KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS

KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TOMAS DREVINSKAS

KAPILIARINĖS ELEKTROFOREZĖS METODO

5-AMINOLEVULINO RŪGŠČIAI ŽMOGAUS ODOJE NUSTATYTI

VYSTYMAS, ĮTEISINIMAS IR PRAKTINIS PRITAIKYMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovai

Prof. Vitalis Briedis

Prof. Audrius Maruška

KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas

Vitalis Briedis

2010 05 12

KAPILIARINĖS ELEKTROFOREZĖS METODO

5-AMINOLEVULINO RŪGŠČIAI ŽMOGAUS ODOJE NUSTATYTI

VYSTYMAS, ĮTEISINIMAS IR PRAKTINIS PRITAIKYMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovai

Vitalis Briedis

2010 05 12

Audrius Maruška

2010 05 12

Darbą atliko

Magistrantas

Tomas Drevinskas

2010 05 12

KAUNAS, 2010

TURINYS

ĮVADAS ... 9

DARBO TIKSLAS ... 10

DARBO UŽDAVINIAI ... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1.5-AMINOLEVULINO RŪGŠTIES NAUDOJIMO FOTODINAMINĖJE PRAKTIKOJE TENDENCIJOS ... 10

1.2.HEMO SINTEZĖ ... 13

1.3.HEMO BIOSINTEZĖS REGULIAVIMAS ... 14

1.4.PROTOPORFIRINO IX PASISKIRSTYMAS IR TOKSIŠKUMAS ... 15

1.5.DEGRADACIJOS MECHANIZMAS ... 16

1.6.STABILUMAS... 17

1.7.SKVARBA Į ODĄ ... 18

1.8.DIFUZIJA... 20

1.9.KAPILIARINĖ ELEKTROFOREZĖ ... 22

1.10.KAPILIARINĖS ELEKTROFOREZĖS VEIKIMO PRINCIPAS ... 24

1.11.KAPILIARINĖ ELEKTROFOREZĖ TYRIMUOSE SU ODA ... 27

1.12.5-AMINOLEVULINO RŪGŠTIES TYRIMO METODAI ... 28

1.13.5-AMINOLEVULINO RŪGŠTIES NUSTATYMAS KAPILIARINĖS ELEKTROFOREZĖS METODU ... 28

2. EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 29

2.1.MEDŽIAGOS ... 29

2.2.APARATŪRA IR PROGRAMINĖ ĮRANGA ... 29

2.3.BANDINIŲ RUOŠIMAS ... 29

2.3.1. Bandinių ruošimas kalibracinei kreivei ... 29

2.3.2. Epidermio ir dermos atskyrimas karščio metodu ... 30

2.3.3. Bandinių ruošimas priedo metodui, išgavai nustatyti ... 30

2.3.4. Ekstrakcijos procedūra... 30

2.3.5. Ekstraktų paruošimas analizei ... 30

2.4.ANALIZĖS SĄLYGOS ... 31

2.6.METODO VYSTYMAS IR ĮTEISINIMAS ... 31

2.6.1. Atrankumas ... 32

2.6.2. Tikslumas ... 36

2.6.3. Glaudumas ... 37

2.6.5. Kiekybinio nustatymo ir radimo ribos ... 38

2.6.6. Išgava ... 39

2.6.7. Išgavos optimizavimas ... 39

2.6.8. Metodo tvirtumas ... 40

2.6.9. Išvystyto metodo aptarimas ... 40

2.7.IŠVYSTYTO METODO PRITAIKYMAS ... 42

2.7.1. Odos paruošimas eksperimentui ... 42

2.7.2. Farmacinių formų ruošimas ... 43

2.7.3. 5-aminolevulino rūgšties skvarba į odą ... 44

2.7.4. Rezultatai ... 44

2.7.5. 5-aminolevulino rūgšties skvarbos į odą aptarimas ... 45

SANTRAUKA

T. Drevinskas. Kapiliarinės elektroforezės metodo 5-aminolevulino rūgščiai žmogaus odoje nustatyti vystymas, įteisinimas ir praktinis pritaikymas, magistro baigiamasis darbas/ moksliniai vadovai prof. Vitalis Briedis ir prof. Audrius Maruška; Kauno medicinos universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra. – Kaunas, 2010, 55 – p.

5-aminolevulino rūgštis (ALA) – provaistas naudojamas fotodinaminėje (FDT) terapijoje, protoporfirino IX prekursorius hemo biosintezės kelyje. Manoma, kad FDT vienas iš selektyviausių odos vėžio gydymo metodų. Nors ALA naudojimas FDT yra daug žadantis tiek terapiniu tiek komerciniais požiūriais, gydytojai vis dar sunkiai priimą šį gydymo metodą. Perkutaninės vaistinės formos dažnai kritikuojamos dėl nepakankamos skvarbos per raginį sluoksnį į odą ir dėl nepakankamo stabilumo. Skvarbai pagerinti yra kelios priemonės: skvarbos stiprikliai (dimetilsulfoksidas (DMSO), oleino rūgštis (OR) ir kt.), ALA derivatizacija į esterius, raginio sluoksnio pašalinimas ir kt. Dideli kiekiai DMSO, ar OR žymiai pagerina skvarbą, tačiau oda gali būti negrįžtamai pažeista. ALA esterių naudojimas vienas iš sėkmingesnių būdų įvesti ALA į odą, tačiau irgi nevisada sėkmingas. Kai kurios ligos pasireiškia jau su pažeistu raginiu sluoksniu (pvz. aktininė keratozė), šiuo atvejų gerai skvarbai užtikrinti nebūtina atlikti jokių papildomų farmacinės formos ruošimo, ar terapinių procedūrų. Viena iš buvusių opiausių ALA farmacinių formų problemų – stabilumas tiek farmacinių formų saugojimo metu, tiek atliekant ekstrakciją biocheminių tyrimų metų. Daugumos autorių nuomone ALA stabilumas užtikrinamas sumažinant pH bent iki 5. Tačiau per daug sumažinus galima sukelti odos paraudimus, ar net pažeidimus, be to mažas pH slopina PpIX biosintezę. Pastaruoju metu yra nemažai atliktų tyrimų prasiskverbusiam ALA kiekiui nustatyti. Dauguma tyrėjų pritaiko ESCh metodą, kartu ir bendrines derivatizacijos reakcijas aminorūgščių nustatymui. Be to yra pritaikytas skysčių scintiliacijos metodas, tačiau šis nustatymo būdas reikalauja radioaktyviais atomais žymėtos ALA. Iš tiesioginių ALA nustatymo metodų gali būti pritaikyta jonų porų ir jonų mainų chromatografija bei kapiliarinė elektroforezė (KE). KE pasižymi pigumu, greitu analizės atlikimo laiku, mažu bandinio ir darbinio buferio turiu. Išvystytas metodas pagal ICH gaires selektyviai atskiria matricos ir ALA smailes. Matematiniai bei statistiniai skaičiavimai patvirtina išvystyto metodo tinkamumą bei atitikimą standartams. ALA skvarbos į odą tyrime nustatytos koncentracijos dermoje: po 4 val – 14,7 µg/cm3 (±40,1%), po 8 val – 34,1 µg/cm3 (±23,6%), po 12 val – 51,7 µg/cm3 (±28,6%). Atlikus lipidų ekstrakciją iš raginio sluoksnio acetonu, žymiai pagerėjo ALA skvarba į odą. Pritaikius lipidų ekstrakcijos procedūrą, dermoje nustatytos koncentracijos: po 4 val – 60,4 µg/cm3 (±19,3%); po 8 val – 96,7 µg/cm3 (±12,0%); po12 val – 137,2 µg/cm3 (±3,2%).

SUMMARY

T. Drevinskas. Optimization, validation and practical uses of a capillary electrophoresis method for determination of 5-aminolevulinic acid in human skin, master thesis/ supervisors prof. Vitalis Briedis and prof. Audrius Maruška; Kaunas University of Medicine, Faculty of Pharmacy; Department of Drug Technology and Social Pharmacy. – Kaunas, 2010, 55 – p.

5-amineluvulinic acid (ALA) is a prodrug that is used in pfotodynamic therapy (PDT). It is a precursor of protoporphyrin IX (PpIX) in heme biosynthesis pathway. It is known, that FDT is promising treatment method according to both commercial and therapeutical aspects. Topical pharmaceutical forms are being criticised due to insufficient penetration to skin and ALA instability. Penetration enhancers such as dimethylsulfoxide (DMSO) or oleic acid (OA) could be used in order to improve penetration to skin. ALA derivatization to obtain more lipopfilic esters and stratum corneum disruption procedures could also be used for penetration improvement. Some skin lessions provide disrupted SC barrier (actinic keratosis). In this case, ALA penetration to skin is often sufficient to obtain therapeutical effect. Various authors state that ALA to be stable at pH 5 or lower, but too low pH can result in skin erythema, or more seriuos damage, moreover low pH inhibits PpIX biosynthesis. Nowadays there are numerous articles about ALA in skin penetration studies. Mostly, the HPLC method method might be epmloyed with a requirement of common derivatization reactions for amino acid determination. Liquid scintillation may also be employed in penetration studies, but it is quite expensive and require radioactive substances for quantitative determination. There are only few methods available for direct analysis. Ion pairing, ion exchange chromathography and capillary electrophoresis (CE) may be used for these purposes. CE offers cheap, rapid, low running buffer and sample volumes requiring method, suitable for microanalysis. High selectivity is provided by CE method, which has been validated according to ICH guidelines. Mathematical and statistical calculations ensures analytical procedure‘s suitability for ALA penetration studies.After applying cream, determined concentrations in derma were: after 4 h – 14,7 µg/cm3 (±40,1%), after 8 h – 34,1 µg/cm3 _{(±23,6%), after 12 h – 51,7 µg/cm}3 _{(±28,6%). After lipid extraction from SC employment,} penetration dramatically increased. Determined concentrations in derma were: after 4 h – 60,4 µg/cm3 (±19,3%); 8 h – 96,7 µg/cm3 _{(±12,0%); 12 h – 137,2 µg/cm}3 _(±3,2%).

