galvijai), o taip pat kai kuriais anatominiais panašumais tarp šių veislių ir zebu, pasiūlė filogenetinės tokių veislių kilmės iš B. indicus versiją. Bell ir kt. (1962), Bali (banteng) galvijuose (B. javanicus) rado trečią α-LA variantą, pavadintą C. Iki šiol nėra įrodytas šio
alelio buvimas nei B. taurus, nei B. indicus. Pastarojo varianto yra žinomas amino rūgščių pasikeitimas (Bell ir kt., 1981), bet ne jų vieta.
Lietuvos galvijų tarpe iš dviejų žinomų α-LA A ir B alelių tik B variantas buvo rastas visose keturiose veislėse dažniu 1,000. α-LA buvo rastas visose veislėse tik BB genotipas (Baltrėnaitė L. 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).
1.4 β-laktoglobulino genas
3 paveikslas. 11-ta galvijų chromosoma, kurioje lokalizuotas β-laktoglobulino
genas
Genas lokalizuotas 11-oje galvijų chromosomoje. Yra žinoma 12 genetinių geno variantų.
Laktoglobulinas (globulinas) sudaro apie 6% visų pieno baltymų ir 0,1% visų pieno sudėtinių dalių. Karvei apsiveršiavus, pirmosiose krekenose pieno globulino yra gana daug 8 – 15% visų pieno sudedamųjų dalių. Laktoglobulino sudėtyje yra imuninių medžiagų, kurios būtinos tik ką atvestam veršeliui. Laktoglobulinas, kaitinant pieną aukštesnėje nei 75 O C temperatūroje yra sutraukiamas ir iškrenta baltomis nuosėdomis (Bendikas P. ir kt., 1998).
β-laktoglobulinas yra pagrindinis išrūgų baltymas karvių piene. Po Palmerio kristalizacijos 1934 m. (Palmer A.H., 1934) daugelį metų naudotas kaip baltymo modelis struktūriniams ir fermentiniams tyrimams, susijusiais su denatūrizacija bei sąsaja tarp jonų ir baltymų. Biologinės šio baltymo funkcijos vis dar nėra gerai žinomos; jis galėtų dalyvauti fosfato metabolizme pieno liaukoje bei retinolio ir riebiųjų rūgščių pernešime virškinimo trakte (Farrell H.M. ir kt., 1971; Hill J.P. ir kt., 1997).
Beta laktoglobulino (β-LG) AA genotipą turinčios karvės pasižymi dideliu pieningumu. Beta laktoglobulino (β-LG) B alelis lemia kazeino baltymų kiekio padidėjimą piene, kadangi kazeinai ir yra baltymai, kurie sutraukinami gaminant sūrį, todėl kuo daugiau piene yra kazeino baltymo, tuo daugiau sūrio galima pagaminti iš to paties kiekio pieno. Tyrimais nustatyta, kad beta laktoglobulino (β-LG) BB genotipą turinčių karvių piene kazeino kiekis yra 3% didesnis nei AA genotipą turinčių karvių piene, todėl iš BB genotipą turinčių karvių tokio paties kiekio pieno galima pagaminti 2% daugiau gaminamo produkto.
β-laktoglobulinas yra pagrindinis išrūgų baltymas karvių piene.β-laktoglobulino A ir B variantai paplitę visose veislėse; B vyrauja kai kuriose europietiškose veislėse, tokiose kaip Airšyrų, Šorthornų, Danijos žalųjų, bei Azijos ir Afrikos zebu (85-95%), o taip pat Italijos mėsinių galvijų veislėse (70-80%). Fryzų ir keliose kitose veislėse abi alelės pasitaiko tuo pačiu dažnumu. β-LG A ir B alelių buvimą labai mažu dažnumu B. grunniens veislėje pastebėjo Grosclaude ir kt. (1976). Autorių nuomone, šį faktą galima interpretuoti kaip veislių kryžminimo su B. taurus rezultatą. Šiuos du alelius aptiko ir Lozovaya Pamiro jake (Lozovaya G.S., 1973).
β-LG C nėra dažnai sutinkama alelis, aptikta tik Australijos džersių (Bell K., 1964) ir Vokietijos džersių (Erhardt G., 1993). Šis alelis dar pastebėta Kubiečių zebu (Perez-Beato O., 1979) ir Pamiro jake.
β-LG D, tuo tarpu, pastebėtas keliose kitose veislėse: Danijos džersių (Larsen B. ir kt., 1986), Lenkijos simentalų (Michalak W., 1967), Italijos žalųjų (Russo V. ir kt.,1971; Mariani P. ir kt., 1987) Reggiana (Mariani P.ir kt., 1971), Modenese (Russo V. ir kt., 1972), Modicana (Bettini T.M. ir kt., 1972), Rendena (Mariani P. ir kt.,1975), Vokietijos simentalų (Seibert B. ir kt., 1987).
β-LG E, F ir G variantai iki šiol pastebėti tik Bali (banteng) galvijuose (B. javanicus). Kiti β-laktoglobulino aleliai yra reti ir buvo aptikti tik vienoje veislėje.
Lietuvos galvijų tarpe labiausiai pageidaujamas β-LG B alelis buvo rastas visose populiacijose ir įvairavo nuo 0,540 (LŠ) iki 0,922 (LŽ). C alelis labai mažu dažniu (0,007) buvo rastas tik Lietuvos žalųjų veislėje. D variantas nebuvo rastas nė vienoje veislėje (Baltrėnaitė L. 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).
β-LG BB genotipas Lietuvos žalųjų populiacijoje rastas labai dideliu dažniu (85,10%). BC genotipas rastas tik Lietuvos žalųjų populiacijoje, o AA genotipas visose tirtose veislėse (Baltrėnaitė L. 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).
1.5 Augimo hormono genas (GH)
4 paveikslas. 19-ta galvijų chromosoma, kurioje lokalizuotas augimo hormono
(GH) genas
Galvijų augimo hormonas (somatotropinas) yra proteino hormonas, sekretuojamas hipofizio liaukinėje dalyje. Šis hormonas aktyvina laktaciją. Manoma, kad jis didina pieno gamybai reikalingų medžiagų – gliukozės, aminorūgščių ir riebalų rūgščių kiekį kraujyje. Jei augimo hormono pakanka, šias medžiagas pieno liaukos lengvai pasisavina (Praškevičius A. ir kt., 2003). Šis genas yra galvijų 19-oje chromosomoje; susideda iš 5 egzonų ir yra atskirtas 4 intronais (Gordon ir kt., 1990). Genas yra sudarytas iš 190 arba 191 amino rūgščių, turinčių Ala arba Phe N gale (Wood ir kt., 1989). Dėl alelinio polimorfizmo leucino arba valino amino rūgštis gali atsirasti 126 (127) bST pozicijoje (Seavey ir kt., 1971). L/V polimorfizmas turi alelinę charakteristiką, nukleotidų C→G pasikeitimas kodone CTG, esančiame GH V egzono pradžioje 127 proteino pozicijoje Val keičia Leu. Geno GH polimorfiniai variantai gali būti potencialūs galvijų produkcijos požymių potencialūs markeriai. Pavyzdžiui didesnis pieno kiekis buvo pastebėtas pas Holšteinų Fryzų karves turinčias GH LL genotipą, lyginant su LV ar VV genotipais (Zwierzchowski L. 2000). Simentalų buliai turintys LV genotipą pasižymėjo didesniu mėsingumu lyginant su LL ir VV homozigotais (Schlee P. ir kt., 1994). Šešios polimorfinės sritys buvo nustatytos promotoriaus regione, kurios pagrinde yra taškinės DNR mutacijos. Kai kurios iš jų persidengia potencialiose vietose sujungdamos transkripcijos faktorius, dalyvaujančius GH geno transkripcijoje (Hetch ir Geldermann, 1996). Be to 3 bp delecija (-35AAG-33) buvo aptikta promotoriaus regione (išsidėsčiusi 9 nukleotiduose
viršutinėje TATAAA dalyje). GH geno 5‘ regionas apima reguliuojančias sekas, kurios kontroliuoja geno ekspresiją ir sąveikauja su eile transkripcijos faktorių (Crone ir kt., 1990).
