2 MATERIALI E METODI

(1)

2 MATERIALI E METODI

2.1 ALLESTIMENTO ED ANALISI DELLE COLTURE

Tutti i campioni pervenuti all’U.O. Microbiologia Universitaria sono stati utilizzati per la ricerca di miceti. In particolare, sono stati inclusi nello studio i lieviti isolati da pazienti ricoverati nei seguenti reparti: centro ustioni, medicina generale ospedaliera, nell’ambulatorio del piede diabetico e in ambulatorio di endoscopia pneumologica ospedaliera nel periodo agosto 2010–aprile 2011.

Trattandosi di materiali biologici prelevati da diversi siti corporei, sono state effettuate procedure differenziate a seconda della natura del campione. Tutti i materiali raccolti mediante tamponi sterili con gel di trasporto venivano seminati direttamente su agar Sabouraud destrosio, addizionato con cloramfenicolo e gentamicina (Becton Dickinson, Heidelberg, Germania, BD), pH 5,6, per inibire la crescita batterica e rendere così tale terreno selettivo per miceti.

Materiali solidi, come le punte dei cateteri, erano sottoposti ad un arricchimento mediante immersione in brodo Brain Hearth Infusion Broth (BD). Una aliquota del brodo di coltura era quindi prelevata con ansa sterile e seminata su agar Sabouraud.

Tutti i materiali liquidi erano seminati direttamente su agar Sabouraud mediante prelievo di una aliquota con ansa sterile. Ai campioni di escreato, broncoaspirato e broncolavaggio, in dipendenza del loro grado di fluidità, venivano aggiunte aliquote di “Supplement” (Oxoid) equivalenti a quelle del campione: tale reagente, ricco di ditiotreitolo consentiva, infatti, la disgregazione dei filamenti mucosi che trattengono i microrganismi eventualmente presenti. Dopo tale trattamento, anche i suddetti materiali erano seminati su piastre di agar Sabouraud (Figura 8).

(2)

Materiali e Metodi, 36

Figura 8. Piastra di agar Sabouraud.

Per quanto riguarda i campioni di sangue, una aliquota era utilizzata per inoculare direttamente i flaconi contenenti il terreno di crescita da introdurre nel sistema automatizzato per emocoltura. In particolare, veniva utilizzato il sistema automatico Bactec 9240 (BD) che prevedeva l’inoculo diretto di aliquote di sangue tra i 5 e i 10 ml in appositi flaconi Bactec Plus. Nei flaconi erano contenute resine per l’assorbimento di molecole antimicotiche e antibiotiche eventualmente presenti nel sangue al momento del prelievo, potenzialmente in grado di inibire la crescita dei microrganismi. I flaconi venivano quindi inseriti negli appositi alloggiamenti del Bactec 9240 (Figura 9). Appena lo sportello dello strumento era chiuso, un sensore segnalava la presenza di un nuovo flacone e consentiva l’inizio del monitoraggio della coltura. La produzione di anidride carbonica, quale catabolita del metabolismo microbico veniva rilevata da un sensore posizionato al fondo del flacone di emocoltura.

(3)

Non appena la concentrazione di CO2 si discostava da un valore

soglia predeterminato veniva generato un allarme acustico e visivo.

Figura 9. Il sistema Bactec 9240.

Dalle colture positive veniva allestito un esame batterioscopico, previa colorazione di Gram; i preparati, osservati al microscopio ottico, fornivano indicazioni presuntive sulla natura dei microrganismi.

Al fine di abbreviare i tempi necessari per l’esame microbiologico, sono oggi disponibili i terreni cromogeni (Figura 10) che in virtù della loro composizione, consentono a specie diverse del genere Candida di assumere aspetti cromogeni di colonia diversi.

(4)

Figura 10. CHROMagar™ Candida. Colonie di Candida albicans dalla caratteristica colorazione verde-turchese, colonie di Candida tropicalis dalla caratteristica colorazione blu scuro, colonie di Candida krusei dalla caratteristica colorazione rosa chiaro, con un alone biancastro e margini frastagliati.

In particolare, nel laboratorio di Microbiologia Universitaria di Pisa, era utilizzato il terreno cromogeno Brilliance TM Candida Agar (OCCA, Oxoid Chromogenic Candida Agar, U.K). Questo terreno contiene due substrati cromogeni, i quali sono metabolizzati da specifici enzimi di alcune specie di Candida: il cromogeno X-NAG, che rileva l’attività dell’enzima esoaminidasi ed il cromogeno BCIP, che mette in evidenza l’attività della fosfatasi alcalina.

