KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
Giedrė Raustytė
Eksperimentinio ūminio vidurinės ausies uždegimo
sukeltos timpanosklerozės
patomorfologiniai ir osteogeneziniai ypatumai
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai, medicina (07 B)
Disertacija rengta 2001 – 2005 metais Kauno medicinos universitete, bendradarbiaujant su Švedijos Lundo universitetu ir Danijos Kopenhagos Gentofte universiteto ligonine.
Mokslinis vadovas:
doc. dr. Vytenis Kinduris (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 07 B)
Konsultantai:
doc. dr. Algidas Basevičius (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 07 B)
prof. habil. dr. Kazys Daukša (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 07 B)
SANTRUMPOS
x - vidurkis
BM - bazinė membrana
Ca - kalcis
CD68 - molekulinis paviršiaus kompleksas
CFU/ml - kolonijas formuojantys vienetai viename mililitre
CI - pasikliautinasis intervalas
F - fibrocitai
GM-CSF - granuliocitų ir makrofagocitų koloniją stimuliuojantis veiksnys Hib - b serotipo Haemophilus influenzae
IL - interleukinas
iNOS - azoto oksido ligazė Int - tarpląstelinė medžiaga
L - limfocitai
M - makrofagocitai
m - miringotomuotas būgnelis
M-CSF - makrofagocitų koloniją stimuliuojantis veiksnys mRNR - informacinė RNR
n - nemiringotomuotas būgnelis
N - tiriamųjų skaičius
NTHi - netipuojamas Haemophilus influenzae
ON (SPARC) - osteonektinas
OPG - osteoprotegerinas
OPN - osteopontinas
PF - pars flaccida
PMN - polimorfiniai branduoliniai leukocitai PT - pars tensa
PTc - pars tensa centrinė dalis
PTp - pars tensa periferinė dalis
r - koreliacijos koeficientas
r/l - regos lauke
SE - vidutinė kvadratinė paklaida α-TNF - α tumoro nekrozės veiksnys β-TGF - β audinių augimo veiksnys
TURINYS
1. Įvadas...5
1.1. Tiriamoji problema ...5
1.2. Darbo aktualumas ir praktinė reikšmė...6
1.3. Darbo tikslas...6
1.4. Darbo uždaviniai...7
1.5. Ginamieji disertacijos teiginiai...7
2. Tyrimų apžvalga...8
2.1. Timpanosklerozės apibūdinimas, istoriniai jos tyrimo aspektai ir klinikinė reikšmė ...8
2.2. Žmogaus ir laboratorinės žiurkės vidurinės ausies anatominiai ir funkciniai aspektai .11 2.3. Laboratoriniai gyvūnai, naudojami ausies uždegimo ir timpanosklerozės tyrimams ...14
2.4. Ūminio vidurinės ausies uždegimo sukėlėjai ...18
2.5. Miringotomija...19
2.6. Timpanosklerozės patogenezė...19
2.7. Timpanosklerozės patologinė histologija ...21
2.8. Kalcifikacija ir osifikacija timpanoskleroziniuose ir kitokiuose audiniuose...22
2.9. Kaulėjimą reguliuojantys veiksniai ...24
3. Darbo metodologija ...27
3.1. Tyrimo metodas ir eiga...27
3.1.1. Eksperimentiniai gyvūnai...27
3.1.2. Bakterijų kultūra...28
3.1.3. Eksperimento eiga ...29
3.1.4. Medžiagos histologinis ir imunohistocheminis tyrimas ...30
3.2. Morfometriniai tyrimo metodai ...33
3.2.1. Otomikroskopinis įvertinimas ...33
3.2.2. Histologinis įvertinimas...34
3.3. Statistinė duomenų analizė ...36
4. Tyrimų rezultatai...37
4.1. Otomikroskopinio tyrimo rezultatai ...37
4.2. Histologinio tyrimo rezultatai...39
4.2.1. Bendrieji būgnelių uždegimo požymiai...39
4.2.2. Kalcio fosfato sankaupų būgnelyje ypatumai...40
4.3. Imunohistocheminio tyrimo rezultatai ...42
4.3.1. Osteopontino imunoreaktyvumo ypatumai ...42
4.3.2. Osteoprotegerino imunoreaktyvumo ypatumai ...43
4.3.3. Osteonektino imunoreaktyvumo ypatumai...44
4.3.4. CD68 makrofagocitų imunoreaktyvumas...46
4.4. Kontrolinių audinių tyrimo ypatumai...46
4.5. Histologinių ir imunohistocheminių duomenų analizė...47
4.5.1. Otito eigos tyrimas ...47
4.5.2. Būgnelių kalcifikacijos tyrimas ...56
4.5.3. Uždegimo bei miringotomijos įtaka būgnelio pokyčiams ir kalcifikacijai...60
4.6. Rezultatų apibendrinimas ...74
5. Išvados ...81
6. Cituotos literatūros sąrašas ...82
7. Publikacijų sąrašas...100
1. ĮVADAS
1.1. Tiriamoji problema
Timpanosklerozė yra sudėtinga ir nepakankamai ištirta patologija, kurią intensyviai nagrinėja šiuolaikinė otorinolaringologija. Timpanosklerozė – tai būklė, sukelianti būgnelio ir vidurinės ausies kalcifikaciją. Timpanosklerozė nustatoma daugiau nei trečdaliui pacientų, sergančių ar sirgusių ausų ligomis. Manoma, kad tai yra negrįžtama gijimo baigtis. Timpanosklerozės patogenezė nėra aiški, todėl tiksliai nežinoma, kaip išvengti jos atsiradimo. Dėl timpanosklerozinių sankaupų didėja vidurinės ausies akustinis pasipriešinimas, blogėja garso perdavimas į vidinę ausį ir pasireiškia įvairaus laipsnio klausos pablogėjimas. Šios patologijos etiologinio gydymo nėra. Vaikystėje timpanosklerozė paprastai pasireiškia po persirgto ūminio pūlinio otito, ypač su pasikartojančiais ligos epizodais, ar po sekrecinio otito bei gydymo ventiliaciniais vamzdeliais ir/ar miringotomija [De Beer ir kt., 2005, Friedman ir kt., 2001, Maw, 1991, Tos ir kt., 1983]. Vidurinės ausies uždegimas yra viena iš dažniausių vaikų ligų. Epidemiologinių tyrimų duomenimis, dažniausiai otitu vaikai serga pirmaisiais gyvenimo metais [Alho, 1997, Alho ir kt., 1991, Daly ir kt., 1999, Daly ir kt., 2005, Paradise ir kt., 1997]. Ūminis vidurinės ausies uždegimas dažniausiai pradedamas gydyti antibakteriniais vaistais ir tais atvejais, jei gydymas nėra sėkmingas ar jei gydant antibiotikais blogėja vaiko būklė, atliekama miringotomija. Miringotomija tinka stipriam skausmingam sindromui slopinti, karščiavimui mažinti ir rimtų komplikacijų (mastoidito, meningito) profilaktikai [Bluestone, 1998, Nomura ir kt., 2005]. Ar miringotomija yra efektyvi vaikų ūminio vidurinės ausies uždegimo gydymo priemonė ir ar toks gydymas gali pakeisti ūminio otito eigą bei pasekmes, tiksliai nežinoma, be to, diskutuojama apie miringotomijos įtaką timpanosklerozės patogenezei.
Manoma, kad atsirandant timpanosklerozei patologinė kalcifikacija būgnelyje būna panaši į kaulinio audinio matricos kalcifikaciją ir persitvarkymą (remodeliavimą), kai osteogenezę reguliuoja keletas baltymų. Šiuo metu iš jų geriausiai žinomi ir svarbiausiais laikomi osteopontinas, osteoprotegerinas ir osteonektinas. Jau yra nustatytas kai kurių baltymų reikšmingumas žmogaus aterogenezei ir jų imunolokalizacija žmogaus kraujagyslių sienelėje. Vieno iš osteogenezę reguliuojančių baltymų osteopontino imunoreaktyvumas yra nustatytas ir žmogaus vidurinės ausies audiniuose, pasireiškus lėtiniam vidurinės ausies uždegimui ir timpanosklerozei [Makiishi-Shimobayashi ir kt., 2004, Makiishi-Shimobayashi ir kt., 2001]. Osteoprotegerino aktyvumas tyrinėtas žmogaus ir laboratorinio gyvūno cholesteatomoje [Hamzei ir kt., 2003, Sudhoff ir kt., 2004], tačiau duomenų apie šiuos
osteogenezės veiksnius būgnelyje, pasireiškus ūminiam vidurinės ausies uždegimui, nėra. Osteonektino lokalizacija, imunoreaktyvumas nei žmogaus, nei laboratorinio gyvūno sveikuose bei uždegimo apimtuose vidurinės ausies audiniuose iki šiol netirti. Duomenų apie osteopontino ir osteoprotegerino aktyvumą sveikoje vidurinėje ausyje taip pat nėra.
Išanalizavus Lietuvos bei užsienio šalių mokslinę literatūrą, vienodos nuomonės timpanosklerozės kilmės ir patogenezės klausimais nerasta. Siekiant užpildyti šią duomenų ir tyrimų spragą ir ieškant naujų timpanosklerozės patogenezės aspektų, moksliniu požiūriu reikšmingas osteogenezės baltymų tyrimas būgnelyje ūminio vidurinės ausies uždegimo metu.
1.2. Darbo aktualumas ir praktinė reikšmė
Disertaciniame darbe aprašomas fundamentinis tyrimas timpanosklerozės proceso esmei ūminio eksperimentinio vidurinės ausies uždegimo metu atskleisti. Imunohistocheminiais metodais ištirta osteogenezės baltymų – osteopontino, osteoprotegerino ir osteonektino – imunoreaktyvumas bei lokalizacija būgnelio audiniuose ūminio vidurinės ausies uždegimo metu ir atlikus miringotomiją. Tyrinėtas šių osteogenezės veiksnių ir kalcifikacijos sąryšis būgnelyje. Šių osteogenezės baltymų imunoreaktyvumas bei lokalizacija tiek sveikame laboratorinio gyvūno būgnelyje, tiek ir eksperimentinio ūminio vidurinės ausies uždegimo ir miringotomijos paveiktame būgnelyje tyrinėti pirmą kartą. Nustatyta, kad tokių osteogenezės veiksnių imunoreaktyvumo sveiko būgnelio audiniuose nebūna. Taikyti pažangūs imunohistocheminiai tyrimo metodai yra labai specifiški. Iki šiol Lietuvos mokslininkai eksperimentinių timpanosklerozės tyrimų nevykdė. Tokio pobūdžio tęstiniai klinikiniai tyrimai timpanosklerozės patogenezei tirti ūminio vidurinės ausies uždegimo metu neįmanomi, todėl timpanosklerozės patomorfologiniams ir patogenezės aspektams tyrinėti pasirinkta eksperimentinio ūminio vidurinės ausies uždegimo, sukelto Haemophilus
influenzae, tyrimo metodika bei tinkamai parinkta eksperimentinio tyrimo imtis. Disertacijoje
aptarta miringotomijos įtaka eksperimentinei būgnelių kalcifikacijai. Pagal šio eksperimentinio tyrimo rezultatus įvertinti ir aprašyti nauji timpanosklerozės patomorfologiniai bei patogenezės ypatumai praplečia supratimą apie audinių kalkėjimą uždegimo sukeltų vidurinės ausies ligų metu.