Keletas polimorfizmų buvo aptikta GH gene. Cowan ir kt., 1989 ir Hilbert ir kt., 1989 aptiko MspI restrikcinės endonukleazės polimorfizmą, kuris lokalizuotas GH 3 introne 1547 pozicijoje. Hoj ir kt., 1993 ir Lee ir kt., 1993 ištyrė, jog GH(Msp-) alelė dažniau pasitaikė karvių linijose, kurios pasižymėjo dideliu pieno riebumu. Panašūs rezultatai buvo gauti ir Falaki ir kt. 1996, kuris įrodė, GH(Msp-) alelės sąryšį su didesniu pieno riebalų kiekiu Holšteinų-Fryzų karvėse. Pagal Lagziel ir kt. 1996-99 tyrimus heterozogotinės karvės davė pieno su didesniu proteinų kiekiu negu homozigotiniai individai. Skirtingi rezultatai buvo pateikti Yao ir kt. 1996 GH(Msp+) alelė turėjo teigiamos įtakos pieno kiekiui (+300 kg), riebalams (+8 kg) ir proteinams (+7 kg). Dybus 2002 tirdamas Lenkijos juodmargius galvijus nustatė, jog GH geną turinčios homozigotinės karvės davė daugiausiai pieno, tuo tarpu heterozigotinės karvės pasižymėjo didesniu pieno riebalų kiekiu nei homozigotinės.
1.6 STAT 5 A ir STAT 5 B genai
STAT5 yra dviejose formose – A ir B, kurios skiriasi keliomis amino rūgštimis, proteino molekulės karboksilo gale. Abi formos yra koduojamos atskirais genais. Galvijų 19-oje chromosom19-oje STAT5A ir STAT5B genai yra lokalizuoti arti vienas kito 40 Kb atstume. Yra žinomi vos keli STAT5A geno nukleotidų sekos polimorfizmo atvejai (Flisikowski K., 2003). Signalų pernešėjai ir transkripcijos aktyvatoriai (STAT-ai) yra 7-ių transkripcijos faktorių šeima, kurie tarpininkauja įvairių peptidinių hormonų ir ląstelėse esančių citokinų veiklą. STAT5 taip pat yra žinomas, kaip pagrindinis augimo hormono (GH) ir prolaktino (PRL) veiklos mediatorius. STAT5 pirmą kartą buvo identifikuotas pieno liaukose ir pradžioje buvo žinomas, kaip pieno liaukų faktorius – MGF (mammary gland factor). STAT5 yra prolaktino viduląstelinis mediatorius, kurio veikiamas jis aktyvuoja pieno proteino genų transkripciją ir genų ekspresiją pieno liaukos epitelio ląstelėse. Dėl to STAT5 polimorfizmas gali įtakoti pieno proteino genų ekspresiją laike laktacijos ir pieninių galvijų pieno produkcijos požymius.
1.7 DGAT1 genas
Genas DGAT1 - diacetilglicerolio aciltransferazė, lokalizuotas galvijų 14 chromosomoje netoli mkrosatelito ILSTS039. Manoma, kad šis genas įtakoja laktaciją ir riebalų metabolizmą. DGAT1 geno K232A polimorfinis (arba ILSTS039 geno 225) alelės didina riebalų koncentraciją.
5 paveikslas. 14 galvijų chromosoma, kurioje lokalizuotas DGAT1 genas
Izraelio Holšteinų galvijų populiacijoje ILSTS039 mikrosatelito 225 alelės dažnumas buvo 11% bulių-motinų tarpe, 12% karvių tarpe ir 16,8 % bulių tarpe. Efektai susiję su 225 alele išanalizuotoje visoje populiacijoje buvo panašus efektams, dukterų analizės modelyje. Alelės K232A dažnumas (DGAT1 genas), kuris padidino riebalų koncentraciją buvo 8,9% karvių tarpe ir 15,5% bulių tarpe.
1 lentelė. ILTS039 dukterų analizės modelyje mikrosatelito ryšys su
produktyvumo savybėmis Markeris ILTS039 Tėvas 2283 3241 Informatyvių dukterų skaičius 201 260 Pienas (kg) -187c -92 Riebalai(kg) 4,5a 7,0d Baltymai(kg) -0,4 -0,8 Riebalai(%) 0,100d 0,094d Baltymai(%) 0,049d 0,019a a P 0.05, b P 0.01, c P 0.001, d P 0.0001
Markerio ILSTS039 alelė 225, ir DGAT1 alelė K232A, buvo susieti su pieno produkcijos mažėjimu ir padidėjimu pieno riebalų, riebalų bei baltymų procentu. Kiekybinių požymių lokusų efektas buvo artimas kodominantiniam. Pokyčio efektas buvo 0,16% riebalų.
Daugelis tyrinėjimų parodė, kad individualus QTL gali būti aptiktas ir komercinių pieninių galvijų populiacijose genetinių markerių pagalba (Weller ir kt., 1990). Keletas tyrimų Ron ir kitų (1998) parodė, kad QTL glaudžiai susijęs su pieno-riebalų koncentracija, rastas Izraelio ir JAV Holšteinų pieninių galvijų populiacijose. Lokusas taip pat buvo rastas ir išskirtas Olandijos Holšteinų populiacijoje (Coppieters ir kt., 1998) ir Vokietijos pieninių galvijų populiacijoje (Looft ir kt., 2001). Grisart ir kiti (2002) genotipavo 1818 Olandijos Holšteinų bulius ir 529 Naujosios Zelandijos Holšteinų karves radus šį polimorfizmą.
1.8 Pieno produkcijos kiekybinių požymių lokusai (QTL)
Išanalizavus Holšteinų populiaciją pagal 246 genetinius markerius buvo aptikta visa eilė kiekybinių požymių lokusų, įtakojančių pieno kiekį, riebumą, baltymingumą bei somatinių ląstelių kiekį.
2 lentelė. Kiekybinių požymių įtakojančių pieno produkciją lokusai
Chromosomos Vieta Požymiai
3 0,00 Baltymai(%) 6 0,38 Pienas 0,00 Riebalai (%) 0,08 Baltymai (%) 20 0,28 Riebalai (%) 0,30 Baltymai (%) 1 0,00 Baltymai 2 0,44 Riebalai (%) 3 0,06 Pienas 0,22 Baltymai(%) 6 0,84 Somatinės ląstelės 9 0,90 Pienas 0,86 Riebalai 0,90 Baltymai 13 1,04 Somatinės ląstelės 17 1,16 Pienas 0,00 Pienas 1,16 Baltymai 0,00 Baltymai 23 0,62 Riebalai 26 0,78 Somatinės ląstelės
Statistiškai patikimas QTL poveikis pieno požymiams buvo aptiktas 3, 6 ir 20 chromosomose. Papildomai QTL manoma yra 1, 2, 9, 17, 23 ir 28 chromosomose. Trys QTL veikiantys somatines ląsteles buvo aptikti 6, 13, 26 chromosomose ir šeši papildomi QTL buvo pateikti 5, 11, 15, 16, 19 ir 21 chromosomose (Boichard D ir kt., 1997).
1.9 Prolaktino genas 1.9.1 Genetinis pagrindimas
Prolaktino genas yra 10 kb dydžio, susideda iš 5 egzonų ir 4 intronų (Dybus A. ir kt., 2002), bei lokalizuotas galvijų 23 chromosomoje (Dybus A. ir kt., 2002).