L’azione degli enzimi sui substrati è dimostrata dalla particolare colorazione che assumono le colonie delle varie specie del genere

(5)

Tabella 2. Differenziazione delle specie del genere Candida, in base all’utilizzazione dei substrati cromogeni X-NAG e BCIP contenuti nel terreno OCCA. Enzima cromogeno: X-NAG Esoaminidasi BCIP Fosfatasi alcalina Colore caratteristico delle colonie

C. tropicalis + Blu scuro

C. albicans C. dubliniensis + Verde ‡ C. krusei + Rugose, frastagliate, dal colore rosa/marrone C. glabrata C. kefyr C. parapsilosis C. lusitaniae Variabile Beige/gialle/ marrone †

Figura 11. Colonie di specie diverse di lievito sul terreno cromogeno OCCA.

(6)

2.2 IDENTIFICAZIONE DEI LIEVITI

Sebbene l’esame colturale, condotto mediante l’impiego di terreni cromogeni, fornisca una rapida diagnosi presuntiva delle più importanti specie del genere Candida, i test biochimici semiautomatizzati consentono di completare l’iter diagnostico, confermando l’identificazione presuntiva o permettendo di identificare le specie di più raro isolamento o lieviti non appartenenti al genere Candida (ad esempio: Cryptococcus). Tali test sfruttano proprietà di natura biochimico-metabolica del lievito in esame.

Tra questi, la galleria ID 32 C (bioMeriéux Incorporated, Francia) è un sistema che consente l’identificazione con metodi automatizzati dei lieviti grazie alla presenza di 32 test di assimilazione degli zuccheri standardizzati e miniaturizzati.

La galleria è costituita da 32 cupole, ognuna delle quali contiene un substrato disidratato. Il lievito da identificare è risospeso ad una specifica densità ottica e la lettura delle reazioni viene effettuata dopo 48 h di incubazione a 30°C ad occhio nudo o utilizzando lo strumento mini API (Figura 12), collegato a un software dedicato (bioMeriéux).

(7)

Per inoculare i pozzetti della galleria, secondo le istruzioni fornite dalla ditta produttrice, colonie di lievito di 24–48 h erano prelevate dal terreno di coltura e risospese in API Suspension Medium, ad una concentrazione pari a 2 Mc Farland. Successivamente, 250 µl della sospensione così ottenuta erano aggiunti alla fiala di API C medium. Una aliquota (135 µl) della nuova sospensione fungina erano quindi distribuiti in ciascuna cupola della galleria ID 32 C.

La galleria veniva posta in incubatore a 30°C, in a mbiente umido, ed era incubata per 24–48 ore (Figura 13).

Figura 13. Identificazione biochimica di lieviti tramite la galleria ID 32 C.

Un’identificazione più rapida (4–6 h) era fornita dal sistema VITEK 2 (bioMeriéux) (Figura 14). Tale sistema si compone di due stazioni di lavoro distinte: lo “SmartCarrier” e lo strumento di lettura e gestione dati Vitek 2. Alla stazione di lavoro SmartCarrier, partendo da colonie pure ed isolate su terreno agar Sabouraud, si allestivano in soluzione salina sospensioni di

(8)

miceti con torbidità equivalente all’indice 2 della scala di McFarland, verificata con il densitometro DensiChek in dotazione.

Per procedere all’identificazione dei miceti, veniva utilizzata la Card YST, collocandola nella sede dedicata, avendo cura di far leggere il codice a barre e di inserire nella sospensione il tubicino della Card.

La Card YST, come tutte le Card Vitek, si compone di una struttura di materiale plastico, che presenta 64 pozzetti. A tale struttura è applicata una membrana semipermeabile su entrambi i lati e questo sistema chiuso è in comunicazione con l’esterno per mezzo di un tubicino ricurvo e flessibile. Il tubo connette l’esterno con tutti e 64 i pozzetti, mediante un sistema di piccoli sifoni. I 64 pozzetti contengono altrettanti metaboliti o sostanze nutritive che i miceti possono utilizzare.

Figura 14. Apparecchio VITEK 2.

Una volta collocata la Card nello strumento, si creava una pressione negativa e la membrana semipermeabile consentiva all’aria nei pozzetti di uscire, richiamando, mediante il tubicino, la sospensione contenuta nella provetta.