1.3. Darbo tikslas
Ištirti patomorfologinius timpanosklerozės ypatumus bei baltymus, lemiančius būgnelio kalcifikaciją ir osifikaciją, eksperimentinio netipuojamo Haemophilus influenzae sukelto ūminio vidurinės ausies uždegimo metu ir atlikus miringotomiją.
1.4. Darbo uždaviniai
1. Otoskopiniu būdu ištirti eksperimentinio ūminio vidurinės ausies uždegimo, sukelto netipuojamo Haemophilus influenzae, eigą ir įvertinti uždegimo pokyčių dinamiką laboratorinių žiurkių būgnelyje.
2. Ištirti kontrolinės grupės eksperimentinių gyvūnų būgnelių morfologinius ypatumus ir osteogenezės baltymų (osteopontino, osteoprotegerino ir osteonektino) imunoreaktyvumą.
3. Histologinio tyrimo metodais ištirti laboratorinių žiurkių būgnelio patomorfologinius pokyčius, atsirandančius sukėlus ūminį vidurinės ausies uždegimą ir atlikus miringotomiją.
4. Imunohistocheminiu metodu ištirti osteogenezės baltymo osteopontino imunoreaktyvumą bei lokalizaciją būgneliuose, sukėlus ūminį vidurinės ausies uždegimą ir atlikus miringotomiją.
5. Imunohistocheminiu metodu ištirti osteoprotegerino imunoreaktyvumą bei lokalizaciją būgneliuose, sukėlus ūminį vidurinės ausies uždegimą ir atlikus miringotomiją.
6. Imunohistocheminiu metodu ištirti osteonektino imunoreaktyvumą bei lokalizaciją būgneliuose, sukėlus ūminį vidurinės ausies uždegimą ir atlikus miringotomiją.
1.5. Ginamieji disertacijos teiginiai
1. Ūminio eksperimentinio vidurinės ausies uždegimo, sukelto netipuojamo
Haemophilus influenzae, eiga ir struktūriniai pokyčiai būgneliuose ankstyvuoju ir
vėlyvuoju uždegimo laikotarpiu skiriasi priklausomai nuo gydymo (miringotomijos).
2. Kontroliniame laboratorinio gyvūno būgnelyje osteogenezės baltymams – osteopontinui, osteoprotegerinui ir osteonektinui – imunoreaktyvumas nebūdingas.
3. Kalcio fosfato sankaupų ir osteogenezės veiksnių (osteopontino, osteoprotegerino ir osteonektino) lokalizacija bei imunoreaktyvumas būgnelyje kinta uždegimo metu.
4. Būgnelių aktyvinti makrofagocitai ir fibrocitai daro įtaką osteogenezės veiksnių (osteopontino, osteoprotegerino) aktyvumui.
2. TYRIMŲ APŽVALGA
2.1. Timpanosklerozės apibūdinimas, istoriniai jos tyrimo aspektai ir klinikinė
reikšmė
Terminas tympanosclerosis (timpanosklerozė) yra kilęs iš trijų graikų kalbos žodžių kamienų: tympanum, reiškiantis „būgninė ertmė“; scleros, reiškiantis „kietas“; is, reiškiantis „būsena“. Plačiąja prasme, šis terminas apima sklerozinius pokyčius būgnelyje ir būgninėje ertmėje. Siauresnis terminas myringosclerosis (miringosklerozė) (myrinx, graikiškai „būgnelis“) nusako sklerozinį procesą būgnelyje.
Miringo- ir timpanosklerozė yra patologinė būsena, pažeidžianti būgnelio skaidulinį sluoksnį (lamina propria) ir vidurinės ausies gleivinę, pasireiškianti šių sričių jungiamojo audinio hialinizacija ir kalcifikacija. Klinikinėje praktikoje timpanosklerozė pasireiškia balkšvomis kalkinėmis plokštelėmis būgnelyje ar vidurinėje ausyje (1 pav.).
1 pav. Žmogaus ausies būgnelio timpanosklerozė
Timpanosklerozė žinoma jau daugelį metų. Pirmą kartą timpanosklerozė kaip „kalkinės dėmės“ būgnelyje paminėta 1734 m. I. F. Cassebohm atlikto ausies anatominio preparavimo metu [Cassebohm, 1734]. Pirmasis detalus timpanosklerozės, apimančios ir būgninę ertmę, aprašymas minimas 1863 m. von A. F. Tröltsch. Jis pasiūlė „paukensclerose“ („būgninės ertmės sklerozė“) terminą, kuriuo apibūdino neįprastą būgninės ertmės gleivinės kietumą, paslankumo ir elastingumo praradimą [Tröltsch, 1869]. Vėliau, XIX amžiaus pabaigos
mokslininkų darbuose, sekė panašūs šios būklės apibūdinimai [Grüber, 1888, Habermann, 1892, Pomeroy, 1883, St John Roosa, 1891, Walb, 1893]. Histopatologines timpanosklerozės ypatybes, vėliau padėjusias skirti klinikinėje praktikoje sunkiai diferencijuojamas timpanosklerozę ir otosklerozę, pirmieji ėmė tyrinėti J.Toynbee 1860 m. ir A. Politzer 1883 m. [Politzer, 1883, Toynbee, 1860]. Po pradinės susidomėjimo bangos, timpanosklerozė buvo pamiršta daugiau nei pusę amžiaus. Ja vėl susidomėta XX amžiaus viduryje, kai F. Zöllner ir C. Beck, žiūrėdami pro operacinį mikroskopą, pateikė aiškų ir išsamų šios patologijos apibūdinimą [Zollner ir Beck, 1955]. 1956 m. Londono laringologijos ir otologijos instituto mokslininkas F. Zöllner pasiūlė anglišką terminą tympanosclerosis vietoje anksčiau vartotojo
paukensclerose [Zollner, 1956]. Tai buvo pradžia didėjančio susidomėjimo šia, ligi šiol
sunkiai suprantama, neaiškios etiologijos bei patogenezės, patologija.
Lietuvoje timpanosklerozės klinikiniai aspektai pradėti tyrinėti palyginti neseniai [Kinduris ir Raustytė, 2001a, Kinduris ir Raustytė, 2001b, Raustyte ir Kinduris, 2004].
Remiantis epidemiologinių tyrimų duomenimis, bendrojoje sveikų žmonių populiacijoje timpanosklerozės paplitimas yra nuo 1 iki 21% [Friedman ir kt., 2001, Raustyte ir Kinduris, 2004, Rudin ir kt., 1983, Stangerup ir kt., 1995, Stangerup ir kt., 1994]. Sveikų vaikų populiacijos tyrimuose įvairių autorių rasti būgnelių otoskopiniai pakitimai pažymėti 1 lentelėje.
1 lentelė. Otoskopiniai sveikų vaikų ausų būgnelių pokyčiai
Pakitę otoskopiniai požymiai Pozicija
(retrakcija) Pars tensa struktūra Tyrimas Pakitusių būgnelių skaičius Spalva (gelsvas, pilkšvas) Pars flaccida Pars tensa Judrumas (suma-žėjęs) Miringo
sklerozėAtrofija Randai Sustorėjęs [Kinduris ir Raustytė, 2001a], Lietuva (85 vaikai) 50,6% 31,8% 10,0% 15,9% 21,2% 9,4% 1,8% 7,1% 11,2% [Haapaniemi ir kt., 1995], Suomija (687 vaikai) 33,7% 9,3% 11,5% 5,6% 3,7% 2,8% 0,6% 6,1% 1,5% [Eagles ir kt., 1967], JAV (1191 vaikas) 29,6% 1,1% 9,2% - 3,5% 1,2% - 4,7% -
Literatūroje dažniausiai minima, kad timpanosklerozė pasireiškia po persirgto ūminio pūlinio otito, ypač su pasikartojančiais ligos epizodais, ar po sekrecinio otito bei gydymo ventiliaciniais vamzdeliais ir/ar miringotomija [De Beer ir kt., 2005, Friedman ir kt., 2001, Maw, 1991, Tos ir kt., 1983]. Įvairių autorių tyrimų duomenimis, 19-62% vaikų ūminiu vidurinės ausies uždegimu suserga iki 1 metų amžiaus, o iki 3 metų amžiaus net 50-84% vaikų bent vieną kartą yra sirgę ausies uždegimu. 80% ikimokyklinio amžiaus vaikų yra sirgę sekreciniu otitu [Alho, 1997, Alho ir kt., 1991, Daly ir kt., 1999, Daly ir kt., 2005, Paradise ir kt., 1997]. Įvairių klinikų duomenimis, timpanosklerozė po persirgtų ūminių pūlinių otitų varijuoja nuo 3 iki 43% [Bhaya ir kt., 1993, De Beer ir kt., 2005].
Įvairių šalių tyrėjai klinikinėse studijose ieškojo ryšio tarp gydymo ventiliaciniais vamzdeliais ir timpanosklerozės pasireiškimo. Pagal danų otologus M. Tos ir S. E. Stangerup, tarp pacientų, sirgusių sekreciniu otitu ir gydytų ventiliaciniais vamzdeliais, timpanosklerozė buvo 59%, o tarp gydytų miringotomija be vamzdelių – 13% [Tos ir kt., 1983, Tos ir Stangerup, 1989]. A. R. Maw duomenimis (D. Britanija), po gydymo ventiliaciniais vamzdeliais timpanosklerozė nustatyta nuo 37 iki 49% atvejų [Maw, 1991]. Kauno medicinos universiteto Ausų, nosies, gerklės ligų klinikos duomenimis, po timpanostomijos timpanosklerozė nustatyta 37,8% atvejų [Gradauskienė, 1999].
Timpanosklerozė nustatoma daugiau nei trečdaliui pacientų, sergančių ar sirgusių lėtinėmis ausų ligomis [Austin, 1988]. Literatūroje nurodoma, kad timpanosklerozė pasireiškia 19,6% atvejų, kai būgnelis yra vientisas, ir 43% – esant būgnelio perforacijai dėl lėtinio otito [da Costa ir kt., 1992].
Timpanosklerozinės masės gali būti kaip izoliuoti būgnelio ar vidurinės ausies depozitai arba masyvios, apgaubiančios klausos kauliukus ir blokuojančios jų grandinės judesius, ar užpildančios vidurinę ausį [Austin, 1988, Kinduris ir Raustytė, 2001b]. Dėl timpanosklerozinių sankaupų didėja vidurinės ausies akustinis impedansas, blogėja garso perdavimas į vidinę ausį, todėl neretai būna įvairaus laipsnio klausos pablogėjimas. Kai timpanosklerozė pažeidžia vidurinės ausies gleivinę, apie 60% pacientų pasireiškia konduktyvaus tipo klausos pažeidimas dėl klausos kauliukų grandinės fiksacijos [Asiri ir kt., 1999, Wielinga ir Kerr, 1993]. Sunkesniais atvejais prikurtimas gali būti dėl vidinės ausies pažeidimo [Forseni ir kt., 1997]. Timpanosklerozinių plokštelių pobūdis nepriklauso nuo pradinių klinikinių simptomų ir uždegimo formos. Taip pat nerandama priklausomybės tarp timpanosklerozės laipsnio ir klausos netekimo sunkumo. Mažos plokštelės gali sukelti žymesnį klausos netekimą, tuo tarpu didelės plokštelės gali nesukelti jokio prikurtimo. Todėl klausos pažeidimą nulemia ne plokštelių dydis, o jų lokalizacija, t. y. ar jos sutrikdo garso transformaciją vidurinėje ausyje, ar ne [Bhaya ir kt., 1993].