Tyli A-G mutacija, 3-e egzone 103 amino rūgšties sukelia polimorfizmą RsaI vietoje (Lewin H.A. ir kt., 1992). Chung ir kt.. (1996) įrodė, kad PRL – RsaI lokusas pas pieninius galvijus turėjo reikšmingos įtakos pieno kiekiui ir pieno riebalų procentui.
6 paveikslas. 23 galvijų chromosoma, kurioje lokalizuotas prolaktino genas
1.9.2 Prolaktino hormono struktūra, funkcijos ir veikimo mechanizmas
Prolaktinas – tai peptidinis hormonas sudarytas iš 199 aminorūgščių, kurį išskiria hipofizis. Jis skatina pieno sekreciją, pieno liaukų augimą. Prolaktino veikimą sustiprina posmegeninės liaukos augimo hormonas. Keisdamas ląstelių fermentinį aktyvumą, jis stimuliuoja sekreciją (Dybus A. ir kt., 2002). Prolaktinas veikia kartu su kortizonu ir insulinu, kad stimuliuoti genų transkripciją, kurie koduoja pieno baltymus. Taip pat prolaktinas aktyvina ir pieno riebalų, ir angliavandenių biosintezę.
7 paveikslas. Prolaktino hormono struktūra
Prolaktino hormonas atsakingas ne tik už pieno sekreciją, pieno liaukų augimą, bet ir palaiko laktaciją (Tucker, 1981; Collier ir kt., 1984).
Prolaktinas veikia į pieno liaukas. Jis jungiasi prie pieno liaukų ląstelėse esančių receptorių ir aktyvina adenilatciklazės sistemą.
• Prolaktinas gyvulio lytinio brendimo metu skatina pieno liaukų augimą ir ląstelių vešėjimą bei brendimą.
• Skatina pieno baltymų – kazeino ir laktalbumino, biosintezę. • Padeda atsirasti pienui ir palaiko laktaciją.
• Prolaktinas aktyvina pieno riebalų ir angliavandenių biosintezę, sulaiko vandenį ir elektrolitus.
• Slopina liutropino sekrecija ir ovuliacija.
slopina prolaktino sintezę. Prolaktino receptorius yra plačiai išreikštas laisvomis ląstelėmis ir kai kurie limfocitai sintetina ir išskiria prolaktiną. Prolaktinas gali veikti kaip autokrino ar parakrino laisvo aktyvumo moduliatorius (Praškevičius A. ir kt., 2003).
8 paveikslas. Prolaktino sekrecija
Dopaminas, sąveikaudamas su hipofizės ląstelėse esančiais receptoriais, sumažina cAMP (ciklinis adenozinmonofosfatas) koncentraciją. Sumažėjus prolaktino sekrecijai nuslopinama prolaktino geno transkripcija. Prolaktino sekreciją skatina progesteronas, estrogenai, endorfinai, taip pat miegas, stresas ir lytiniai santykiai bei spenelių dirginimas maitinimo metu (Praškevičius A. ir kt., 2003). Hipotaliamas veikia hipofizę, kuri išskiria folikulą stimuliuojantį hormoną FSH. Šis hormonas brandina folikulą, kuris gamina estrogeną. Hipotaliamas perduoda signalą hipofiziui, o pastarasis liepia kiaušidėms gaminti. Prolaktino perteklius gali būti dėl neurotransmiterio dopamino trūkumo, kuris yra natūralus prolaktino antagonistas. Prolaktiną dar reguliuoja skydliaukę stimuliuojantis hormonas (TSH); taip pat luteinizuojantis ir folikulus stimuliuojantis hormonai (LH ir FSH), pastarieji du yra lytines liaukas stimuliuojantys hormonai.
Apibendrinimas. Galvijų genotipavimui yra naudojami specifiniai sintetiniai markeriai, kurie atpažįsta ir nustato tokių požymių kaip pieningumas, riebalų ir baltymų kiekis piene, atsparumas mastitams pagal somatinių ląstelių kiekį alelius, tačiau mažiau žinoma genų, , kurie susiję su reprodukcinėmis savybėmis. Specifiniai genetiniai markeriai, tikslingai naudojant juos gyvulių genotipavime, gerokai padidina selekcijos efektyvumą, kadangi jų pagalba galima vykdyti atranką vieno ar net kelių požymių, kurių pasireiškimą lemia vienas ar keli sukibę genai.
Hipotaliamas Dopaminas STOP Hipofizis Prolaktinas Estrogenai Stimuliuojantys faktoriai
Šis QTL nustatymo metodas vadinamas MAS (marker-assisted selection) (Lien S., Alestrom P. ir kt., 1992).
Yra atrasta visa eilė genų, kurie įtakoja pieno kiekį, pieno baltymų ir riebalų kiekį, pieno baltymų kokybinę sudėtį – tai kazeinų genai, β laktoglobulinas, prolaktino genas, GH (augimo hormonas) genas, Stat5a. Tyrimų rezultatai rodo, kad nauja genams identifikuoti pagrįsta technologija leidžia ištirti gyvulio genotipą, nustatyti šiuos genus, ir selekcijos procese panaudoti juos kaip genetinius žymeklius.
2. TYRIMŲ METODAI IR MEDŽIAGA
2.1 Tyrimų medžiaga:
Tyrimų schema
Prolaktino geno (PRL) variantų ištyrimas LJ, LŽ, LB, LŠ galvijų veislėse
Produktyvumo duomenų bazės suformavimas
Pieno kiekiui PRL geno įtakos ištyrimas
Pieno riebalams Pieno baltymams
Tyrimų metodai
1) DNR 2) Polimerazinė 3) Restrikcinių
skyrimas: grandininė reakcija fragmentų ilgio (RFIP)
- Iš šerių (PGR) metodas
- Iš kraujo - prolaktino (PRL) genui - PRL- restriktazė
padauginti RsaI
4) Elektroforezė 5) Dažymas etidžio 6) Mėginių
agarozės gelyje bromidu genotipavimas
Mėginiai buvo paimti iš 11 LŠ (5 karvių, 6 bulių), 36 LJ, (30 karvių, 6 bulių), 18 LB (16 karvių, 2 bulių), ir 26 LŽ (20 karvių, 6 bulių), negiminingų bulių ir karvių.
Kraujas buvo imamas iš jungo venos į vienkartinius vakuminius sterilius mėgintuvėlius (Venoject) su konservantu K3 EDTA.
Šeriai (10-15 vnt.) buvo pešami iš ausų, su svogūnėliais, dedami į vienkartinius plastikinius maišelius.
Bulių DNR mėginiai buvo naudojami iš K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje, esančio DNR banko (Prieduose surašyti visi duomenys apie tirtus gyvulius, bei naudota įranga, instrumentus ir reagentus atliekant tiriamąjį darbą).
2.2 DNR skyrimas
2.2.1 DNR skyrimas iš plauko svogūnėlio ląstelių:
Nukerpami 4-5 plaukų svogūnėliai ir patalpinami į mėgintuvėlius. Paruošiamas lizavimo mišinys (proteinazė K:lizavimo buferis = 1:5). Mėgintuvėlio turinys užpilamas lizavimo mišiniu (vienam pavyzdžiui imama 50 µl buferio ir 10 µl proteinazės K). Mėgintuvėliai 30s. maišomi maišyklės “Vortex” pagalba. Centrifuguojami 10s. 13 500 aps./min. greičiu. Pavyzdžiai per naktį inkubuojami 56oC temperatūroje.
Po naktinės inkubacijos pavyzdžiai 10 min. pakaitinami 94oC temperatūroje ir atšaldomi iki kambario temperatūros. Centrifuguojami 10s. 13 500 aps./min. greičiu.