SANTRUMPOS

ep

 - dviejų šalia esančių analičių

elektroforezinių judrių vidurkis



∆μep – dviejų šalia esančių analičių elektroforezinių judrių skirtumas µEOS – elektroosmozinis judris µep – Elektroforezinis judris ACN – Acetonitrilas

ALA – 5-aminolevulino rūgštis

ALAD – Aminolevulinat dehidrogenazė ALAS – Aminolevulinat sintazė

COPRO III – Coproporfobilinogenas III D – analitės difuzijos keoficientas DAD – Diodų matricos detektorius

DHPY – 2,5-dikarboksietil-3,6-dihidropirazinas DL – Radimo riba

DMSO – Dimetilsulfoksidas E – Elektros lauko stipris EOS – Elektroosmozinis srautas

ESCh – Efektyvioji skysčių chromatografija FD – Fluorescencinė diagnozė

FDT – Fotodinaminė terapija Fe – Geležis

GAE – Geležiai atsakantis elementas GRF – Geležį reguliuojantis faktorius KE – Kapiliarinė elektroforezė L – bendras kapiliaro ilgis

l – efektyvus kapiliaro ilgis MeOH – Metanolis

mRNR – Informacinė ribonukleorūgštis n – Matavimų skaičius

N - teorinių lėkštelių skaičius NDS – Natrio dodecilsulfatas OR – Oleino rūgštis

P.I. – Pasikliautinieji intervalai PBG – Porfobilinogenas

PBGD – Porfobilinogen deaminazė PY – 2,5-dikarboksietilpiraziną PpIX – Protoporfirinas IX

PROTO III – Protoporfirinigenas III q – Analitės krūvis

QL – Kiekybinio nustatymo riba r – Stokso spindulys

S – Kalibracinės kreivės pasvirimo kampa SSN – Santykinis standartinis nuokrypis t – analitės migracijos laikas

TfR – Transferino receptorius tR – migracijos laikas

URO III – Uroporfobilinogenas III V – įtampa

vep – Elektroforezinis greitis

wh – smailės plotis pusėje jos aukščio ε – dielektrinė konstanta

ξw – kapiliaro sienelės dzeta potencialas σ – Vidutinis standartinis triukšmų nuokrypis

SĄVOKOS

Akceptorinė fazė – Tirpalas, kuris imituoja kraują skvarbos tyrimuose Atrankumas – Veiksnys, kuris apibūdina smailių atsiskyrimą tarpusavyje

Glaudumas – Veiksnys, kuris nurodo kaip keli matavimai yra išsibarstę tarpusavyje Išgava – Veiksnys, kuris parodo kiek pavyko išekstrahuoti tam tikros medžiagos Optimizacija – Procedūra, kurios metu pasiekiami geriausi rezultatai

Skvarba – Tam tikros medžiagos geba skverbtis per tam tikrą barjerą ar membraną

Tikslumas – Veiksnys, kuris parodo kiek tam tikras matavimas yra nutolęs nuo tikrosios vertės dydžio Tvirtumas – Veiksnys, kuris parodo, ar metodas yra tinkamas esant pakitusioms sąlygoms

ĮVADAS

5-aminolevulino rūgštis (ALA) – provaistas naudojamas fotodinaminėje terapijoje. Ši medžiaga yra protoporfirino IX prekursorius hemo biosintezėje ir naudojama terapijoje daugiau nei dvidešimt metų įvairioms odos ligoms, tokioms kaip: pamatinių ląstelių karcinomai [1], aktininei keratozei [2], Bowen‘o ligai [3], vulvos intraepitelinei neoplazijai [4,5], vulvos Paget‘o ligai [6], vulvos žvyninių ląstelių karcinomai [7] ir kitoms ligoms gydyti.

Skvarbos į odą tyrimai reikalauja tinkamos metodikos veikliajai medžiagai nustatyti. Dažniausiai tai yra sunku padaryti dėl biologiniuose ekstraktuose esančių pašalinių medžiagų. Yra metodų ALA nustatymui odos mėginiuose, tokių kaip efektyvioji skysčių chromatografija (ESCh), kuris reikalauja bendrųjų derivatizacijos reakcijų aminorūgščių nustatymui. Taip pat prasiskverbęs ALA kiekis į odą gali būti nustatytas pasitelkiant skysčių scintiliaciją ir autoradiografinę analizę aprašytą Woolfson et al. [8]. Šiame metode naudojamos beta dalelės, kurios yra radioaktyvios, o jonizuojančios spinduliuotės tokio tipo farmaciniuose preparatuose natūraliai nebūna. Tiktais keli metodai tiesioginiam ALA nustatymui yra aprašyti. Atvirkčių fazių chromatografijoje nederivatizuotos ALA sulaikymas yra nepakankamas dėl didelio poliškumo, todėl įmanoma ALA nustatyti jonų mainų chromatografijos [9,10], ar jonų porų chromatografijos pagalba [11].

Kapiliarinė elektroforezė (KE) yra parankus metodas dalelėms, turinčioms krūvį nustatyti. Jos panaudojimas ALA ir porfobilinogeno vienalaikiam nustatymui yra aprašytas Luo et al. [12]. KE metodą ALA ir jos skilimo produktų vienalaikiam kiekybiniam nustatymui aprašė Bunke et al., 2000 [13]. Lyginant KE ir ESCh, KE pasižymi gera skiriamaja geba, aukštu efektyvumu, trumpu analizės laiku, kas būtina rutininei analizei, mažu tyrinių ir darbinio buferio tūrio poreikiu, pigiu kapiliaru, žymiai mažesniu bandinio paruošimo žingsnių skaičiumi. KE metodą su vaistu susijusioms priemaišoms nustatyti aprašė Altria, 1996 [14]. Šiuo metu yra labai nedaug tyrimų atliktų su biologiniais bandiniais, kuriuose būtų pritaikyta KE. Straipsnių su KE pritaikymu odos ekstraktams tirti yra vos keli, o ALA nustatymo odoje KE metodu dar kolkas niekas neaprašė.

Taip pat didelis dėmesys turėtų būti atkreiptas į ALA ekstrakcijos iš odos procedūrą. Keli metodai ALA ekstrakcijai iš skirtingų matricų jau yra aprašyti. Ekstrakcija iš bevandenių gelių jau aprašė McCarron et. al. 2005 [15]. Ekstrakcijos procedūra iš odos naudojant metanolį (Pierre et. al. [16]) taip pat yra aprašyta. Taip pat svarbu atsižvelgti į ALA stabilumą, kadangi šarminėje terpėje ši medžiaga dimerizuojasi. Anksčiau tyrėjai ALA suskilimą nustatydavo pagal spalvos pokyčius (Chang et al., [17]) ir absorbcijos spektrą (Novo et al., [18]). ALA stabilumas rūgščiuose ir vandeniniuose tirpaluose buvo aprašytas Elfsson et. al. [11]. Taip pat ALA stabilumą rūgščiuose tirpaluose aprašė Gadmar et al. [19]

Šiuo darbu yra siekiama išvystyti ir įteisinti metodą, kuris galėtų tiesiogiai, greitai ir tiksliai nustatyti ALA kiekį biologiniuose bandiniuose (dermos, epidermio ekstraktai) ir akceptorineje fazėje bei pritaikyti išvystytą metodą praktiškai.

DARBO TIKSLAS

1. Optimizuoti ekstrakcijos iš odos ir kapiliarinės elektroforezės metodus ALA skvarbos į oda ivertinimui naudojant „Cremor Basalis“ pagrindu pagamintą 20% ALA kremą bei ištirti galimybes padidinti skvarbos efektyvumą pritaikant lipidų ekstarkciją acetonu iš odos raginio sluoksnio.

DARBO UŽDAVINIAI

Darbo tikslui pasiekti buvo iškelti šie uždaviniai:

1. Optimizuoti kapiliarinės elektroforezės metodą bei atlikti pagrindinius analitinio metodo įteisinimo žingsnius;

2. Optimizuoti ALA ekstrakcijos sąlygas iš odos skirtingų sluoksnių bei optimizuoti bandinio ruošimo procedūrą;

3. Atlikti „Cremor Basalis“ pagrindu pagaminto 20% ALA kremo skvarbos į dermą tyrimą ir ištirti galimybes padidinti skvarbą acetonu pašalinus lipidus nuo odos raginio sluoksnio

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. 5-aminolevulino rūgšties naudojimo fotodinaminėje praktikoje tendencijos

Po to kai Kelly et al. [20] pademonstravo išoriškai užnešto hematoporfirino derivato selektyvų kaupimąsi žmogaus šlapimo pūslės vėžinėse ląstelėse, susidomėjimas fotodinamine terapija (FDT) gerokai išaugo. Šį alternatyvų gydymo metodą sudaro selektyviai vėžinį audinį sensibilizuojanti medžiagą ir tam tikro bangos ilgio bei intensyvumo šviesos šaltinis. FDT veikimo mechanizmas yra aprašytas keliuose šaltiniuose [21,22]. Priklausomai nuo fotosensibilizuojančios medžiagos, šviesa sukelia aktyvaus deguonies išsiskyrimą, kuris suardo įvairias ląstelių struktūras (plazminę membraną,

audinys pašalinamas per keletą fotocheminių, imunologinių, fiziologinių procesų [23]. Priešingai nei jonizuojanti spinduliuotė, FDT gali būti panaudota keletą kartų dėl silpno invazinio poveikio. Be to, šis gydymo medotas yra paprastas, pigus ir efektyvus. Taip pat FDT galima taikyti kartu su chemoterapija, chrurgija ar jonizuojančia spinduliuote.

Terapiniu požiūriu fotosensibilizuojančių medžiagų selektyvus kaupinamasis vėžiniuose audiniuose gali būti pritaikytas ir diagnostiniaims tikslams. Šis metodas dažniausiai vadinamas fluorescencine diagnoze (FD), arba fluorescencine fotodetekcija, kuriame panaudojami jautrūs ryškinimo prietaisai. Klinikinis FD panaudojimas ir svarba yra aprašyta Wagnieres et al. [24]. Nors moksliniu ir terapiniu požiūriais fotosensibilizuojančios medžiagos lenkia kitus gydymo metodus, tik kelioms medžiagomis buvo leista prekiauti kaip vaistais onkologinėje terapijoje. Klinikinėje praktikoje FDT yra apribotas kelių būdingų trūkumų: sumažėjęs selektyvumas, sensibilizacijos laiko pailgėjimas, raudonos šviesos absorbcijos sumažėjimas, problemos gaminant tinkamą farmacinę formą. Tačiau manoma, kad FDT gali turėti didelę tiek terapinę, tiek komercinę reikšmę.