Vertinant timpanosklerozės įtaką klausai, vyrauja bendra nuomonė, kad būgnelių skleroziniai pokyčiai neturi įtakos klausai, o audiologiniais tyrimais nustatyta, kad tuomet klausos pažeidimas yra mažesnis nei 0,5 dB [Skinner ir kt., 1988, Tos ir Stangerup, 1989]. Be to, nerandama priklausomybės tarp timpanosklerozės sunkumo ir klausos slenksčių [Gradauskienė, 1999, Johnston ir kt., 2004, Kinduris ir Raustytė, 2001a, Maw, 1991, Skinner ir kt., 1988, Tos ir Stangerup, 1989]. Klinikai reikšminga laikoma tokia timpanosklerozė, kai, siekiant klausos pagerėjimo, reikia chirurginio gydymo. Ji pasireiškia mažiau nei pusei pacientų, sergančių įvairaus laipsnio timpanoskleroze [Austin, 1988]. Esant klinikai reikšmingai timpanosklerozei, net 90% pacientų liga apima klausos kauliukų grandinę, o 50% iš jų būna kilpos fiksacija bei plaktuko ir/ar priekalo fiksacija atike [Austin, 1988, Kinduris ir Raustytė, 2001b]. Pusei pacientų, sergančių timpanoskleroze, jos požymių buvo ir būgnelyje. Trečdaliui jų buvo reikalinga chirurginė intervencija [Austin, 1988].
Šiuo metu naudojamos įvairios timpanosklerozės chirurginio gydymo metodikos arba klausos protezavimas neoperabiliais atvejais. Dėl timpanosklerozės proceso lėtai progresuojančios eigos timpanosklerozinių plokštelių formavimasis gali tęstis ir po operacijos. Šiais atvejais ne visuomet išlieka stabilus operacijos metu pasiektas klausos pagerėjimas [Austin, 1988, Schiff, 1983]. Kol kas etiologinio šios būklės gydymo nėra [Forseni ir kt., 1997, Forseni ir kt., 1999b]. Taigi, svarbu daugiau dėmesio skirti timpanosklerozės profilaktikai, t.y. racionaliai gydyti ūminį, sekrecinį ar lėtinį vidurinės ausies uždegimą, bei numatyti nepalankios eigos, kai yra galima audinių sklerozė, vidurinės ausies uždegimo atvejus.
2.2. Žmogaus ir laboratorinės žiurkės vidurinės ausies anatominiai ir funkciniai
aspektai
S. Hellström ir N. Albiin (Švedija) tyrinėjo ir detaliai aprašė žiurkės vidurinės ausies anatomiją ir histologiją [Albiin ir kt., 1986, Hellstrom ir kt., 1982a]. Dauguma aspektų žiurkės vidurinė ausis yra panaši į žmogaus. Žmogaus kaip ir žiurkės būgninė ertmė klinikinės anatomijos aspektu dalijama į antbūgninę (epitympanum), vidurinę būgninę (mesotympanum) ir apatinę būgninę (hipotympanum) dalis. Tačiau yra ir kai kurių struktūrinių skirtumų. Skirtingai nei žmonės, žiurkės neturi speninės ataugos speninių ląstelių, tačiau jų vietoje yra didelė vidurinės ausies pūslė (bulla mastoidea). Antbūgninėje dalyje (epitympanum), arba atike, yra žiurkės vidurinės ausies kauliukai. Atikas dalijamas į lateralinę ir medialinę dalis, o pastaroji per siaurą sąsmauką susisiekia su vidurine būgnine dalimi (mesotympanum). Antbūgninė ir vidurinė būgninė dalys, kaip ir pas žmones, yra atskirtos vidurinės ausies kauliukų [Proctor, 1989].
Medialinėje apatinės būgninės dalies (hipotympanum) sienoje, į priekį nuo promontoriumo, yra klausomojo vamzdžio anga, o į viršų bei priekį nuo jos – fossa nasalis. Apvalaus langelio niša ir ovalus langelis yra už promontoriumo. Hipotympanum atitinka didžiausią graužikų vidurinės ausies pūslės dalį [Hebel ir Stromberg, 1976, Hellstrom ir kt., 1982a].
Žiurkės vidurinės ausies gleivinė yra panaši į žmogaus vidurinės ausies gleivinę. Didžiausia vidurinės ausies dalis yra išklota vienasluoksniu plokščiuoju ar kubiniu epiteliu [Albiin ir kt., 1986, Lim, 1976]. Blakstienotosios epitelio ląstelės yra susitelkusios dviejuose traktuose – priekiniame ir apatiniame [Shimada ir Lim, 1972]. Šie traktai yra padengti vienasluoksniu daugiaeiliu stulpiniu epiteliu su blakstienotosiomis ir sekrecinėmis ląstelėmis.
Bendrais bruožais žiurkės klausomojo vamzdžio anatomija yra panaši į žmogaus. Žiurkės klausomasis vamzdis yra horizontalus, o atstumas nuo nosiaryklinės iki būgninės klausomojo vamzdžio angos yra 4,5 mm [Albiin ir kt., 1983]. Klausomasis vamzdis išklotas daugiaeiliu respiraciniu epiteliu su taurinėmis, blakstienotosiomis, sekrecinėmis ir pamatinėmis ląstelėmis. Jo skaiduliniame sluoksnyje (lamina propria) gausu serozinių ir mukozinių liaukučių. Nustatyta, kad žiurkės klausomojo vamzdžio atsidarymo slėgis atitinka žmogaus [Hellstrom ir Stenfors, 1983]. Klausomasis vamzdis atlieka šias funkcijas: vidurinės ausies ventiliacija, vidurinės ausies slėgio reguliacija, vidurinės ausies drenažas, vidurinės ausies apsauga nuo spaudimo nosiaryklėje pokyčių ir sekreto patekimo iš jos. Taigi klausomojo vamzdžio funkcija yra svarbi vidurinės ausies uždegimo patogenezėje [Bluestone, 1996, Bluestone ir kt., 2005]. Be to, klausomojo vamzdžio liaukutės ir epitelio sekrecinės ląstelės sekretuoja mucinus, akvaporinus ir surfaktantą. Sekreciniai antimikrobiniai baltymai ir peptidai (lizocimas, laktoferinas ir kt.) yra svarbūs gynybai nuo patogenų. Klausomojo vamzdžio mukociliarinis aparatas kartu su įgimtais imuninės sistemos elementais sudaro pirmąjį apsaugos barjerą [Lim ir kt., 2000].
Būgnelis
Būgnelis sudaro lateralinę vidurinės ausies ertmės sieną. Pagrindinės būgnelio funkcijos yra garso perdavimo ir barjerinė, apsauganti nuo išorinės infekcijos ir iritantų. Būgnelis yra svarbus vidurinės ausies būklės diagnostikai. Pirmasis žmogaus būgnelį aprašė Hipokratas maždaug 400 m. pr. Kr. [Saunders ir kt., 1980, Weir, 1990]. 1832 m. H. J. Shrapnell būgnelį aprašė kaip susidedantį iš dviejų dalių: įtemptosios – pars tensa ir laisvosios – pars flaccida [Shrapnell, 1832]. Įtemptosios dalies kraštuose yra fibrozinis žiedas (anulus fibrosus), kuris įsistato į smilkinkaulio būgninio žiedo kaulinę vagelę (sulcus tympanicus) [Vitkus ir kt., 2003]. Žmogaus būgnelio vertikalusis matmuo yra 8,5-10 mm, o horizontalusis apie 8-9 mm.
Pars tensa
Žiurkės pars tensa plotas apie 5,5 mm2 [Widemar ir kt., 1984], t.y. apie 1/10 žmogaus būgnelio ploto, jos storis 5-10 µm, o žmonių pars tensa storis apie 64-95 µm. Žiurkės, kaip ir žmogaus, pars tensa susideda iš trijų sluoksnių. Išorinį sluoksnį sudaro daugiasluoksnis plokščiasis ragėjantis epitelis iš 2-3 ląstelių eilių. Vidinį sluoksnį sudaro vienasluoksnis plokščiasis epitelis. Vidurinis, skaidulinis sluoksnis (lamina propria), susideda iš išorinių radialinių ir vidinių cirkuliarinių tankiai išsidėsčiusių kolageno skaidulų, kurias supa plonas subepiderminis ir subepitelinis puraus jungiamojo audinio sluoksnis [Schmidt ir Hellstrom, 1991]. Manoma, kad kolageno skaidulų sudėtis yra tokia pati kaip odoje, t.y. I, III, V ir VI tipo [Broekaert, 1995]. Jungiamojo audinio sluoksnyje yra fibroblastocitai ir nervinės skaidulos [Lim, 1968a, Lim, 1995]. Šiose nervinėse skaidulose yra nustatytas substancijos P, kalcitonino tipo peptidų ir neurokinino A imunoreaktyvumas, o anulus fibrosus nervinės skaidulos turi katecholaminų [Goldie ir kt., 1989, Uddman ir kt., 1988]. Būgnelio įtemptojoje dalyje randamos ir putliosios ląstelės (mastocitai), išsidėstę išilgai plaktuko rankenėlės ir
anulus fibrosus srityje [Albiin ir kt., 1986].
Žiurkės būgnelio kraujotaka labai panaši į žmogaus. Pars tensa kraujagyslės, atėję iš išorinės miego arterijos baseino, išsidėsto pagal plaktuko rankenėlę ir anulus fibrosus po išoriniu epiteliu. Fibrozinio žiedo srityje kraujagyslės suformuoja smulkų tinklą, yra išsidėstę po vidiniu epitelio sluoksniu ir patenka iš vidurinės ausies ertmės [Albiin ir kt., 1985]. Normaliomis sąlygomis, centrinėje pars tensa dalyje nėra kraujagyslių [Hellstrom ir kt., 2003].
Pagrindinė pars tensa dalies funkcija yra perduoti garso bangą vidurinės ausies kauliukams ir vidinei ausiai.