2.2.2 DNR skyrimas iš kraujo. Chloroforminis - fenolinis metodas
Į mėgintuvėlius įpilama po 10 ml kraujo ir po 30 ml buferio A. Mėgintuvėlių turinys sumaišomas vartant. Mėgintuvėliai 30 min. inkubuojami ledo vonioje. Kas 5-10 min. mėgintuvėlių turinys sumaišomas vartant. Centrifuguojama 10 min. 4oC temperatūroje 3000 aps./min. greičiu. Nupilamas skystis ir paliekamos tik nuosėdos. Ant nuosėdų užpilama 10ml buferio A ir gerai išmaišoma pipete. Centrifuguojama 10 min. 4oC temperatūroje 3000 aps./min. greičiu. Nupilamas paviršiuje esantis skystis. Ant nuosėdų užpilama 10 ml 0.15M KCl ir gerai išmaišoma pipete. Centrifuguojama 10 min.4oC temperatūroje 3000 aps./min. greičiu. Nupilamas paviršiuje esantis skystis. Ant nuosėdų užpilama 10 ml 0.15M KCl ir gerai išmaišoma pipete. Centrifuguojama 10 min. 4oC temperatūroje 3000 aps./min.greičiu. Nupilamas paviršiuje esantis skystis. Ant nuosėdų užpilama 5ml buferio B, 500 ml 10% SDS, 15 ml proteinazės K ir gerai išmaišoma pipete. Inkubuojama per naktį 37oC (arba 2 val 55oC) temperatūroje.
chloroformo ir mėginiai vėl maišomi, kol susidaro balta vienalytė masė. Centrifuguojama 20 min. 22oC temperatūroje 4000 aps./min. greičiu. Iš centrifugos mėginiai išimami atsargiai, kad nesusimaišytų susidarę sluoksniai. Pipete atsargiai nusiurbiamas viršutinis sluoksnis, (kuriame yra DNR), perpilamas į kitus mėgintuvėlius, ir užpilamas tokiu pat kiekiu 99% etilo spirito. Mėgintuvėliai sandariai uždengiami ir turinys išmaišomas vartant. Mėginius galima palikti nakčiai –20oC temperatūroje. Iškritusi DNR išimama kilpelės pagalba, perplaunama 70 % spirite ir perkeliama į mėgintuvėlius, kuriuose yra po 100 ml dejonizuoto H2O. Mėgintuvėliai paliekami nakčiai šaldytuve arba purtyklėje, kad DNR visiškai ištirptų.
2.3 DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas
Genominės DNR kiekis ir grynumas nustatomas spektrofotometrinio metodo pagalba. Tam tikslui paruošiama 100 µl skiestos DNR tirpalo: imama 10 µl koncentruotos DNR ir skiedžiama 90 µl distiliuotu vandeniu. DNR kiekis nustatomas išmatuojant skiesto tirpalo optinį tankį (OD) prie 260nm bangos ilgio. Kai OD = 1, tai 1 ml tirpalo yra 50 µg dvigrandės DNR.
DNR kokybė įvertinama išmatavus skiesto tirpalo optinius tankius prie 260 ir 280 nm bangos ilgių. Švarumą rodo santykis OD260/OD280. Švarių DNR tirpalų santykis yra 1.8-2.0. Jei tirpale yra baltymų ar fenolio priemaišų, šis santykis bus mažesnis nei nurodyta. Baltymų koncentracija neturi viršyti 0.5 mg/ml ribos. Jei tirpale priemaišų yra daugiau, reikia atlikti pakartotinį genominės DNR valymą.
Šiuo metu laboratorijose naudojami spektrofotometrai iš karto nustato ir apskaičiuoja tiek DNR, tiek baltymų koncentraciją tirpale.
2.4 Polimerazės grandininė reakcija (PGR)
Polimerazės grandininė reakcija yra metodas, pavadintas pagal DNR polimerazę, fermentą, vykdantį DNR replikaciją ląstelėje. Tai yra nukleino rūgščių sintezės in vitro metodas, kuriuo laboratoriniame mėgintuvėlyje gali būti specifiškai padauginti (amplifikuoti) atskiri DNR fragmentai. PGR metodas yra labai jautrus, todėl padauginti pasirinkta DNR atkarpa gali sudaryti netgi vieną milijoninę bendro DNR pavyzdžio dalį. Tai reiškia, kad, naudojant PGR galima amplifikuoti net ir vienintelį pasirinktą geną.
Prolaktino geno pradmenys:
Pirminis (5‘ –CGAGTCCTTATGAGCTTGATTCTT-3‘) Atvirkštinis (5‘ –GCCTTCCAGAAGTCGTTTGTTTTC-3‘)
Mišinys PGR reakcijai:
PGR komponentai: Vienai reakcijai atlikti (μl)
Geros kokybės dejonizuotas vanduo ddH2O
4,9
Buferis 10xPCR (be MgCl2) 2,5
MgCl2 (konc. 50mM) 1,5
dNTP miksas (2mM) 2,5
Pirminis pradmuo (darbinė
konc. 10pmol) 1,1
Atvirkštinis pradmuo (darbinė konc. 10pmol) 1,25 BSA 0,25 Taq polymerazė (1vnt./μl) aktyvumo 1
PGR mišinio pasiruošimą reikia pradėti nuo vandens, o toliau sekantys komponentai. Supilama 10 μl genominė DNR ir 15 μl PGR reakcijos mišinio į vieną mėgintuvėlį. Galutinis mišinio kiekis 25 μl. Supylus visus komponentus, gautas mišinys gerai išmaišomas ir nucentrifuguojamas. PGR atliekama automatiniame amplifikatoriuje. PGR ciklai kartojasi 30 kartų.
PGR sąlygos:
94 OC, 3 min (pirminė denatūracija) 30 ciklų:
94 OC, 30s (denatūracija)
59 OC, 40s (oligonukleotidų prisijungimas) 72 OC, 20s (DNR grandinėlės sintezė) Sintezės užbaigimui: 72 OC, 5 min Laikyti: 4 OC.
2.5 Karpymas fermentais ir elektroforezė
10 μl PGR produkto karpoma su 10 μl restrikcinio mišinio (ddH2O-7,5 μl, 10x Mbuf. 2 μl, RsaI 0,5 μl). Paliekama termostate nakčiai (15h) 37°C.
Karpytas PGR produktas frakcionuojamas 4 % agarozės gelyje, 100V, 35 min. DNR elektroforezė atliekama horizontaliame 0,65-3,0 % agarozės gelyje. Pagaminti 4,0 % agarozės gelį, reikia 2 g agarozės miltelių ištirpinti 100 ml 1x TAE buferyje kaitinant ir maišant tol, kol tirpalas pasidaro skaidrus ir vientisos konsistencijos. Vėstant, indas su ištirpinta agaroze maišomas atsargiai, kad nesusidarytų oro burbulai. Iki 70 - 65 OC atvėsintą agarozę greitai, bet tolygiai supilame į paruoštą formą. Po to, į gelį įstatome „šukutes“ ir formą palikti 30 min kambario temperatūroje, kad gelis sustingtų. Sustingus geliui, atsargiai ištraukti „šukutes“. Prieš įvedant DNR mėginius į susiformavusius „šulinėlius“, gelį reikia įstatyti į elektroforezės vonelę, užpildytą 1xTAE buferiu taip, kad šis apsemtų gelį. Į kiekvieną šulinėlį įvesti po DNR mėginį, sumaišytą su bromfenolio mėlio dažais (7,0-10,0 DNR mėginio + 3,0 μl dažo). Elektroforezė vykdoma leidžiant elektros srovę per gelį, ko poveikyje DNR fragmentai juda nuo katodo link teigiamo poliaus – anodo. Fragmentų judėjimo greitis gelyje priklauso nuo jų dydžio: mažesni fragmentai juda greičiau, didesni – lėčiau. Atsižvelgiant į gelio dydį ir DNR fragmentų molekulinę masę, elektroforezė vykdoma 30 – 60 min., esant 70 – 110 V įtampai. Nudažome etidžio bromido tirpalu, elektroforezės metu išfrakcionuotus DNR mėginius:
a) iš elektroforezės formos išimamas agarozės gelis
b) į dažymo vonelę įpilti 300 ml dist. H2O ir 30 μl etidžio bromido tirpalo (10mg/ml). Galutinė dažų koncentracija – 0,5 μl/ml.
c) gelį panardinti į paruoštus etidžio bromido dažus.
d) gelį gerai nuskalauti dist. H2O taip,kad neliktų etidžio bromido dažų liekanų.
e) rezultatus įvertinti UV šviesoje. Dažymo metu DNR ir etidžio bromidas sudaro ultravioletinėje šviesoje fluorescuojantį kompleksą.
