KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS

KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

Vytautas Kurantavičius

Dobilų (Trifolium L.) genties augalų izoflavonų kiekybinės sudėties tyrimas

Darbo vadovas:

doc. dr. Valdas Jakštas

Kaunas

2

TURINYS

TURINYS ... 2

1. ĮVADAS ... 4

2. LITERATŪROS APŽVALGA... 6

2.1. Flavonoidai ir jų biologinės savybės ... 6

2.2. Izoflavonoidai ... 7

2.2.1. Izoflavanoidų cheminė struktūra ir įvairovė ... 7

2.3. Flavonoidų ir izoflavonų kiekybinis nustatymas ... 10

2.3.1. Flavonoidų ir izoflavonoidų ekstrakcija ... 10

2.3.2. Flavonoidų nustatymui taikomos metodikos ... 11

2.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos sistema ir jos komponentai... 13

2.5. Izoflavonų biologinės savybės ir veikimas ... 15

2.6 Vėžio prevencija... 18

2.7. Osteoporozės prevencija ... 19

2.8. Farmakokinetika ir farmakodinamika ... 20

2.10. Trifolium L. genties apibūdinimas ... 22

3. TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODIKA ... 26

3.1. Tyrimo objektas ... 26

3.2. Medžiagos ir tirpikliai ... 26

3.3. Tyrimo metodas ... 27

3

4.1. Metodikos optimizavimas ... 29

4.1.1. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas ... 29

4.1.2. ESC metodo optimizavimas ... 32

4.2. Nustatytų izoflavonų kiekybinis įvertinimas dobilų rūšyse... 35

4.3. Izoflavonų kiekio įvairavimas dobilų genties augalų organuose ... 36

4.4. Izoflavonų nustatymas T.pratense L. rūšies augalų dalyse... 37

4.5. IZOFLAVONŲ KIEKIO SKIRTUMAI KULTIVUOJAMŲ IR RINKTŲ NATŪRALIOSE AUGIMVIETĖSE T.PRATENSE L. ORGANUOSE ... 38

4.6. Apibendrinimas ... 38 5. IŠVADOS ... 40 6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 41 PRIEDAI ... 49 SANTRAUKA ... 55 SUMMARY ... 57

4

1. ĮVADAS

Izoflavonai - svarbi fenolinių junginių grupė, dėl savo terapinio veikimo priskiriama prie fitoestrogenų. Šiais augaliniais junginiais domimasi dėl galimo jų apsaugančio poveikio nuo krūtų ir prostatos vėžio, osteoporozės ir širdies kraujagyslių ligų. Daugiausia izoflavonų aptinkama pupinių (Fabaceae L.) šeimos augaluose - sojoje, avinžirniuose ir dobiluose.

Dobilai (Trifolium L.) - tai svarbi Fabaceae L. šeimos gentis, turtinga izoflavonus

kaupiančiomis augalų rūšimis. Per pastarąjį dešimtmetį buvo ypač susidomėta šios genties augalais, kaip galimu izoflavonų šaltiniu vaistinių preparatų ir maisto papildų gamybai. Dobilai plačiai paplitę pasaulyje, todėl vaistų ir maisto papildų gamintojams yra komerciškai naudinga gaminti produktus būtent iš šios genties augalų [75]. Siekiant padidinti vaistinių junginių gavybą iš dobilų genties augalų, tikslinga atlikti tyrimus ir išsiaiškinti, kuri augalų rūšis, kokioje augalo dalyje kaupia didžiausius veikliųjų junginių kiekius. Todėl fitocheminės sudėties įvairavimo tyrimas dobilų genties augaluose yra reikšmingas moksliniu ir praktiniu požiūriu.

Tiriant vaistinius augalus svarbu nustatyti augalinėje žaliavoje besikaupiančių veikliųjų junginių kiekius bei pagrįsti minėtų junginių farmakologines savybes. Prieš analizuojant augalinę žaliavą, svarbu pasirinkti ir optimizuoti metodą, o tai savo ruožtu sudaro nemažą atliekamo tyrimo darbo dalį. Tinkamas metodikos optimizavimas konkretiems tyrimo objektams neįmanomas be ekstrakcijos tirpiklio ir ekstrakcijos sąlygų parinkimo, chromatografinio skirstymo sąlygų parinkimo bei kiekybinės metodikos tinkamumo parametrų (atrankumo, tiesiškumo, taikymo ribų) pagrindimo.

Darbo tikslas. Ištirti dobilų (Trifolium L.) genties augalų izoflavonų (genisteino,

formononetino ir daidzeino) kiekybinę sudėtį, taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą.

Darbo uždaviniai:

1. Optimizuoti efektyviosios chromatografijos metodą dobilų genties augalų žaliavos tyrimui ir parinkti chromatografinio skirstymo sąlygas izoflavonų kiekio nustatymui. Parinkti ekstrakcijos sąlygas, įvertinant pasirinkto ekstrakcijos tirpiklio, jo poliškumo ir ekstrakcijos laiko įtaką izoflavonų išskyrimui.

5 2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu atlikti izoflavonų nustatymą: T.

incarnatum L.; T. medium L.; T. pratense L.; T. montanum L.; T. ambigum M. Bieb.; T. alpestre L.; T. hibridum L.; T. rubens L.; T. aureum Poll.; T. panonicum Jacq. T. ochroleucum Huds.; T. trepens L.; T. arvense L.; T. alexandrinum Jusl.; T. glanduliferum L.; T. resupinatum L.; T. campestre Schreb.; T. fragiferum L. dobilų

genties augalų rūšių žaliavose.

3. Įvertinti izoflavonų kiekio įvairavimą tirtuose dobilų genties augalinių žaliavų mėginiuose ir nustatyti izoflavonų kiekybinės sudėties pasiskirstymą dobilų genties augalų organuose.

4. Nustatyti izoflavonų kiekių įvairavimą T. pratense L. rūšies augalų organuose ir palyginti izoflavonų kiekybinę sudėtį T. pratense L. rūšies kultivuojamų ir natūraliose augimvietėse surinktų augalinių žaliavų ėminiuose.

Darbo naujumas. Pirmą kartą nustatytas izoflavonų kiekis Lietuvos klimatinėmis

sąlygomis užaugintų 18 rūšių dobilų žaliavose. Atlikus mokslinės literatūros šaltinių analizę nepavyko rasti duomenų apie izoflavonų (genisteino, formononetino ir daidzeino) kiekius T.

glanduliferum L. dobilų rūšyje ir T. medium L. rūšyje, todėl gauti duomenys yra nauji.

Darbo praktinė reikšmė. Optimizuotos bandinio ruošimo ir skirstymo sąlygos

kiekybiniam izoflavonų nustatymui įvairiuose dobilų genties augalų žaliavų ėminiuose. Tyrimo Buvo atlikti metodo optimizacijos ir įteisinimo žingsniai, leidžiantys atlikti kiekybinę analizę

Trifolium L. genties augaluose. Nustatytos fotocheminiu aspektu vertingiausios dobilų rūšys,

kaupiančios didžiausius kiekius izoflavonų. Atlikus tyrimus nustatyti didžiausius izoflavonų kiekius kaupiantys augalų organai

6

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1. Flavonoidai ir jų biologinės savybės

Flavonoidai yra antriniai augalinės kilmės metabolitai, sudarantys vieną iš gausiausių

gamtinių junginių grupių, aptinkamų beveik visuose induočiuose augaluose.

Flavonoidai yra viena gausiausių ir svarbiausių polifenolinių junginių grupių aptinkamų augalų karalystėje. Flavonoidų aglikono pagrindas yra C6-C3-C6 struktūra, susidedanti iš dviejų

aromatinių benzeno žiedų (A ir B žiedai) sujungtų trimis anglies atomais, paprastai per deguonies tiltelį suformuojančiais heterociklinį žiedą (C žiedas) (1 pav.).

Įvairios heterociklinio C žiedo modifikacijos suskirsto flavonoidus į keletą klasių: 2-fenilbenzopiranus (flavonai, flavonoliai, flavan-3-oliai (katechinai), flavanonai, antocianidinai) bei 3-benzopiranus (izoflavonai). Individualūs skirtumai klasių viduje atsiranda dėl skirtingų pakaitų A ir B žieduose: fenolinių hidroksilo grupių, kurios gali būti metilintos, acetilintos, prenilintos,

1 pav. Flavonoidų aglikono struktūrinis pagrindas

sulfatuotos, taip pat įvairių O – cukrų bei gliukuronidų. Gamtoje flavonoidai paprastai randami O- ar C-glikozidų formoje. Vykstant glikozilinimui molekulė tampa mažiau aktyvia sąveikaudama su laisvaisiais radikalais bei geriau tirpi vandenyje. C-glikozidai yra retesni nei O-glikozidai. Pastaruosiuose cukrinė dalis jungiasi prie aglikono per hidroksilo grupę, o įprastinės glikozilinimo pozicijos yra 7-hidroksilo flavonams ir izoflavonams, 3- ir 7-hidroksilo flavonoliams bei 3- ir 5-hidroksilo antocianidinams. Tuo tarpu C-glikoziduose cukrai jungiasi tiesiogiai prie aglikono anglies atomų, paprastai 6 ar 8 padėtyse. Cukrų monozidai dažniausiai randami glikozidų struktūroje yra gliukozė, galaktozė, ramnozė, ksilozė ir arabinozė, taip pat ir disacharidai, dažniausiai susidedantys iš gliukozės ir ramnozės, tai - rutinozė bei neohesperidozė[25].

Fenoliniai junginiai svarbūs augalų fiziologijoje bei ekologijoje. Šie junginiai atlieka

7 ekstraorganizminiame lygmenyje, pavyzdžiui alelopatinėje augalų, grybų ir mikroorganizmų sąveikoje [2]. Flavonoidai atlieka įvairias funkcijas: apdulkinimo metu veikia kaip vizualiniai signalai vabzdžiams, dalyvauja augalų vystymosi reguliavime, saugo augalus nuo patogeninių mikroorganizmų invazijos, apsaugo augalines ląsteles nuo oksidacinio streso bei nuo deguonies trūkumo sukelto streso, surišdami susiformavusius laisvuosius radikalus [29]. Manoma, kad fenoliniai junginiai atlieka svarbų vaidmenį augalo atsako, į šalčio ir karščio stresų sukeltas reakcijas, procese [2]. Nustatyta, kad flavonoidai yra svarbūs augalo atsparumui dideliems sunkiųjų metalų kiekiams [2], o dėl palankių UV absorbcinių savybių 280-315 nm srityje flavonoidai apsaugo augalus nuo kenksmingų UV-B spinduliavimo efektų [6]. Atlikti tyrimai įrodė, kad ozonas stimuliuoja fenilpropanoidų metabolizmą ir padidėja fenilpropanoidų ir flavonoidų sankaupos augaluose, be to šių metabolitų biosintezė indukuojama kaip atsakas į augalo sužeidimą [2, 6].