Pars flaccida
Laisvoji būgnelio dalis ribojasi su išorinės klausomosios landos oda ir yra storesnė nei
pars tensa. Žiurkės būgnelio pars flaccida sudaro santykinai didesnę būgnelio dalį nei
žmonių. Žiurkės pars flaccida plotas apie 1,10 mm2 ir atitinka 1/5 pars tensa ploto [Grote ir kt., 1989, Widemar ir kt., 1984], o storis apie 30-70 µm [Alm ir kt., 1983]. Žmogaus pars
flaccida sudaro apie 1/9 pars tensa dalį ir užima apie 7,9 mm2 ploto [Widemar ir kt., 1986], o jos storis svyruoja 30-230 µm ribose [Lim, 1970]. Kaip ir įtemptoji būgnelio dalis, laisvoji dalis sudaryta iš išorinio epidermio, vidurinio skaidulinio (lamina propria) ir vidinio gleivinės sluoksnių. Tačiau, lyginant su pars tensa, pars flaccida skaidulinį sluoksnį sudaro purus jungiamasis audinys su smulkiais įvairiomis kryptimis išsidėsčiusiais kolageninių ir elastinių skaidulų pluoštais, fibroblastocitais ir nervinėmis skaidulomis [Lim, 1968b]. Pars flaccida
kraujagyslės taip pat atsišakoja iš išorinės miego arterijos šakų, bet sudaro vidinį ir išorinį tinklus, esančius po išorinio ragėjančio epitelio ir vidinio epitelio sluoksniais [Albiin ir kt., 1985]. Ir žmogaus, ir žiurkės laisvojoje būgnelio dalyje yra gausu mastocitų [Alm ir kt., 1983, Widemar ir kt., 1986].
Ik šiol nėra gerai žinoma pars flaccida fiziologinė svarba. Eksperimentiniai tyrimai rodo, kad pars flaccida greičiau už pars tensa sureaguoja į uždegimo sukeltą stimulą, nepriklausomai nuo jo kilmės, o glaudus ryšys tarp pars flaccida kraujagyslių, nervų ir mastocitų kaip tik ir nulemia šią greitą laisvosios dalies edemą ir vidurinės ausies sekreto gamybą [Goldie ir Hellstrom, 1986, Magnuson ir Hellstrom, 1994, Mattsson ir kt., 1999].
Pars flaccida pasižymi dideliu elastingumu. Žiurkės pars flaccida reaguoja į mažiausią slėgio
pokytį būgninėje ertmėje: jam tampant neigiamu – retrakcija, o tampant teigiamu – išsipūtimu [Hellstrom ir Stenfors, 1983]. Netgi yra manoma, kad pars flaccida veikia kaip baroreceptorius, reaguodamas į mažus vidurinės ausies slėgio pokyčius [Rockley ir Hawke, 1992]. Patologinėmis sąlygomis, retrakciška pars flaccida atitinka sumažėjusios pneumatizacijos speninę ataugą [Sade, 1997, Sade ir Fuchs, 1997, Sade ir kt., 1997]. Diskusijų objektu išlieka klausimas, ar pars flaccida judrumas atlieka slėgio reguliatoriaus funkciją, palaikančią vidurinės ausies garso kondukcinę gebą, ar yra ligos požymis.
Taigi žmogaus ir žiurkės vidurinės ausies struktūros turi ir panašumų, ir skirtumų. Gerai apsvarsčius ir įvertinus skirtumus, laboratorinė žiurkė yra tinkamas gyvūnas eksperimentiniams vidurinės ausies tyrimams [Albiin, 1985].
2.3. Laboratoriniai gyvūnai, naudojami ausies uždegimo ir timpanosklerozės
tyrimams
Turimomis žiniomis, pirmasis eksperimente sukelto vidurinės ausies uždegimo tyrimas buvo aprašytas 1913 m. Ludwig Hayman. Kaip eksperimentinį gyvūną jis panaudojo jūros kiaulytę, o uždegimą sukėlė įvairiomis bakterijomis, inokuliuodamas jas pro nosį, būgnelį ar kaulinę vidurinės ausies sieną. Laboratorinių gyvūnų rūšys, naudotos kituose eksperimentinio vidurinės ausies uždegimo tyrimuose, buvo įvairios ir kito metų bėgyje. Išnagrinėjus literatūrą Medline duomenų bazėje ir atkreipiant dėmesį į terminus animal studies, otitis media,
tympanosclerosis ar myringosclerosis, paaiškėjo, kad dažniausiai vidurinės ausies uždegimo
moksliniuose tyrinėjimuose naudojamas gyvūnas yra laboratorinė žiurkė. Žiurkė yra naudojama daugiau nei pusėje eksperimentinių studijų ir 3 kartus dažniau nei šinšila, kuri yra antrasis pagal pasirinkimo dažnumą eksperimentinis gyvūnas.
Nepaisant sunkumų, iškylančių taikant eksperimentų su laboratoriniais gyvūnais rezultatus žmonėms, akivaizdu, kad laboratorinių gyvūnų tyrimai suteikia naujų, kitaip
negaunamų žinių ir galimybių vidurinės ausies patologijos tyrimuose. Laboratorinių gyvūnų tyrimai palygus su žmonių tyrimais pasižymi tam tikrais pranašumais: gyvūnai gali būti stebimi ir išskiriami patys įdomiausi tiriamieji, galimi kartotiniai tyrimai, galimas nuolatinis ligos eigos monitoringas bei kartotinis kraujo, bakteriologinių ir histologinių pavyzdžių paėmimas. Laboratorinių gyvūnų taikymas įgalina tyrinėti negydomą infekciją, o taip pat ir gydymo bei profilaktikos metodus, tame tarpe ir intervencinius.
Nors buvo atlikta nemažai ūminio otito eksperimentinių tyrimų [Friedmann, 1955a, Friedmann, 1955b, Holmgren, 1940], tačiau iki šiol vis dar išlikęs susidomėjimas šia aktualia tyrimų sritimi. Įvairūs laboratoriniai gyvūnai buvo naudojami tiriant eksperimentinį vidurinės ausies uždegimą: beždžionės (lot. – Simiiformes) [Doyle ir kt., 1980], katės (lot. – Felinae) [Proud ir Odoi, 1970], šunys (lot. – Canis lupus familiaris) [Holmgren, 1940, Sade ir kt., 1959], šinšilos (lot. – Chinchilla) [Bakaletz ir kt., 1999, Giebink ir kt., 1976, Lewis ir kt., 1980], smiltpelės (lot. – Meriones unguiculatus) [Fulghum ir kt., 1982, Parra ir kt., 2002], pelės (lot. – Muridae) [Sabirov ir kt., 2001], jūrų kiaulytės (lot. – Cavia porcellus) [Ryan ir kt., 1986, Sato, 1997, Thore ir kt., 1982], žiurkės (lot. – Rattus) [Hermansson ir kt., 1988, Kuijpers ir kt., 1979, Maeda ir kt., 1976, Stenfors ir kt., 1979]. Buvo sunku rasti vieną gyvūnų rūšį tinkamą visapusiškiems ūminio vidurinės ausies uždegimo tyrimams, tačiau tyrimų įvairovė leido studijuoti skirtingus ūminio vidurinės ausies uždegimo aspektus. Antrasis iš dažniausiai naudojamų laboratorinių gyvūnų buvo šinšilos [Giebink, 1999]. Šinšilos ir smiltpelės vidurinės ausies ir klausomojo vamzdžio struktūra yra tarpusavyje panašios, bet skiriasi nuo žmogaus ir žiurkės. Šinšilos vidurinė ausis nuo žmogaus skiriasi pirmiausia jos daugiaskilte būgnine ertme ir atviru ar pusiau atviru klausomuoju vamzdžiu [Doyle, 1985]. Dar vienas laboratorinis gyvūnas, kuriuo ypač imta domėtis ūminio vidurinės ausies uždegimo tyrimuose, yra pelė, ypač dėl didelių galimybių patogenezės tyrimuose, naudojant padermes su eliminuotais genais [Melhus ir Ryan, 2003].
Dažniausiai pasitaikantys žmogaus ūminio vidurinės ausies uždegimo sukėlėjai yra taip pat tyrinėjami vykdant eksperimentus su laboratoriniais gyvūnais. Ūminio vidurinės ausies uždegimo, sukelto Streptococcus pneumoniae ir Haemophilus influenzae, laboratorinio tyrimo metodika jau yra žinoma kelioms šių sukėlėjų rūšims. Vis dar kyla sunkumų, kuriant gyvūnų tyrimo metodiką Moraxella catarrhalis sukeltam otitui [Doyle, 1989, Westman ir kt., 1999]. Pastebėta, kad Moraxella catarrhalis užkrėstiems laboratoriniams gyvūnams lengvai išsivysto ūminis vidurinės ausies uždegimas, tačiau bakterijos greitai išnyksta iš būgninės ertmės [Doyle, 1989, Fulghum ir Marrow, 1996].
Eksperimentinis vidurinės ausies uždegimas gali būti sukeliamas įvairiais metodais: dirginant būgnelį, sukeliant mechaninę ar funkcinę klausomojo vamzdžio obstrukciją [Doyle
ir kt., 1980, Hellstrom ir kt., 1982b, Holmgren, 1940, Stenfors ir kt., 1982], į vidurinę ausį inokuliuojant gyvą ar negyvą bakterijų ar virusų kultūrą [Davis, 1979, Giebink ir kt., 1976, Lowell ir kt., 1980] ar į nosį inokuliuojant bakterijas ir/ar virusus [Giebink ir kt., 1980, Lim ir kt., 1989]. Vienas iš šių eksperimentinių otito studijų trūkumų yra tai, kad naudojant pneumokokus vidurinės ausies infekcijai sukelti (ypač šinšilai) dažnai išsivysto generalizuotas sepsis su dideliu mirtingumu, kartais siekiančiu 50% [Giebink, 1999].
Laboratorinių gyvūnų eksperimentiniai tyrimai paprastai naudojami ligos etiopatogeneziniams mechanizmams atskleisti ir įvairiems gydymo bei prevencijos metodams išbandyti [Caye-Thomasen ir kt., 1996, Hermansson ir kt., 1992, Melhus ir kt., 1996]. Naudojami įvairūs infekcijos eigos įvertinimo būdai: otomikroskopija, timpanometrija, vidurinės ausies bakterijų kultūros tyrimai, cheminė vidurinės ausies sekreto analizė ir būgnelio bei vidurinės ausies gleivinės ir/ar kaulinių struktūrų morfologinis tyrimas, dažant selektyviais dažymo metodais, atliekant imunomorfologinius tyrimus, pasitelkiant šviesinę ir/ar elektroninę mikroskopiją.