Gelis dažomas etidžio bromido tirpale 15-20 min. ir analizuojamas UV šviesoje (bangos ilgis 300 nm).
2.6 Prolaktino geno variantų ištyrimas Gautas PGR produktas yra 156 bp.
DNR fragmentų dydis po karpymo restrikciniu fermentu RsaI priklauso nuo galvijų prolaktino geno alelių.
AA – 156 bp
AB - 156 bp 82 bp 74 bp BB - 82 bp 74 bp
AA AB BB
74bp
82bp
156bp ▬▬ ▬▬
2.7 Statistinė analizė
Geno dažnumai kiekvienoje veislėje ir visoje populiacijoje buvo apskaičiuoti tiesioginiu genų skaičiavimo metodu. Skaičiavimai atlikti su statistiniu R – paketu (Gentlemen R. ir kt., 1997).
Genotipų dažnis p apskaičiuojamas pagal formulę 1) p=
Nn
n – atskiro genotipo individų skaičius N – tirtų individų skaičius
Alelių dažnis apskaičiuojamas pagal formulę 2) p= N n n 2 2 1+ 2 3) q= N n n 2 2 3 + 2
n1 ir n3 – homozigotinių individų skaičius n2 - heterozigotinių individų skaičius N - tirtų individų skaičius
Faktinis heterozigotiškumas apskaičiuojamas pagal formulę 4) ho=
N
n2 (ho – observed) n2 - heterozigotinių individų skaičius
Numatomas heterozigotiškumas apskaičiuojamas pagal formulę 5) he=1-(p2+q2) (he – expacted)
p ir q – alelių dažniai
ho< he reiškia heterozigotiškumo trūkumą
Nukrypimas nuo Hardy-Weinbergo dėsnio buvo patikrintas Fis fiksacijos indeksu (Nei, 1987) naudojant formulę (he – ho)/he. Skirtumai tarp genotipų dažnumų buvo patikrinti naudojant x2 analizę pagal Nei (1987).
Lietuvos pieninių galvijų populiacijoje, siekiant įvertinti prolaktino geno įtaką pieno kiekiui ir pieno sudėtinėms dalims buvo atlikta daugiafaktorinė dispersinė analizė (ANOVA).
Pagal tiesinį mišrų modelį paskaičiuota genetinių veiksnių įtaka pieno kiekiui ir sudėčiai Lietuvos pieninių galvijų populiacijoje:
Pieno kiekis ijklmn = μ + prolaktinas + veislė1 + laktacijan + e ijklmn
Riebalai procentais ijklmn = μ + prolaktinas + veislė1 + laktacijan + e ijklmn Riebalai, kg ijklmn = μ + prolaktinas + veislė1 + laktacijan + e ijklmn
Riebalai, procentais ijklmn = μ + prolaktinas + veislė1 + laktacijan + e ijklmn Baltymai, kg ijklmn = μ + prolaktinas + veislė1 + laktacijan + e ijklmn
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Yra atrasta visa eilė genų , kurie įtakoja pieno kiekį, pieno baltymų ir riebalų kiekį, pieno baltymų kokybinę sudėtį. Genai susiję su pieno produkcija buvo išstudijuoti daugelyje veislių, siekiant rasti skirtumus tarp veislių ar veislių grupių (Aschaffenburg ir kt., 1965; Baker ir kt., 1980; Poli ir kt., 1992; Boland ir kt., 1992; Velmala ir kt., 1993; Medjugorac ir kt., 1994). Skirtumai buvo nustatyti genų polimorfizmo pagrindu.
Prolaktino geno polimorfizmą tyriame keturiose Lietuvos galvijų veislėse. Buvo ištirta 91 negiminingas galvijas – 71 karvė ir 20 bulių, atstovaujančių keturias Lietuvos pieninių galvijų veisles – 11 Lietuvos šėmų galvijų, 36 Lietuvos juodmargių, 18 Lietuvos baltnugarių ir 26 Lietuvos žalųjų galvijų.
3 lentelė. Prolaktino (PRL) genotipų dažniai Lietuvos šėmų, Lietuvos
baltnugarių, Lietuvos žalųjų ir Lietuvos juodmargių veislėse
Veislė genotipai
Lietuvos
baltnugariai Lietuvos šėmi Lietuvos žalieji Lietuvos juodmargiai Visoje populiacijoje
AA 0,94 0,91 0,62 0,71 0,75 AB 0,06 0,09 0,37 0,21 0,18 BB 0,00 0,00 0,01 0,08 0,07
Prolaktino geno AA genotipas buvo labiausiai dažnas visose ištirtose veislėse (0,62 – 0,94), AB (0,06 – 0,37). Mažiausiai pasikartojantis buvo BB genotipas (0,00 – 0,08). Lietuvos baltnugarių ir Lietuvos šėmų galvijų tarpe BB genotipas visai nerastas. 75% tirtos populiacijos turėjo AA genotipą, 18% tirtos populiacijos turi genotipą AB ir 7% BB genotipą.
4 lentelė. Prolaktino geno alelių dažniai Lietuvos šėmų, Lietuvos baltnugarių,
Lietuvos žalųjų ir Lietuvos juodmargių veislėse
Veislė Aleliai Lietuvos baltnugariai Lietuvos šėmi Lietuvos žalieji Lietuvos juodmargiai Visoje populiacijoje A 0,97 0,95 0,77 0,80 0,87
Prolaktino geno A alelis didžiausiu dažniu (0,97) rastas Lietuvos baltnugarių veislėje, mažiausiu (0,77) – Lietuvos žalųjų galvijų tarpe. Visoje populiacijoje A alelio dažnis labai aukštas – 0,87, tuo tarpu B tik 0,13, t.y. 87% populiacijos individų turi A alelį, o 13% turi B alelį.
Gauti rezultatai koreliuoja su kitų mokslininkų rezultatais. Aukštas PRL geno A alelio (0,95) dažnumas Holšteinuose buvo Chrenek ir kt. (1998) bei Mitra ir kt. (1980), Chung ir kt. (1996) – 0,80 ir 0,73. Lenkijos žalųjų tarpe.
A alelis rastas 0,87 dažniu Lenkijos žalųjų tarpe (Kopenčny ir kt., 2004), Bohemijos žalųjų tarpe 0,62 dažniu (Kopenčny ir kt., 2004), Rusijos airšyrų 0,86 dažniu (Udina I.G., 2000), Gorbatov žalųjų tarpe 0,92 dažniu (Udina I.G., 2000), Šveicarijos žalųjų – 0,61 dažniu (Udina I.G., 2000), Argentinos Holšteinų tarpe – 0,87 (Ng-Kuai-Hang ir kt., 1984), Argentinos Kreole – 0,96 (Ng-Kuai-Hang irk t., 1984).