1 pav. Hemo biosintezės kelias žinduoliuose Photochemistry and Photobiology, 2006, 82 995

Kaip alternatyva, yra pasiūlyta sensibilizuojančią medžiagą vartoti provaisto pavidalu. Pasak Albert [25], provaistas yra neaktyvi medžiaga, kuri po suvartojimo metaboliškai paveršiama į aktyvų

junginį. Vieną provaistą, ALA, pasiūlė Kennedy et al. [26], 1992. Jie įrodė, kad pacientams su išorinėmis odos ligomis, po ALA vandeninio tirpalo pavartojimo pastebėtas vietiškas protoporfirino IX (PpIX) kaupimasis pažeistame epiteliniame audinyje. Tiek ALA, tiek PpIX yra medžiagos natūraliai esančios organizme, kurios dalyvauja hemo biosintezėje praktiškai visose aerobinėse žinduolių ląstelėse (1 pav). Pirmasis fermentas – 5-aminolevulinato sintazė (ALAS), katalizuoja glicino ir sukcinil CoA virtimą į vieną molekulę ALA, kurios dvi molekulės asimetriškai kondensuojamos į vieną porfobiolinogeno (PBG) molekulę; šį virsmą atlieka 5-aminolevulinat dehidratazė (ALAD). Toliau keturios PBG molekulės kondensuojamos į tetrapirolo žiedą ir per dekarbokslinimo kaskadą ir kelis tarpinius biosintezės produktus pagaminamas PpIX. Hemą pagamina ferochelatazė įterpdama geležį (A – acetatas; P – propionatas; URO – uroporfirinogenas; COPRO – koproporfirinogenas; PROTO – protoporfirinogenas; PBGD – PBG deaminazė).

PpIX lyginant su hemu, PpIX išskiria apie 56% aktyvaus deguonies [27] ir taip pat pasižymi ryškia fluorescencija. Natūraliai, hemas slopina ALA gamybą per neigiamą grįžtamąjį ryšį, todėl organizmas išvengia savaiminės PpIX fotosensibilizacijos [28,29]. Tačiau išoriškai pavartota ALA aplenkia paminėtą mechanizmą, padidėja PpIX, kuris veikia vėžinėse ląstelėse, biosintezė. Faktoriai, įtakojantys šį reiškinį buvo aprašyti Collaud et al. [29]. Yra nustatyta, kad priklausomai nuo vėžinių ląstelių prigimties ir metabolizmo priklauso PpIX biosintezė.

2 pav. Pubmed paieška su ALA tematika

Pastaruoju metų FDT ALA naudojimą galima vadinti vienu selektyviausių vėžinių susirgimų gydymo metodų. Susidomėjimą FDT atspindi straipsnių šia tematika pagausėjimas (2 pav). Be to ALA sukeltas PpIX biosintezės sunintensyvėjimas pasižymi netik aukštu selektyvumu vėžiniam audiniui, bet ir trumpa odos fotosensibilizacijos trukme (24-48 h) [30]. Nors ir yra nemažai straipsnių apie ALA panaudojimą FDT ir FD [31], kolkas gydytojai nelinkę pripažinti šio gydymo metodo svarbos. Kolkas yra 1999 metais FDA patvirtintas AK gydymas panaudojant ALA. Yra keletas priežasčių dėl kurių nepavyksta įteisinti ALA kaip vaisto platesniu mąstu. Viena iš pagrindinių priežasčių yra dėl tam tikrų fiziko-cheminių savybių. Fiziologinėje terpėje daugiau nei 90% ALA yra „cviterjono“ pavidalu ir turi teigiamą krūvį prie amino grupės ir neigiamą prie karboksirūgšties grupės. Dėl tokios būsenos molekulei yra sudėtinga pasiekti taikinį. Šis trūkumas pasireiškia ganėtinai maža skvarbą ir nepakankamu PpIX biosintezės lygiu. Ši tendencija puikiai pastebima gydant pamatinių ląstelių karcinomas [31,32]. Nepakankamas bioprieinamumas ypač akcentuojamas kai ALA vartojama parenteraliai. ALA greitai eliminuojama iš organizmo su plazma, pusperiodis lygus 50 min, kai švirkščiama į veną ir 45 min, kai pavartojama peroraliai [33]. Mažas pasiskirstymo tūris (8,3 L) nurodo, kad didelė dalis ekskretuojama su šlapimu nepakitus. Tyrimai su šunimis teigia, kad >50% pavartotos dozės yra suskaidoma kepenyse ir maždaug 15% filtruojama per inkstus [34]. Dėl šių priežasčių sistemiškai pavartota ALA sukelia nepakankamą PpIX biosintezę.

Gana nemažai susidomėjimo yra sulaukę lipofiliniai ALA esteriai, nes susintetinamas didesnis PpIX kiekis [35,36]. Padidinant ALA lipofiliškumą pagerėja skvarbą į gilesnius audinius.

1.2. Hemo sintezė

Pirmasis hemo sintezės žingsnis yra ALA pagaminimas (1 pav). Žinduoliuose ir fotosintetinančiose bakterijose ALA sintazė (ALAS) pagaminama ALA iš glicino ir sukcinil-Coa. Stuburiniai turi du ALAS izofermentus: pagrindinis ir esantis visame organizme bei eritrocitams būdingas fermentas. ALAS yra vidinėje mitochondrijos membranos dalyje, matrikse [37], nestipriai sukibęs su membrana [38]. Šis enzimas atlieka pagrindinį hemo sintezės reguliavimo vaidmenį.

Kitas fermentas hemo biosintezės kelyje – ALA dehidratazė (ALAD), kurio yra citozolyje. Šis fermentas atlieka dviejų ALA molekulių kondensaciją į porfobilinogeną (PBG), dvi vandens molekulės yra pašalinamos. Veikiant kitiems dviems fermentams – PBG deaminazei (PBGD) ir uroporfirinogeno III kosintazei [39], sudaroma grandinė iš keturių PBG molekulių susijungusių „galva“ su „uodega“. Gaunamas junginys iš keturiu pirolo žiedų – uroporfirinogenas III (URO III). Abu paminėti fermentai yra citozolyje. Kitą reakciją atlieka fermentas – uroporfirinogeno

dekarboksilazė. Šios reakcijos metų keturios karboksilo grupės yra atimamos iš URO III ir susidaro junginys vadinamas koproporfirinogenu III (COPRO III). Tolesnę reakciją atlieka fermentas - coproporfirinogeno oksidazė (COPRO III oksidazė), kuris yra tarpmembraninėje mitochondrijos dalyje [40,41]. Fermentas dekarboksilina propionines grupes A ir B žieduose ir prijungia vinilo grupes. Paskutinį sintezės žingsnį vykdo protoporfirinogeno oksidazė (PROTO III oksidazė). Reakcijos metu atimami šeši vandenilio atomai, tetrapirolo žiedas oksiduojamas ir gaunamas junginys – PpIX. Šis fermentas randamas ant vidinės mitochondrijos memranos sienos. Aktyvi dalis atsukta į matrikso pusę [42]. Šio reakcijos greitis priklauso nuo deguonies kiekio, o fermentas turi didelį atrankumą substratui [43]. Paskutinė hemo biosintezės reakcija – geležies įterpimas, kuri atliekama dalyvaujant ferochelatazei (EC 4.99.1.1). Ferochelatazė randama ant vidinės mitochondrijos membranos.

1.3. Hemo biosintezės reguliavimas

Visos reakcijos vykdomos hemo biosintezės fermentų ir yra negrįžtamos. Kai kurios reakcijos dalinai valdomos substrato kiekiu arba neigiamo grįžtamojo ryšio pagalba (pvz. ALAS katalizuojama reakcija). Substratų ir tarpinių produktų koncentracijos toli gražu nepasiekia, sudėjus visus fermentus, Michaelis constantos [44]. Iš visų fermentų ALAS turi mažiausią aktyvumą. Kitų fermentų aktyvumas žymiai didesnis. Ferochelatazės aktyvumas mažas taip pat, tačiau apie tris kartus didesnis nei ALAS [44].

Pagrindinis biosintezės reguliavimas vyksta per ALAS aktyvumą 3 pav (GAE – geležiai atsakantis elementas, GRF – geležies reguliavimo faktorius, TfR – transferino receptorius). Hemas gali tiesiogiai inhibuoti ALAS aktyvumą [45], transkripciją, transliaciją ir baltymų transportą į mitochondriją. Tačiau tiesioginis inhibavimas turi mažai reikšmės, kadangi, jis pasireiškia prie 10-5 M koncentracijos, o ALAS gamyba kontroliuojama esant 10-7 M koncentracijai. Manoma, kad 10-7 M hemo koncentracija ir atlieka šį reguliavimą [46]. Pagrindinio ALAS ir fermento esančio eritrocituose reguliacinis mechanizmas skiriasi [47-58].