Flavonoidų biologinis poveikis. Flavonoidai yra vienos gausiausių polifenolinių

junginių klasių aptinkamų žmonių mityboje. Jie yra laikomi bioaktyviais nemaistiniais mitybos komponentais, kurie yra randami vaisiuose, daržovėse ir įvairiuose gėrimuose. Epidemiologinės studijos atskleidė, kad vartojant daug vaisių ir daržovių rečiau sergama vėžiu, širdies ir kraujagyslių ligomis, o tyrimai in vitro ir in vivo sistemose patvirtina neuroprotekcinį juose esančių komponentų poveikį [32]. Šis teigiamas poveikis yra susijęs su vaisių ir daržovių antioksidantinėmis savybėmis. Plačiai ištyrinėti antioksidantai maiste yra vitaminai C, E ir karotinoidai [28]. Atlikti tyrimai parodė, kad su maistu gaunami fenoliniai junginiai pasižymi didesniu antioksidantiniu aktyvumu nei minėti vitaminai tame pačiame maiste [13]. Gausiais in vitro bei in vivo tyrimais pagrįstas ir įrodytas flavonoidų antiproliferacinis [41], priešvėžinis [22], antilipoperoksidantinis [68], antitrombogeninis [26], anti-išeminis [61], priešvirusinis [44], antialerginis [46], priešuždegiminis [29] poveikiai. Atlikti moksliniai darbai patvirtina, kad fenoliniai junginiai veikdami įvairiuose daugiapakopių biocheminių procesų lygmenyse, geba atlikti esminę ląstelinės homeostazės moduliaciją.

2.2. Izoflavonoidai

2.2.1. Izoflavanoidų cheminė struktūra ir įvairovė

Izoflavonoidai yra savita flavonoidų klasė, šie junginiai plačiai paplitę Fabaceae L. šeimos augaluose, tačiau bent po vieną jų atstovą randama dar dvidešimtyje šeimų. Didžiausi izoflavonoidų kiekiai aptinkami sojoje, dobiluose ir avinžirniuose. Izoflavonoidai yra charakterizuojami pagal bendrą 3-fenilchromano struktūrą ir skiriasi vienas nuo kito metoksi,

8 b b a a O O H OH 6 8 5 7 6 2 3 O 1 4 1' 2' 6' 3' 5' 4'

hidroksi funkcinėmis grupėmis. Šie junginiai augaluose gali būti aptinkami kaip aglikonai (3 proc.) arba glikozidų, acetilglikozidų, malonilglikozidų formoje. Izoflavonoidai skirstomi į keletą grupių:

Izoflavonus. Izoflavonai išsiskiria savo oksidacijos laipsniu ir heterociklinio žiedo

struktūra, kuri yra panaši į flavonų: C-4 atomas turi keto grupę, o tarp C-2 ir C-3 atomo yra dvigubas ryšys. Pagrindiniai šios grupės atstovai yra genisteinas (5,7,4-trihidroksiizoflavonas), formononetinas (4-hidroksi-7-metoksiizoflavonas, biochaninas A (5,7-dihidroksi-4'-metoksiizoflavonas) ir daidzeinas (7,4- dihidroksiizoflavonas) (8 pav.).

Izoflavononai. Izoflavononai struktūriškai susiję su izoflavonais, taip kaip flavononai su

flavonais. Nuo izoflavonų šie junginiai skiriasi tuo, jog tarp C2 ir C3 atomo nėra dvigubo ryšio. Daugiausia šių junginių aptinkama Fabaceae L. šeimoje. Tyrinėjant pietų Afrikos augalą Erythrina

sigmoidea buvo atrasti nauji izoflavononai: C-prenilizoflavononai [56] (2 pav.).

2 pav. a) izoflavanonas; b) C-prenilisoflavanonas: 7,2',4-trihidroksi-6,8-di-C-prenilizoflavanonas.

Izoflavanai. Šie junginiai neturi keto grupės bei dvigubųjų ryšių heterocikliniame pirano

žiede, todėl jiems yra būdinga stereoizomerija. Pats paprasčiausias junginys priklausantis šiai klasei yra ekvolis (3S) (3 pav.). Ekvolis yra daidzeino ir formononetino metabolitas, todėl dažnai yra aptinkamas gyvūnų, bei žmogaus organizmuose. Visi izoflavanai, aptinkami augaluose, turi oksiduotą C-2' atomą.

3 pav. a )izoflavanų karkasas; b) ekvolis 7,4'-dihidroksiizoflavanas:

Izoflavan-3-enai (izoflavenai) (4a pav.). Labai retai augaluose aptinkama izoflavonoidų

klasė. Vienas iš šios klasės atstovų - 6,7,3'-trihidroksi-2',4'-dimetoksiizoflavan-3-enas (4b pav.), aptinkamas Fabaceae L. šaimos augale Baphia nitida, augančiame Afrikoje.

6 8 5 7 6 2 3 O 1 4 1' 2' 6' 3' 5' 4' O _CH 2 CH₃ CH₃ C H₃ C H₃

9 6 8 5 7 6 2 3 O 1 4 1' 2' 6' 3' 5' 4' O O H O H OCH₃ OH OCH₃ 6 8 5 7 6 2 3 O 1 4 1' 2' 6' 3' 5' 4' O O O OCH3 OCH3 C H3 CH3 OCH3 C H3 C H3 O 4 1 3 2 6 6a O 5 11a 7 8 10 9 O 11 4 1 3 2 6 6a O 5 11a 7 8 10 9 O 11 O 8 11 9 10 6a 12a O 7 12 7 1 4 2 3 6 5 8 5 7 6 2 3 O 1 4 _3' 5' 4' O O b a a b c d a b

4 pav. a) izoflaven-3-enas karkasas; b) 6,7,3'-trihidroksi-2',4'-dimetoksiizoflavan-3-enas

3-arilkumarinai. Tai izoflav-3-en-2-ono dariniai, jie yra skirstomi į dvi grupes: turintys

C-4 oksidaciją (3-aril-4-hidroksikumarinai) ir neturintys C-4 oksidacijos (3arilkumarinai) (5a pav.). Šie junginiai aptinkami Azijoje augančiame Fabaceae L. šeimos augale Derris scandens [58], pvz., junginys skandeninas (4,4'-di-O-metil-skandeninas) (5b pav.) [9].

5 pav. a) 3-arilkumarinai; b) 6,7,3'-trihidroksi-2',4'-dimetoksiizoflavan-3-enas.

Tetracikliniai izoflavonoidai. Tai ypatinga izoflavanoidų, grupė išsiskirianti savo

neįprasta tetracikline strūktūra ir fitoaleksininiu poveikiu. Manoma, kad tetraciklinė struktūra susiformuoja, kai izoflavonoiduose vyksta prenilo grupių ciklizacija. Šie izoflavanoidai yra skirstomi į keturias grupes: pterokarpanus, kumestanus, rotenoidus, kumaronochromonus (6 pav.). Visi tetracikliniai izoflavanoidai turi arba prieš grybelinį, arba bakteriocidinį poveikį, o augaluose didžiausi jų kiekiai aptinkami augalui kovojant su grybeline ar bakterine infekcija. Pterokarpanų atradimas buvo pirmasis fitoaleksinų teorijos įrodymas.

10

2.3. Flavonoidų ir izoflavonų kiekybinis nustatymas

Esminis žingsnis visų flavonoidų išgavimui iš biologinių šaltinių yra jų išskyrimas iš bandinio matricos ekstrakcijos pagalba. Dėl paprastai kompleksinės augalinių žaliavų prigimties yra būtinas bandinio paruošimo žingsnis [66].

Sekančiam žingsniui – biologiškai aktyvių junginių ekstrakcijai – naudojami įvairūs organiniai tirpikliai. Ekstrahento pasirinkimas yra esminis faktorius prognozuojant išskiriamų fenolinių komponentų kokybinės ir kiekinės sudėties rodmenis. Naudojamo ekstrahento poliškumas yra svarbiausias veiksnys lemiantis atrankią antrinių metabolitų ekstrakciją. Mažiau poliškų flavonoidų (izoflavonų, flavanonų, metilintų flavonų ir flavonolių) bei fenolinių rūgščių ekstrakcijai yra naudojamas trichlormetanas, dichlormetanas, dietilo eteris, etilo acetatas, acetonas. Fenilpropanoidams, flavonoidų glikozidams bei poliškesniems jų aglikonams išekstrahuoti naudojami alkoholiai: metanolis, etanolis arba įvairios koncentracijos jų mišiniai su vandeniu [2; 70].

Svarbu parinkti ir optimizuoti bandinio ekstrakcijos metodą. Tradiciniai ekstrakcijos iš kietafazių bandinių metodai apjungia maceraciją, perkoliaciją bei Soksleto ekstrakciją. Vienas technologiškai paprasčiausių metodų yra maceracija, kurios efektyvumas gali būti didinamas naudojant mechaninę ar magnetinę maišyklę siekiant homogenizuoti ekstraktą ir įsotinti tirpiklį [64, 75]. Šiuo metodu siekiant visiškai išekstrahuoti bandinį, ekstrakcijos sistemą reikia papildyti naujomis ekstrahento porcijomis, o tai reikalauja filtracijos stadijos, kurios metu galima netekti tirpiklio, analičių ir (ar) žaliavos. Perkoliacija yra vienas plačiausiai fitochemijoje taikomų ekstrakcijos metodų [79]. Toks ekstrakcijos procesas nereikalauja daug darbo sąnaudų, o jo metu sudaromos palankios sąlygos intensyviai difuzijai ir visiškam žaliavos išekstrahavimui. Pagrindiniai ekstrakcijos Soksleto aparate privalumai yra tai, kad metodas yra automatizuotas, užtikrinantis maksimalią išgavą, tačiau svarbiausias trūkumas yra išskyrimo metu taikomas šildymo procesas, kurio metu gali suirti šiluminiam poveikiui jautrūs antriniai metabolitai [64, 60].