5 lentelė. Prolaktino geno alelių ir genotipų polimorfizmo tyrimas bulių ir karvių
tarpe
Lietuvos
balnugariai Lietuvos šėmi
Lietuvos juodmargiai Lietuvos žalieji Visoje tirtoje populiacijoje Veislė Aleliai,
genotipai karvės buliai karvės buliai karvės buliai karvės buliai karvės buliai
A 1,00 0,7 1,0 0,9 0,8 0,5 0,7 0,7 0,9 0,7
B 0 0,3 0 0,1 0,2 0,5 0,3 0,3 0,1 0,3
AA 1,00 0,5 1,0 0,83 0,76 0,40 0,60 0,67 0,84 0,60
AB 0 0,5 0 0,17 0,17 0,40 0,35 0,17 0,13 0,31
BB 0 0 0 0 0,07 0,20 0,05 0,17 0,03 0,09
Ištyrus prolaktino geno alelių polimorfizmą karvių ir bulių tarpe A alelės dažnis didesnis rastas karvių tarpe (0,9) nei bulių (0,7), bet lyginant A ir B alelių dažnius ir karvių ir bulių tarpe A alelis rastas ženkliai didesniu dažniu.
Įvertinus prolaktino geno lokuso heterozigotiškumą visoje populiacijoje buvo rastas nežymus jo trūkumas. Vidutinė rasta prolaktino geno heterozigotiškumo reikšmė (Ho=0,19) buvo truputį mažesnė už numatomą reikšmę (He=0,26), bet nebuvo rastas nukrypimas nuo Hardi-Veinbergo dėsnio.
Produktyvumo analizei buvo panaudoti Lietuvos pieninių veislių karvių kontrolės 2001 – 2004 metų produktyvumo rodikliai iš VĮ „Kaimo verslo plėtros ir informacijos centras“.
6 lentelė. Pieninių veislių karvių pieno produkcijos rodikliai Veislė Laktacijų skaičius Pienas kg Riebalai % Riebalai kg Baltymai % Baltymai kg LJ 65 4927 ± 201 4,09 ± 0,82 205,63 ± 9,45 3,19 ± 0,33 158,26 ± 6,83 LŽ 102 3785 ± 115 4,32 ± 0,67 164,36 ± 6,02 3,39 ± 0,33 128,54 ± 4,09 Vidutiniškai 167 4356 ± 158 4,20 ± 0,74 184,99 ± 7,7 3,29 ± 0,33 143,40 ± 5,46
Vidutinis pieno primilžis tirtoje populiacijoje buvo 4356 kg, riebalų 4,20%, baltymų 3,29%.
Daugiafaktorinės analizės būdu buvo įvertinta genetinių faktorių – prolaktino genotipo, veislės ir laktacijos įtaka pieno produkcinėm savybėms t.y. pieno kiekiui, riebalams ir baltymams.
7 lentelė. Prolaktino geno polimorfizmo įtaka pieno produkcinėms savybėms
Lietuvos pieninių galvijų populiacijoje
Genetiniai veiksniai Klasių skaičius Pienas kg Riebalai % Riebalai kg Baltymai % Baltymai kg Prolaktinas 3 4,98% ** 12,12% *** 5,26% ** 6,49% *** 6,77% *** Veislė 2 14,00% *** 3,15% 8,22% *** 9,54% *** 8,86% *** Laktacija 11 13% ** 5,58% 14,67% ** 3,58% 17,80% *** *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001
Prolaktino genotipas statistiškai reikšmingai įtakojo visas pieno produkcines savybes. Jis įtakojo 4,98% (p<0,01) pieno kiekio genetinės įvairovės, 12,12% (p<0,001) pieno riebumo genetinės įvairovės, 5,26% (p<0,01) pieno riebalų kiekio, 6,49% (p<0,001) baltymingumo ir 6,77% (p<0,001) baltymų kiekio genetinės įvairovės.
Lietuvos pieninių galvijų populiacijoje buvo analizuota prolaktino geno 3 genotipų įtaka pieno kiekiui, riebalų ir baltymų kiekiui bei procentui. 8 lentelėje pateikti 41 karvės 167 laktacijų pieno kiekio ir sudėtinių dalių vidurkiai pagal prolaktino geno genotipus.
8 lentelė. Karvių pieno produkcijos savybių nuokrypiai su skirtingais prolaktino
geno genotipais Prolaktino geno genotipai n Pienas kg Riebalai % Riebalai kg Baltymai % Baltymai kg AA 101 4431 ± 154 4,41 ± 0,07 189,20 ± 7,28 3,38 ± 0,34 145,85 ± 4,91 AB 56 4113 ± 175 4,01 ± 0,08 173,74 ± 8,15 3,27 ± 0,04 136,14 ± 6,03 BB 10 3111 ± 368 3,66 ± 0,14 124,4 ± 16,7 3,06 ± 0,06 94,8 ± 10,6
9 lentelė. Pieno kiekio nuokrypiai su skirtingais PRL genotipais
Genotipas AA AB BB
AA 0 -265 -1348**
AB -265 0 -1083*
BB -1348** -1083* 0
*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001
Buvo nustatyti reikšmingi skirtumai tarp karvių su skirtingais PRL genotipais (p<0.01). Karvės turinčios AA ir AB aleles pasižymėjo didesniu pieno kiekiu: (+1348 kg ir +1083 kg atitinkamai) negu BB individai. Chung ir kt. (1996) teigė, kad karvės su PRL genotipo AA alele davė didesnę pieno produkciją negu BB individai. Tokius pat rezultatus gavo ir lenkų mokslininkai (Dybus A. 2002), kai karvės su AA genotipu davė 768 kg daugiau pieno nei BB genotipu (p<0.01).
10 lentelė. Pieno riebalų % nuokrypiai su skirtingais PRL genotipais Genotipas AA AB BB AA 0 -0,38** -0,76** AB -0,38** 0 -0,38** BB -0,76** -0,38** 0 *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001
Karvės turinčios AA genotipą davė 0,76% riebesnį pieną nei BB genotipo (p<0,01), o turinčios AB genotipą 0,38% nei BB. Chung ir kt. teigė, kad karvės turinčios AA aleles davė pieno riebalų procentą didesnį, negu BB karvės(Chung ir kt., 1996).
11. lentelė. Pieno riebalų kiekio nuokrypiai su skirtingais PRL genotipais
Genotipas AA AB BB
AA 0 -11,92 -67,21**
AB -11,92 0 -55,29*
BB -67,21** -55,29* 0
*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001
Karvės turinčios AA ir AB aleles pasižymėjo didesniu pieno riebalų kiekiu +67,21 kg (p<0,01) ir +55,29 kg (p<0,05) negu BB individai.
12 lentelė. Pieno baltymingumo % nuokrypiai su skirtingais PRL genotipais
Genotipas AA AB BB
AA 0 -0,16* -0,31**
AB -0,16* 0 -0,15 BB -0,31** -0,15 0 *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001
Karvės, turinčios AA genotipą pasižymėjo didesniu pieno baltymingumu +0,31%, (p<0,01) nei karvės turinčios BB genotipą, karvių su AB genotipu pieno baltymingumas procentais viršijo BB genotipo karvių pieno baltymingumą +0,16% (p<0,05).
13 lentelė. Pieno baltymų kiekio nuokrypiai su skirtingais PRL genotipais
Genotipas AA AB BB
AA 0 -7,36 -52,80***
AB -7,36 0 -45,43**
BB -52,80*** -45,43** 0
*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001
Karvės turinčios AA ir AB genotipus, pasižymėjo didesniu pieno baltymų kiekiu +52,8 kg (p<0,01) +45,43 kg ((p<0,01) negu BB individai.
Galvijų veislių charakterizavimas pagal prolaktino geno įvairovę gali būti panaudotas, kuriant selekcines programas, sudarant kryžminimo schemas, identifikuojant gyvulius, bioįvairovės ir filogenetinės analizės tikslais.
Prolaktino geno polimorfizmo identifikavimas gali būti ekonomiškai svarbus kriterijus formuojant pieninias bandas, ir gali būti ateityje naudojamas kaip papildomas selekcijos kriterijus pieno kiekiui, sudėčiai ir technologinėms savybėms galvijų selekcijos programose įvertinti.