In questo modo, si procedeva all’inoculo della Card, permettendo alla sospensione di lieviti di penetrare in tutti e 64 i pozzetti. Nella fase immediatamente successiva una lama incandescente tagliava e

(9)

contemporaneamente saldava il tubicino e la Card era pronta per essere processata.

Seguiva un’incubazione di 16 h, in ambiente termostatato a 30°C, durante la quale i pozzetti della Card venivano sottoposti a lettura spettrofotometrica ogni 10 minuti. Venivano determinati 64 grafici di crescita o utilizzo metabolico che alla fine del processo, dopo 96 letture, stabilivano la positività o negatività di ogni singolo test.

Il software del Vitek 2 consentiva di rapportare la serie delle indicazioni tratte dai pozzetti positivi e/o negativi, al database contenente l’abaco digitale necessario a effettuare l’identificazione. Il sistema Vitek 2 identifica 46 specie diverse di miceti lievitiformi discriminando 26 specie nell’ambito del genere Candida. Tutte le informazioni relative all’identificazione del ceppo in esame venivano contemporaneamente archiviate nel computer gestionale di Vitek 2, rimanendo a disposizione per successive consultazioni ed elaborazioni statistiche.

2.3 ANTIMICOGRAMMA

Per ciascun ceppo di lievito in studio è stata valutata la sensibilità/ resistenza ai principali farmaci antimicotici.

A causa della ormai vasta diffusione del fenomeno della farmaco-resistenza, il test di sensibilità agli antimicotici conclude l’iter diagnostico dei campioni di isolamento clinico e fornisce importanti informazioni, per la scelta mirata del farmaco.

In questo studio, le tecniche utilizzate per valutare la suscettibilità agli antimicotici sono state il sistema in micro piastra Sensititre® Yeast One 9, basato sul principio di micro diluizione in brodo ed il sistema E-Test, basato sulla diffusione in agar.

(10)

2.3.1 I sistemi Sensititre® Yeast One e E-test

La metodica Sensititre Yeast One (Sensititre Trek Diagnostic System UK) prevedeva di cimentare una sospensione standardizzata di miceti lievitiformi con concentrazioni scalari di vari antimicotici in una piastra a micropozzetti. Le molecole antifungine, si trovano in forma liofilizzata e in concentrazioni crescenti già depositate sul fondo dei pozzetti della piastra.

In particolare, la piastra di Sensititre® yeast one Y09 utilizzata prevedeva la valutazione della suscettibilità del lievito ai seguenti farmaci antifungini: fluconazolo, itraconazolo, voriconazolo, posaconazolo, anidulafungina, micafungina, caspofungina, 5–fluorocitosina, amfotericina B. Nella figura sottostante, è rappresentato lo schema del contenuto di una piastra di Sensititre® yeastone Y09, dove sono riportate orizzontalmente quantità crescenti di tutti gli antimicotici eccetto l’amfotericina B, posta nell’ultima colonna verticale (Figura 15).

Figura 15. Schema del contenuto dei pozzetti della piastra Sensititre® yeast one Y09.

(11)

Inoculando la sospensione di funghi, si otteneva il contemporaneo risultato di idratare i farmaci antimicotici e di porre quest’ultimi in contatto con le cellule di lievito. Una piccola quantità della colonia, prelevata con ansa sterile dalla piastra in esame, veniva sospesa in soluzione sterile allo 0,45% di NaCl, fino a raggiungere la torbidità di 0,5 McFarland. Una aliquota di 20 µl della sospensione veniva trasferita in una provetta contenente 11 ml di brodo di coltura RPMI (MAIM S.L. Spagna).

Si procedeva, quindi, ad inoculare in ogni pozzetto della micropiastra 100 µl della sospensione così preparata, ponendo attenzione a non formare bolle d’aria. La piastra così preparata veniva ricoperta con un film adesivo, per impedire l’evaporazione del materiale liquido, e posta in termostato a 37°C. La lettura del test veniva effet tuata dopo 24 ore di incubazione, valutando le variazioni cromatiche nei pozzetti; nei pozzetti nei quali avveniva crescita dei miceti si sviluppava un intenso colore fucsia, mentre dove le molecole antifungine avevano inibito la crescita, il pozzetto rimaneva blu (Figura 16).

(12)

In Tabella 3 sono riportati i criteri interpretativi e i valori di breakpoint per la valutazione dell’antimicogramma.

