4. MATERIALI E METODI
4.1 TERRENI E REAGENTI
Per la coltura delle cellule, è stato adoperato terreno RPMI 1640 (Sigma) preparato con l’aggiunta di aminoacidi non essenziali all’1%, 2 mM L-glutammina, 50 µg/ml gentamicina.
Al terreno è stato aggiunto, dove non specificato altrimenti, plasma autologo di gatto al 3%, IL-4 10 ng/ml e il GM-CSF 50 ng/ml ricombinanti felini (R&D Systems, USA).
Gli anticorpi monoclonali utilizzati sono stati i seguenti: α-MHC II felino (fornito dal Dr. Peter F. Moore, Università della California, Davis); α-CD14 umano ficoeritrinilato, e il suo controllo isotipico (TUK4, Serotec, USA) come controllo negativo; α-CD1a felino (FE1. 5F4) e α-B7. 1 felino (B7. 1.66), gentilmente fornito dal Dr. Wayne Tompkins (Università della Carolina del Nord) (Tompkins et al., 2002). Per quanto riguarda il controllo negativo è stato utilizzato l’anticorpo L8D8 (Freer et al., 1998).
Le DC in coltura sono state in seguito maturate con i seguenti stimoli:
1) LPS derivato da Escherichia coli 0127:B8 (Sigma chemical Co, St Louis, USA) nella dose di 50 ng/ml. 2) IFNα umano ricombinante, acquistato dalla Roche (Roferon-A) e l’IFNα umano naturale, acquistato dalla Jansen (Cilferon-A), è una glicoproteina solubile di origine naturale, appartenente alla famiglia delle citochine. 3) Il TNFα umano ricombinante (ottenuto dal’R&D). 4) Il Poly (I:C), acquistato dal Amersham Biosciences e diluito in soluzione, è un
sintetico dell’RNA. 5) Le piastrine feline attivate erano ottenute da 15ml di sangue di gatto in EDTA, separato su Ficoll e venivano attivate con l’aggiunta di 20 µM ADP per 2 min. 6) CD40L umano che agisce per la stessa via delle piastrine, era presente sulla superficie di fibroblasti umani trasfettati. Questi erano lasciati crescere qualche settimana in terreno al 3% di plasma autologo felino e aggiunti al giorno 5 di coltura delle DC, 25.000 cellule per pozzetto.
4.2 METODI PER PURIFICARE I MONOCITI
Vari metodi sono stati inizialmente provati per purificare i monociti dai PBMC. A. PURIFICA TRAMITE MACS:
Le cellule sono state incubate per 15 min, 20× 106 PBMC con 40 µl anticorpi α-CD14 umano (Miltenyi Biotec, Germania) legati covalentemente a ferro colloidale. Successivamente i PBMC lavati, venivano caricati su una colonnina MS (Miltenyi Biotec) posta su un magnete. Per effetto del campo magnetico, che si creava, venivano separati i monociti legati all’anticorpo α-CD14 umano, dalle restanti popolazioni. Dopo lavaggio della colonna i monociti così ottenuti, venivano seminati su piastra in 2 ml di terreno al 3% di plasma autologo contenente 5 µl/ml di GM-CSF e 1.6 µl/ml di IL-4 felini.
50 × 106 PBMC. Dopo separazione su Ficoll e conta, i PBMC erano risospesi in 3 ml di Percoll 100%, in precedenza preparato in una provetta da 50 ml. Sui PBMC in Percoll 100% sono stati stratificati 3ml di frazioni a diversa percentuale di percoll: 60%, 50%, 42.5%, 35%. Il gradiente continuo così ottenuto era centrifugato a 2000 rpm per 30 min (accelerazione 2 e decelerazione 0).
Alla fine della centrifuga si otteneva una serie di anelli delle diverse popolazioni (Fig. 5) che erano separati in provette diverse, lavati in soluzione fisiologica e centrifugati a 1800 rpm per 10 min.
Per determinare la percentuale di cellule CD14+ nelle varie frazioni cellulari, ogni frazione era risospesa in 2 ml di RPMI. 100µl d’ogni sospensione era posta in provette da FACS e colorata con 2 µl αCD14 e 20% BSA e azide. Dopo mezz’ora d’incubazione le cellule erano lavate e fissate con PBS all’1% paraformaldeide per l’analisi al FACS.
4.3 ANIMALI
Gli animali utilizzati sono gatti di sesso femminile specific-pathogen free forniti dalla IFFA Credo (L’Arbresle, Francia).
Il sangue venoso giugulare eparinizzato era ottenuto, in anestesia, da gatti di 1-4 anni, mantenuti secondo le condizioni richieste dalle leggi della Comunità Europea.
4.4 COLTIVAZIONE DELLE DC
Come spiegato in dettaglio nel cap 5.3, il protocollo messo a punto, che si è dimostrato più indicato ai nostri scopi, è stato il seguente.
mediante centrifugazione su gradiente Ficoll-Paque per 30 min a 1800 rpm. I PBMC, dopo essere stati lavati in soluzione fisiologica e contati in Turk, erano risospesi in RPMI alla concentrazione di 3 ×106 cellule/ml, poi 3 ml di sospensione cellulare erano posti in piastre da 6 pozzetti, e portati al 3% di plasma autologo felino. Prima della semina, venivano lasciati 106 PBMC per la colorazione CD14+ mediante analisi al FACS, per calcolare la percentuale di cellule con FSC > 200.