Tradicinių ekstrakcijos metodų efektyvumas gali būti didinamas apdorojant bandinį ultragarsu, mikrobangomis ar perkaitinto skysčio būsenos tirpikliu. Pastarieji metodai ženkliai sutrumpina ekstrakcijos trukmę. Eksponuojant ultragarsu pasiekiama didesnė tirpinimo ir ekstrakcijos galia, dėl tirpalo sąlytyje su kietafaze matrica pasiekiamų efektyvių temperatūrų ir slėgių [45,78].

11 Ekstrahuojant poliniais tirpikliais ir veikiant mikrobangomis, tirpikliai turintys didelę dielektrinę konstantą absorbuoja daugiau mikrobangų energijos, tokiu būdu ženkliai padidinamas ekstrakcijos efektyvumas [70].

Superkritinių skysčių ekstrakcija, tirpikliu naudojant superkritinį anglies dioksidą, tinkamesnė nepolinių flavonoidų aglikonų išskyrimui. Siekiant išekstrahuoti glikozidus ekstrakcijos atrankumas keičiamas keičiant slėgį, temperatūrą, pridedant organinio modifikatoriaus [66, 70]. Fenolinių junginių išgavimui iš skystafazių bandinių dažniausiai naudajama skystis - skystis ar kietafazė ekstrakcijos [51]. Pastarosios dažniau taikomos kaip procedūros mažinančios matricos komponentų kiekį biologiniuose skysčiuose ar daugiakomponentėse augalinėse ištraukose bei įgalinančios atlikti reikalingų analičių išgryninimą ir frakcionavimą [21, 66].

2.3.2. Flavonoidų nustatymui taikomos metodikos

2.3.2.1. Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC)

ESC yra pirmo pasirinkimo analizės metodas taikomas tiek kokybiniam, tiek kiekybiniam flavonoidų nustatymui. Šis metodas plačiai taikomas visų flavonoidų klasių analizėje, taip pat ESC metodas yra rekomenduojamas daugelio farmakopėjinių straipsnių, kurie skirti flavanoidų nustatymui. Analizuojant įvairias flavonoidų klases (flavonus, flavonolius, izoflavonoidus, proantocianidinus ir t.t) nejudančioji fazė, eluentai ir gradientas turi būti optimizuoti pagal būdingas analizuojamų medžiagų savybes. Efektyviam flavonoidų atskyrimui dažniausiai naudojamos atvirkščių fazių chromatografinės oktadecilsilil silikagelio nejudančios fazės: ODS, RP-18, ar C18 [2]. Naudojant šias imobilizuotas fazes flavonoidų glikozidai yra išplaunami iš

kolonėlės prieš aglikonus, o daugiau hidroksilo grupių turintys aglikonai bus išplauti greičiau, nei mažiau hidroksilo grupių turintys jų analogai. Dažniausiai naudojami eliuentai yra parūgštinti acetonitrilo ar metanolio mišiniais su vandeniu. Rūgštiniai tirpalai naudojami sumažinti fenolinių hidroksilo grupių jonizaciją, ko pasekoje chromatogramose smailės tampa aštresnės. Yra pastebėta, kad junginių atsiskyrimas skiriasi, naudojant tokius pačius parametrus turinčias kolonėles, tačiau pagamintas kito gamintojo [20], todėl visada būtina atlikti metodo optimizavimą prieš pradedant junginių analizę.

Izoflavonų kokybinei ir kiekybinei analizei ESC yra pirmo pasirinkimo metodas. Šį analizės metodą izoflavonoidų nustatymui reglamentuoja ir Amerikos farmakopėjos straipsnis [73].

12 Dažniausiai nustatant izoflavonoidus renkamasi atvirkščių fazių sistema - oktadecilsilil silikagelio (pvz., RP-18) fazė. Judri fazė dažniausiai būna acetonitrilo arba metanolio mišiniai su vandeniu. Analizės laikas dažniausiai trunka nuo 40 min. iki 1 val. Tėkmės greitis ir gradientas dažniausiai parenkamas individualiai kiekvienai analizei ir turimai aparatūrai [20].

Sėkmingam flavonoidų bei izoflavonoidų nustatymui ESC metodu, nemažai įtakos turi ir naudojami detektoriai. Dažniausiai flavonoidų ir izoflavonoidų nustatymui naudojamos šios ESC detektorių sistemos:

1. ESC - UV/VIS spektrofotometrija. UV spektrofotometrija yra dažniausiai naudojamas detekcijos metodas. Daugelis flavanoidų turi jiems būdingus absorbcijos maksimumus esant tam tikram bangos ilgiui. Šio tipo detektorius tinka izoflavonoidų nustatymui, nes jų spektras skiriasi absorbcijos savybėmis nuo daugelio kitų flavonoidų. Izoflavonoidai tarp C2-C3 atomų turi dvigubą ryšį ir fenilo grupę prie C3 atomo, dėl šių savybių keto grupės (C4) konjungacija su fenilo grupe tampa negalima. Konjungacijos išnykimas sumažina B žiedo sąveiką su UV bangomis, todėl izoflavanoidų optinės savybės skiriasi nuo kitų flavonoidų [2].

2. ESC-DMD (diodų matricos detektorius). Diodų matricos detektorius pasižymi galimybe vienu metu fiksuoti absorbciją pasirinktame šviesos bangų diapazone, todėl galima įvertinti smailių švarumą ir identifikuoti junginius. Be to junginių spektrai gali būti fiksuojami duomenų bazėje ir esant reikalui galima juos palyginti su nežinomos medžiagos spektru.

3. ESC-MS (masių spektrometrija). Tai yra viena iš šiuolaikinių ESC detekcijos technikų, vis dažniau taikoma tiek flavonoidų, tiek kitų vaistinių augalinių junginių bei vaistinių preparatų analizėje. Šis metodas yra labai jautrus ir jo pagalba gali būti indentifikuojami junginiai, kurių nepavyko nustatyti su UV detektoriumi. Labai dažnai MS yra naudojama kartu su UV spektrofotometrija. Masių spektrų duomenys gali suteikti nemažai informacijos apie tiriamo flavonoido struktūrą, taip pat iš masės spektrų galima nustatyti junginio molekulinę masę ir junginio grupių išsidėstymą. Tačiau masių spektroskopijos detektoriai vis dar išlieka labai brangi analizės technika ir rutininei laboratoriniai analizei nėra taikoma.

13

2.3.2.2. Elektromigracinės analizės

Elektromigracinės analizės metodai, dažniausiai naudojami fenolinių junginių analizei, apjungia metodus, pasižyminčius skirtingomis įgyvendinimo bei skirstymo charakteristikomis. Tam tikslui naudojama kapiliarinė zonų elektroforezė bei micelinė elektrokinetinė kapiliarinė chromatografija [2, 21, 51, 70]. Aukščiau paminėti metodai pasižymi didele skiriamąja geba ir analizės atlikimo sparta, dideliu efektyvumu, minimaliu bandinio ir reagentų sunaudojimu, tačiau dažniausiai jie yra lydimi problemų susijusių su jautriu ir rezultatų atkuriamumu [21, 31, 70]. Kapiliarinė elektroforezė flavonoidų ir fenilpropanoidų analizėje yra labiau alternatyvus ar papildantis chromatografinius metodus įrankis [21, 31, 51, 66].

Atliekant skirstymą kapiliarinės elektroforezės metodu reikia atsižvelgti ir optimizuoti šias sąlygas: elektrolitų pH ir koncentraciją, surfaktanto koncentraciją ir tipus, temperatūrą, organinius modifikatorius ir įtampą. Kapiliarinė elektroforezė gali būti kelių rūšių: kapiliarinių zonų elektroforezė (KZE), micelinė elektrokinetinė chromatografija (MEKC), kapiliarinė gel elektroforezė (KGE), kapiliarinė elektrochromatografija (KEC) ir bevandenė KE. Paprasčiausia ir labiausiai įvairiapusė yra kapiliarinių zonų elektroforezė, šis KE metodas paremtas skirtumu tarp masės ir krūvio santykio, todėl analitės, įgavusios skirtingą greitį, išsiskirsto. Anijonai ir katijonai kapiliarinėje zonų elektroforezėje išsiskirsto dėl elektroforezinės migracijos ir elektro - osmotinės tėkmės (EOT), o neautralios dalelės juda tik dėl elektro - osmotinės tėkmės įtakos [76].

2.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos sistema ir jos komponentai

ESC sistema sudaryta iš nuosekliai sujungtų aparatūros modulių, atliekančių tam tikras funkcijas. Moduliai gali būti autonominiai, t.y. juos galima pakeisti kitais analogais, arba integruoti į vieną sistemą. Integruoti moduliai į vieną sistemą yra iškarto vienas su kitu suderinti ir nereikalauja papildomo derinimo, tačiau modulinės autonominės sistemos yra lankstesnės ir iškilus chromatografijos problemai, modulį galima pakeisti labiau tinkamu analogu. ESC sistema susideda iš tokių dalių:

Judrios fazės talpos. Talpos turi būti inertiškos, t.y. pagamintos iš specialaus stiklo,

nesąveikaujančio su jame esančiomis medžiagomis. Jose laikomi eluentai (judri fazė), kuri per vamzdeliu yra paduodama į ESC sistemą.

Siurblys. Tai yra vienas svarbiausių komponentų ESC sistemoje. Jo pagalba sistemoje sukuriamas

0,5-14 5 ml/s. Siurblys turi pasižymėti netik savo sukuriamo slėgio dydžiu, tačiau ir sukuriamo slėgio pastovumu. Dažniausiai, kad slėgis būtų išlaikytas pastovus laiko atžvilgiu, naudojami du siurbliai. Pagrindinės ESC siurblių eksplotacinės savybės yra šios: skaitmeninis debito nustatymas, trumpalaikis debito pastovumas, ilgalaikis debito pastovumas, srauto pulsacijos slopinimas bei nustatomo debito tikslumas.

Bandinio įleidimo modulis. Gali būti rankinis įšvirkštimas arba automatinis. Labai svarbu, jog į

analizinę kolonėlę būtų įleidžiamas tikslus ir pastovus bandinio kiekis, todėl autoinjektorius arba injekcijos kilpa turi būti termostatuojama. Dažniausiai injekcijos tūris būna 1-20 μl.

Kolonėlė. Atlieka analičių skirstymą per kuo trumpesnį laiką. Rezultatų atsikartojamumui

užtikrinti kolonėlė dažniausiai talpinama į programuojamą termostatą. Analizės kolonėlė nuo 2 iki 4,6 mm vidinio skersmens ir nuo 5 iki 25cm ilgio. Kolonėlės viduje yra imobilizuota fazė, kuri vadinama nejudria faze. Kolonėlės būna normalių ir atvirkščių fazių. Dažniausiai tai imobilizuota molekulė su poline (normalių fazių) arba nepoline (atvirkščių fazių) galvute.