Tabella 3. Criteri interpretativi e valori di breakpoint per la valutazione dell’antimicogramma*

*

I valori di breakpoint sono definiti secondo quanto indicato da CLSI (Reference

Method for Broth Diluition Antifungal Suscetibility Testing of Yeast)

La metodica E–Test si basa, invece, sull’impiego di striscioline (bioMeriéux) contenenti un gradiente scalare di un solo antimicotico, la cui relativa concentrazione è ben evidenziata dagli indici numerici.

Il sistema si basa sul concetto di gradiente di concentrazione che si crea ponendo a contatto la striscia E-Test con la superficie del terreno Mueller-Hinton AGAR in piastra Petri (Biolife, Italia). Si ha una diffusione della molecola antimicotica sulla superficie del terreno stesso dovuta a fattori fisici, quali la concentrazione differenziale e la solubilità che porta alla formazione nella piastra Petri di settori a gradiente di concentrazione differenziale. Le colonie del lievito venivano sospese in soluzione fisiologica sterile fino ad arrivare ad una torbidità uguale a 0,5 McFarland. Un tampone sterile veniva poi inserito nella sospensione e ritratto, eliminando il liquido in eccesso, ruotando il tampone contro le pareti della provetta.

ANTIFUNGINO SENSIBILE SENSIBILE DOSE DIPENDENTE INTERMEDIO RESISTENTE Anidulafungina ≤ 2 µg/ml Micafungina ≤ 2 µg/ml Caspongina ≤ 2 µg/ml 5 - Fluorocitosina ≤ 4 µg/ml − (8−16) µg/ml ≥ 32 µg/ml Posaconazolo ≤ 1 µg/ml Voriconazolo ≤ 1 µg/ml 2 µg/ml − ≥ 4 µg/ml Itraconazolo ≤ 0,125 µg/ml (0,25−0,5) µg/ml − ≥ 1 µg/ml Fluconazolo ≤ 8 µg/ml (16−32) µg/ml − ≥ 64 µg/ml Amfotericina B ≤ 1 µg/ml

(13)

Il tampone imbevuto della sospensione contenente i miceti era quindi seminato a reticolo sulla superficie di una piastra di Mueller-Hinton Agar. Con l’ausilio di pinze sterili, veniva quindi deposta sul terreno la striscia E-Test, contenente l’antimicotico scelto. Le piastre così preparate erano incubate a 30°C per 24 ore. Al termine del pe riodo di incubazione, si procedeva alla lettura del test. La comparsa di un alone di inibizione di crescita di forma ellittica indicava che la molecola antifungina saggiata aveva determinato, in vitro, un’azione inibente la crescita (Figura 17)

Figura 17. Esempio di una striscia dell’antimicotico fluconazolo con l’alone di inibizione: valore di MIC pari a 1 µg/ml.

Inoltre, questo metodo permetteva la valutazione rapida della concentrazione minima inibente (MIC). Il punto in cui l’alone incontra la striscia, corrisponde alla minima concentrazione di antimicotico in grado di inibire la crescita del lievito. Riportando i risultati delle MIC alle linee guida M27–A2 CLSI 2002, era possibile stabilire se il ceppo fosse sensibile (S), resistente (R), intermedio (I), nella suscettibilità al farmaco (CLSI, Clinical and Laboratory Standard Institute).

(14)

2.4 CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DEL GRUPPO

“PSILOSIS”

I ceppi di Candida parapsilosis isolati dai 5 reparti Ospedalieri dell’Azienda Universitaria Pisana inclusi nello studio sono stati mantenuti su Agar Sabouraud per la durata dello studio e conservati a – 20°C e a – 80°C, in brodo Sabouraud, addizionato con il 30% di glicerolo.

I ceppi, identificati come C. parapsilosis in base al profilo biochimico(n=23) come descritto nel paragrafo 2.2 di questa sezione, sono stati sottoposti ad identificazione molecolare per valutare la presenza delle specie C. orthopsilosis e C. metapsilosis, indistinguibili fenotipicamente da

(15)

Tabella 4. Caratteristiche dei ceppi, identificati come Candida parapsilosis su base biochimica, e sottoposti ad identificazione molecolare

Paziente Anno di

nascita Sesso Reparto Data di isolamento Distretto

P1 1922 F MED4 18 marzo 2011 EMO c

P2 a 1929 M PNEND 9 novembre 2010 B.ASP d.