Nors eksperimentinės studijos įnešė svarų indėlį į vidurinės ausies ligų patogenezės supratimą, tačiau dar lieka daug neatsakytų klausimų. Susidomėjimas žiurkės tyrimo metodika eksperimentinio ūminio vidurinės ausies uždegimo ir timpanosklerozės moksliniuose tyrimuose žymiai išaugo apie 1980-uosius metus. Skirtingai nei šinšiloms ar smiltpelėms, žiurkėms būdingas spontaninis ūminis vidurinės ausies uždegimas. Be to, žiurkės neturi polinkio sepsiui, kai jos užkrečiamos pneumokokais intraperitoniniu būdu [Offenbartl ir kt., 1986]. Žiurkė buvo pasirinkta vidurinės ausies tyrimams dėl to, kad jos vidurinės ausies anatomija yra panaši į žmogaus, žiurkėms patogu atlikti eksperimentines manipuliacijas ir chirurgines intervencijas, jų būgnelis lengvai apžiūrimas įprastiniu otomikroskopu ir jos yra santykinai nebrangios. Tyrimai parodė, kad žiurkės būgnelio ir vidurinės ausies struktūra panaši ir gali būti lyginama su žmogaus, todėl laboratorinė žiurkė yra tinkama vidurinės ausies patologijos tyrinėjimams [Hellstrom ir kt., 1982a, Schmidt ir Hellstrom, 1991]. Spraque Dawley žiurkės naudojimą eksperimentinio ūminio vidurinės ausies uždegimo, sukelto Streptococcus pneumoniae, tyrimams pirmoji pasiūlė ir metodiką pritaikė A. Hermansson 1988 m. (Švedija) [Hermansson ir kt., 1988]. Bakterijos į vidurinę ausį buvo įterpiamos bendrinėje nejautroje. Atlikus žiurkės kakle vidurio linijoje inciziją, pasiekiama vidurinės ausies pūslė (bulla) ir adata penetravus jos kaulinę sienelę, inokuliuojama bakterijų suspensija. A. Hermansson atliktuose tyrimuose ūminis vidurinės ausies uždegimas su pūline sekrecija buvo sukeliamas į būgninę ertmę inokuliavus 0,05 ml 3 serotipo Streptococcus pneumoniae suspensijos, kurioje bakterijų koncentracija buvo 2,5x106 CFU/ml. Tyrimai parodė, kad laboratorinių Spraque Dawley žiurkių natūrali vidurinės ausies
infekcijos eiga yra panaši į žmonių. Įprastai per 10 dienų nustatomas spontaninis pasveikimas, tačiau vidurinės ausies gleivinės struktūriniai pokyčiai išlieka keletą mėnesių [Hermansson ir kt., 1990]. Šią metodiką taip pat naudojo M. Svinhufvud ūminio vidurinės ausies uždegimo tyrimuose [Svinhufvud ir kt., 1992a, Svinhufvud ir kt., 1992b, Svinhufvud ir kt., 1993, Svinhufvud ir kt., 1991] ir C. Mattsson timpanosklerozės tyrimuose [Mattsson ir kt., 1997a, Mattsson ir Hellstrom, 1997, Mattsson ir kt., 1999, Mattsson ir kt., 1995, Mattsson ir kt., 1998, Mattsson ir kt., 1997b, Mattsson ir kt., 2000]. Vėliau šios metodikos pagrindu buvo sukurta eksperimentinio ūminio vidurinės ausies uždegimo, sukelto Haemophilus influenzae, tyrimo metodika [Magnuson ir kt., 1997, Melhus ir kt., 1994]. Timpanosklerozė buvo sėkmingai sukelta laboratorinei žiurkei eksperimento sąlygomis ir dažniausiai pasireiškianti „arklio pasagos“ formos aplink būgnelio bambą (umbo) po ūminio vidurinės ausies uždegimo ir/ar miringotomijos ir/ar transtimpaninių ventiliacinių vamzdelių įdėjimo bei žymiau išreikšta padidintos deguonies koncentracijos aplinkoje [Mattsson ir kt., 1995]. C. Mattsson darė prielaidą, kad laisvieji deguonies radikalai dalyvauja vystantis timpanosklerozei, todėl skleroziniai pokyčiai būgnelyje galėtų būti sumažinti naudojant laisvųjų radikalų blokerius [Mattsson ir kt., 1997b]. Anksčiau buvo manyta, kad timpanosklerozė yra lėtinė liga [Schiff, 1983], tačiau pastarųjų metų tyrimai, naudojant žiurkės tyrimo metodiką, parodė, kad timpanosklerozė gali atsirasti praėjus 9 valandoms po miringotomijos [Mattsson ir kt., 1999]. Pneumokokinis ūminis vidurinės ausies uždegimas su miringotomija ar tik miringotomija sukelia būgnelio kolageninio sluoksnio uždegimo reakciją, kuri yra svarbus veiksnys vystantis timpanosklerozei [Mattsson ir kt., 1998]. Eksperimento sąlygomis timpanosklerozės formavimasis gali būti nuslopintas lokaliai skiriant preparatą prieš uždegimą - fenspiridą [Mattsson ir Hellstrom, 1997] ar į pilvaplėvės ertmę injekuojant gliukokortikosteroidą deksametazoną [Mattsson ir kt., 2000].
Pastaraisiais metais ypač imta domėtis imunokompetentinių ląstelių bei uždegimo mediatorių svarba timpanosklerozės patogenezėje [Forseni Flodin, 2001, Forseni Flodin ir Hultcrantz, 2002, Forseni ir kt., 2001, Forseni ir kt., 1999a, Forseni ir kt., 1999b, Jecker ir kt., 1996]. Imunohistocheminiais tyrimais įvertintas makrofagocitų, T ir B limfocitų, neutrofilinių granuliocitų pasklidimas žiurkės vidurinės ausies ir klausomojo vamzdžio gleivinėje bakterinės ir nebakterinės kilmės eksperimentinio otito metu [Jecker ir kt., 1996, Jecker ir kt., 2001]. Nustatyta, kad eksperimentinio ūminio vidurinės ausies uždegimo metu makrofagocitų diferenciacija į osteoklastocitus inicijuoja vidurinės ausies kaulo persitvarkymo (remodeliavimo) procesą, sukeliantį timpanosklerozę [Forseni Flodin, 2001]. Manoma, kad citokinas – interleukinas-6 (IL-6) ir aktyvintų makrofagocitų sintetinama azoto oksido ligazė (iNOS) taip pat dalyvauja smilkinkaulio remodeliavimo procese ir yra svarbūs
timpanosklerozei atsirasti. Taikant imunohistocheminės analizės bei mRNR in situ hibridizacijos metodus, nustatytas IL-6 ir iNOS aktyvumas laboratorinės žiurkės vidurinės ausies audiniuose ūminio vidurinės ausies uždegimo metu [Forseni Flodin ir Hultcrantz, 2002], o žmogaus – sekrecinio otito bei timpanosklerozės metu [Forseni ir kt., 2001].
2.4. Ūminio vidurinės ausies uždegimo sukėlėjai
Dabar dažniausiai nustatomi ūminio vidurinės ausies uždegimo sukėlėjai yra
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae ir Moraxella catarrhalis [Barenkamp ir
kt., 2005, Jacobs ir kt., 1998]. Jų tarpe Streptococcus pneumoniae ir netipuojamas
Haemophilus influenzae aptinkami dažniausiai ir išauginami atitinkamai 18-46% ir 23-30% iš
sekreto vaikų, sergančių ūminiu vidurinės ausies uždegimu [Gehanno ir kt., 2001, St Geme, 2000]. Trečiasis iš dažniausiai sutinkamų ūminio vidurinės ausies uždegimo sukėlėjų yra
Moraxella catarrhalis, išskiriama 10-23% atvejų [Kilpi ir kt., 2001].
Pirmą kartą Haemophilus influenzae kaip patogenas, sukeliantis ūminį vidurinės ausies uždegimą, aprašytas 1928 m. E. Wirth [Wirth, 1928]. Haemophilus influenzae yra smulki Gramo būdu neigiamai besidažanti, nejudri, nehemolizinė fakultatyviai anaerobinė bakterija [Pavilonis ir kt., 2000]. Haemophilus influenzae yra labai heterogeniška bakterijų grupė, kurią galima klasifikuoti pagal antigeninius ir biocheminius žymenis. Kapsulę turinčios padermės skiriamos į a-f serotipus pagal šešis skirtingus kapsulinius polisacharidus. Serotipavimas yra svarbus klinikai, nes invazinė infekcijos forma dažniausiai susijusi su b serotipu. Padermės, neturinčios kapsulės, nereaguoja su kapsuliniais a-f antiserumais ir vadinamos netipuojamomis (nekapsulinėmis). Neturintis kapsulės Haemophilus influenzae yra mažiau virulentiškas nei Streptococcus pneumoniae. Lipooligosacharidai yra pagrindiniai netipuojamo Haemophilus influenzae išorinės membranos komponentai. Šie endotoksinai atsakingi už citokinų aktyvinimą infekcijos metu ir sąveiką su šeimininko organizmu (makroorganizmu). Išskiriami aštuoni Haemophilus influenzae biotipai, iš kurių II ir III dažniausiai aptinkami ūminio vidurinės ausies uždegimo metu [Baron ir kt., 1996]. Nepaisant santykinai dažno paplitimo populiacijoje, dauguma Haemophilus influenzae nešiotojų yra besimptomiai. Nosiaryklė dažniausiai yra vartai sisteminei Haemophilus influenzae infekcijai: b serotipo (Hib) [Gilbert ir kt., 1991], o taip pat ir netipuojamam (NTHi) [Loos ir kt., 1989, Murphy ir kt., 1983].
Netipuojamas Haemophilus influenzae ilgą laiką laikytas komensalu, tačiau pastaraisiais metais susidomėjimas juo didėja. Nuo 5 iki 10% atvejų netipuojamas Haemophilus influenzae gali sukelti ir invazines infekcijas [Falla ir kt., 1993]. Invazinė netipuojamo Haemophilus
influenzae infekcijos forma dažniausiai pasireiškia pneumonija, bakteriemija ar meningitu
[Anderson ir kt., 1995].
Iš visų vidurinės ausies sekreto pasėlių, kuriuose išauginamas Haemophilus influenzae, apie 90% jų sudaro netipuojamas Haemophilus influenzae (NTHi) ir apie 5-10% b serotipo
Haemophilus influenzae (Hib). Pastarųjų metų tyrimuose nustatyta, kad Haemophilus influenzae yra ypač susijęs su pasikartojančiu (recidyvuojančiu) ūminiu vidurinės ausies
uždegimu vaikams [Kilpi ir kt., 2001]. Apie 70% vaikų yra netipuojamo Haemophilus
influenzae nešiotojai, todėl ši bakterija laikoma obligaciniu žmogaus gleivinių parazitu.
Vaikams, persirgusiems netipuojamo Haemophilus influenzae sukeltu ūminiu vidurinės ausies uždegimu, atsiranda serumo baktericidinis aktyvumas prieš patogeną, tačiau naujo netipuojamo Haemophilus influenzae ūminio vidurinės ausies uždegimo epizodo metu šis baktericidinis poveikis nėra pakankama apsauga nuo infekcijos [Barenkamp ir kt., 2005].
2.5. Miringotomija
Miringotomija – tai būgnelio įpjovimas. Iki XVIII a. miringotomija buvo naudojama kurtumo gydymui [Cooper, 1802].
Miringotomija taikoma gydant ūminį ir sekrecinį vidurinės ausies uždegimą. Tačiau nėra patvirtinančių duomenų, kad, siekiant simptomų atslūgimo ir ankstyvo pasveikimo, gydant nekomplikuotą ūminį vidurinės ausies uždegimą, miringotomija ar miringotomija su antibakteriniu gydymu būtų efektyvesnė nei tik antibakterinis gydymas. Gydant sekrecinį vidurinės ausies uždegimą, miringotomija ir ventiliacinių vamzdelių įdėjimas yra reikšmingesni nei vien tik miringotomija [Rosenfeld ir Bluestone, 2003].
