3 Materiale e metodi
3.1 Cenni sui vitigni utilizzati
Per il campionamento sono state utilizzate uve provenienti da due vitigni: il Trebbiano e il Sangiovese. Il Trebbiano è un vitigno a bacca bianca (Fig.14), molto diffuso nell'Italia Centrale, caratterizzato dalla grande produttività e dalla buona resistenza alle malattie. I grappoli del trebbiano sono generalmente grandi, con acini sferici di colore giallo chiaro. La buccia è di media consistenza, la polpa è succosa. Dà un vino di colore giallo paglierino, di buona leva ma non particolarmente caratteristico. Il suo utilizzo è spesso correlato alla vinificazione o taglio con altri vini quali Malvasia Toscana, Verdicchio, Vernaccia di S. Gimignano, Chardonnay, Sauvignon, Bombino Bianco, ecc. Il Trebbiano è famoso per il suo utilizzo nella produzione di Vin Santo, un vino appassito servito come dessert e caratteristico della Toscana e dell’Umbria. Il Sangiovese è senz'altro l'uva a bacca rossa (Fig.14) più diffusa in Italia, soprattutto in Toscana, Umbria, Emilia Romagna. Entra negli uvaggi di centinaia di vini, tra i quali alcuni dei più prestigiosi vini italiani: Carmignano, Rosso Piceno Superiore, Chianti e Chianti Classico, Brunello di Montalcino, Vino Nobile di Montepulciano, Montefalco rosso, Sangiovese di Romagna, Morellino di Scansano e molti altri meno conosciuti ma altrettanto validi. In generale si parla di Sangiovese, ma in realtà questo termine definisce un gran numero di varietà nelle quali si è differenziato nel corso dei secoli. In Toscana ad esempio se ne distinguono due grandi famiglie: il Sangiovese Grosso, che comprende tra gli altri le varietà Brunello (utilizzato per la produzione dell'omonimo vino) e Prugnolo Gentile (utilizzato per la produzione del Vino Nobile di Montepulciano), ed il Sangiovese Piccolo, utilizzato in gran parte della regione. Il vino che se ne ricava ha alcune costanti comuni (buoni tannini ed elevata acidità che ne caratterizzano una discreta longevità) ma può variare dal vino rosso più economico ai vertici qualitativi del Brunello, vino di elevato valore prodotto nella zona di Montalcino; l’acino è di dimensioni medio–grandi, con buccia particolarmente pruinosa di colore nero violaceo, polpa consistente leggermente colorata in rosa.
3.2 Campionamento e trattamento
Le uve, appartenenti sia alle cultivar Trebbiano e Sangiovese, sono state raccolte nel periodo di settembre-ottobre 2009, presso l’azienda-agriturismo Fibbiano a Terricciola (Pisa). Una metà di queste è stata trattata con elicitori gassosi andando cosi a costituire il “materiale trattato”. L’altra metà non ha subito alcun tipo di trattamento, ed è stata considerata come “materiale di controllo”. È stata presa poi la decisione di effettuare uno stoccaggio diverso per i due tipi di uve, in particolare per il Trebbiano è stato scelto di effettuare un appassimento mirato per la produzione di Vin Santo, per il Sangiovese, una lieve disidratazione per una eventuale futura produzione di vino rinforzato. Al momento della vendemmia i grappoli di uva raccolti sono stati scelti in base alla dimensione delle bacche, al colore e al grado di maturazione cercando ti mantenere uniformi questi tre parametri. I grappoli destinati al trattamento, sono stati posti all’interno di un tunnel (camera di disidratazione) in cui si è verificata la circolazione forzata di etilene (1000 ppm) per 36 h o CO2 (100%) per tre giorni. Il tunnel in questione, locato presso la stessa azienda agricola Fibbiano dove sono state effettuate le vendemmie, poteva contenere al massimo 500 kg di uva. L’uva è stata sottoposta all’azione di tali elicitori gassosi, per poi proseguire il processo di appassimento a temperatura ambiente per altri 2 giorni (Sangiovese) o per più di un mese (Trebbiano). Le bacche appartenenti alla cultivar Sangiovese hanno raggiunto una perdita di peso del 5% mentre quelle appartenenti alla cultivar Trebbiano sono state portate ad ottenere una perdita di peso di circa 40-45%, essenziale al raggiungimento di minimo 28°Brix, necessari per l’ottenimento di un vino passito che possa essere definito Vin Santo Toscano. L’uva di controllo ha invece subito un processo di appassimento naturale a temperatura ambiente ed è stata portata al raggiungimento di una perdita di peso pressoché simile a quella delle uve trattate. Durante lo “storage” sono stati effettuati campionamenti periodici dei grappoli di uva. Entrambe le uve (Sangiovese e Trebbiano) locate all’interno del tunnel sono state lasciate ad una umidità relativa di circa il 60-65%. La temperatura è stata impostata a circa 20°C per il Sangiovese e a circa 15°C per il Trebbiano. Dell’uva campionata, sono state scelte bacche più simili possibile e le bucce sono state separate dalle polpe. Il materiale è stato poi congelato con N2 liquido, e conservato a -80°C.