Detektoriai. Naudojami skirstymo rezultatams įvertinti. Detektoriai turi pasižymėti šiomis

savybėmis: kuo didesnis jautris, žemos aptikimo ribos, platus linijinis nustatymo intervalas ir signalo stabilumas laiko atžvilgiu. Detektoriai gali būti: UV detektoriai, diodų matricos detektoriai (DMD), masių spektrometrijos (MS) detektoriai, NMR detektoriai, fluorescentiniai detektoriai.

Duomenų registravimo aparatūros ir valdymo programos. Suteikia galimybę registruoti ir saugoti

15 O H O H C H₃ A B 1 2 O O O H OH O O O OH O H H H H O H OH H OH OH

Daidzeinas Daidzinas (daidzeino gliukozidas)

O O O H O H OH O O O H O OH O H H H H O H OH H OH OH

Genisteinas Genistinas (geniteino gliukozidas)

O O O H O CH3 O O O O O H H H H O H OH H OH OH CH3

Formononetinas Sisotrinas (formononetino gliukozidas)

O O O H O OH CH3 O O O O O H H H H O H OH H OH OH OH CH3

Biochaninas A Ononias (ononino gliukozidas)

7 pav. 1)Estradiolis; 2)genisteinas

2.5. Izoflavonų biologinės savybės ir veikimas

Estrogeninis poveikis. Dėl savo polinių savybių ir struktūrinio panašumo į β-estradiolį,

isoflavonai turi estrogeninį aktyvumą, todėl kitaip vadinami fitoestrogenais (7 pav.). Labiausiai tyrinėjami ir į daugelį vaistinių preparatų bei maisto papildų sudėtį įeinantys izoflavonai - genisteinas, daidzeinas, biochaninas A ir formononetinas. 8 pav. pateikti svarbiausi iš dobilų ir sojų išskiriami izoflavonų aglikonai ir jų 7-O-β-d-glikozidų dariniai. Siekiant įvertinti izoflavonų estrogeninį aktyvumą buvo atlikti tyrimai su sterilizuotomis pelių patelėmis. Pelių grupė buvo šeriama raudonojo dobilo ekstraktu 21 dieną, kuriame yra 16 proc. izoflavonų. Buvo nustatyta, kad izoflavonus gavusiųjų pelių grupėje gimdos svoris buvo didesnis lyginant su kontroline grupe, bet mažesnis lyginant su ta grupe, kuriai davė 17β-estradiolį. Remiantis rezultatais galima daryti išvadą, kad izoflavonoidai turi silpną estrogeninį aktyvumą. Taip pat buvo nustatyta, kad naudojant standartizuotą raudonųjų dobilų ekstraktą pelių pieno liaukų ląstelių proliferacija nebuvo stimuliuojama [11, 15, 10]. Tą patį patvirtina ir kiti atlikti tyrimai su gyvūnais [59]. In vitro tyrimuose naudojant chimerinius baltymus, susidedančius iš estradiolio α, β receptorių domenų, sujungtų su Gal4 DNR jungimosi domenu, buvo nustatyta, kad izoflavonas genisteinas yra α ir β estradiolio receptorių agonistas [48]. Taip pat panašus in vitro tyrimas su izoflavonoidais ir jų metabolitais parodė, kad organizme aptinkami daidzeino metabolitai 3',4',7-isoflavonas ir 4',6,7-isoflavonas yra α ir β estradiolio receptorių "super" agonistai [52].

8 pav. Izoflavonai ir ju glikozidai:

O O OH OH O H

A

B

16 Priešvėžinis poveikis. Fitoestrogenai ir izoflavonoidai gali sumažinti vėžio riziką, tame tarpe ir krūtų vėžio bei prostatos vėžio riziką [16, 24]. In vitro tyrimuose biochaninas A, izoliuotas iš raudonojo dobilo, parodė antimutageninį efektą, taip pat apsauginį poveikį nuo cheminio DNR pažeidimo [14]. Taip pat in vitro tyrimai parodė, kad genisteinas inhibuoja ląstelių proliferaciją ir angiogenezę [23].

Tyrimuose su gyvūnais buvo nustatyta, kad raudonojo dobilo izoflavonoidai stipriai padidina estrogenų β-receptorių ir E - kadherino ekspresiją, bet sumažino beta - 1 augimo faktorių. Šie baltymai yra estrogenų indukuotos proliferacijos, ląstelės fenotipo išsaugojimo ir potencialios noeplastinės bei metastatinės transformacijos sumažėjimo markeriai. Todėl galima daryti išvadą, kad raudonojo dobilo izoflavonai gali pasitarnauti gydant prostatos hiperplaziją ir mažinant neoplastinės transformacijos riziką [65]. Atlikus tyrimus su pelėmis, naudojant iš raudonojo dobilo izoliuotus izoflavonoidus paaiškėjo, kad izoflavonoidai gali veikti antiandrogeniškai bei sumažinti nepiktybinį prostatos didėjimą [39].

Menopauzės simptomų lengvinimas. Izoflavonoidai turi silpnų estrogeninių savybių, todėl buvo atlikta nemažai klinikinių tyrimų norint patikrinti izoflavonoidų gebėjimą sumažinti vazomotorinius menopauzės simptomus [7, 42, 40, 53, 69].

2008 metais buvo atlikta sisteminė klinikinių tyrimų apžvalga apie izoflavonoidus ir vazomotorinių simptomų palengvinimą menopauzės periodu ir po jo. Literatūros buvo ieškoma septyniasdešimtyje duomenų bazių naudojant šiuos paieškos žodžius: izoflavonoidai, soja, raudonasis dobilas, vazomotoriniai simptomai, karščio bangos ir naktinis prakaitavimas. Tyrimai į apžvalgą buvo įtraukti remiantis šiais kriterijais: randomizuoti, placebu kontroliuojami tyrimai, kurie truko nemažiau kaip 12 mėnesių, tyrimai su izoflavonoidų derivatais, gautais iš sojų ir raudonojo dobilo bei tyrimai su moterimis, kurioms menopauzinis arba postmenopauzinis laikotarpis. Iš viso į apžvalgą buvo įtraukti 23 klinikiniai tyrimai: 17 su sojos izoflavonoidais ir 6 su raudonojo dobilo izoflavonoidais. Remiantis klinikinių tyrimų rezultatais buvo padaryta išvada, kad raudonojo dobilo izoflavonoidai nesumažina naktinio prakaitavimo ir karščio bangų dažnumo, nes tik vienas iš šešių tyrimų parodė mažą pasikeitimą lyginant su placebu kontroliuojama grupe. Su sojos izoflavonoidais tik trijuose tyrimuose buvo pastebėti karščio bangų pokyčiai lyginant su placebu kontroliuojama grupe[37]. Labai panašios išvados pateiktos ir seniau atliktose sistematinėse klinikinių tyrimų išvadose su izoflavonoidais [54, 1, 19, 43].

17

Poveikis cholesterolio chomeostazei. Pasirodžius pranešimams, kad estrogenai palankiai

veikia lipidų kiekį, buvo pradėta tirti ar izoflavonoidai tai pat pasižymi šiomis savybėmis.

Per pastaruosius 10 metų atliktuose moksliniuose tyrimuose buvo gauta nemažai duomenų, liudijančių apie galimą teigiamą izoflavonoidų poveikį reguliuojant žmogaus cholesterolio homeostazę. Norint patikrinti, ar izoflavonoidai turi poveikį lipidams, buvo atliktas randomizuotas, dvigubai aklas, placebu kontroliuojamas klinikinis tyrimas. Tyrime dalyvavo 23 sveikos, menopauzinio periodo moterys, kurioms buvo duodama 61,8 mg izoflavonoidų ekstrakto per dieną. Kraujo serumo rodmenys buvo fiksuoti prieš tyrimą ir jam pasibaigus (po 4 savaičių). Pasibaigus tyrimui paaiškėjo, kad moterų grupėje, vartojusioje izoflavonoidus, pastebimai sumažėjo bendro cholesterolio, MTL rodmenys kraujo serume [72]. Kitame, 12 savaičių trukusiame randomizuotame, dvigubai aklame, placebu kontroliuojamame tyrime su 252 menopauzinio periodo moterimis, vartojusiomis Rimostilį (57,2 mg izoflavonoidų) ir Promensilį (82 mg izoflavonoidų), buvo užfiksuotas mažas, bet statistiškai patikimas trigliceridų kiekio sumažėjimas kraujo serume. Taip pat buvo pastebėtas ir nedidelis DTL kiekio padidėjimas kraujo serume [63]. 2004 metais buvo atliktas randomizuotas, dvigubai aklas, kryžminis placebu kontroliuojamas tyrimas su 46 vidutinio amžiaus vyrais ir 34 postmenopauzinio periodo moterimis. Tyrimo tikslas buvo patikrinti biochanino ir formononetino gebėjimą paveikti MTL kiekį kraujo serume [55]. Tiriamieji vartojo du raudonojo dobilo izoflavonoidų mišinius, kurių vienas buvo praturtintas biochaninu, kitas - formononetinu. Žmonės buvo padalinti į dvi grupes B ir F, 6 savaites pusė F grupės gavo formononetinu praturtintus dobilo izoflavonus, kita pusė - biochaninu, o grupė B - placebą. Po šešių savaičių abi grupės savaitę gavo placebą. Po to B grupė 6 savaites gavo formononetino ir biochanino, o F - placebo. Tyrimo rezultatai parodė, kad 10 proc. MTL sumažėjimas kraujo serume pasireiškė tik pas vyrus, vartojusius biochaninu praturtintus dobilo izoflavonoidus. Tai gali paaiškinti, kodėl kituose atliktuose tyrimuose tik su moterimis nebuvo pastebėta izoflavonoidų cholesterolio homeostazę įtakojančio veikimo. 2004 metais buvo atliktas dvigubai aklas, randomizuotas, placebu kontroliuojamas tyrimas su raudonojo dobilo izoflavonoidų derivatais (43,5 mg/d), kuriame dalyvavo 250 moterys, kurių amžius tarp 49 ir 65 metų. Po 12 mėnesių taikyto gydymo pas tiriamąsias nebuvo nustatyta ryškaus BCh , DTL ir MTL kiekio pokyčio lyginant su gydymo pradžioje atliktais lipidų tyrimais [4]. Kitas, randomizuotas, dvigubai aklas, tyrimas nustatė, kad pas 25-kias postmenopauzinio periodo moteris, vartojusias 86 mg/d išgrynintų izoflavonoidų, izoliuotų iš raudonojo dobilo, nebuvo pastebėtas ryškus cholesterolio homeostazės pokytis.