Kai miringotomija atliekama eksperimento sąlygomis žiurkės būgnelyje, vystosi ankstyvoji uždegiminė reakcija. Būgnelio pars flaccida dalyje ši uždegiminė reakcija pasireiškia anksčiau nei pars tensa dalyje [Mattsson ir kt., 1999]. Miringotominė žaizda žiurkės būgnelyje sugyja per 9-11 dienų. Gyjant būgneliui, pars tensa dalyje, prieš įaugant epiteliui ir persitvarkant jungiamajam audiniui, atsiranda keratino sankaupa [Stenfors ir kt., 1980]. Jei miringotomija atliekama eksperimentinio ūminio bakterinio vidurinės ausies uždegimo metu, stebimas lėtesnis sveikimas, o jungiamojo audinio struktūra išlieka pakitusi. Tačiau ūminio vidurinės ausies uždegimo metu būgnelio perforacija sugyja greičiau [Magnuson ir kt., 1996].
2.6. Timpanosklerozės patogenezė
Nors timpanosklerozės kilme domimasi eilę metų, atliekamos klinikinės studijos bei eksperimentiniai tyrimai su laboratoriniais gyvūnais, timpanosklerozės etiopatogeneziniai,
histologiniai ir klinikiniai aspektai nėra pakankamai ištirti. Pagal klinikinių ir eksperimentinių stebėjimų duomenis vyrauja nuomonė, kad timpanosklerozė yra ūminio pūlinio, sekrecinio ar lėtinio otito pasekmė, taip pat ji gali būti susijusi su būgnelio trauma ar jatrogeniniu būgnelio vientisumo pažeidimu chirurginės intervencijos metu (timpanostomija, miringotomija) [Bhaya ir kt., 1993, da Costa ir kt., 1992, Forseni ir kt., 1997, Forseni ir kt., 1999b, Mattsson ir kt., 1999, Mattsson ir kt., 1998].
Timpanosklerozė gali pažeisti: 1) būgnelį; 2) klausos kauliukus ir jų sąnarius, būgninės ertmės sieneles; 3) olą (antrum) ir speninę ataugą (retai); 4) vidinę ausį (rečiausiai) [Bhaya ir kt., 1993]. Tik būgnelyje sklerozinės sankaupos aptinkamos apie 80-90%.
Timpanosklerozės formavimuisi svarbus kompaktinis gerai suformuotas ir diferencijuotas būgnelio vidurinis skaidulinis sluoksnis, gaminantis kolageną. Timpanosklerozinio proceso metu keičiasi skaidulinio sluoksnio skaidulų išsidėstymo tvarka. Timpanosklerozė linkusi formuotis tam tikrose būgnelio vietose, t.y. ten, kur skaidulinis sluoksnis yra kompaktiškesnis. Dažniausiai ji aptinkama būgnelio priekiniuose ir užpakaliniuose apatiniuose kvadrantuose ar tarp šių kvadrantų ir dažniau centrinėje nei periferinėje būgnelio dalyje. Būgnelio vidurinis skaidulinis sluoksnis anulus, umbo, užpakalinio viršutinio kvadranto srityje yra laisvesnis (puresnis), o pars flaccida srityje jo visai nėra, todėl šiose srityse timpanosklerozė retesnė. Tai taip pat paaiškina, kad timpanosklerozė dažniau pasireiškia suaugusiesiems, kadangi senstant mažėja būgnelio skaidulinio sluoksnio tarpląstelinės medžiagos apimtis ir fibrilės išsidėsto kompaktiškiau, t.y tankiau. Speninės ataugos ir vidurinės ausies anatominės architektūros skirtumai nulemia tai, kad timpanosklerozė šiose srityse atsiranda rečiau – taip yra dėl jose esančio puraus subepitelinio tarpo [Bhaya ir kt., 1993]. Sunkiais atvejais timpanosklerozė gali pažeisti ir vidinę ausį. Tuomet ji apima vidinės ausies kapsulę. Tai sukelia neurosensorinį klausos pažeidimą ir labai retais atvejais netgi kurtumą [Forseni ir kt., 1997].
Aiškinantis timpanosklerozės kilmę, iškelta įvairių etiologinių hipotezių: infekcinė, endokrininė, imuninė.
Tirta vidurinės ausies infekcijos įtaka plokštelių formavimuisi [Wielinga ir Kerr, 1993]. Nustatyta, kad uždegimas ūminio pūlinio otito metu stipresnis pars flaccida dalyje ir užpakaliniame viršutiniame būgnelio kvadrante dėl geresnės šių dalių vaskuliarizacijos. Uždegimo metu imunokompetentinės ląstelės (PMN leukocitai, makrofagocitai, limfocitai) juda uždegimo vietos link ir išlaisvina fermentus, sukeliančius normalių audinių hidrolizę bei degradaciją, vedančią į būgnelio skaidulinio sluoksnio destrukciją, ypač aukščiau nurodytose vietose. Tačiau kompaktinio, gerai suformuoto sluoksnio šiose srityse nebuvimas apsaugo nuo timpanosklerozės. Tiriant vidurinės ausies sekretą laboratoriniams gyvūnams nustatytas
didesnis jo kolagenolizinis aktyvumas pūlinio otito nei sekrecinio otito metu. Todėl timpanosklerozė mažiau tikėtina esant pūliniamam otitui nei sekreciniam [Bhaya ir kt., 1993]. M. H. Bhaya (Švedija) tyrimo duomenimis, po persirgto lėtinio vidurinės ausies uždegimo timpanosklerozė diagnozuota 24,3% atvejų, po sekrecinio vidurinės ausies uždegimo – 16,6%, o po ūminio pūlinio otito – 5%.
Santykinai dažnesnis timpanoskerozės pasireiškimas moterims (santykis moterys:vyrai – 1,6:1) siejamas su endokrininiais veiksniais, galinčiais stimuliuoti šio pažeidimo atsiradimą [Bhaya ir kt., 1993].
Būgnelių ir timpanosklerozinių plokštelių imunohistocheminė analizė rodo ir galimą imuninę proceso kilmę. Manoma, kad egzistuoja veiksniai, inicijuojantys imunologines grandinines reakcijas, nulemiančias timpanosklerozės formavimąsi. Tai gali būti dėl individualių organizmo imuninės reakcijos variacijų, kadangi kai kuriems pacientams pasireiškia sunki timpanosklerozė po kelių nedidelių uždegimo epizodų, tuo tarpu kitiems timpanosklerozė neatsiranda net po recidyvuojančių agresyvių infekcijų [Forseni ir kt., 1997]. Manoma, kad timpanosklerozė vystosi kaip antrinė reakcija į vietinį padidėjusį imuninį jautrumą. Taigi tikėtina, kad timpanosklerozė neatsiranda pirmojo pažeidimo metu, reikalinga pakartotinė jau įjautrintos vietos stimuliacija. Pirmasis pažeidimas yra tik pirminis stimulas būsimai antigeninei stimuliacijai. Lėtiniai negrįžtami vidurinės ausies uždegimo nulemti pokyčiai gali pratęsti būgnelio vidurinio sluoksnio imuninių komponentų stimuliaciją, sąlygojančią timpanosklerozės atsiradimą [Bhaya ir kt., 1993].
2.7. Timpanosklerozės patologinė histologija
Timpanosklerozė atsiranda vidurinėje ausyje ar būgnelyje dėl jungiamojo audinio kalkėjimo. Vidurinėje ausyje, pogleivyje ant kaulinio paviršiaus susidaro hialininis jungiamasis audinys, vėliau prasideda jo kalcifikacija ar net osifikacija. Būgnelyje timpanosklerozinės plokštelės lokalizuojasi skaidulinio sluoksnio jungiamojo audinio mikrostruktūrose [Bhaya ir kt., 1993, Forseni ir kt., 1997].
Tiriant cheminę timpanosklerozinės plokštelės sudėtį nustatyta, kad ją sudaro dalinai kalcifikuota organinė matrica su cholesterolio bei kalcio fosfato kristalais. Plokštelės sukalkėjimo laipsnis varijuoja priklausomai nuo lokalizacijos ir atvejo. Tačiau kalcio kiekis joje dažniausia yra mažesnis nei kituose patologiškai sukalkėjusiuose audiniuose. Kiekybinės analizės būdu nustatomas vidutinis kalcio kiekis plokštelėje yra 2 mg/100mg audinio arba 12 mg/100 mg baltymo. Vidutinis kalcio ir fosfatų molinės koncentracijos santykis yra 3. Vidutinis bendro cholesterolio kiekis yra 15 µg/100 mg baltymo [Buyanover ir kt., 1987]. Tiriant elektroniniu mikroskopu matoma, kad plokštelės susideda iš netaisyklingai trimatėje
erdvėje išsidėsčiusių kolageno fibrilių, užpildytų sferiniais mineraliniais kalcio fosfato agregatais (1-5 µm diametro) [McKee ir Kerr, 1989]. Plokštelės susidarymo metu, vykstant skaidulinio sluoksnio mikrofibrilių irimui, kartu su hialinine degeneracija kaupiasi ir kalkiniai depozitai. Tuo metu padidėja makrofagocitų, fibroblastocitų ir fibrocitų skaičius pogleiviniame audinyje [Chang, 1969]. Kalcifikacijos procesas panašus į kitų ligų, tokių kaip aterosklerozė, sergant koronarine širdies liga [Buyanover ir kt., 1987, Forseni ir kt., 1997, Koc ir Uneri, 2002, Olsson ir kt., 1994]. Pagal "subrendimą" būgnelio timpanosklerozinės plokštelės klasifikuojamos į: 1) ankstyvąsias – tai būgnelio vidurinio skaidulinio sluoksnio skaidulų normalios išsidėstymo tvarkos suardymas; 2) tarpines – kai matomas aiškiai ribotas hialinizacijos plotas; 3) vėlyvąsias – subrendusias, gerai susiformavusias plokšteles, kai yra arba nėra kalcifikacijos ar osifikacijos [Bhaya ir kt., 1993].
Patologiniu histologiniu požiūriu išskiriamos kelios timpanosklerozės formos: 1) neinvazinė paviršinė timpanosklerozė (sklerozuojantis mukozitas); 2) invazinė giluminė timpanosklerozė (osteoklastinis mukoperiostitas).
2.8. Kalcifikacija ir osifikacija timpanoskleroziniuose ir kitokiuose audiniuose
Visais skeleto kalcifikacijos atvejais mineralizacijai būdingos dvi pagrindinės fazės: I fazė, kurios metu matricos pūslelėse (matricos pūslelės – tai iš mitochondrijos ar išorinės ląstelės membranos pumpuravimosi būdu arba dėl membranos įtrūkimų susidariusios pūslelės) iš hidroksiapatito mineralų formuojasi pirminiai kristalai ir II fazė – mineralizacijos plitimo fazė. Besiformuojantys ir susiformavę kristalai sudaro pradžią naujų kristalų branduoliui. Pirmoji fazė yra aktyvi, kontroliuojama matricos pūslelių membranos. Antroji fazė yra fizikocheminė ir priklauso nuo šių matricos veiksnių: ekstraceliulinio skysčio Ca2+ ir PO43- koncentracijos, kolageninio substrato, ant kurio galėtų nusėsti mineralai ir proliferacijąreguliuojančios medžiagos (pirofosfatų ir kt.) buvimo [Anderson, 1988]. Ankstesni tyrimai parodė, kad šis kalkėjimo mechanizmas yra būdingas ir patologiniam audinių kalkėjimui, pvz.: aterosklerozinėms plokštelėms, osteoartritui, timpanosklerozei ir širdies vožtuvų kalcifikacijai [Anderson, 1988]. Timpanosklerozės atveju pogleivyje randamas padidėjęs makrofagocitų, fibroblastocitų ir fibrocitų skaičius [Moller, 1984]. Tiriant nereumatinės kilmės aortos vožtuvų stenozę, taip pat nustatytas padidėjęs T-limfocitų, fibroblastocitų, makrofagocitų ir interleukino-2 receptorių kiekis sukalkėjusiuose ir gretimuose audiniuose [Olsson ir kt., 1994].