P2 1929 M PNEND 11 gennaio 2011 B.ASP

P3 1933 M PIEDI 19 gennaio 2011 T.CUT e

P4 1934 M PNEND 23 marzo 2011 B.ASP

P5 1934 M PNEND 19 novembre 2010 BAL f

P6 a 1937 M PIEDI 12 febbraio 2011 T.CUT

P6 1937 M PIEDI 12 marzo 2011 T.CUT

P7 ( R/L ) b 1938 M PNEND 12 gennaio 2011 BAL

P8 1938 M PNEND 1 aprile 2011 B.ASP

P9 1939 F PIEDI 25 gennaio 2011 T.CUT

P10 1940 M PNEND 26 novembre 2010 B.ASP

P11 1940 M PNEND 3 marzo 2011 B.ASP

P12 1940 F PNEND 11 gennaio 2011 B.ASP

P13 1941 M PNEND 22 febbraio 2011 BAL

P14 a 1942 M CUS 25 marzo 2011 B.ASP

P14 ₁₉₄₂ _M _CUS _{29 marzo 2011} _B.ASP

P14 ₁₉₄₂ _M _CUS _{1 aprile 2011} _B.ASP

P14 ₁₉₄₂ _M _CUS _{22 marzo 2011} _B.ASP

P15 ₁₉₄₂ _M _CUS _{24 marzo 2011} _BAL

P16 1944 M PIEDI 19 marzo 2011 T.CUT

P17 1946 M PIEDI 23 febbraio 2011 T.CUT

P19 1950 M PIEDI 13 gennaio 2011 T.CUT

P21 1958 F PIEDI 15 marzo 2011 T.CUT

P22 1963 F PNEND 28 gennaio 2011 B.ASP

P23 1986 M PNEND 16 febbraio 2011 BAL

a

Pazienti con più di un isolamento colturale di C. parapsilosis, bpaziente con presenza di C. parapsilosis rugosa e liscia, cemocoltura, dbronco aspirato,

e

(16)

2.4.1 Estrazione del DNA genomico da C. parapsilosis

I ceppi di C. parapsilosis erano inoculati in brodo YPD contenente 2% glucosio, 2% peptone (Oxoid, Milano, Italia) e 1% estratto di lievito (Difco, Detroit, MI) ed incubati a 30° C per 12 ore in agitazione. I lieviti venivano raccolti in fase stazionaria mediante centrifugazione del campione a 2600 x g per 5 minuti e risospesi in 200 µl di tampone di lisi contenente 100 mM Tris HCl, (pH 8.0), 2% Triton X-100, 1% SDS e 1 mM EDTA (pH 8.0). A questa soluzione era quindi aggiunto un volume pari a 300 µl di palline di vetro (diametro 0.45-0.52 mm, Sigma, St. Louis, USA) e 200 µl di una soluzione fenolo:cloroformio (1:1, Sigma). La lisi dei blastoconidi veniva effettuata ponendo i campioni in vortex (Vortex-Genie, Scientific Industries, New York, USA) per 5 minuti. Al lisato erano aggiunti 200 µl TE [1mM EDTA, (pH 8.0), 10 mM Tris HCl, (pH 8.0)]; la miscela era, infine, centrifugata a 10600 x g per 5 minuti. Il DNA contenuto nel sovranatante, raccolto in un tubo da microcentrifuga, era stato fatto precipitare aggiungendo 1 ml di etanolo assoluto. Successivamente, il campione veniva centrifugato per 2 minuti a 10600 x g ed il sovranatante eliminato. Il pellet era risospeso in 400 µl di TE contenente 10 µl di una soluzione 10 mg/ml di RNase (Sigma), allo scopo di degradare l’RNA presente nel campione. La miscela veniva, successivamente, incubata a 37°C per un’ora ed il DNA veniva nuovamente precipitato mediante aggiunta di 2 volumi di isopropanolo (Sigma) e 10 µl di una soluzione 4 M di ammonio acetato (Sigma). Dopo una centrifugazione a 10600 x g per 10 minuti, il sedimento contenente il DNA genomico era lasciato essiccare a temperatura ambiente, ed infine risospeso in 50 µl di TE (pH 8.0). La qualità del DNA genomico estratto da ciascun ceppo di C. parapsilosis veniva valutata sottoponendo ciascuna preparazione ad elettroforesi su gel di agarosio all’1%, utilizzando TAE 1X [40mM Tris acetato, (pH 8.0), 1mM EDTA, (pH 8.0)] come tampone di migrazione elettroforetica e il DNA del fago λ digerito con l’enzima Hind III, come marker di peso molecolare a

(17)

concentrazione nota. La colorazione del gel con bromuro di etidio (0.05 µl/ml di una soluzione 10 mg/ml, Sigma), al termine della migrazione consentiva di visualizzare le bande di DNA genomico al transilluminatore a luce ultravioletta (ImageMaster VDS, Pharmacia). Ciò permetteva di effettuare una stima approssimativa della concentrazione del DNA.