Dopo 24 h dalla messa in coltura, venivano rimosse le cellule non aderenti, mentre le aderenti erano lavate delicatamente con RPMI-sf. Alle cellule nei pozzetti, si aggiungeva 1 ml (per pozzetto) di RPMI–sf al 3% di plasma autologo al quale erano addizionate le citochine:
IL-4 felina ricombinante (10 ng/ml) GMCSF felino ricombinante (50 ng/ml)
Al terzo giorno, dalla messa in coltura, si dava una seconda dose di citochine, nel volume di 100µl/pozzetto di RPMI–sf al 3% di plasma autologo, alla concentrazione sopra definita nel volume finale di 1,1 ml/ pozzetto.
4.5 COLORAZIONE CON ANTICORPI
Al settimo giorno di coltura, le cellule erano raccolte e centrifugate a 1800 rpm per 10 min a TA. Il pellet risospeso in RPMI e contato in tripan blue.
Venivano preparate tante provette da FACS quanti erano i campioni e posti in ghiaccio si aggiungeva lo 0,2% di albumina di siero bovino, 0,1% di Na azide a tutti i campioni che ricevevano gli anticorpi. Successivamente si aggiungevano le cellule concentrate tra 5 × 105 –6 × 105 cellule ad ogni campione e incubate per 30 min in ghiaccio. Dopo il lavaggio, si aggiungeva un anticorpo secondario fluoresceinato, il siero policlonale anti-IgG di topo fluoresceinato (Sigma) e si incubava in ghiaccio per 30 min. Alla fine della colorazione o del trattamento, i campioni venivano fissati con una soluzione all’1% di paraformaldeide.
Per determinare la vitalità delle cellule al citofluorimetro, in alcuni esperimenti, le cellule colorate con FITC non venivano fissate, ma trattate con 2 µl di 100 µg/ml di propidio ioduro, un colorante che al FACS, analizzato in FL-2, escludendo le cellule morte.
4.6 ANALISI AL CITOFLUORIMETRO A FLUSSO
La citofluorimetria a flusso è una tecnica che permette di misurare le caratteristiche biofisiche e biochimiche delle singole cellule permettendone un analisi sia quantitativa sia qualitativa.
L’interazione del raggio di luce focalizzata con le singole cellule, dà origine a segnali di luce diffusa, relativi alle loro caratteristiche fisiche e morfologiche, e a segnali di fluorescenza legati alla presenza di marcatori fluorescenti sulla superficie.
I segnali di luce diffusa, comprendono sia fenomeni di diffrazione sia di riflessione e rifrazione della luce. La luce dispersa in avanti entro piccoli angoli o Forward Light Scatter (FSC), è determinata principalmente da fenomeni di diffrazione ed è correlata alle dimensioni cellulari; il segnale Side Light Scatter (SSC) o scatter ad ampio angolo è dovuto invece sia a fenomeni di riflessione che di rifrazione della luce ed è funzione della morfologia cellulare: granulosità citoplasmatica, rapporto nucleo citoplasmatico, rugosità superficiale e diametro cellulare.
Oltre alle caratteristiche fisiche e morfologiche, questo strumento, permette di evidenziare le diverse strutture cellulari, mediante l’utilizzo di molecole fluorescenti, quali l’isotiocinato fluoresceina (FITC), la ficoeritrina (PE).
La rappresentazione grafica di tali eventi, è data da diagrammi di dispersione a punti o dot-plot, in cui ogni punto rappresenta un evento dotato di un definito valore.
Tutti i dati del presente studio, sono stati acquisiti con un citofluorimetro a flusso FACS con Becton Dickinson con un programma “Cell Quest” e analizzati con il programma WinMD.
Le cellule morte e i linfociti possono essere esclusi dalla colorazione con propridio di ioduro e analizzate in fluorescenza rossa (FL-2).
4.7 ANALISI DELLA FAGOCITOSI
Al settimo giorno dalla coltura, le DC erano raccolte e centrifugate a 1800 × g per 10 min. Il pellet risospeso in RPMI, alla concentrazione di 3 × 106/ml.
Per l’analisi della fagocitosi mediata dall’MMR (Lanzavecchia et al., 1995), le DC venivano risospese in RPMI al 5% FCS, 200 µg/ml DX FITC (FITC-DX, Molecular Probes) e incubate per tre tempi diversi. Per la pinocitosi (Bienzle et al., 2003) le DC venivano risospese in RPMI 5% FCS, 100 µg/ml di Alexa
Fluor 488 (Invitrogen, Milano, Italia) ed incubate per quattro tempi. Entrambe venivano incubate sia a 37°C sia a 0°C.
Prima di essere acquisite le DC venivano risospese in PBS 1% paraformaldeide.
4.8 SAGGI DI ALLOREATTIVITA’
I saggi di alloreattività, venivano fatti mettendo a contatto le DC di un gatto erano messe in coltura con i PBMC di un altro gatto. Al momento del saggio, le DC erano raccolte in provette, centrifugate a 1800 rpm, risospese in terreno RPMI e contate in tripan blue.
I MΦ, le iDC e le mDC sono stati incubati per quattro giorni con 105 PBMC di un gatto allo genico, al rapporto di 1:100, 1:33, 1:10 (ossia 1.000, 3.000, o 10.000 DC). Per ogni popolazione le DC erano seminate da sole come controllo negativo; le rimanenti erano seminate con i PBMC freschi dell’altro gatto, nella concentrazione di 104/pozzetto.
Per quanto riguardava i PBMC freschi, venivano seminati nel seguente modo:solo PBMC freschi e tre con PBMC addizionati alla concanavalina (ConA) 50µl/pozzetto (diluita 1:5).
In ogni pozzetto era aggiunto 20 µl di siero umano inattivato.
La piastra era incubata a 37°C. Al quarto giorno, dall’inizio del saggio, si aggiungeva 1 µCi di [metil-3H] timidina (Amersham Biosciences) e dopo diciotto ore le cellule venivano raccolte su filtri e contate al beta-caunter