Timpanosklerozinę mineralizaciją elektroniniu mikroskopu tyrinėjo I. Friedmann su bendraautoriais [Friedman ir kt., 1981, Friedmann ir kt., 1980], tyrimams naudodami pacientų, sergančių lėtiniu vidurinės ausies uždegimu, biopsinę medžiagą. Autoriai išskyrė
keturias timpanosklerozinės mineralizacijos stadijas. Iš esmės kolageninė matrica susideda iš tankiai ar laisvai susipynusių pluoštų, susidedančių iš tolygiai kalcifikuotomis granulėmis ar stambesnėmis susiliejančiomis jų masėmis inkrustuotų skaidulų. Randami pavieniai fibroblastocitai, chondrocitai ar osteocitai ir smulkūs kapiliarai. Ląstelėse gali būti degeneravusių mitochondrijų ir įvairaus dydžio pūslelių, kurios atpalaiduojamos į kolageninę matricą. Mineralizacijos stadijos: 1) ankstyvoji stadija charakterizuojama matricos pūslelių kolageno matricoje susidarymu iš ląstelių (fibroblastocitų, uždegimo ląstelių ir epitelio ląstelių); 2) vėliau pūslelių viduje susidaro kristaliniai intarpai ir formuojasi įvairios struktūros kalkosferulės (plokštelinės, serpantininės, kristalinės, dėmėtos, homogeniškos); 3) progresuojančios mineralizacijos, kai laipsniškai didėja kristalinių intarpų kiekis, dažnai lydimas mineralizacijos ir už matricos pūslelių ribų; 4) galiausiai, susiliejus mineralizuotoms masėms, susiformuoja plokštelė.
Heterotopinė osifikacija yra naujo kaulo formavimasis nekauliniame audinyje. Pastaraisiais metais diskutuojama dėl heterotopinės osifikacijos mechanizmo diferencijuojantis vėlyvosios stadijos aterosklerozinei plokštelei iš fibrozinės [Deneke ir kt., 2001]. Panašumams priskiriami aterosklerozinėje plokštelėje randami pagrindiniai osteoido elementai, osteogenezę reguliuojantys veiksniai ir arterijos sienelės ląstelių subpopuliacija, galinti diferencijuotis į osteoblastocitų eilės ląsteles [Bostrom ir Demer, 2000]. Naujausi tyrimai rodo, kad kraujagyslių sienelės kalkėjimas ir aterosklerozinių plokštelių atsiradimas yra panašūs į skeleto kaulų formavimąsi ir kalcifikaciją [Dhore ir kt., 2001, Shioi ir kt., 2000].
Jauno kaulinio audinio tarpląstelinės medžiagos (matricos) kalkėjimas yra pagrindinis osteoneogenezės procesas, kuris taip pat nustatomas daugelio infekcijos ar uždegimo sukeltų ligų, pvz.: gingivito, artrito, lėtinio vidurinės ausies uždegimo ir eksperimentinio ūminio vidurinės ausies uždegimo, metu [Caye-Thomasen ir kt., 1999, Melhus ir Ryan, 2001, Paparella ir kt., 1980]. Naujausių eksperimentinių tyrimų metu buvo nustatyti kai kurie kaulo augimo, rezorbcijos ir formavimosi veiksniai (β-TGF, osteokalcinas, prokolagenas I) bei uždegimo citokinai (IL-1, IL-6, α-TNF) vidurinės ausies gleivinėje eksperimentinio ūminio vidurinės ausies uždegimo metu [Melhus ir Ryan, 2000, Melhus ir Ryan, 2001]. Makroskopiškai ir mikroskopu timpanoskleroziniai pakitimai matomi kaip balkšvos, į kaulą panašios sklerozinės plokštelės. Taigi, būgnelio ir vidurinės ausies gleivinės hialinizuoto skaidulinio sluoksnio kalcifikacija vystantis timpanosklerozei taip pat gali būti panaši į šį aukščiau aptartą patologinį ektopinį kalkėjimą, todėl daroma prielaida, kad timpanosklerozės atsiradimas ir kaulinio audinio matricos kalcifikacija osteogenezės metu yra panašūs procesai. Įvairios ląstelės, hormonai ir citokinai dalyvauja osteogenezėje. Pagrindinės ląstelės, dalyvaujančios kaulo remodeliavime, yra osteoblastocitai ir osteoklastocitai [Robbins ir
Cotran, 2005, Vitkus ir kt., 2003]. Osteoblastocitai yra kilę iš pluripotencinių mezenchiminių kamieninių kaulų čiulpų ląstelių. Jie gamina daugelį citokinų, svarbių jų pačių brendimui, IL-6, IL-11, granuliocitų ir makrofagocitų koloniją stimuliuojantį veiksnį (GM-CSF) ir makrofagocitų koloniją stimuliuojantį veiksnį (M-CSF). Osteoklastocitai kilę iš granuliocitų ir makrofagocitų koloniją formuojančių hematopoetinių ląstelių. Jie gamina 1, 3, 6, IL-11, tumoro nekrozės veiksnį (TNF), granuliocitų ir makrofagocitų koloniją stimuliuojantį veiksnį (GM-CSF) ir makrofagocitų koloniją stimuliuojantį veiksnį (M-CSF) [Robbins ir Cotran, 2005].
2.9. Kaulėjimą reguliuojantys veiksniai
Svarbiausi ir geriausiai žinomi kaulo morfogenezės baltymai ir kaulo formavimosi veiksniai yra osteopontinas, osteoprotegerinas ir osteonektinas.
Osteopontinas (OPN) yra pagrindinis rūgštinis fosforilintas kaulo glikoproteinas (angl. k. – major acidic phosphorylated glycoprotein of bone), surišantis kalcį [Dhore ir kt., 2001, Young ir kt., 1990, Oldberg ir kt., 1986]. Osteopontinas veikia kaip citokinas ir yra ekstraceliulinės matricos baltymas [Barry ir kt., 2000]. Osteopontinas priskiriamas kaulo formavimosi (osifikacijos) aktyvatoriams [Chen ir kt., 1992, Dhore ir kt., 2001, Nomura ir kt., 1988]. Osteopontiną sekretuoja osteoblastocitai. Šis baltymas dalyvauja patologiniame kalkėjime, pvz.: aterosklerozinių plokštelių kalcifikacija [Hirota ir kt., 1993, Mohler ir kt., 1997] ir yra nustatomas sukalkėjusiose arterijose bei mitraliniame vožtuve [Canver ir kt., 2000]. Sveikoje aortoje osteopontino nerandama [Dhore ir kt., 2001]. Pelėms su mutavusiu osteopontino genu būdinga jungiamojo audinio matricos dezorganizacija ir kolageno fibrilogenezės sutrikimas [Liaw ir kt., 1998]. Be to, osteopontinas randamas kalcifikacijos vietose vykstant patologiniam kalkėjimui lėtinio otito metu [Makiishi-Shimobayashi ir kt., 2004, Makiishi-Shimobayashi ir kt., 2001]. Osteopontinas yra aptinkamas sveikoje vidinėje ausyje (sraigės labirinto pamatinės skiauterės kraujagyslinio ruožo (stria vascularis) ląstelėse, spiralinio mazgo (ganglion spirale) ląstelėse, prieangio neurosensorinėse plaukuotosiose ląstelėse) ir manoma, kad dalyvauja vidinės ausies skysčių jonų apykaitoje [Sakagami, 2000]. Turimomis žiniomis nerasta duomenų apie osteopontino pasireiškimą sveikoje vidurinėje ausyje.
Osteoprotegerinas (OPG) buvo identifikuotas 1997 m. kaip tumoro nekrozės veiksnio šeimos ligandas ir receptorius (angl. k. – a member of the tumor necrosis factor ligand and
receptor superfamily) [Simonet ir kt., 1997, Tsuda ir Higashio, 1998]. Jis yra vienas iš
pirminių kaulo metabolizmo reguliatorių [Khosla, 2001], veikiantis kaip kaulo rezorbcijos inhibitorius, slopinantis osteoklastogenezę [O'Brien ir kt., 2000]. Osteoprotegerinas randamas
kaulų čiulpų stromos ląstelėse, osteoblastocituose ir osteosarkomos ląstelėse, odontoblastocituose, ameloblastocituose, dantų pulpos ląstelėse, preosteoblastocitų eilės kaulo ląstelėse, endotelio ląstelėse, sveikos aortos vidurinio sluoksnio lygiųjų raumenų ląstelėse ir retkarčiais osteocituose [Dhore ir kt., 2001]. Pelėms be osteoprotegerino geno būdingas sumažėjęs bendras kaulų tankis ir dažni kaulų lūžiai [Bucay ir kt., 1998]. Šioms pelėms taip pat būdinga aortos ir inkstų arterijų kalcifikacija [Schinke ir Karsenty, 2000]. Šie duomenys dera su kitų autorių tyrimo rezultatais ir kyla prielaida, kad osteoprotegerinas yra svarbus osteoporozės ir kraujagyslių kalcifikacijos sąryšiui. Taigi manoma, kad aterosklerozinės kalcifikacijos progresavimas moterims menopauzės metu yra susijęs su padidėjusiu kaulo masės praradimu [Hak ir kt., 2000]. Osteoprotegerinas, produkuojamas osteoblastocitų, reguliuoja kaulo persitvarkymo procesą, slopindamas osteoklastocitų diferenciaciją ir išgyvenimą, stabdydamas osteoklastocitų aktyvinimą ir skatindamas jų apoptozę [Udagawa ir kt., 2000]. Tuo būdu, osteoprotegerinas yra kaulo rezorbcijos, o tuo pačiu ir kaulo remodeliavimo, inhibitorius. Matyti, kad osteoprotegerinas, didele dalimi produkuojamas sraigės labirinto kauliniame audinyje, gali paaiškinti nepaprastai lėtą perilabirintinio kaulinio audinio struktūrų persitvarkymą [Zehnder ir kt., 2005]. Buvo tyrinėta osteoprotegerino svarba cholesteatomos sukeltai kaulo rezorbcijai žmogaus ir laboratorinio gyvūno vidurinės ausies audiniuose [Hamzei ir kt., 2003, Sudhoff ir kt., 2004], tačiau nerasta duomenų apie osteoprotegerino pasireiškimą sveikoje vidurinėje ausyje.