3 pav. Hemo sintezės reguliavimas

CANCER June 15, 1997 / Volume 79 / Number 12

1.4. Protoporfirino IX pasiskirstymas ir toksiškumas

Nors ir mažai žinoma apie pasiskirstymą audiniuose po išorinio ALA pavartojimo, tačiau pastebėta, kad fluorescencija su laiku didėja dėl PpIX biosintezės maždaug 4 – 14 valandų bėgyje, priklausomai nuo ALA koncentracijos tepale (2-40%), užtepto kiekio (30 – 50 mg/cm3) ir nuo skvarbos laiko (iki 24 val.) [59-61]. Dažniausiai išviršiniai preparatai naudoti iki 4 val. PpIX biosintezės padidėjimą sukelia lokaliai. Jeigu naudojamas ilgesnis skvarbos laikas (iki 14 val.), skvarbos stiprikliai (pvz. Dimetilsulfoksidas (DMSO)), galima išplitusi odos fotosensibilizacija. Užtepus išviršinę farmacinę formą (5 – 40%) ir praėjus šešioms valandoms pacientams pastebėtas

nežymus PpIX pagausėjimas plazmoje ir eritrocituose; po 24 valandų organizmo kiekis atsistatė, PpIX fluorescencijos detektuoti nepavyko. Pastebėta, kad pati ALA nera toksiška organizmui naudojant <50% vanduo/aliejuje tipo emulsijas ir atliekant skvarbą esant iki 48 val. Be to biosintetintas PpIX taip pat nerodo jokio toksiškumo, kol oda nešvitinama raudona šviesa. Tačiau švitinimo metu ir kelias valandas po procedūros pacientai jaučia niežėjimą, diegimą ar deginimą švitinimo srityje, panašų į porfirija sergančių pacientų. Kai kurie pacientai šio skausmo negali kentėti. Skausmą galima numalšinti 2% lignokaino geliu [62], ar „Elma“ kremu (2,5% lignokaino ir 2,5% prilokaino) [63], intrakutanine 1% lignokaino injekcija [61], ar mepivakainu [64], arba naudoti purškalą turintį 10% lignokaino. Todėl gaminami kremai turėtų būti daromi kartu su anestetikais. Labai retai kai kurie gydomi susirgimai gali išsivystyti į superinfekcijas.

1.5. Degradacijos mechanizmas

ALA priklauso α-amino ketonų grupei, kurie dimerizuojasi esant šarminei terpei [65]. Susidarę dihidropirazinai toliau gali būti oksiduojami į pirazinus. ALA degradacijos mechanizmas jau yra išaiškintas 4 pav. Esant šarminiam pH, susidaro 2,5-dikarboksietil-3,6-dihidropirazinas (DHPY) [18,68-69],porfobilinogenas [67,71] ir pseudoporfobilinogenas [67-69,71] per atvirą dimerizuotą ketimino grupę. Oksidacija iš DHPY į 2,5-dikarboksietilpiraziną (PY) buvo patvirtinta anksčiau [68-69,70,71]. Be to ALA gali būti ir keto-enolinės formos [68,72]. BMR tyrimai rodo, kad prie pH = 7,8 susidaro <0,3% enolinės ALA formos.

Seniau kilę klausimai dėl ALA stabilumo buvo sunkiai sprendžiami, nes nebuvo iki galo išaiškinti tarpiniai skilimo produktai, kurie dabar yra aiškūs. Pastebėta, kad žemas pH (pH<5,5) padidina ALA stabilumą. Koncentracija taip pat turi įtakos dimerizacijos greičiui.

4 pav. Literatūroje aprašomi ALA kondensacijos produktai Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 89, No. 10, October 2000

1.6. Stabilumas

Pasak Elfsson et al, 1998 [11], ALA dimerizacijai nereikalingi fermentai. Kondensacija vandeniniame tirpale vyksta savaime. Franck ir Stratmann, 1981 [67] įrodė, jog šarminėje terpėje susidaro du kondensacijos produktai santykiu 1:10 ir mažai priklauso nuo sąlygų. Mažesnis kiekis skilimo produkto identifikuotas kaip PBG, o didesnis kaip DHPY. Butler ir George, 1992 [69] identifikavo tris skilimo produktus ir jie teigė, kad jų susidarymas priklauso nuo salygų: prie neutralaus pH ir prie anaerobinių salygų DHPY oksiduojamas į PY. DHPY ir PBG susidaro stipriai šarminėje terpėje. Fiziologinėmis sąlygomis susidaro 4-7% DHPY.

Pasak Diddens et al., 1994 [73], dimerizacija priklauso nuo ALA koncentracijos, pH ir laiko. Tačiau šie mokslininkai netyrė reakcijos kinetikos. Manoma, kad galėtų vykti reakcija, amino grupė

turi būti neprotonizuota ir galėtų sąveikauti su kitos ALA keto grupe, tada susidaro DHPY (Novo et al., 1996 [18]).

Elfsson et al, 1998 [11] tyrimų duomenimis, ALA išlieka stabili prie pH=2,35, kur amino grupė protonizuota (pKa=8.05). Šie mokslininkai nustatė, kad ALA dimerizacija yra antros pakopos reakcija. Temperatūra taip pat turi daug įtakos stabilumui. Tyrimai įrodo, kad gaminant farmacines formas būtina pH išlaikyti kuo žemesnį.

Bandant sukurti stabilius injekcinius tirpalus Blois et al., 2002 [74] pastebėjo, kad žėmas pH gali sulėtinti PpIX biosintezę, todėl būtina rinktis tirpalą su pH=4-9. Be to žemas pH gali sukelti odos irimą. Šių mokslininkų nuomone, optimalus pH yra lygus 5.

Atliekant stabilumo tyrimus prie pH=5, esant kambario temperatūrai (21oC), 2%, 5%, 10% tirpalai iki 90% buvusios koncentracijos degradavo per atitinkamai 150, 94, 29 dienas. Atliekant pagreitinto stabilumo tyrimus, pH=5, 0,1% tirpalas prie 63oC temperatūros parodė 438 valandų skilimo pusperiodį ir prie 85oC parodė 34 valandų skilimo pusperiodį.

1.7. Skvarba į odą

Yra padaryta nemažai tyrimų susijusių su ALA skvarbos matavimu į odą tiek in vitro, tiek in vivo. Šiam tiksliui taikomi ekstrakcijos būdai ir ESCh metodai bei yra aprašytų darbų pritaikant skysčių scintiliaciją. Pastarasis metodas įgalina netik nustatyti prasiskverbusios ALA koncentraciją audinyje, bet ir nurodyti, kokiame gylyje, koks kiekis yra pažymėtos medžiagos. Tačiau šiam tiksliui pasiekti reikia naudoti radioaktyvius junginius, be to šis metodas ganėtinai brangus. Skvarbos tyrimai atliekami tam, kad būtų įsitikinta, jog prasiskverbusios ALA koncentracija į dermą pasiektų fototoksinę dozę. Fototoksinės dozės jau yra nustatytos atliekant tyrimus su ląstelių kultūromis. Teigiama, kad koncentracija turi būti 0.01 – 0.17 mg/ml ribose [75,76] tam, kad būtų pasiektas efektyvus PpIX biosintezės lygis ir sukelta pakankama vėžinių ląstelių žūtis.

Yra keletas tyrimų susijusių su prasiskverbusios ALA kiekiu į odą gylio nustatymu. Be skysčių scintiliacijos PpIX kiekiui audinyje išmatuoti dar galima taikyti fluorescencinę mikroskopiją. Prieš atliekant nustatymą užtepama kremo, paliekama 4 – 6 val. Skverbtis į odą ir po to daroma biopsija. Gauti odos gabaliukai užšaldomi ir supjaustomi. Biosintetinto PpIX kiekis nustatomas fluorescencinės mikroskopijos [77,78], arba fluorescencinės spektrofotometrijos metodų pagalba. Kiekybinis nustatymas gana tikslus. Pavyksta nustatyti susiformavusio PpIX kiekį tam tikrame gylyje ir pagal tai apskaičiuojamas prasiskverbusios ALA kiekis. Šie tyrimai parodo kaip giliai yra formuojamas PpIX. Konig et al., 1994 [79] aprašė PpIX fluorescenciją 0,6 mm gylyje, odos auglyje. Szeimies et al., 1994 [80] aprašė fluorescenciją 0,3 mm gylyje pacientams su pamatinių ląstelių

augliuose.

Metodai, kuriais nustatinėjamas ALA kiekis yra sudėtingesni, nes reikalauja papildomų žingsnių (pvz. ekstrakcija). Gali būti panaudoti kai kurie alternatyvūs metodai kaip mikrodializė kiekybiniam ALA nustatymui sveikoje odoje ir su pamatinių ląstelių karcinoma [82]. Užtepus 20 % vandeniniu pagrindu gelio ir įdėjus mikrodializes vamzdelį 0,5 mm gylyje po augliu pavyko nustatyti nuo 0 iki 0.52 mg/ml ALA koncentraciją, bet nepavyko visiškai aptikti sveikoje odoje. Be to nepavyksta netik nustatyti ALA koncentracijų prieš ir už 0.5 mm ribos, bet ir gilesniuose sluoksniuose. Kai kurios vėžinės ląstelės gali persistuoti iki 2,5 mm gylio.

Šiam tikslui tinka skysčių scintiliacijos spektrofotometrija, be to užtenka ekstrahuoti mažus odos kiekius, o jautris gana didelis. Tačiau prieš atliekant tyrimus būtina pasiruošti atitinkamą farmacinę formą su radioaktyviais atomais žymėta ALA. Registruojamos beta dalelės, skaičiuojamas skilimų skaičiumus per minutę, o tai gali būti tiesiogiai susieta su prasiskverbusiu ALA kiekiu. Panašūs tyrimai yra atlikti su radioaktyviais atomais žymėtu 5-fluoruracilu [8]. Casas et al. [83] naudodamas skysčių scintiliacijos spektrofotometriją įrodė, jog ALA pelės odos auglyje gali prasiskverbti iki 5 mm gylio, nors didžiausia dalis buvo rasta iki 2 mm gylio. Skirtingas koncentracijas skirtingame odos gylyje nustatė McCarron et al. [84].

Atlikti tyrimai su vaginos epiteliniu audiniu rodo, jog vidutinis ALA prasiskverbimo gylis, kuriame koncentracija yra didžiausia – 2,375 mm, nors vulvos intraepitelinė neoplazija gali atsirasti gylyje ne mažiau kaip 2,5 mm. Nustatyta koncentracija buvo apie 5 mg/cm3, kuri gerokai viršija minimalios reikalingos koncentracijos pakankamam PpIX kiekiui biosintetinti tam, kad būtų sukelta vėžinių ląstelių žūtis [76]. Taigi, galima tikėtis, kad 5-ALA koncentracija ties 2,5 mm gyliu taip pat bus didelė. Iš tiesų, autoradiografija parodė, kad 5-ALA gali įsiskverbti į makšties epitelio audinį iki 6 mm, net po 2 val. skvarbos.