18 Tačiau šiai dienai įrodymai apie izoflavonoidų poveikį lipidams nėra pakankami ir norint patvirtinti jų teigiamą klinikinį poveikį lipidų homeostazei, reikia tolimesnių studijų.

Poveikis kraujo spaudimui ir endotelio funkcijai. Atliktame randomizuotame dvigubai

aklame, kryžminiame klinikiniame tyrime su 16 postmenopauzinio periodo moterų, turinčių antrojo tipo diabetą, raudonojo dobilo izoflavonoidai (50 mg/d) parodė poveikį didinant kraujagyslių rezistentiškumą ir reguliuojant kraujo spaudimą [33]. Po 4 savaičių moterims taikytos izoflavonoidų terapijos pastebėtas SKS ir DKS sumažėjimas ir kraujagyslių atsakas į L - NMMA (L - nitromonometilargininas) buvo žymiai didesnis lyginant su placebu kontroliuojama grupe. Norint patikrinti ar izoflavonoidai gali veikti kraujo spaudimą ir endotelio funkcijas, buvo atliktas kitas randomizuotas dvigubai aklas tyrimas su 80 sveikų savanorių: 46 vyrais ir 34 moterimis [67]. Tiriamieji vartojo raudonojo dobilo izoflavonoidus, praturtintus biochaninu ir formononetinu (80 mg/d). Tyrimas kryžminis, todėl eksperimentas buvo dalijamas į du 6 savaičių periodus. Tyrimo metu buvo nustatyta, kad izoflavonoidai, praturtinti formononetinu, sumažino arterijų standumą ir bendrą vazorezistentiškumą, bet neturėjo kraujo spaudimą mažinančio efekto.

2.6 Vėžio prevencija

Krūties vėžys. Nustačius, kad mamografinis tankis turi įtakos krūtų vėžio išsivystymui

[74], buvo pradėti tyrimai su įvairiais preparatais, norint patikrinti jų gebėjimą sumažinti mamografinį tankį. 2003 metais buvo atliktas klinikinis dvigubai aklas, randomizuotas, placebu kontroliuojamas tyrimas su 205 moterimis (amžius tarp 45 - 69 metų) [5]. Tiriamosios vartojo iš raudonojo dobilo izoliuotus izoflavonoidus (26 mg/d biochanino A, 16 mg/d formononetino, 1 mg/d genisteino ir 0,5 mg/d daidzeino). Prieš tyrimą ir jam pasibaigus, t.y. po 12 mėnesių, buvo stebimi šie rodmenys: mamografinis tankis, estradiolio, FSH (folikulinas arba folikulus stimuliuojantis baltymas), LH (liuteinizuojantis hormonas) kiekiai. Tyrimo metu buvo nustatyta, kad grupėje, vartojusioje izoflavonoidus, nežymiai sumažėjo mamografijos tankis. Kiti rodmenys žymiai nepasikeitė lyginant su placebą gavusia grupe, nors vėliau, 2007 metais atliktoje sisteminėje klinikinių tyrimų apžvalgoje, buvo pastebėta, kad sojos izoflavonoidai gali ryškiai sumažinti FSH ir LH hormonų kiekį. FSH ir LH kiekis dažniausiai išauga postmenopauziniu laikotarpiu, o šių hormonų padidėjimas gali būti susijęs su krūtų vėžio atsiradimu [30]. Kitas tyrimas su raudonojo dobilo izoflavonoidais (50 mg/d), kuriame dalyvavo 30 menopauzinio periodo moterų, nustatė izoflavonoidų antiproliferacinį veikimą [27].

19

Prostatos vėžys. Atliktame nerandomizuotame, neaklame tyrime su 38 savanoriais

vyrais, sergančiais prostatos vėžiu, buvo nustatyta, kad raudonojo dobilo izoflavonoidai (160 mg/d) padidina ląstelių apoptozę, lyginant su kontrole (P=0.0018) [38]. Tačiau nebuvo pastebėtas PSA (prostatos - specifinių antigenų), testosterono bei Glisono skaičiaus pasikeitimas, prieš ir po gydymo izoflavonoidais. Verta paminėti, kad prostatos atsiradimo priežastys nėra žinomos, didelę įtaką turi paveldėjimas. Remiantis epidemiologiniais tyrimais, prostatos vėžiu rečiau sergama rytų šalyse. Manoma taip yra todėl, kad ten suvartojama daugiau augalinio maisto, kuriame yra izoflavonoidų, lignanų, seleno [47].

2.7. Osteoporozės prevencija

Menopauzės metu apsisaugojimui nuo kaulų retėjimo yra taikoma pakaitinė hormonų terapija (PHT), tačiau yra tyrimų bylojančių, jog taikant PHT didėja vėžio rizika, ypač krūtų [8, 50]. Todėl fitoestrogenai buvo pradėti naudoti kaip alternatyvi osteoporozės prevencijos priemonė. Nors daugiausiai buvo tyrinėti sojos izoflavonai, tačiau yra nemažai duomenų, kad raudonojo dobilo izoflavonai taip pat pasižymi šia savybe.

2004 metais atliktame tyrime paaiškėjo, kad pas moteris, vartojusias raudonojo dobilo izoflavonoidus (43,5 mg/d) 12 mėnesių, juosmens slankstelių mineralų kiekio ir kaulų tankio sumažėjimas buvo mažesnis, lyginant su placebu kontroliuojama grupe. Taip pat pastebėtas kaulų formavimosi markerių padidėjimas. Tyrimas buvo randomizuotas, dvigubai aklas ir placebu kontroliuojamas, jame dalyvavo 205 moterys [3]. Kitas randomizuotas, dvigubai aklas klinikinis tyrimas buvo atliktas su 46 postmenopauzinio periodo moterimis. 6 savaites moterys vartojo atsitiktinai paskirtą izoflavonoidų dozę - 28,5 mg/d, 57 mg/d arba 85,5 mg/d. Po 6 savaičių taikytos izoflavonoidų terapijos buvo pastebėtas kaulų tankio padidėjimas lyginant su pradiniais tyrimais. Tiriamųjų, vartojusių 57 mg/d izoflavonoidų, kaulų tankis padidėjo 4,1 proc., vartojusių 85,5 mg/d - 3,0 proc., o vartojusių 28,5 mg/d kaulų tankio pasikeitimai buvo nežymūs [18]. 2007 metais atliktame randomizuotame dvigubai aklame tyrime su 389 postmenopauzinio periodo moterimis, kurių kaulų mineralų tankis buvo mažesnis nei 0,795 g/cm2, buvo nustatyta, kad izoflavonoidas genisteinas turi teigiamą efektą didinant kaulų tankį. Tyrimas truko 2 metus. Tiriamosios buvo padalintos į dvi grupes - viena vartojo placebą (n=191), o kita (n=198) 54 mg/d genisteino [49].

20

2.8. Farmakokinetika ir farmakodinamika

Buvo tiriama raudonojo dobilo izoflavonoidų kasdieninio ilgo vartojimo farmakokinetika. 14 tiriamųjų dvi savaites vartojo mažai izoflavonoidų turintį maistą, kitas dvi savaites gavo po dvi tabletes (80 mg p/o) izoflavonoidų per dieną. Kraujo tyrimai buvo atlikti praėjus 48 val. po paskutinės izoflavonoidų dozės. Kraujo mėginiai buvo tiriami ESC pagalba. Tyrimo rezultatai parodė, kad apatinės daidzeino ir genisteino plazmos koncentracijos buvo žymiai didesnės nei tos, kurios buvo nustatytos šio tyrimo pradžioje, o bendra izoflavonoidų plazmos koncentracija atitiko tas pačias ribas, kaip ir pas žmones, kurie vartoja daug izoflavonoidų turintį maistą. Remiantis kraujo tyrimais nustatyta, kad ilgai vartojant izoflavonoidų preparatus, jų užtenka vienos terapinės dozės per dieną [34].

Kitas klinikinis tyrimas buvo atliktas norint išsiaiškinti ar izoflavonoidų glikozidų ir izoflavonoidų aglikonų pasisavinimas vienodas žmogaus organizme. Atliktas tyrimas buvo randomizuotas, kryžminis, dvigubai aklas bei placebu kontroliuojamas. Jame dalyvavo 14 savanorių. Tiriamieji vartojo sojos izoflavonoidų glikozidus ir raudonojo dobilo izoflavonoidų aglikonus, įterptus į pusryčių maistą. Tyrimas buvo kryžminis, todėl buvo padalintas į tris periodus po 2 savaites: pirmą periodą į maistą buvo dedamas placebas ir sojos izoflavonoidų glikozidai, antras periodas buvo išsivalymo - visi tiriamieji vartojo placebą, trečias periodas - tiriamieji vartojo placebą ir raudonojo dobilo izoflavonoidų aglikonus. Izoflavonoidų absorbcija buvo matuojama pagal šlapimo mėginius, paimtus 24 val. po paskutinės terapinės dozės. Ištyrus šlapimo mėginius, paaiškėjo, kad izoflavonoidų absorbcija nepriklauso nuo to ar jie pateko glikozidų ar aglikonų pavidalu. Kadangi izoflavonoidų kiekis tiriamųjų šlapime buvo labai panašus, buvo padaryta išvada, kad absorbcijai individualus kintamumas neturi įtakos [71]. Kitame panašiame tyrime su izoflavonoidų glikozidais ir išvalytais izoflavonoidų aglikonais buvo nustatyta, kad izoflavonoidų aglikonai pasisavinami greičiau ir didesniais kiekiais, lyginant su glikozidintais izoflavonoidais [36].

Buvo pastebėta, kad gyvūnams, dažniausiai avims, suvartojusiems labai didelį kiekį dobilų, pasireiškia grupė simptomų, vadinamų "dobilų liga". Publikacija, aprašanti "dobilų ligą", kaip pagrindinius simptomus įvardija nevaisingumą, nenormalią laktaciją, distociją ir gimdos prolapsą. Visų šių simptomų atsiradimo priežastis hipotetiškai yra priskiriama estrogeniniam

21 dobiluose esančių izoflavonoidų veikimui [77, 12]. Tačiau nei viename klinikiniame tyrime nebuvo pastebėtas šalutinis poveikis vartojant iki 160 mg izoflavonoidų per dieną.