Osteonektinas (ON) yra taip pat žinomas kaip SPARC – sekrecinis rūgštinis baltymas, su dideliu cisteino kiekiu (angl. k. – secreted protein acidic and rich in cysteine). Tai kalcį surišantis ekstraceliulinės matricos glikoproteinas, reguliuojantis ląstelių sąveiką su ekstraceliuline aplinka kaulo vystymosi ir atsako į pažeidimą metu [Bradshaw ir Sage, 2001]. Osteonektinas aptinkamas įvairiuose audiniuose [Maki ir kt., 2000]. Šis baltymas dalyvauja ląstelių matricos sąveikoje, angiogenezės metu, gyjant žaizdoms, formuojantis kataraktai [Kantorow ir kt., 2000] ir karcinogenezėje [Dhore ir kt., 2001]. Taip pat yra žinoma, kad osteonektinas dalyvauja kraujagyslių kalcifikacijoje [Bini ir kt., 1999], be to, osteonektinas aptinkamas ir sveikos aortos adventicijos kraujagyslėse [Bini ir kt., 1999, Dhore ir kt., 2001]. Randamas kaulo matricoje, osteonektinas yra sintetinamas osteoblastocitų. Jis reguliuoja kaulo matricos sudėtį ir todėl yra aptinkamas aktyvaus kaulo remodeliavimo vietose [Bradshaw ir Sage, 2001]. Be to, osteonektinas yra būtinas normaliam osteoblastocitų formavimuisi, brendimui ir išgyvenimui [Delany ir kt., 2003], kaulo persitvarkymo, kaulinio audinio masės ir kokybės palaikymui [Delany ir kt., 2000]. Pelėms be osteonektino geno sumažėja osteoblastocitų ir osteoklastocitų skaičius, o tai sukelia kaulo formavimosi ir remodeliavimosi sulėtėjimą, neigiamą kaulo balansą, gilią osteopeniją bei išreikštą kataraktą
[Delany ir kt., 2000, Delany ir kt., 2003]. Osteonektinas yra svarbus besivystant sraigei [Mothye ir Brown, 2001], tačiau nerasta literatūros šaltinių apie osteonektino pasireiškimą vidurinės ausies uždegimo metu, o taip pat ir sveikoje vidurinėje ausyje.
Apibendrinus literatūroje paskelbtus tyrimus, matyti, kad ieškant naujų faktų apie timpanosklerozės patogenezę, aktualu įvertinti kaulo augimo ir remodeliavimo procesuose dalyvaujančių baltymų pasireiškimą būgnelyje. Kadangi yra nustatyta, kad timpanosklerozė vystosi po ūminio vidurinės ausies uždegimo ir/ar miringotomijos, o būgnelio ir kaulinio audinio matricos kalcifikacijos procesai gali turėti panašumų, šiame disertaciniame darbe tyrinėta eksperimentinė būgnelio kalcifikacija, vertinant kalcio fosfato sankaupas ir trijų pagrindinių osteogenezės veiksnių – osteopontino, osteoprotegerino ir osteonektino – aktyvumą būgnelyje ūminio bakterinio vidurinės ausies uždegimo metu.
3. DARBO METODOLOGIJA
3.1. Tyrimo metodas ir eiga
Eksperimentiniam randomizuotam kalcifikacijos proceso būgnelyje tyrimui pasirinktas žinomas ir pripažintas laboratorinės žiurkės ūminio vidurinės ausies uždegimo, sukelto
Haemophilus influenzae [Hermansson ir kt., 1988, Magnuson ir kt., 1997, Melhus ir kt.,
1994], tyrimo metodas. Darbas atliktas dirbant kartu su grupe Lundo universiteto (Švedija) ir Kopenhagos Gentofte universiteto ligoninės (Danija) mokslininkų. Tyrimo eigos projektas ir gyvūnų priežiūros sąlygos patvirtintos laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komitete (protokolo Nr. M18-04, Lundo universitetas, Švedija). Eksperimentinio tyrimo eigos schema pateikta 2 pav.
2 pav. Eksperimentinio tyrimo schema
3.1.1. Eksperimentiniai gyvūnai
Tyrimui buvo pasirinktos Spraque-Dawley veislės žiurkės. Eksperimentui naudoti sveiki, dviejų mėnesių amžiaus, vyriškos lyties gyvūnai, kurių svoris tyrimo pradžioje buvo 200-300 gramų. Žiurkės buvo laikomos vivariume standartizuotose sąlygose, maitinamos standartiniu granuliuotu maistu ir vandeniu ad libidum [Försöksdjursnämnden, 2002, Krinke, 2000, Zutphen ir kt., 1993]. Dešinysis būgnelis Infekuoti miringotomuoti Infekuoti nemiringotomuoti NTHi Dešinioji vidurinė ausis Inokuliavimas Otomikroskopija Miringotomija Histologija Kairysis būgnelis Neinfekuoti miringotomuoti Neinfekuoti nemiringotomuoti Kairioji vidurinė ausis Laboratorinis gyvūnas
2 2 2 + + + = d d q p q p C N c c e e
Statistinis eksperimentinio tyrimo imties pagrindimas
Analizuojant tiriamąją ir kontrolę grupes, kuriose tiriamas dominančio veiksnio atsiradimas, šių grupių imties dydis N įvertintas tokiu būdu [Dell ir kt., 2002, Fleiss, 1981]:
, pc = rc / Nc; pe = re / Ne; qc = 1 – pc; qe = 1 – pe; d = |pc – pe|.
Čia rc – veiksnio atsiradimų skaičius kontrolinėje grupėje. Nc – analizuojamų objektų skaičius kontrolinėje grupėje. re – veiksnio atsiradimų skaičius tiriamojoje grupėje. Ne – analizuojamų objektų skaičius tiriamojoje grupėje.
Kai reikšmingumo lygmuo α = 0,05 (ir 1 - β = 0,9), tai koeficientas C = 10,51.
Atlikus skaičiavimus gauta, kad jei kontrolinėje grupėje nebus gaunamas tiriamasis veiksnys (rc = 0), o tiriamojoje grupėje veiksnys atsiras kiekviename analizuojamame objekte
(re = Ne), tai statistiškai reikšmingiems rezultatams gauti kontrolinėje ir tiriamojoje grupėje
analizuojamų objektų skaičius turi būti ne mažesnis už N = 4.
Jei daroma prielaida, kad visgi kontrolinėje grupėje viename analizuojamame objekte kažkodėl bus stebimas tiriamasis veiksnys (rc = 1), o tiriamojoje grupėje veiksnys atsiras
kiekviename analizuojamame objekte (rc = Ne), tai N = 5,79. Tuomet suapvalinus
analizuojamų objektų imties dydis turi būti ne mažesnis už N = 6.
Atsižvelgus į imties dydžio vertinimus bei eksperimento metu atliekamų intervencijų poveikį laboratorinių gyvūnų gyvybei, tyrimui buvo panaudota 16 Spraque-Dawley veislės žiurkių abiejų ausų būgnelių serijiniai pjūviai (viso 624).
Kontrolinė grupė
Ankstesnių eksperimentų su laboratorinėmis Spraque-Dawley žiurkėmis metu buvo nustatyta, kad nėra skirtumų tarp sveikos laboratorinės žiurkės ir netipuojamo Haemophilus
influenzae kultūra inokuliuotos žiurkės kontralateralinės ausies būgnelių [Magnuson ir kt.,
1997]. Todėl šiame tyrime 8 kontralateralinės neinokuliuotos nemiringotomuotos vidurinės ausys be otomikroskopinių otito požymių buvo priskirtos kontrolinėms.
3.1.2. Bakterijų kultūra
Ūminiam vidurinės ausies uždegimui sukelti naudota netipuojamo (nekapsulinio)
Haemophilus influenzae (NTHi) 3655 štamo II biotipo kultūra.
Bakterijos kultivuotos Lundo universiteto mikrobiologijos skyriuje (Malmö, Švedija). Bakterijų koncentracija inokuliate buvo matuojama kolonijas formuojančiais vienetais
viename mililitre (CFU/ml). Gyvūnams užkrėsti naudota 1,0 x 106 CFU/ml koncentracijos gyvų NTHi mikroorganizmų suspensija.
3.1.3. Eksperimento eiga
Prieš kiekvieną eksperimentinę procedūrą gyvūnams buvo atliekama intraperitoninė anestezija, injekuojant 36mg/100g kūno svorio chloralhidrato (Apoteket Produktion & Laboratorier, Malmö, Švedija) į pilvaplėvės ertmę. Prieš inokuliuojant bakterijas, visų žiurkių būgneliai buvo apžiūrėti Olympus operaciniu otomikroskopu, įsitikinta, kad nėra galimų spontaninio otito požymių. Tuomet žiurkės kaklo vidurio linijoje buvo atlikta incizija, buku būdu praskyrus kaklo audinius pasiekta dešiniosios vidurinės ausies pūslė (bulla) ir plona injekcine adata penetravus jos kaulinę sienelę, inokuliuota po 0,05 ml gyvų netipuojamo nekapsulinio Haemophilus influenzae bakterijų suspensijos. Pjūvis kakle susiūtas. Kairioji vidurinės ausies pūslė (bulla) nebuvo liečiama.
Ketvirtąją parą po bakterijų įterpimo į vidurinę ausį visoms žiurkėms atlikta otomikroskopija ir šešioms, atsitiktinės atrankos būdu parinktoms žiurkėms – abiejų būgnelių miringotomija apatiniame užpakaliniame kvadrante (miringotomuotų grupė). Likusios 10 žiurkių priskiriamos nemiringotomuotų grupei (2 lentelė). Iš 4 atsitiktinai pasirinktų miringotomuotų žiurkių paimti vidurinės ausies sekreto tepinėliai bakteriologiniam tyrimui. 2 lentelė. NTHi kultūra infekuotų gyvūnų eksperimento planas
Eliminuota iš tyrimo (m+n) Tyrimo
diena
Gyvūnų
skaičius Analizė (gyvūnų skaičius) Dešinysis būgnelis Kairysis būgnelis
0 16 Otomikroskopija (16) – – 4 16 Otomikroskopija (16) miringotomija (6) sekreto pasėlis (4) Histologija (0+4) Histologija (0+2) 7 12 Otomikroskopija (12) Histologija (2+2) Histologija (0+2) 14 8 Otomikroskopija (8) Histologija (2+2) Histologija (0+2) 28 4 Otomikroskopija (4) Histologija (2+2) Histologija (0+2) m – miringotomuoti laboratoriniai gyvūnai.
n – nemiringotomuoti laboratoriniai gyvūnai.
4-ąją, 7-ąją, 14-ąją ir 28-ąją tyrimo dieną visų gyvūnų būgneliai įvertinti otomikroskopijos būdu. Po to dviems žiurkėms iš kiekvienos grupės, suleidus letalinę chloralhidrato dozę (75mg/100g kūno svorio intraperitonealiai), atlikta širdies punkcija ir per kairįjį širdies skilvelį simultaninė fiksacinė perfuzija 1,5% paraformaldehidu. Žiurkės dekapituotos, pasiekus abi kaulines vidurinių ausų ertmes (bullae), atlikta jų papildoma