Reikšmingų skvarbos skirtumų nepastebėta tarp Porphin kremo ir pleistro, kurių sudėtyje yra vienodi ALA kiekiai. Pastebėta, kad prasiskverbusios ALA kiekiui daugiausia įtakos turi laikas. Makšties epitelinis audinys neturi keratinizuoto raginio sluoksnio, tačiau vulva turi epitelinio audinio, kuris manoma, yra keratinizuotas. Yra žinoma, kad raginis sluoksnis yra pagrindinis barjeras sukeliantis skvarbos nepakankamumą [78], o tam tikri piktybiniai ir nepiktybiniai pažeidimai pageriną 5-ALA skvarbą [85]. Atlikus skvarbos tyrimus su kiaulės oda, pastebėta, kad ALA neprasiskverbė giliau nei apatinė raginio sluoksnio dalis [86].

Yra žinoma keletas ALA skvarbos į odą pagerinimo per raginį sluoksnį būdų. Vienas iš pagerinimo būdų yra okliuzija. Klinikinėje praktikoje užtepama kremo ant pažeistos odos ir uždedama PVC plėvelė. Kitas metodas skvarbai pagerinti yra ALA-esterių naudojimas. Šio metodo pritaikymas pagerina lipofiliškumą, todėl pagerėja skvarba per raginį sluoksnį. Taip pat nemažai susidomėjimo

sulaukęs yra jontoforetinis ALA įnešimo į odą būdas, tačiau mažai tyrimų atlikta. Keratinizuotų liekanų ant odos nuplėšimo lipnia juostele būdas taip pat gali būti taikomas klinikinėje praktikoje [87]. Dažniausiai vartojamas būdas pagerinti ALA skvarbą į odą – tai skvarbos stipriklių, tokių kaip dimetilsulfoksidas (DMSO) ir kitų, naudojimas [83,85].

Dabartiniai tyrimai parodo, jog DMSO ir oleino rūgštis (OR) kartu gali būti vartotini skvarbai pagerinti. Manoma, kad DMSO tirpdo raginio sluoksnio lipidus ir baltymus. OR įsiterpia į bilipidines struktūras ir jas suardo.

Be to, reikia prisiminti, kad DMSO gali būti netik skvarbos stipriklis, tačiau ir medžiaga, kuri didina ALAS, ALAD, PBGD aktyvumą ląstelių kultūrose [88]. Šiuo būdų galima pakelti PpIX biosintezės lygį iki terapinio lango dar nepasiekus reikiamos ALA koncentracijos audiniuose. Todėl DMSO nors ir statistiškai nepagerina skvarbos į odą, tačiau gali būti panaudotas dėl prieš tai paminėtos priežasties farmacinės formose. Pastebėta, jog DMSO skvarbą pagerino tik su 20 % ALA kremais. Manoma, kad DMSO aktyvumas labai priklauso nuo koncentracijos. 60 % (v/v) ir daugiau turėtų ryškiai pagerinti skvarbą. Tačiau didelės DMSO koncentracijos sukelia paraudimus, negrįžtamą odos sužalojimą, raginio sluoksnio pažeidimus ir baltymų denatūraciją. Be to, tokios didelės koncentracijos neleistų tinkamai padaryti tepalo, ar kremo. 10 % DMSO pleistrai praranda lipnumą, stiprumą ir sudrėkus neįmanoma jo tinkamai prilipdyti. Panašūs OR kiekiai sukelia panašias problemas.

1.8. Difuzija

Pasyvi difuzija yra vienas iš svarbiausių vaistų patekimo būdų į organizmą. Šį patekimo būdą reguoliuoja ir vaisto ir biologinių membranų fizikocheminės savybės.

Pagal skystos mozaikos modelio, biomembranos yra sudarytos iš dvigubo lipidų sluoksnio [89]. Šis dvigubas sluoksnis yra amfiprotinių lipidų (fosfolipidai, glikoproteinai ir cholesterolis) orientacijos vandeninėje terpėje pasėkmė. Taip pat membranoje yra baltymų, kurie atlieka skirtingas funkcijas. Kai kurie baltymai su paviršiais, ar kitomis ląstelėmis sudaro tvirtus ryšius. Daugelyje biologinių membranų šie baltymai gali atlikti vandeniui pralaidžių porų funkciją. Tokios vidinės jungtys sudaro apie 0,01 % viso paviršiaus ploto [90]. Didžioji biomembranos paviršiaus dalis yra lipofilinė, todėl lipofilinės medžiagos geriau pereina šį barjerą. Pagrindinis veiksnys, kuris riboja molekulių patekimą per biomembranas – yra jų dydis, forma, tirpumas, lipofiliškumas, poliškumas ir krūvis.

dh DA

dt  (1)

dQ – medžiagos kiekis, kuris prasiskverbia į membraną per laiko tarpą – dt per plotą A, procesą įtakoja koncentracijos gradientas – dC/dh. D – difuzijos koeficientas ir priklauso nuo membranos fizikocheminių savybių, vaisto ir farmacinės formos sąvybių. Šis difuzijos koeficientas nesutampa su Stokso-Einšteino lygtimi, kuri apibūdina sferinių dalelių judėjimą skystyje. Priešingai difuzijai pagal Stokso teoriją, membraniniai difuzijos modeliai parodo labai didelį jautrumą dalelių dydžiui [91]. Tam kad galėtume įvesti farmacinės formos ir membranos pasiskirstymo koeficientą Km ir difuziškumą Dm galime pakeisti lygtį:

v m m _C h A D K J dt dQ    (2)

Pagal šią formulę, judėjimą per membraną galima padidinti pakėlus difuziškumą, padidinus pasiskirstymo koeficientą, ar koncentracijos gradientą. Tam kad ALA efektyviai veiktų, ji turi pasiekti citozolį. Šiam tikslui naudojami ALA derivatai (ALA esteriai). Tačiau tie esteriai, kurių lipofiliškumas per didelis gali nepatekti į citozolį, jie gali tiesiog užstrigti tarpląstelinėje erdvėje. Yra priimta manyti, jog pasiskirstymo koeficientas aliejaus ir vandens fazėse P(aliejus/vanduo) yra lemiantis faktorius medžiagų skvarbai į biomembranas. Pasiskyrstymo koeficientas tarp membranos ir aplinkinės fazės išreiškiamas:

apl mem C C

P  (3)

Cmem ir Capl yra koncentracijos membranoje ir aplinkoje (farmacinė forma, tirpalas ir t.t.) esant pusiausvyros sąlygoms. Eksperimentiškai nustatyti pasiskirstymo koeficientus su biologinėmis membranomis yra gana sunki užduotis, tačiau yra keletas modelių tam įvertinti.

Taip pat yra pasiūlytų ir kitokių tirpiklių sistemų. Daugiausia dėmesio susilaukus yra 1-oktanolio/vandens sistema. Pastebėta, kad ji gerai nurodo pasiskirstymo koeficientus [92]. Be to ši sistema gali būti išreiškiama logaritmine forma (logP). Yra keletas eksperimentinių ir teorinių būdų apskaičiuoti logP. Žinoma, jog 1-oktanolis yra ganėtinai geras organinis tirpiklis.

Kolkas nedaug atlikta tyrimų, kurie tiksliai susietų membranos pralaidumą ir P. Pastebėta, kad didėjant logP, skvarba taip pat didėja tiesiškai, kaip ir aprašyta Fiko dėsnyje, tačiau, kai logP pasiekia dideles reikšmes, skvarba pasiekia plotmę ir nebekyla, kai kuriais atvejais net sumažėja.

1.9. Kapiliarinė elektroforezė

Kapiliarinė elektroforezė (KE) yra metodų grupė, kurie atliekami siauruose kapiliaruose (20 – 200 μm vidinio skersmens) tiek didelės molekulinės masės, tiek mažos molekulinės masės junginių ir jonų efektyviam atskyrimui. Šiuos skirstymus sąlygoja aukštos įtampos panaudojimas, kuris gali sukurti kapiliaro viduje tam tikro greičio buferinių tirpalų ir jonų elektroosmozinį ir elektroforezinį srautus.

Elektroforezė, kaip skirstymo metodas, pirmą kartą buvo pasiūlytas 1930 m. A. Tiselijaus. Patalpinęs baltymų mišinį vamzdelyje, esančiame tarp dviejų buferio tirpalų, veikiant elektros laukui, jis pastebėjo, kad analitės juda viena kryptimi ir jų elektroforezinis judris priklauso nuo dalelių krūvio ir masės santykio. 1948 m. Tiselijui buvo paskirta Nobelio premija už elektroforezės ir adsorbcijos tyrimus. Tačiau skirstymo efektyvumą ribojo šiluminė difuzija bei konvekcija.

Pirmieji KE darbai buvo atlikti 1965 m. S. Hjerténo, panaudojant 1 mm skersmens kapiliarus, kurie sumažino konvekcijos efektą. Vėliau Virtanenas ir Mikeris elektroforezei panaudojo 200 μm vidinio skersmens kapiliarus, pagamintus iš stiklo bei teflono. 1980 m. Jorgensonas ir Lukacas pritaikė 75 μm vidinio skersmens lydyto kvarco kapiliarus. Jorgensonas taip pat aprašė priklausomybę tarp analizės parametrų ir skirstymo kokybės, pabrėždamas, kad KE yra pranašus analizės metodas. Nuo to laiko, publikuota nemažai straipsnių bei vadovėlių ir mokslinių monografijų apie įvairiausius KE aspektus.

KE bruožai:

1. Elektroforezė vykdoma mažo vidinio skersmens (25 – 75μm) lydyto kvarco kapiliaruose. 2. Analizei atlikti naudojama aukšta įtampa (10 – 30 kV) ir stiprus elektrinis laukas (100 – 500

V/cm).

3. Didelis efektyvumas (N>105 – 106) ir trumpa analizės trukmė . 4. Detekcija atliekama kapiliare.

5. Injektuojami maži bandinių tūriai (1 – 50 nl).

6. Daug įvairių būdų atrankumui gerinti bei platus metodo pritaikymas. 7. Analizė dažniausia atliekama vandeniniuose tirpaluose.