Genetinių žymeklių panaudojimas žemės ūkio gyvulių selekcijoje atveria galimybes įvertinti gyvulį iš vidaus ir pilnai panaudoti jame slypinčias naudingas ūkines savybes. Genetiniai žymekliai gali būti naudojami tiek vieno geno, tiek genų grupės lemiamo požymio ar požymių grupės identifikavimui. Dar vienas genetinių žymeklių panaudojimo selekcijoje privalumas yra tas, kad šis gyvulių vertinimo būdas yra patikimas, nereikalaujantis didelių ekonominių bei, svarbiausia, laiko sąnaudų, leidžia jauname amžiuje išaiškinti genus, kontroliuojančius selekcinę ir technologinę auginamų gyvulių vertę, įvertinti žemės ūkio gyvulių genetinį kintamumą ir genetinių defektų paplitimą bei suteikia galimybę laiku išvengti nepageidaujamų požymių pasireiškimo. Genetinių žymeklių panaudojimas selekcijoje gali labai paspartinti selekcijos procesą, pagerinti žemės ūkio produkcijos kokybę, sumažinti jos gamybos savikainą bei padaryti produkciją konkurentabilę užsienio rinkose.
4.
IŠVADOS
• Pirmą kartą prolaktino geno polimorfizmas buvo tirtas Lietuvos pieninių galvijų veislėse.
• Visose keturiose tirtose veislėse (LJ, LŽ, LB, LŠ) didžiausiu dažniu (0,62 – 0,94) buvo rastas AA genotipas bei A alelis (0,77 – 0,97).
• Rastas prolaktino geno lokuso mažesnis heterozigotiškumas nei prognozuojamas, rodo viduveislinį genetinės įvairovės sumažėjimą vykstant atrankai pageidaujamo homozigotinio genotipo atžvilgiu.
• Rasta prolaktino geno AA genotipo reikšminga įtaka pieno produkcinėms savybėms sudaro selekcijos galimybes šio genotipo atžvilgiu Lietuvos pieninių galvijų populiacijoje.
PADĖKA
Dėkoju vadovei doc. dr. Ilonai Miceikienei taip pat doktorantei Linai Baltrėnaitei už pagalbą įsisavinant genetikos laboratorijoje molekulinės genetikos metodus bei atliekant tyrimus, Sigitai už pagalbą atliekant statistinę duomenų analizę, Laurynui bei reprodukcijos laboratorijos darbuotojams už pagalbą imant mėginius tyrimams bei visiems geranoriškai padėjusiems, kad šis kūrinys išvystų pasaulį.
5. SUMMARY Master Laura Riaubaitė
Topic of Master thesis Investigations of cattle prolactin gene polymorphism in Lithuanian
dairy cattle
Master‘s work
Tutor of M. Sc. thesis Assoc. prof. Ilona Miceikiene
Lithuanian Veterinary Academy, Department of Animal Breeding and Genetics, K. Janušauskas Laboratory of Animal Genetics.
Master‘s work accomplished in the year 2003 – 2004, volume of Master work 51 paginal, 13 tables and 8 pictures.
Summary. Object of work. 1. Investigation of prolactin gene polymorphism and distribution
of different alleles at Lithuanian cattle breeds (Lithuanian Red, Lithuanian Light Grey, Lithuanian White Backed, Lithuanian Black and White). 2 Investigation of prolactin (PRL) gene influence to milk production.
Tasks of work. 1. Introduce cattle prolactin gene research methodology at K. Janušauskas
Laboratory of Animal Genetics, LVA. 2. Investigate prolactin gene polymorphism at LR, LBW, LWB, LLG cattle breeds by molecular PCR-RFLP method. 3. Determine frequency of prolactin gene alleles and genotypes at LR, LBW, LWB, LLG cattle breeds. 4. Compose data base for dairy production of investigative cattle population. 5. Investigate influence of prolactin gene to milk yield, fat and proteins.
Research methodology. 1. DNA extraction from: blood and hair roots. 2. PCR to amplify
PRL gene. 3. RFLP method-PRL – enzyme RsaI. 3. Electrophoresis in agarose gel. 4. Staining with Etidium bromide. 5. Genotyping.
Results. The following DNA restriction fragments were obtained for the PRL-RsaI
polymorphism: 82 and 74 bp for the BB genotype, 156, 82 and 74 bp for the AB and 156 bp for the AA genotype. The AA genotype was found most frequent in all breeds (0.06 – 0.94), followed by the AB (0.06 – 0.37). The least frequent was the BB genotype (0.00 – 0.08). Prolactin gene A allele was found most frequent (0.97) at Lithuanian Light Grey, the least frequent (0.77) - at Lithuanian red cattle breed.
Conclusions. First-time prolactin gene was investigated at Lithuanian cattle breeds. At the
LR, LBW, LWB, LLG higher frequency (0.62 – 0.94) was found AA genotype and A allele (0.77 – 0.97). Prolactin gene AA genotype has significant effect on all milk production traits.
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1 Aschaffenburg, R. and Thymann, M.1965. Simultaneous phenotyping procedure for the principal proteins of cow’s milk. J.Dairy Sci. 48: 1524-1526.
2 Baltrėnaitė L. Pieno baltymų polimorfizmas: Genetinių variantų aptikimas ir išplitimas Lietuvos galvijų veislėse, Magistrantūros baigiamasis darbas 2003.
3 Baker, C.M.A. and Manwell, C. 1980. Chemical classification of cattle. . Anim. Blood Groups Biochem. Genet. 11: 127-150.
4 Bell K., Hopper K.E., McKenzie H.A. - Bovine a-Lactalbumin C and as1-, β- and k- Caseins of Bali (Banteng) Cattle, Bos (Bibos) javanicus. "Australian Journal Biological Sciences", 1981. 34, 149-159.
5 Bell K. One-dimensional starch-gel electrophoresis of bovine skim-milk. "Nature", 1962. 195, 705-706.
6 Bendikas P., Gaidžiūnienė N., Jeninas E. Gyvulininkystės pagrindai. V. Presvika 1998 m.
7 Bettini T.M., Masina P. Proteine e polimorfismo proteico del latte vaccino. "ProduzioneAnimale", 1972. 11, 107-126.
8 Bianchini F., Crimella C., Rognoni G., Carenzi C. Distribuzione delle varianti genetiche di caseina del latte nella popolazione bovina Frisona delle provincie di Milano, Cremona e Mantova. "Proceedings Societa Italiana delle Scienze Veterinarie", 1973. 27, 526-535.
9 Boichard D., Bishop M.D. Detection of QTLs influencing milk production and mastitis resistance with a granddaughter design in Holstein cattle, 1997.
10 Bovenhuis H., van Harendonk J.A.M. Estimation of milk protein gene frequencies in cngssbred cattle by maximum likelihood. "Journal of Dairy Science", 1991. 74, 2728-2736.
11 Caroli A., Bolla P., Budelli E., Barbieri G., Leone P. Effect of k-casein E allele on clotfing aptitude of Italian Friesian milk. "Zootecnica e Nutrizione Animale", 2000. in preparation.
12 Chianese L., Di Luccia A., Mauriello R., Ferrara L, Zehender G., Addeo F. Polimorfismo biochimico delle proteine del latte in bovine di razza Podolica. "Zootecnica e Nutrizione Animale", 1988. 14, 189-197.
13 Chrenek P., Vasicek D., Bauerova M., Bulla J., 1998 – Simultaneous analysis of bovine growth hormone and prolactin alleles by multiplex PCR and RFLP. Czech
Journal of A Chung E.R., Rhim T.J., Han S.K., 1996 – Associatios between PCR-RFLP markers of growth hormone and prolactin genes and production traits in dairy cattle. Korean Journal of Animal Science 38, 321-336.nimal Science 43, 53-55.
14 Chung E.R., Rhim T.J., Han S.K., 1996 – Associatios between PCR-RFLP markers of growth hormone and prolactin genes and production traits in dairy cattle. Korean Journal of Animal Science 38, 321-336.