Raudonojo dobilo preparatai yra kontraindikuotini asmenims, kurie yra alergiški šiam augalui. Taip pat preparatų iš šio augalo negalima vartoti nėštumo, žindymo laikotarpiu ir vaikams iki 12 metų dėl galimo jų sistemino hormoninio poveikio.

Pacientai, sergantys nuo hormonų priklausomomis ligomis, esant nuo hormonų priklausomam vėžiui ar šeiminei jo anamnezei, prieš vartodami raudonojo dobilo preparatus turėtų pasitarti su savo gydytoju.

Dozavimas:

 Menopauzės simptomų lengvinimui - 40 - 82 mg raudonojo dobilo izoflavonoidų per dieną.

 Cholesterolio kiekio mažinimui - 40 - 86 mg raudonojo dobilo izoflavonoidų per dieną.  Osteoporozės prevencijai - 44 - 86 mg raudonojo dobilo izoflavonoidų per dieną.

 Pradinės prostatos hiperplazijos simptomų lengvinimui - 40 - 80 mg raudonojo dobilo izoflavonoidų per dieną.

22

2.10. Trifolium L. genties apibūdinimas

Dobilai (Trifolium L.) yra viena iš svarbiausių pupinių (Leguminosae L. arba Fabaceae

L.) šeimos genčių. Ją sudaro apie tris šimtus augalų rūšių. Ši gentis yra žinoma žmonijai nuo

biblijinių laikų. Trifolium lotyniškai reiškia "trys lapai". Šis pavadinimas atsirado dėl charakteringų augalo morfologinių bruožų - ant lapkočio dažniausiai būna trys lapeliai. Mitologijoje dobilas žinomas kaip sėkmę nešantis augalas [17].

9 pav. Purpurinis dobilas (Trifolium incarnatum L.) (A) ir pūstavaisis dobilas (Trifolium

fragiferum L.) (B).

Purpurinis dobilas (Trifolium incarnatum L.) (9 pav.): vienametis, 30-45 cm aukščio, pilkai žalias augalas su mažai šakota liemenine šaknimi ir pavieniu stiebu. Stiebas status arba kylantis, nuo pamato išsišakojęs, padengtas tankiais lapeliais. Lapeliai pilkai žali, kartais šiek tiek rausvi, plačiai atvirkščiai kiaušiniški, 1-3 cm ilgio. Žiedynkočiai ilgi, standūs, žiedų galvutės neapsuptos žiedų, žiedai skaiščiai raudoni.

Pūstavaisis dobilas (Trifolium fragiferum L.) (9 pav.): daugiametis 10-20 cm aukščio augalas su stora šakota liemenine šaknimi ir keliais stiebais. Stiebai gulsti arba kylantys, žemutiniuose bambliuose įsišaknijantys, dažniausiai pliki, mažai šakoti. Lapai 3-15 cm ilgio, viršūnėje plaukuoti. Lapai trilapiai; lapelių koteliai trumpi, apaugę gana ilgais plaukeliais. Lapeliai melsvai žali, atvirkščiai kiaušiniški arba elipsiški, viršūnėje įlenkti, su labai trumpu smaigalėliu, smulkiai pjūkliški. Žiedai statūs ar įstriži, 5-7 mm ilgio, ant labai trumpų plaukuotų kotelių,

23 susibūrę po 30 - 60 į tankias balsvas galvutes. Žydi birželio-rugpjūčio mėnesį. Didelė žiedų dalis - savidulkiai.

10 pav. Raudonasis dobilas (Trifolium pratense L.) (A) ir šilinis dobilas (Trifolium

medium L.) (B)

Raudonasis dobilas (Trifolium pratense L.) (10 A): daugiametis, 15-70 cm aukščio augalas su stora, išsišakojusia liemenine šaknimi ir 3-10 stiebų. Stiebai žali, kartais rausvi, dažniausiai kylantys arba pagulę, rečiau statūs, nuo pat pamato arba tik viršūnėje vagoti. Pamatinių lapų lapkočiai ilgi, stiebinių trumpesni arba lapai bekočiai. Lapai trilapiai, retai su 4-5 lapeliais; lapeliai su trumpais, vienodo ilgio koteliais, plačiai atvirkščiai kiaušiniški arba elipsiški, rečiau lancetiški. Žiedai įstriži, 12-17 mm ilgio, bekočiai be pažiedžių po 30-80 susitelkę apvaliose ar plačiai kiaušiniškose 2-3 cm pločio raudonose galvutėse. Žydi birželio-rugsėjo mėnesį. Apdulkinimas kryžmiškas, dažniausiai kamanių.

Šilinis dobilas (Trifolium medium L.) (10 B): daugiametis, 20-50 cm aukščio augalas su labai išsišakojusia liemenine šaknimi, ilgomis požeminėmis palaipomis ir daugeliu stiebų. Stiebai gulsčiais pamatais, kylantys, rečiau statūs, vingiuoti, nešakoti arba šakoti, dažnai rausvi, pliki arba padengti retų prigludusių plaukelių. Žemutinių lapų lapkočiai ilgesni, viršūninių - visai trumpi. Lapai trilapiai; lapeliai trumpai kotuoti, pailgai elipsiški, plačiai lancetiški ar kiaušiniški 1,3-4 cm ilgio ir 0,6-2 cm pločio, smailiaviršūniai, viršutinėje pusėje tamsiai žali, ties pagrindine gysla

24 apaugę prigludusiais plaukeliais, lancetiški. Žiedai įstriži, kvapūs, 12-17 mm ilgio, lenkti, bekočiai, be pažiedžių, po 20-80 susibūrę plačiai kiaušiniškuose beveik apvaliose 2-3 cm pločio, dažniausiai pavienėse rausvose galvutėse. Žydi birželio - rugpjūčio mėn. Augalas hemikriptofitas.

Genties apibūdinimas. Gentį sudaro vienmečiai arba daugiamečiai žoliniai augalai su

stačiais, kylančiais ar gulinčiais, rečiau šliaužiančiais stiebais. Augalai užauga iki 30 - 80 cm. Lapai - trilapiai arba retai pirštiški, su 5 - 9, dažniausiai elipsiniais lapeliais. Prielapiai didesne dalimi suaugę su lapkočiu, dažnai sudarydami tarsi makštį, apkabinančią stiebą. Žiedai (1 - 1,5 cm) sėdintys, susitelkę švytuoklinėse galvutės, rečiau kekėse ar skėčiuose. Žiedai dažniausiai susitelkę trumpoje kekėje arba retai sauliški, su pažiede arba be jos. Taurelė įvairi, dažniausiai vamzdiška, rečiau varpiška, vaisiams atsiradus, kartais padidėjanti, taisyklinga, taisyklinga arba dvilūpė, penkiadantė; jos vamzdelis su 5 arba 10 (20) ar daugiau gyslų, žiotys atviros arba pridengtos plaukelių vainiko ir žiediškai pastorėjusiu pakraščio. auganti, sukietėjusi arba išsipūtusi; taurėlapių skaičius lyginis arba nelyginis. Vainikėlio spalva žydėjimo metu dažniausiai nekinta, priklausomai nuo rūšies gali būti raudonos (Trifolium incarnatum L.), purpurinės (Trifolium fragiferum L.), rožinės (Trifolium pratense L), geltonos (Trifolium campestre Schrieb.) arba baltos (Trifolium

montanum L.) spalvos. Vaisius - atvira ankštis, kurios viduje būna 1 - 2, rečiau 3-6 sėklos [57, 77].

Paplitimas ir kultivavimas. Daugelis dobilų rūšių yra kilę iš vidurio ir pietų Europos,

Šiaurės Afrikos, vidurio Azijos ir Kinijos. Šių teritorijų drėgnose vietose dobilai yra paplitę labai plačiai. Dėl žmogaus ūkinės veiklos šie augalai išplito daugelyje pasaulio vietų. Žemės ūkyje dobilai plačiai naudojami kaip pašarinis augalas.

Dobilai yra sėjami vieni arba su svidrėmis. Kultivuojami jie dėl kelių priežasčių: tai lengvai augantys augalai; suformuoja maistingas ir patogias ganyklas pievose; gali būti naudojami šviežiam arba džiovintam pašarui; fiksuoja azotą, todėl praturtina žemę įvairiomis druskomis ir neleidžia jai skursti; tinka įvairus dirvožemis ir klimatas. Dažniausiai yra kultivuojami daugiamečiai dobilai: raudonasis dobilas (T. pretense L.), baltasis dobilas (T. repens L.), hibridinis dobilas (T.

hybridum L.), pūstavaisis dobilas (T. frageritum L.), kaukazinis dobilas (T. ambigum M.Bieb.), bet

taip pat yra ir kitų svarbių agrokultūrinių rūšių: persinis dobilas (T. resupitanum L), Egiptinis dobilas (T. alexandrinum Jusl.). Dobilai dažniausiai yra gerai adaptavęsi prie šalčio ir nepalankių klimato sąlygų. Kaukazinis dobilas atsparus šalčiui ir sausrai, o T. resupitanum L. ir T.

25 žemam pH. T. alexandrinum Jusl. gali augti gan smėlėtose vietovėse, o kitos rūšys pvz., T.

fragiferum L., T. hybridum L. mėgsta labiau vandenį sulaikančią, druskingą dirvą [62].

Dobilų kaupiamos farmakologiškai aktyvios medžiagos. Dobilų pagrindinės

kaupiamos cheminės medžiagos yra flavonoidai (izoflavonai - formononetinas, daidzeinas, genisteinas, biochaninas A), flavonoliai (kvercetinas); fenolinės rūgštys (salicilo r., p - kumarino r.), žiedo galvutėje randama eterinių aliejų [77, 10].

Flavonoidai yra labai didelė ir svarbi medicinai polifenolinių junginių grupė, šios grupės atstovai - izoflavonai medicinoje taikomi neseniai, o iš atliktų tyrimų rezultatų galima spręsti, kad izoflavonai yra biologiškai aktyvūs augaliniai junginiai, kuriuos galima taikyti gydymo tikslais. Labiausiai izoflavonai ištyrinėti sojoje, tačiau per pastarąjį dešimtmetį buvo laibai susidomėta ir dobilų genties augalais. Dobilai taip pat kaupia nemažus kiekius izoflavonų, todėl yra perspektyvūs vaistiniai augalai. Dobiluose izoflavonai nustatinėjami taikant šiuolaikinės analizės metodikas - efektyviąją skysčių chromatografiją. Izoflavonų nustatymui dobiluose ir ekstraktų standartizavimui, Amerikos farmakopėjos straipsnis siūlo naudoti ESC metodą [73].