8. Automatizuota aparatūra.

Nuo pirmųjų Hjérteno bandymų 1965 m. iki šių dienų KE metodas labai patobulėjo, tačiau nepakankamas detekcijos jautrumas ribojo platesnį metodo pritaikymą įvairiose mokslo srityse. Todėl pastaruoju metu didelis dėmesys yra skiriamas detekcijos jautrumo didinimui. Jautrumo didinimui atliekamas bandinio sukoncentravimas adsorbuojant nejudria ar pseudonejudria faze,

„burbulinės“ arba „z“ formos kiuvetės.

5 pav. Kapiliarinės elektroforezės sistemos principinė schema

Encyclopedia of Physical Sciences and Technology, 3rd Edition, Volume 2, 2001

Vienas iš KE privalumų yra platus šio metodo pritaikymas įvairiose srityse (pvz., aminorūgščių, vaistų, vitaminų, pesticidų, neorganinių jonų, organinių rūgščių, dažų, baltymų, angliavandenių, oligonukleotidų, DNR restrikcijos fragmentų ir netgi visos ląstelės bei bakterijų analizė). Tačiau biologinių bandinių analizė KE metodu sumažina rezultatų pakartojamumą, kadangi biologinę matricą sudaro eilė komponentų (pvz. baltymai, lipidai), kurie adsorbuojasi lydyto kvarco paviršiuje. Lydyto kvarco kapiliaro paviršiuje yra apie 8,31 μmol/m2 silanolinių grupių (pKa 6,3). Šios silpnai rūgštinės grupės kvarco paviršiuje sukuria dvigubą elektrinį sluoksnį elektroforezės metu. Lydyto kvarco kapiliaro paviršius turi neigiamą krūvį, esant skirtingam buferio pH, kai silanolinės grupės disocijuotos. Peptidai ir baltymai elektroforezės metu migruos link katodo nepriklausomai nuo jų krūvio. Taip pat elektrosmozė sutrumpina analizės trukmę. Silanolinės grupės įtakoja bazinių savybių turinčių analičių adsorbciją. Baltymų sąveika su lydyto kvarco kapiliaro paviršiumi pasireiškia analitės zonos išsiplėtimu, asimetriškumo faktoriumi, efektyvumo ir jautrio sumažėjimu, taip pat migracijos laikų nepakartojamumu. Regeneruojant lydyto kvarco paviršių po baltymų adsorbcijos natrio hidroksidu ir druskos rūgštimi aptikti baltymų likučiai.

Apibendrinant KE metodo privalumus, trūkumus bei jo panaudojimo galimybes, galima teigti, kad nors KE pritaikymų sritis yra gana plati, techninis lygis vis dar tobulinamas. Teorijos vystymas ir skirstymų pritaikymai dar turi šiokių tokių trūkumų, tad suprantama, kad šiuos metodus būtina tobulinti bei optimizuoti skirstymo sąlygas[93].

1.10. Kapiliarinės elektroforezės veikimo principas

KE instrumento konstrukcija yra paprasta. Reikalingas lydyto kvarco kapiliaras su optinės detekcijos langu nuo kurio pašalinta UV nepralaidi poliimidinė danga, reguliuojamas aukštos įtampos šaltinis, du elektrodai, du buferio rezervuarai. Optinės detekcijos langas fiksuojamas ties detektoriumi. KE sistemos principinė schema pateikta 5 pav. Kapiliaras užpildomas elektrolitu ir jo galai panardinami į elektrolito rezervuarus, kuriuose yra platinos elektrodai. Elektrodai sujungiami su aukštos įtampos šaltiniu.

6 pav. Elektroosmozės mechanizmas kapiliare

Encyclopedia of Physical Sciences and Technology, 3rd Edition, Volume 2, 2001

Atskyrimas pagrįstas skirtingu analičių judėjimo greičiu elektriniame lauke. Elektroforezės greitis, vep (cm/s) priklauso nuo elektros lauko stiprio, E (V/cm). Elektroforezinis judris, μep (cm2/Vs) gali būti išreikštas šia formule:

E

Tam tikro pH tirpale judris išreiškiamas šia formule:   r q ep 6  (5)

q – analitės krūvis, η – tirpalo klampa, r – Stokso spindulys duotas analitei. Kadangi Stokso spindulys susietas su molekuline mase, judris didės mažėjant masei. Elektroforezinis judris gali būti apskaičiuotas elektroforezinį greitį padauginus iš elektros lauko stiprio:

V L t l ep   (6)

l – efektyvus kapiliaro ilgis (cm), t – analitės migracijos laikas (s), L – bendras kapiliaro ilgis (cm), V – įtampa (kV).

Kitas faktorius, nuo ko priklauso tiek analitės judėjimo greitis, tiek analizės greitis – yra elektroosmozė (EOS). Šis reiškinys stebimas tada, kai esant tam tikram pH kapiliaro sienelės įsikrauna dėl silanolinių grupių (SiOH) jonizacijos. Silanolinės grupės yra silpnai rūgštinės ir jonizuojasi prie maždaug pH=3. Hidratuoti katijonai asocijuojasi su įkrautomis SiO- grupėmis ir sudaromas dvigubas elektrinis sluoksnis: statiškas sluoksnis prie pat kapiliaro sienelės ir dinaminis, išorinis sluoksnis dar žinomas kaip Helmholtz‘o sienelė. Įjungus elektros srovę, hidratuoti katijonai išoriniame sluoksnyje juda link katodo, taip susidaro tėkmė per visą kapiliaro spindį 6 pav. EOS greitis priklauso nuo elektros lauko stiprio ir nuo krūvio ant kapiliaro sienelės. Didėjant pH daugėja įkrautų silanolinių grupių ant sienelės, todėl greitėja EOS 7 pav.

pH vE O S (c m /s )

7 pav. pH įtaka elektroosmozei

EOS greitis gali būti išreikštas:

E

vEOS EOS (7)

µEOS – elektroosmozinis judris ir gali būti išreikštas šia formule:

 

 w

EOS  (8)

ε – dielektrinė konstanta, ξw – kapiliaro sienelės dzeta potencialas, η – tirpalo klampa. EOS gali būti nustatyta eksperimentiškai, o elektroosmozinis judris gali būti apskaičiuotas:

V L t l EOS EOS   (9)

Analitės judėjimo greitis priklausys nuo EOS ir nuo judėjimo tirpale prie tam tikro elektros lauko stiprio:

E v

v

vAn  ep  EOS (ep EOS) (10)

Analitės, kurios turės teigiamą krūvį išeis prieš EOS, analitės kurios krūvio neturės, išeis kartu su EOS, o tos analitės, kurios turės neigiamą krūvį išeis po EOS.

Tam kad pakartojamumas būtų geras, EOS privaloma išlaikyti vienodą atliekant kiekvieną analizę ir ji taip pat neturi kisti analizės atlikimo metu. Matricoje esantys baltymai, kiti peptidai, hidrofobinės medžiagos adsoruojasi ant sienelės paviršiaus, dėl to kinta EOS ir analizės atlikimo kokybė. Kad to būtų išvengta, kaskart reikia tinkamai atlikti kapiliaro plovimo procedūrą.

Atskyrimo efektyvumas, arba teorinių lėkštelių skaičius, N KE gali būti išreiškiamas šia lygtimi:

D V

N 



D – analitės difuzijos keoficientas buferiniame tirpale, kuriame yra atliekama analizė. Iš formulės matosi, kad atskyrimo efektyvumas labai priklauso nuo elektros lauko stiprio ir jeigu kapiliaras bus

suprastės.

Europos farmakopėja pateikią dar vieną teorinių lėkščių apskaičiavimo formulę:

2 54 . 5 _        h R w t N (12)

tR – migracijos laikas, wh – smailės plotis pusėje jos aukščio. Ši formulė taikoma netik KE, bet ir ESCh. Teorinių lėkštelių skaičius paskaičiuojamas ne pagal elektroforetinius parametrus, bet pagal elektroforetinio vaizdo gautus parametrus.

Kartais kapiliarinėje elektroforezėje, atliekant analizę, gaunamas labai aukštas teorinių lėkštelių skaičius, netgi iki kelių šimtų tūkstančių. KE atskyrimo efektyvumas geresnis nei ESCh todėl, kad pernešant iš vienos teorinės lėkštelės analitę, masės pernešimas neturi įtakos, taip pat didesnis teorinių lėkštelių skaičius gaunamas dėl elektroosmozinio srauto, tuo tarpu ESCh pasireiškia laminarinis srautas.

Skiriamoji geba gali būti išreikšta šia formule:

N R ep ep     4 1 (13)

∆μep – dviejų šalia esančių analičių elektroforezinių judrių skirtumas, ep- dviejų šalia esančių analičių elektroforezinių judrių vidurkis. Iš formulės matosi, kad pakėlus elektros lauko stiprį pagerėja skiriamoji geba. Tačiau įtampos didinimas yra ribota skiriamosios gebos gerinimo alternatyva. Pakėlus įtampą dvigubai, skiriamoji geba padidės tiktais apie 1,4 karto, o įtampos didinimas pasireiškia džiaulio šilumos efektu [94].

1.11. Kapiliarinė elektroforezė tyrimuose su oda

Atlikus paiešką interneto mokslinių žurnalų duombazėse pavyko surasti tik keletą straipsnių, kuriuose aprašomas KE panaudojimas tyrimuose su oda. Biologinių bandinių tyrimas yra sudėtingas procesas dėl junginių įvairovės. Atlikus ekstrakciją gaunama daug baltymų, kurie gali užteršti aparatūrą ir dėl to bus gaunami iškraipyti rezultatai. Kita problema susijusi su junginių atskyrimu. Kartais tenka dirbti ribinėmis salygomis tam, kad būtų pasiektas tinkamas analičių atskyrimas, o

kartais to padaryti nepavyksta. Šios problemos sprendžiamos įvairiais biologinių bandinių valymo metodais, bet tai įneša papildomo darbo, išlaidų ir paklaidų.