15 Collier, R.J., McNamara, J.P., Wallace, C.R. and Dehoff, M.H. 1984. A review on endocrine regulation of metabolism during lactation. J. Anim. Sci. 59: 495-510.
16 Coppieters, W., J. Riquet, J.-J. Arranz, P. Berzi, N. Cambisano, B. Grisart, L. Karim, F. Marcq, I. Moreau, C. Nezer, P. Simon, P. Vanmanshoven, D. Wagenaar, and M. Georges. 1998. A QTL with major effect on milk yield and composition maps to bovine Chromosome 14. Mammal. Genome 9:540–544.
17 Corradini C. Distribution of the genetic variants of as1-, β- and k-casein in milk from Jersey cows in the Netherlands. "Netherlands Milk Dairy Journal", 1969. 23, 79-82. 18 Davoli R., Dall'Olio S., Mile J., Russo V. Diffusione dell'allele G di as1-caseina in
razze bovine allevate in Italia. "Proceedings Societa Italiana delle Scienze Veterinarie", Silvi Marina (TE), Italy, 1998. 52, 493-494.
19 Di Stasio L. Indagine genetica sulle razze bovine Modicana e Cinisara mediante I'analisi dei sistemi proteici del latte. "Rivista di Zootecnia e Veterinaria", 1983. 11 (1), 70-74.
20 Di Stasio L., Merlin P. Polimorfismi biochimici del latte nella razza bovina Grigio Alpina. "Rivista di Zootecnia e Veterinaria", 1979. 7(2), 64-67.
21 Dybus A. 2002. Associations of growth hormone (GH) and prolactin (PRL) genes polymorphisms with milk production traits in Polish-and-White cattle.
22 Dybus A., Kmiec M. 2002. Polymorphism of the growth hormone gene in Limousine cattle. Czech J. Anim. Sci. 47 (2).
23 Erhardt G. Allete frequencies of milk proteins in German cattle breeds and demonstration of as2-casein variants by isoelectric focusing. "Archiv fur Tierzucht, Dummerstorf", 1993. 36, 145-152.
24 Erhardt G. k-Kaseine in Rindermilch - Nachweis eines weiteren Allels (k-CnE) in verschiedenen Rassen. "Journal of Animal Breeding and Genetics", 1989. 106, 225-231.
26 Flisikowski K., Zwierzchowski L. 2003. Polymerase chain reaction-heteroduplex (PCR-HD) polymorphism within the bovine STAT5A gene.
27 Grisart, B., W. Coppieters, F. Farnir, L. Karim, C. Ford, P. Berzi, N. Cambisano, M. Mni, S. Reid, P. Simon, R. Spelman, M. Georges, and R. Snell. 2002. Positional candidate cloning of a QTL in dairy cattle: Identification of a missense mutation in the bovine DGAT1 gene with major effect on milk yield and composition. Genome Res. 12:222–231.
28 Grosclaude F., Pujolle J., Gamier J., Ribadeau-Dumas B. Mise en evidence de deux variants supplementaires des proteines du lait de vache: as1-CnD et LgD. "Annales de Biologie Animale, Biochimie et Biophysique", 1966. 6, 215-222.
29 Grosclaude F., Mahe M.F., Mercier J.C., Bonnemaire J., Teissier J.H. Polymorphisme des lactoproteines de Bovines Nepalais. II. Polymorphisme des caseines "as-mineures"; le locus as2-Cn est-il lie aux loci as1-Cn, β-Cn et k-Cn? "Annales de Genetique et de Selection Animale", 1976. 8,481-491.
30 Grosclaude F., Joudrier P., Mahe M.F. Polymorphisme de la caseine as2 bovine: etroite liason du locus as2-Cn avec les loci as1-Cn, β-Cn et k-Cn; mise en evidence d'une deletion dans le variant as2-CnD. "Annales de Genetique et de Selection Animale", 1978. 10, 313-327.
31 Grosclaude P., Mahe M.F., Accolas J.P. Note sur le polymorphisme genetique des lactoproteines de bovins et de yaks Mongols. "Annales de Genetique et de Selection Animale", 1982. 14, 545-550.
32 Hill J.P., Thresher W.C., Boland M.J., Creamer L.K., Anema S.G., Manderson G., Otter D.E., Paterson G.R., Lowe R., Burr R.G., Motion R.L., Winkelman A., Wickham B. The polymorphism of the milk protein β-lactoglobulin. A review. In "Milk Composition, Production and Biotechnology", Eds. Welch R.A.S. et al., CAB International, Wallingford, UK, 1997. 173-213.
33 lkonen T., Ruottinen 0., Erhardt G., Ojala M. Allele frequencies of the major milk proteins in the Finnish Ayrshire and detection of a new k-casein variant. "Animal Genetics", 1996. 27, 179-181.
34 Krause I., Buchberger J., WeiB G., Klostermeyer H. Screening methods for genetic variants of milk proteins. In "Milk Proteins: nutritional, clinical, functional and technological aspects", / Eds. C.A. Barth and E. Schlimme, Steinkopff Verlag Darmstadt, Germany, 1988. 171-173.
35 Kopenčy M., Nebola M., Dvorak J. (2004) Growth hormone and prolactin genes in gene reserves in Czech republic and Poland.
36 Larsen B., Thymann M. Studies on milk protein polymorphism in Danish cattle and the bovine. Sequence complete. "European Journal of Biochemistry", 1986. 23, 41-51. 37 Leone P., Scaltriti V., Sangalli S., Caroli A., Pagnacco G. Polimorfismo della k-
caseina nei bovini: identificazione dell'allele E in torelli di razza Bruna e Frisona Italiana. "Proceedings IVth National Congress Biodiversity, Alghero, Italy, 8-11 September". 1998.
38 Lewin H.A., Schmitt, K., Hubert, R., van Eijk, M.J.T. and Arnheim, N. (1992). Close linkage between bovine prolactin and BoLA-DRB3 genes: genetic mapping in cattle by single sperm typing. Genomics 13: 44-48.
39 Lien S., Alestrom P., Klungland H., Rogne S. Detection of β-CN allele by amplification created restiction sitis. Animal Genetics, 23, 1992.
40 Lozovaya G.S. Genetic variation in haemoglobin, transferrin and β-lactoglobulin types in yaks from the Pamirs. "Tsitologiya i Genetika", 1973. 7(2), 158-160.
41 Looft, C., N. Reinsch, C. Karall-Albrecht, S. Paul, M. Brink, H. Thomsen, G. Brockmann, C. Kuhn, M. Schwerin, and E. Kalm. 2001. A mammary gland EST showing linkage disequilibrium to a milk production QTL on bovine Chromosome 14. Mammal. Genome 12:646–650.
42 Lunden A., Nilsson M., Janson L. Marked effect of β-lactoglobulin polymorphism on the ratio of casein to total protein in milk. "Journal of Dairy Science", 1997. 80, 2996-3005.
43 Malevičiūtė J., Baltrėnaitė L., Pečiulienė N., Miceikienė I. Genetinių žymeklių panaudojimas gyvulių selekcijoje, 2003.
44 Mariani P. II polimorfismo genetico delle caseine in vacche di razza Bruna: frequenza della variante C al locus k-Cn. "Annali Facolta di Medicina Veterinaria, Universita di Parma", 1987. 7, 317- 332.
45 Marletta D., Rando A., Senese C., Mariani P., D'Urso G. Identificazione dell'allele quantitative as1-Cn G in bovini di razza Modicana. "Proceedings Societa Italiana delle Scienze Veterinarie", Perugia, Italy, 1996. 50, 461-462.
46 Mariani P., Russo V. Distribuzione delle varianti genetiche delle caseine e della beta- lattoglobulina nelle vacche di razza Reggiana. "Rivista di Zootecnia", 1971. 44, 310-321.