26

3

TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODIKA

3.1. Tyrimo objektas

Buvo tirtos 18 dobilų rūšių žaliavos: T. incarnatum L.; T. medium L.; T. pratense L.; T.

montanum L.; T. ambigum M. Bieb.; T. alpestre L.; T. hibridum L.; T. rubens L.; T. aureum Poll.; T. panonicum Jacq.; T. ochroleucum Huds.; T. trepens L.; T. arvense L.; T. alexandrinum Jusl.; T. glanduliferum L.; T. resupinatum L.; T. campestre Schreb.; T. fragiferum L. Dobilų mėginiai

užauginti Lietuvoje, Lietuvos žemdirbystės instituto - 2008 m. Žaliava surinkta žydėjimo metu. Daugiamečių dobilų rūšių antžeminė dalis suskirstyta į žiedus, lapus ir stiebus. Detaliau mėginiai aprašyti 1 priedo lentelėje).

Analizuota:

 50 proc. etanoliniai T. pratense L. dobilų rūšies ekstraktai ekstrakcijos laikui įvertinti.

 Įvairių koncentracijų T. pratense L. dobilų rūšies ekstraktai tirpiklio poliškumui įvertinti.

 50 proc. etanoliniai, parūgštinti įvairių dobilų rūšių, ekstraktai.

 Formononetino, genisteino ir daidzeino standartiniai tirpalai paruošti metanolyje, pradinė koncentracija 0,1 - 0,16 mg/ml. Skiedžiant pradinį tirpalą buvo paruošti kiti penkių skirtingų koncentracijų standartiniai tirpalai, iš kurių duomenų buvo sudarytos gradavimo kreivės.

3.2. Medžiagos ir tirpikliai

Naudoti analitinio švarumo eliuentai. Gradientinio švarumo acetonitrilas (ACN) įsigytas „Sigma–Aldrich GmbH“ (Vokietija), 99,8 proc. trifluoracto rūgštis (TFA) iš „Sigma-Aldrich GmbH“ (Vokietija). Išgrynintas dejonizuotas vanduo (18,2 mΏcm-1) ruošiamas „Millipore“ (JAV) vandens valymo sistema. Prieš naudojant eliuentai degazuojami. Formononetino standartas įsigytas iš „Sigma – Aldrich GmbH“, (Vokietija), genisteino ir daidzeino standartai iš „Chomadex inc. (JAV). Etanolis (reaktifikuotas spiritas 96,3 proc.) įsigytas iš AB „Stumbras“ (Kaunas, Lietuva).

27

3.3. Tyrimo metodas

Tyrimui pasirinktas analizės metodas – efektyvioji skysčių chromatografija (ESC). Mėginiai ruošti analizei, izoflavonus ekstrahuojant iš augalinės žaliavos 50 proc. (V/V) etanoliniu vandens tirpalu. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas pritaikytas ir optimizuotas izoflavonų analizėje remiantis 30 Amerikos farmakopėjos straipsniu T. pratense augaliniai žaliavai analizuoti.

Tiriamųjų mėginių paruošimas. Dobilų ekstraktai buvo ruošiami remiantis 30 Amerikos

Farmakopėjos straipsniu, skirtu T. pratense L. analizei atlikti [73]. 1.5 g žaliavos užpilama 60 ml 50 proc. (V/V) vandens etanoliniu tirpalu ir paliekama 12 valandų orbitalinėje kratyklėje. Po 12 valandų ekstraktas filtruojamas vakuuminiu filtru, 50 ml filtrato perkeliama į stiklinėlę ir džiovinama džiovykloje 700C temperatūroje iki sauso likučio. Sausas likutis užpilamas 10 ml 96,3 proc. (V/V) etanoliu, gerai išmaišomas, įpilama 10 ml vandens bei 5 ml 1M HCl. Gautas mišinys 30 min. hidrolizuojamas verdančioje vandens vonioje. Atlikus hidrolizę, tirpalas filtruojamas vakuminiu filtru ir praskiedžiamas 50 proc. (V/V) etanoliniu vandens tirpalu iki 30 ml.

Efektyviosios skysčių chromatografijos aparatūra. Efektyvioji skysčių

chromatografija buvo atlikta naudojant Waters 2695 chromatografijos sistemą Detekcijai buvo naudojamas diodų matricos detektorius Waters 996. Chromatografavimo kolonėlė Xterra 150 mm ilgio, 3,0 mm diametro, porų dydis - 3,5μm, kolonėlė apsaugota su XTerra prieškolonėle.

Efektyviosios skysčių chromatografijos sąlygos. Pasirinkto chromatografinio metodo

judri fazė sudaryta iš tirpiklio A (acetonitrilo) ir tirpiklio B (0,1 proc. trifluoracto rūgšties vandeninio tirpalo R). Atlikus keletą bandymų, eliuacijos gradientas pasirinktas toks, kad smailės chromatogramoje atsiskirtų geriausiai ir atitiktų tik po vieną analitę. Eliucijos gradientas pateikiamas 1 lentelėje. Eliuentų tekmės greitis – 0,45 ml/min., injekcijos tūris – 10 µl., kolonėlės temperatūra – 220C. Chromatografinių smailių identifikavimas atliktas pagal analitės bei etaloninio junginio eliucijos trukmės sutapimą, o taip pat diodų matricos detektoriumi lyginant etaloninių junginių ir analičių UV absorbcijos spektrus 200-540 nm srityje. Kiekinis biologiškai aktyvių junginių nustatymas atliktas išorinio standarto metodu naudojantis kalibracinėmis kreivėmis, kurios sudarytos naudojant penkis kiekvienai identifikuotai analitei tapataus etalono skiedimus. Etaloniniai junginiai tirpinti metanolyje ir jų tirpalai paruošti apytikrėse analičių kiekiui bandinių ekstraktuose koncentracijų ribose.

28 1 lentelė. Eliuentų kiekybinės sudėties kitimo priklausomybė nuo laiko.

Laikas, min. Tėkmės greitis,

ml/min A, proc. B, proc.

1 0,01 0,4 5 95 2 45 0,4 45 55 3 50 0,4 45 55 4 53 0,4 90 10 5 55 0,4 90 10 6 57 0,4 5 95

Duomenų analizė. duomenys rinkti ir analizuoti personalinio kompiuterio programinės

įrangos Empower 2 Chromatography Data Software (Waters Corporation, Milford, JAV) bei Microsoft Office Excel 2007 pagalba. Statistiniai įverčiai pasirinkti atsižvelgiant į mokslinių gairių reikalavimus.

29

4. DARBO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

4.1. Metodikos optimizavimas

Vaistinių augalinių žaliavų ir iš jų gautų fitopreparatų cheminės sudėties įvairovės tyrimams, kokybės kontrolei užtikrinti būtina taikyti šiuolaikinius analizės metodus. Jie turi būti pakankamai jautrūs ir leisti efektyviai išskirstyti sudėtingus mišinius. Būtina atsižvelgti į naudojamų metodų informatyvumą, tai svarbu siekiant patikimai identifikuoti veikliuosius junginius ir tiksliai įvertinti jų kiekį. Naujo metodo vystymas ir optimizavimas atliktas remiantis moksliniais literatūros šaltiniais bei 30 JAV Farmakopėjos monografijomis. T. pratense žolė ir ekstraktas yra įtraukti į USP 30 [73]. Tyrimo objektas – įvairios dobilų rūšys bei įvairios augalinės žaliavos (lapai, žiedai stiebai). Farmakopėjoje aprašytas metodas privalo būti optimizuotas atsižvelgiant į tyrimo kompleksiškumą bei mėginių ypatumus. Kadangi literatūros šaltiniuose nepavyko rasti duomenų apie izoflavonų kiekius ir pasiskirstymą kitose dobilų rūšyse bei jų dalyse, optimizavimo pagrindu pasirinkta: ekstrakcijos sąlygų optimizavimas ir chromatografinio skirstymo sąlygų optimizavimas. Optimizuotai metodikai pagrįsti pasirinkti esminiai validacijos parametrai: atrankumas, tiesiškumas, ribos.

4.1.1. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas

Ekstrakcijos tirpiklio poliškumo bei ekstrahavimo metodo įtakos biologiškai aktyvių junginių sudėties kokybiniams ir kiekiniams rodmenims įvertinimas yra esminis žingsnis optimizuojant augalinės žaliavos ekstrakcijos sąlygas. Ekstrakcijos sąlygos visoms dobilų rūšims buvo parinktos pagal 30 Amerikos Farmakopėjos straipsnį T. pratense L. rūšies augalams analizuoti. Remiantis šiuo straipsniu pasirinktas metodas buvo optimizuotas ir pritaikytas turimai laboratorinei įrangai.

Tirpiklio poliškumo įtaka: poliškumas yra svarbus faktorius pasirenkant ekstrakcijos

tirpiklį, nes flavonoidų glikozidai yra daug poliškesnės molekulės, nei jų aglikonai. Kadangi laisvų aglikonų augaluose yra tik apie 3 proc., geriau naudoti vandens - alkoholių mišinius. Dažniausiai yra naudojamas 70 proc. arba 50 proc. koncentracijos etanolis [35].

Tirpiklio poliškumo įtakai įvertinti buvo atlikti eksperimentai, ekstrakcijos tirpikliu naudojant 40, 50, 60, 70 (V/V) proc. vandeninius etanolio tirpalus. Ekstrakcija buvo atliekama 20

30 val. kratyklėje. Po 20 val. ekstraktas buvo skiedžiamas etanoliu santykiu 1:25 ir matuojama absorbcija prie bangos ilgių, kurie atitinka izoflavonų absorbcijos maksimumus: 249, 259, 301, 328 nm. Rezultatų atsikartojamumui padidinti buvo ruošiami po du kiekvienos koncentracijos mėginiai, pamatavus jų absorbciją išvedamas absorbcijos vidurkis. Gauti duomenys pateikti 2 lentelėje, o grafinė jų išraiška - 11 pav.

2 lentelė. Įvairių koncentracijų ekstrakcijos tirpiklių absorbcijos vidurkiai. Etanolio koncentracija, proc. Ekstrakcijos laikas, val. λ=249 λ=259 λ=301 λ=328 1 40 20 1,1219 1,0192 0,8229 0,8453 2 50 20 1,2913 1,1262 0,8945 0,8572 3 60 20 1,0982 0,9677 0,7734 0,7642 4 70 20 1,0475 0,9551 0,7493 0,7402

11 pav. Ekstrakcijos tirpiklio absorbcijos priklausomybė nuo koncentracijos.