Hermann ir Abeck, 2000 [95] aprašė histidino ir urokaninės rūgšties izomerų nustatymą odos ekstraktuose efektyviosios kapiliarinės elektroforezės (EKE) metodu. Kowalski et al., 2003 [96] aprašė KE metodo vystyma nustatant įvairių vaistų ir jų likučių raumens, inksto, odos, kepenų mėginiuose. Pasak šių autorių, naudojant KE gerai pavyksta atskirti vaistus nuo matricos, o kokybinio nustatymo riba 20 μg/kg. V. Van Lierde et al., 2005 [97] aprašė chromo junginių skvarbos į kiaulės ir žmogaus odą modelį. Nustatymui buvo pritaikytas KE kombinacijoje su induktyviai susietos plazmos masių spektrometrija (ICP-MS). F. Al-Otaibi et al., 2008 [98] aprašė tetrakaino mustatymui panaudoto KE metodo iteisinimą. T. Caon et al., 2010 [99] skirtingų parabenų skvarbos per kiaulės ausies odą modeliui įvertinti nurodė KE metodą.

Aprašytus metodus sieja greita, tiksli, selektyvi analizė, kuri nereikalauja daug pastangų ruošiant bandinius.

1.12. 5-aminolevulino rūgšties tyrimo metodai

Anksčiau ALA kiekis buvo nustatomas ESCh metodu atliekant tipines derivatizacijos rekacijas aminorūgštims nustatyti. Viena iš dažniausiai vartojamų derivatizacijos reakcijų – reakcija su acetilacetonu; su ALA sudaromas fluorescuojantis junginys, kurį galima nustatyti fluorescentiniu detektoriumi [77,100].

Iš tiesioginių nustatymo metodų, yra pritaikyta jonų mainų ir jonų porų chromatografija. Elfsson et al. 1998 [11] aprašė jonų porų chromatografijos metodą ALA nustatymui rugščių ir vandeniniuose tirpaluose.

1.13. 5-aminolevulino rūgšties nustatymas kapiliarinės elektroforezės metodu

Vienas iš tiesioginių ALA nustatymo metodų yra KE. Literatūroje yra keletas aprašytų KE būdų ALA nustatyti. Luo et al., 1996 [12] aprašė micelinės elektrokinetinės chromatografijos (MEKC) metodo pritaikymą ALA ir PBG nustatymui biologiniuose bandiniuose. Su vaistais susijusioms priemaišoms nustatyti buvo pritaikytas KE metodas, kurį aprašė Altria, 1996 [14]. Kim et al., 2001 [101] aprašė metodą ALA, PBG, glicino ir levulino rūgšties nustatymui Rhodopseudomonas sphaeroides kultūroje. Bunke et al., 2000 [13] išvystė ir įteisino metodą, kuris buvo skirtas ALA ir jos skilimo produktų nustatymui. Pastarasis metodas ir buvo pasirinktas kaip gairė vystyti metodą, kuris leistų nustatyti ALA kiekį odos ekstraktuose.

2. EKSPERIMENTINĖ DALIS

2.1. Medžiagos

Eksperimentams atlikti buvo panaudotos šios medžiagos: di-natrio tetraborato dekahidratas (grynumas – 99,0 %, Lachema, Čekija); natrio dihidrofosfato dihidratas (grynumas – 99,0 %, Lachema, Čekija); natrio dodecilsulfatas (grynumas – 99,0 %, Carl Roth GmbH, Vokietija); natrio hidroksidas (grynumas – 98,5 % Lachema, Čekija) metanolis (grynumas – 99,5 %, Barta a Cihlar, Čekija); acetonitrilas (grynumas – 99,9 %, Sigma-Aldrich, Vokietija); nailono filtrai (porų dydis – 0,45 μm, Carl Roth GmbH, Vokietija); Bidistiliuotas vanduo buvo paruoštas laboratorijoje.

2.2. Aparatūra ir programinė įranga

Analizės buvo atliktos naudojant kapiliaro elektroforimetrą Biofocus 3000 (BIORAD Laboratories, JAV); ultragarsinė vonelė Cole-Parmer (Cole-Parmer Instrument Company, JAV); centrifūga WIFUG (CHEMICO, Švedija); svarstyklės (Sartorius Basic, Vokietija); Bidistiliatorius (Fistreem Cyclon, Didžioji Britanija); Bruno difuzinės celės, 0,64 cm2; peristaltinis siurblys (Cole-Parmer Instrument Company, JAV); kaitrinė vonelė (Grant, Didžioji Britanija); viskozimetras (AND, JAV) analizės metu duomenys renkami Biofocus 3000 programinės įrangos pagalba, elektroferogramos apdorotos su Biofocus Integrator programa; statistinė analizė ir skaičiavimai atlikti su MS Excell. Analitinė dalies tyrimai atlikti VDU laboratorijoje, biochemijos ir biotechnologijų katedroje; Skvarbos tyrimai atlikti KMU laboratorijoje, vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedroje.

2.3. Bandinių ruošimas

2.3.1. Bandinių ruošimas kalibracinei kreivei

10 mg ALA buvo ištirpinta 2 ml izotoninio (0,067 M) fosfatinio buferio, pH=5,0. Atlikti reikiami praskiedimai praskiesta metanoliu 1:1 (v/v) ir gautos koncentracijos: 0,300 mg/ml, 0,200 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,100 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,025 mg/ml.

2.3.2. Epidermio ir dermos atskyrimas karščio metodu

Epidermio nuo dermos atskyrimas buvo atliktas pagal Kassis ir Søndergaard, 1981 [102] pasiūlytą metodą. Mentelė vonelėje įkaitinama iki 60oC ir palaikoma ant odos mėginėlio paviršiaus. 5 sekundžių užteko visiškam epidermio atskyrimui, tuo tarpu Autoriai siūlo palaikyti 1 min. ALA Stabilumo klausimas buvo atsakytas remiantis A.W. de Blois et al., 2002 publikuotu straipsniu. Šie mokslininkai nustatė, jog 0,1 % ALA tirpalo, kurio pH=5,0 skilimo pusperiodis yra 438 valandos. Atliekant epidermio nuplėšimą nuo dermos karščio metodu ALA kiekio sumažėjimas yra nežymus.

2.3.3. Bandinių ruošimas priedo metodui, išgavai nustatyti

10 mg ALA buvo ištirpinta 0,25 ml metanolio. 500 μl gauto tirpalo buvo praskiesta dar 500 μl metanolio. Pastarasis tirpalas buvo praskiestas metanoliu, 1:1 (v/v) santykiu. Padaryti trys metanoliniai ALA tirpalai su atitinkamomis koncentracijomis: 40 mg/ml, 20 mg/ml ir 10 mg/ml. Pagamintų tirpalų po 10 μl užlašinta ant epidermio ir dermos. Palikta džiūti 15 min, kol ALA prasiskverbs į epidermį ir dermą. Išdžiūvus mėginėliams atlikta ekstrakcija.

2.3.4. Ekstrakcijos procedūra

Ekstrakcijai paruošti derma ir epidermis sudedami į mėgintuvėlius, užpilami 0,5 ml izotoniniu fosfatiniu buferiniu tirpalu, pH=5,0. Homogenizacija atliekama 5 min ir iškart mėgintuvėliai su ekstrakcijai paruoštais ruošiniais dedami į ultragarsinę vonelę. Ultragarsu (40 kHz) veikiama 45 min, 25oC temperatūroje.

2.3.5. Ekstraktų paruošimas analizei

Po ekstrakcijos procedūros išimami mėgintuvėliai ir 300 μl ekstrakto supilama į atskirą mėgintuvėlį, praskiedžiama su 300 μl metanolio baltymų išsodinimui. Mėgintuvėliai su gautu tirpalu dedami į centrifūgą ir 6000 aps/min rėžimu centrifūguojami 2 min. Sustojus centrifūgai mėgintuvėliai

filtrą tiesiai į 500 μl mėgintuvėlius.

2.4. Analizės sąlygos

Mėginiai buvo injekuojami 10 psi*s, injekuoto bandinio tūris – 14 nl, įtampa – 24 kV, temperatūra 30oC. Analitė buvo detektuojama prie 200 nm bangos ilgio todėl, kad jį neturi jokių aromatinių ar kitokių chromoforinėmis savybėmis pasižyminčių grupių. Prieš kiekvieną analizę, kapiliaras buvo plaunamas 2 min NaOH tirpalu, 2 min bidistiliuotu vandeniu ir 2 min pildomas darbiniu buferiu. Darbinis buferis - 62 mM boratinis buferinis tirpalas + 8 % MeOH (v/v), pH nereguliuotas, filtruotas per 0,45 μm porų dydžio nailono filtrą, degazuotas vakuumu švirkšte tam, kad būtų kuo mažesnis buferio išsekimas. Elektroosmozė buvo pamatuota injekavus acetono ir pastebėta, kad ji sutampa su tyrinio metanolio smaile. Elektroforeziniai išvystyto metodo parametrai nurodyti 1 lentelėje (pastaba: X, ALA ir Y smailės nurodytos 12 pav).

1 lentelė. Elektroforeziniai analizės metodo parametrai

Parametrai X X/ALA ALA ALA/Y Y

Efektyvus judris 2,101*10-4 - 2,238*10-4 - 2,312*10-4

Atskyrimo veiksnys - 1,085595 - 1,048077 -

Skiriamoji geba - 7,45 - 3,36 -

Simetrijos veiksnys 1,44 - 1,88 - 2,48

2.6. Metodo vystymas ir įteisinimas

Motodas buvo išvystytas pagal ICH gairese [103] pateiktą metodologiją ir reikalavimus. Metodas buvo vystomas taip, kad atitiktų minimalius reikalavimus, tačiau kai kurie parametrai buvo įteisinti atlikus daugiau pakartojimų dėl tikslesnių rezultatų.

2.6.1. Atrankumas

Buvo susidurta su keletu problemų vystant atrankumą. Pradinės sąlygos: 50 mM boratinis darbinis buferis + 10 mM NDS (NDS įdėtas į darbinį buferį remiantis literatūra tam, kad būtų išvengta baltymų bei lipofilinių darinių iš matricos adsorbcijos ant sienelės), pH nereguliuotas (apie 9,35), įtampa – 20 kV, nedengtas silikagelinis kapiliaras 50 μm vidinio diametro, 45,5 cm – efektyvus ilgis, 50,0 cm – bendras ilgis. Atrankumas buvo tiriamas naudojant tuščius dermos ir epidermio ekstraktus bei taikant priedo metodą. Epidermis nerodė jokių smailių ties ALA išėjimo laiku. Tiriant dermą buvo gauta smailė ties ALA išėjimo laiku (8 pav).