2.4.2 Amplificazione del frammento SADH

Il DNA genomico dei ceppi di C. parapsilosis in studio (80 ng) era utilizzato per l’amplificazione di un frammento del gene SADH (alcool deidrogenasi secondaria), con i primer SADH Fwd 5’-GTTGATGCTGTTGGATTGT-3’ e SADH Rev 5’-CAATGCCAAATCTCCCAA-3’. La miscela di reazione (50 µl), per ciascun gene analizzato, conteneva 1 µl del DNA genomico (80 ng/µl), 2.5 U di GoTaq polimerasi (Promega, Madison, Wi, USA), 5 µl del tampone 5X (fornito con l’enzima), dNTPs 200 mM e 1 µl di ciascun primer (forward e

reverse, soluzioni 10 µM). Il controllo negativo era costituito, per ciascun

frammento analizzato, dalla miscela di reazione in cui il volume del DNA stampo era sostituito da un uguale volume di acqua distillata. La reazione di PCR era condotta in un termociclizzatore Flexigene (Techno, Cambridge, UK), programmato secondo i seguenti parametri: un primo ciclo di denaturazione per 7 minuti a 94° C, seguito da 30 cicli costituiti da denaturazione a 94° C per 1 minuto, annealing a 50° C per 1 minuto, ed elongazione a 74° C° per 1 minuto. Seguiva una fase di estensione del la catena a 74° C per 10 minuti.

I prodotti di amplificazione (5 µl) venivano sottoposti a migrazione elettroforetica su gel di agarosio all’1%, utilizzando TAE 1X come tampone di corsa e λ ladder 100 bp (Promega), come marker di peso molecolare. Il peso molecolare del prodotto di PCR atteso era di 716 paia di basi (bp). Il frammento di amplificazione era quindi purificato per tutti i ceppi di studio,

(18)

utilizzando il sistema Wizard PCR preps DNA purification kit (Promega), seguendo le indicazioni fornite dalla casa produttrice, e veniva eluito in 50 µl di acqua distillata.

2.4.3 Digestione del frammento SADH con l’enzima di

restrizione BanI ed identificazione delle specie

appartenenti al gruppo “psilosis”

Il frammento SADH ottenuto mediante amplificazione per ciascun ceppo di C. parapsilosis in studio veniva sottoposto a digestione enzimatica in presenza dell’enzima BanI (New England Biolabs Beverly, MA, USA). Infatti, la presenza di polimorfismi nella sequenza del gene

SADH di C. orthopsilosis, C. metapsilosis e C. parapsilosis produceva un

solo sito di restrizione per l’enzima BanI in C. parapsilosis tre siti di taglio

nei ceppi appartenenti a C. metapsilosis e nessun sito di restrizione nei ceppi di C orthopsilosis (Tavanti et al., 2005). La miscela di reazione conteneva 20 µl di amplificato purificato, 4 µl di buffer 4 10X, 2 µl di una soluzione costituita da 20 U/µl dell’enzima BanI e 10 µl di acqua, per un volume finale di 40 µl. La miscela è stata incubata a 37°C per 90 minuti.

I prodotti ottenuti dalla digestione venivano visualizzati mediante separazione elettroforetica su gel di agarosio al 2% contenente bromuro di etidio (0.05 µg/ml), utilizzando TBE 1X, come tampone di corsa e λ ladder 100 bp (Promega), come marker di peso molecolare.

Le bande di DNA, corrispondenti ai profili di restrizione di ciascun amplificato ottenuto, venivano visualizzate al transilluminatore a luce ultravioletta (ImageMaster VDS, Pharmacia). I profili di digestione ottenuti per ciascun ceppo permettevano di evidenziare l’eventuale presenza delle specie C. metapsilosis e C. orthopsilosis. (Tavanti et al., 2005).

(19)

2.4.4 Analisi statistica

L’analisi statistica dei dati è stata condotta utilizzando il programma GraphPad Instat 3.06.

Il confronto tra le diverse frequenze di isolamento delle specie del genere Candida è stato effettuato tramite test esatto di Fischer a due code.