Didžiausia absorbciją pasižymi 50 proc. (V/V) vandeninis etanolinis ekstraktas, be to labiau poliškas tirpiklis sąlygoja mažesnį chlorofilo patekimą į ekstraktus. Todėl tolimesnei bandinių ekstrakcijai pasirinktas 50 (V/V) proc. vandens etanolio tirpiklis.

31

Ekstrakcijos trukmės įtaka. Ekstrakcijos trukmės įvertinimui analizuoti 50 (V/V)

proc. (V/V) vandens etanoliniai bandiniai, bandiniai buvo imami periodiškai, po 1, 2, 4, 6 ,12 ir 20 val. maišymo orbitalinėje kratyklėje. Rezultatų atsikartojamumui padidinti buvo ruošiami trys bandiniai, o pamatavus jų absorbcijas išvedamas vidurkis. Gauti rezultatai pateikiami 3 lentelėje, o grafinė jų išraiška - 12 pav.

3 lentelė. Absorbcijos priklausomybė nuo ekstrakcijos laiko. Ekstrakcijos laikas λ=249 λ=259 1 0,8 0,758 2 0,857 0,8631 4 1,0241 1,0536 6 1,1163 1,125 12 1,2913 1,1305 20 1,2919 1,1411

12 pav. Bandinio absorbcijos priklausomybė nuo ekstrakcijos laiko.

Didžiausia absorbcija pasižymėjo bandiniai, kurių ekstrakcijos laikas yra 12 ir 20 val. Todėl taupant laiką ir laboratorinę įrangą buvo pasirinkta 12 valandų ekstrakcijos trukmė.

32 14 pav. T.pratense L. mėginio chromatograma ir analites atitinkantys absorbcijos spektrai.

4.1.2. ESC metodo optimizavimas

Atlikti preliminarūs bandymai, siekiant gauti geriausią analičių smailių skiriamają gebą ir etaloninių junginių mišinio išskirstymą. Acetonitrilo – vandens ar metanolio – vandens mišiniai, be ar su nedideliu kiekiu rūgšties, yra pirmo pasirinkimo tirpikliai flavonoidų ir izoflavonoidų eliuavimui atvirkščių fazių efektyviojoje skysčių chromatografijoje Dėl augalinės matricos, turinčios įvairaus polingumo analičių, kompleksiškumo buvo pasirinktas didesnės eliucinės gebos organinis tirpiklis - acetonitrilas. Be to, siekiant sumažinti fenolinių hidroksilo grupių jonizaciją, sąlygojančią didesnį chromatografinį analičių sulaikymą [2, 13], buvo naudojama trifluoracto rūgštis (TFA).

4.1.2.1. Metodo atrankumas

Metodo atrankumas parodo, kad kiekviena smailė esanti chromotogramoje atitinka po vieną analitę. Todėl kiekvienai smailei chromatogramoje buvo registruojami UV absorbcijos spektrai, parodantys ar smailę chromatogramoje atitinka tik vienas junginys (14 pav.). Esant keliems junginiams skirtingose smailės vietose užregistruojami spektrai skiriasi. Smailių indentifikavimas atliktas palyginant juos su standartų UV absorbcijos spektrais (13 pav.).

33

4.1.2.2. Tiesiškumas

Daidzeino, genisteino ir formononetino kiekibiniam įvertinimui buvo sudarytos gradavimo kreivės. Gauti rezultatai pateikti 15 pav.

15 pav. Formononetino, daidzeino ir genisteino standartų gradavimo grafikai.

Smailės ploto priklausomybė yra tiesiška išanalizuotame koncentracijų intervale. Gradavimo kreivės yra patikimos ir gali būti naudojamos kiekybiniam izoflavonų nustatymui, nes korialiacijos koeficientų R2 reikšmės yra artimos 1, kas rodo didelę tiesinę priklausomybę.

34

4.1.2.3. Aptikimo ir nustatymo ribos

Nustatymo (NR) ir aptikimo ribos (AR) apskaičiuotos lyginant išmatuotą mažos koncentracijos pavyzdžio smailės aukštį su bazinės linijos triukšmu, nustatant koncentraciją, kada analitė dar gali būti patikimai atskirta nuo bazinės linijos triukšmo. Nustatymo ribos skaičiuojamos lyginant smailės aukštį su bazinės linijos triukšmu. Įvertinamas bazinės linijos triukšmo dydis. Smailė, kurios aukštis 3 kartus didesnis už bazinės linijos triukšmą, atitinka aptikimo ribą – tereikia apskaičiuoti kokią medžiagos koncentraciją ji atitinka. Nustatymo riba – analogiškai, tik smailė turi būti 10 kartų aukštesnė už triukšmą.

4 lentelė. Izoflavonų daidzeino, genisteino ir formononetino nustaytmo ir aptikimo ribos. Aptikimo riba (µg/ml) Nustatymo riba (µg/ml)

Daidzeinas 0,0779 0,2360

Genisteinas 0,0323 0,0979

35

4.2. Nustatytų izoflavonų kiekybinis įvertinimas dobilų rūšyse

Izoflavonų kiekybinis įvertinimas augalinėje žaliavoje buvo vertintas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Atlikto tyrimo duomenys pateikti priede (2 priedo lentelė). Apdorojus gautus rezultatus buvo sudarytas genisteino, daidzeino ir formononetino tarprūšinis pasiskirstymas, kuris grafiškai pateiktas 16 pav.

16 pav. Nustatytų izoflavonų pasiskirstymas tarp rūšių.

Daugiausia daidzeino, formononetino ir genisteino kaupia T. medium Grufb., atitinkamai -1,417 mg/g 2,923 mg/g ir 3,928 mg/g. T. pratense L., T. fragiferum L. ir T. incarnatum

L. rūšyse formononetino nustatyta, atitinkamai - 1,221 mg/g, 1,522 mg/g ir 2,494 mg/g. T. campestre Schrieb. nustatytas didelis kiekis genisteino - 3,038 mg/g, tačiau formononetino ir

daidzeino pavyko aptikti tik pėdsakus. Genisteino taip pat buvo nustatyta T. ochroleucum Huds., T.

rubens L. ir T. alpestre L., atitinkamai - 0,717 mg/g, 1,878 mg/g ir 0,702 mg/g. Iš nustatytų

izoflavonų mažiausiai buvo aptikta daidzeino - didžiausi jo kiekiai nustatyti T. medium L., T.

pratense L., T. frageritum L. rūšyse, atitinkamai - 1,417 mg/g, 0,751 mg/ ir 0,442 mg/g. Mažiausiai

izoflavonų nustatyta T. hibridum L., T. arvense L., T. repens L., T. montanumL., T. aureum Poll. augaluose.

36

4.3. Izoflavonų kiekio įvairavimas dobilų genties augalų organuose

Kiekybiškai buvo nustatyta genisteino, daidzeino ir formononetino kiekiai daugiamečių augalų lapuose, žieduose ir stiebuose. Apdorojus gautus rezultatus, buvo sudarytas grafinis izoflavonų pasiskirstymo vaizdas augalų dalyse, rezultatai pateikti 17 pav.

17 pav. Suminis nustatytų izoflavonų pasiskirstymas augalų dalyse.

Kaip matyti iš diagramos, daugiausia izoflavonų nustatyta T. medium Grufb. lapuose - 8,270 mg/g. T. pratense L. rūšis daugiausia izoflavonų kaupia stiebuose - 2,742 mg/g, T. frageritum

L. - lapuose - 2,752 mg/g, T. ochroleucum Huds. lapuose - 1,014 mg/g. Žieduose izoflavonų

nustatyta mažiausiai, tik T.aureum Poll. rūšis lyginant su lapais ir stiebais žieduose kaupia daugiau izoflavonų - lapuose - 0,001 mg/g, stiebuose 0,001 mg/g, o žieduose - 0,345 mg/g.

37

4.4. Izoflavonų nustatymas T.pratense L. rūšies augalų organuose

Kiekybiškai nustatytas genisteino, formononetino ir daidzeino kiekis T. pratense L rūšies augalų lapuose, žieduose, stiebuose, bei šaknyse. Rezultatai grafiškai pateikti 18 pav.

18 pav. Suminis nustatytų izoflavonų kiekis T. pratense L. rūšies augalų organuose.

T. pratense L. augalai šaknyse izoflavonų kaupia panašius kiekius kaip ir kitose augalo

dalyse, šaknyse izoflavonų nustatyta 2,349 mg/g. Daugiausia izoflavonų nustatyta stiebuose - 2,742 mg/g, mažiausiai - žieduose - 1,827 mg/g, lapuose- 2,308 mg/g. Iš tyrimo duomenų galima spręsti, kad izoflavonai pasiskirstę visame augale.

38

4.5. IZOFLAVONŲ KIEKIO SKIRTUMAI KULTIVUOJAMŲ IR RINKTŲ

NATŪRALIOSE AUGIMVIETĖSE T.PRATENSE L. ORGANUOSE

Buvo nustatyta T. pratense izoflavonų kiekiai laukinių ir kultivuojamų augalų lapuose, žieduose ir stiebuose. Gauti rezultatai grafiškai pateikti 19 pav.

19 pav. T. pratense L. nustatytų izoflavonų kiekio pasiskirstymas kultivuojamos ir laukinės populiacijos augalų organuose.

Kaip matyti iš grafiko, kultivuojami T. pratense L. rūšies augalai kaupia daugiau nustatytų izoflavonų, nei laukinės populiacijos atstovai. Kultivuojamų augalų lapuose, žieduose ir stiebuose izoflavonų nustatyta atitinkamai - 2,549 mg/g, 1,411 mg/g, 3,499 mg/g. Laukinės populiacijos atstovų lapuose, žieduose ir stiebuose izoflavonų nustatyta, atitinkamai - 1,105 mg/g, 0,990 mg/g ir 1,514 mg/g.

4.6. Apibendrinimas

Atlikus tyrimus nustatyta, jog T. medium Grufb. dobilų rūšis kaupia daugiau izoflavonų, nei šiuo metu medicinos praktikoje naudojama T. pratense L.. Todėl T.medium Grufb. rūšies žaliava galėtų būti perspektyvi gaminant vaistinius preparatus, kurių sudėtyje yra izoflavonų. Sprendžiant iš izoflavonų pasiskirstymo įvairiose dobilų genties augalo dalyse, galima teigti, kad izoflavonų gavybai iš dobilų genties augalų geriausiai yra naudoti visą žolę, nes antžeminėje dalyje ir šaknyse izoflavonų kiekių pasiskirstymas panašus. Nustatyta jog kultivuojami T.pratense L. augalai kaupia