0 2 4 6 8 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 0.014 0.016 0.018 0.020 0.022 m A V Laikas, min Vidinis standartas, ALA tirpalas Dermos ekstraktas + ALA Dermos ekstraktas 1 2 3 4 4 1 – ALA

2 – Persidengiančios ALA + matricos smailės 3 – Persidengianti su ALA matricos smailė 4 – EOS

8 pav. Dermos smailių ir ALA smailės persiklojimas. Sąlygos: 50 mM boratinis buferis + 10 mM

NDS, pH – nereguliuotas, įtampa – 20 kV, temperatūra – 30 oC, nedengtas silikagelinis kapiliaras, vidinis diametras – 50 μm, efektyvus ilgis – 45,8 cm, bendras ilgis – 50,3 cm.

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4 5 6 7 7.5 Įpilta MeOH, % (v/v) S k ir ia m o ji g eb a

9 pav. MeOH kiekio darbiniame buferyje įtaka skiriamajai gebai

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0.000 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009

m

A

V

Laikas, min

2 – Smailė iš matricos 3 – EOS Dermos standartas + ALA Vidinis standartas, ALA tirpalas Dermos ekstraktas

10 pav. Smailių atskyrimas įdėjus 7% MeOH. Sąlygos: 50 mM boratinis buferis + 10 mM NDS + 7

% MeOH (v/v), pH – nereguliuotas, įtampa – 20 kV, temperatūra – 30 oC, nedengtas silikagelinis kapiliaras, vidinis diametras – 50 μm, efektyvus ilgis – 58,3 cm, bendras ilgis – 62,8 cm.

Iš pradžių buvo bandoma reguliuoti pH, pastebėtas smailių skilimas ties pH=9,2, tačiau tai pasirodė neefektyvu. Reguliuojant pH, dėl papildomų druskų į darbinį buferį idėjimo gerokai padidėjo

funkcinė srovė analizės atlikimo metu, todėl buvo įdėtas ilgesnis kapiliaras. Į buferį įdėjus 5 % (v/v) ACN rezultatai pagerėjo, bet vis dar buvo nepakankama skiriamoji geba.

Buvo pastebėta, kad MeOH gerokai stipriau padidina skiriamąją geba tarp persidengiančių smailių nei ACN (9 pav). Atlikus analizę su 50 mM boratiniu + 7 % MeOH (v/v) darbiniu buferiu smailės visiškai atsiskyrė (10 pav).

Atlikus analizę su kitų donorų odos ekstraktais buvo pastebėti nežinomos medžiagos pėdsakai, kurie persidengia su ALA smaile (11 pav). Buvo nuspręsta padidinti MeOH kiekį buferyje, tai ribota skiriamosios gebos gerinimo priemonė, kadangi dideli organinių modifikatorių kiekiai sukelia greitą buferio išsekimą, kinta migracijos laikas, gaunami prasti rezultatai atsižvelgiant į pakartojamumą. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 0.014

m

A

V

Laikas, min

2 – Smailė iš matricos 3 – Nežinomos medžiagos

pėdsakai iš matricos

4 - EOS

11 pav. Pėdsakai iš dermos ekstrakto, persiklojantys su ALA smaile. Sąlygos: 50 mM boratinis

buferis + 10 mM NDS + 7 % MeOH (v/v), pH – nereguliuotas, įtampa – 20 kV, temperatūra – 30 oC, nedengtas silikagelinis kapiliaras, vidinis diametras – 50 μm, efektyvus ilgis – 58,3 cm, bendras ilgis –

62,8 cm.

Dėl šios priežasties būtina jį pakeisti. Gerinant skiriamąją gebą taip pat buvo didinama darbinio buferio joninė jėga. Pasiekus reikiamus rezultatus, įtampa buvo pakelta iki 24 kV, nes įtampa greitina EOS ir analizė užtrunka trumpesnį laiko tarpą, be to skiriamojį geba dar padidėja. 24 kV riba buvo pasirinkta todėl, kad nepastebimas džiaulio šilumos poveikis, nesunku gauti gerą pakartojamumą. Be to buvo atsisakyta NDS, kadangi šis anijoninis detergentas padidina srovę, bei sumažina EOS dėl kapiliaro sienelių ir buferinio tirpalo sąveikos. Pašalinus iš tirpalo NDS buvo gauta papildoma smailė,

rūgštys. Atlikus analizę su 62 mM boratiniu buferiu, į kurį buvo įdėtą 8 % MeOH (v/v), smailės visiškai atsiskyrė (12 pav).

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040

m

A

V

Laikas, min

2 – Smailė iš matricos 3 – Nežinomos medžiagos

pėdsakai iš matricos

4 - EOS

12 pav. Atskirtos smailės optimizavus sąlygas. Sąlygos: 62 mM boratinis buferis + 8 % MeOH

(v/v), pH – nereguliuotas, įtampa – 24 kV, temperatūra – 30 oC, nedengtas silikagelinis kapiliaras, vidinis diametras – 50 μm, efektyvus ilgis – 58,3 cm, bendras ilgis – 62,8 cm.

2 lentelė. Metanolio koncentracijos darbiniame buferyje įtaka skiriamajai gebai

Įpiltas MeOH kiekis, v/v % RsALA/Y RsX/ALA 7 8 9 6.45 2.17 7.45 3.36 5.20 2.67

Atskyrimo parametrai su skirtingu MeOH kiekiu darbiniame buferyje pateikti 2 lentelėje. Gero migracijos laiko pakartojamumo dėka, pavyko puikiai atskirti ALA ir matricos smailes, 3 lentelė. Epidermio ekstraktai nerodė jokio smailių ar pėdsakų persiklojimo, (13 pav).

3 lentelė. Migracijos laiko pakartojamumas

Dienos bėgyje (n=15) Kelių dienų bėgyje (n=30) Parametras SSN, % P.I., % SSN, % P.I., % Migracijos laikas 1.15 ±0.58 2.58 ±0.92

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040

m

A

V

Laikas, min

13 pav. Epidermio ekstraktai nerodo jokio smailių persidengimo. Sąlygos: 62 mM boratinis

buferis + 8 % MeOH (v/v), pH – nereguliuotas, įtampa – 24 kV, temperatūra – 30 oC, nedengtas silikagelinis kapiliaras, vidinis diametras – 50 μm, efektyvus ilgis – 58,3 cm, bendras ilgis – 62,8 cm.

2.6.2. Tikslumas

Išvystyto metodo tikslumas buvo įvertintas apskaičiuojant ir įvertinant 5 skirtingų koncentracijų tirpalų pataisytą smailės plotą (Apat=PL/ML). Tikslumui įvertinti apskaičiuoti kriterijai: nustatyta koncentracija, %; SSN, %; P.I., % (SSN apskaičiuotas pagal tikrąją, 100 % koncentraciją, o ne gautų rezultatų vidurkį tam, kad labiau apibūdintų tikslumo savybes, gautas rezultatas parodo nuokrypį nuo 100 % koncentracijos; P.I. apskaičiuotas pagal gautą SSN). Visi skaičiavimai parodo, kad metodas yra tikslus ir atitinka standartus, 4 lentelė.

4 lentelė. Išvystyto metodo tikslumas ir apskaičiuoti statistiniai parametrai

Koncentracija, mg/ml Nustatyta koncentracija, %

0,309 99,98 0,216 99,81 0,135 98,33 0,108 100,01 0,051 101,62 SSN., % (n=5) 1.17 P.I., % (n=5) 1.03

Išvystyto metodo glaudumas taip pat kaip ir tikslumas, buvo įvertintas apskaičiuojant 3 skirtingų koncentracijų tirpalų pataisytus smailės plotus (Apat=PL/ML). Glaudumui įvertinti apskaičiuoti kriterijai: SSN, %; P.I., %. Kiekvieno bandymo gauti rezultatai buvo perskaičiuoti į nuokrypį procentais nuo tikrosios reikšmės ir tada apskaičiuoti SSN ir P.I. Visi skaičiavimai parodo, kad metodas yra tikslus ir atitinka standartus, 5 lentelė.

5 lentelė. Išvystyto metodo glaudumas ir apskaičiuoti statistiniai parametrai

Parametrai SSN (%) P.I. (%)

Pakartojamumas (n=9) 1.94 ±1.27

Glaudumas kelių dienų bėgyje (n=9) 3.07 ±2.01

2.6.4. Tiesiškumas ir nustatymo ribos

ALA kalibracinė kreivė buvo sudaryta pagal išorinį standartą su šešiomis skirtingomis koncentracijomis nuo 0,025 mg/ml iki 0,300 mg/ml. Pavyko pasiekti gerą koreliacijos koeficientą, kuris patvirtina puikų tiesiškumą nustatymo ribose (14 pav).

2.6.5. Kiekybinio nustatymo ir radimo ribos

Kiekybinio nustatymo ir radimo ribos buvo apskaičiuotos pagal formulę pateiktą ICH gairėse [103]: S DL3,3 (14) S QL10 (15) DL – Radimo riba;

QL – Kiekybinio nustatymo riba;

σ – Vidutinis standartinis triukšmų nuokrypis;

S – Kalibracinės kreivės pasvirimo kampas (139103,55126)

Vidutinis standartinis triukšmų nuokrypis buvo rastas atlikus analizę su tuščiu mėginiu (izotoninis fosfatinis buferis + MeOH, 1:1 (v/v)) ties analitės išejimo laiku buvo integruoti susidariusių triukšmų apskaičiuoti pataisyti plotai, o jų standartinis nuokrypis (n=25) paskaičiuotas naudojant MS Excell programą. Gauti rezultatai: DL=1,04 µg/ml; QL=3,18 µg/ml.

Buvo ištirta galimybė padidinti radimo ir kiekybinio nustatyto ribas. Pastebėta, jog dėl esančio metabolio bandinyje pasireiškia elektrosuspaudimo efektas, todėl injekavus žymiai didesnį bandinio tūrį smailės neišplatėja ir yra tinkamos kiekybiniam nustatymui (15 pav).

15 pav. Nustatytos koncentracijos su skirtingo tūrio bandinių injekcijomis.