Trattamento con elicitori gassosi: L’erogazione di etilene e CO2 è avvenuta con l’utilizzo di bombole acquistate alla SOL (Pisa). Nella fig. 15 seguente è mostrato il tunnel presente in azienda.
Figura 15: camera di disidratazione o “tunnel” utilizzato per lo stoccaggio prolungato delle uve e per il trattamento con
elicitori gassosi (a) contenuti in bombole apposite (b); campionamento in laboratorio degli acini (c).
3.3 Analisi dell’attività enzimatiche
3.3.1 Quantificazione delle proteine estratte: Bio-Rad Protein Assay
Per avere una giusta misura dell’attività enzimatica è opportuno essere a conoscenza dell’esatta quantità di proteine presente nell’estratto. Gli enzimi sono delle proteine che grazie alla loro struttura terziaria e quaternaria assumono il ruolo di catalizzatori in molte reazioni biologiche, abbattendo l’energia di attivazione. Una misura indiretta della quantità di enzimi presenti è il tenore in proteine che viene calcolato tramite il Bio Rad (BIO-RAD Laboratories S.R.L., MI) che è costituito da un colorante-reattivo a base di acido fosforico, metanolo. Il saggio Bio-Rad è basato sul cambiamento di colore che deriva dal legame di un colorante alle proteine e varia in risposta alla concentrazione proteica. L’assorbanza del complesso colorante-proteina è relativamente stabile. Questo saggio è basato sull’osservazione che il massimo di assorbanza di una soluzione acida di Coomassie Brilliant Blue G-250 varia da 465 nm a 595 nm quando avviene il legame con la proteina. Lo standard di riferimento è l’albumina (BSA). Standard, campione e bianco vengono preparati all’interno di cuvette per il visibile:
- Bianco: 800 µl di acqua e 200 µl di reattivo
- Standard: 790 µl di acqua, 10 µl di campione (si utilizza albumina a concentrazione nota) e 200 µl di reattivo
Dopo aver agitato con cura le cuvette, è necessario attendere circa 15 minuti perché avvenga la reazione. Dopo di che si procede ad una lettura allo spettofotometro (595 nm). Lo spettrofotometro utilizzato era un Ultro spec 2100 pro UV-visible spectro- photometer (Amersham Biosciences). Essendo nota la concentrazione dell’albumina (1,41 mg/ml) sarà possibile calcolare la concentrazione proteica nel nostro estratto con la seguente proporzione:
1,41 mg/ml : Abs Standard = x : Abs campione (x)= concentrazione proteica estratto 3.3.2 Polifenolo ossidasi (PPO)
3.3.2.1 Estrazione
50 g di acini di uva (privati dei vinaccioli) sono stati ridoti a polvere con azoto liquido e successivamente omogeneizzati con 50 ml di sodio fosfato buffer (100 mM, 7,3 pH ) contenente acido ascorbico 10 mM. Quest’ultimo inibisce momentaneamente l’attività delle PPO che cosi non si perdono prematuramente.
Il materiale è stato poi filtrato per mezzo di una garza (8 strati), ed il liquido recuperato è stato centrifugato (15 minuti, 4000 x g, 4°C). Dal nostro centrifugato è stato buttato via il surnatante, mentre la parte solida è stata sospesa nuovamente con una soluzione di Triton x-114 al 4 % (w/v) in sodio fosfato buffer 100 mM (pH 7,3) e sottoposto ad estrazione (30 min., 4°C). Il triton ha la funzione di staccare le proteine dalle membrane a cui sono attaccate, facendole coagulare. Successivamente, la soluzione è stata sottoposta ad una ripartizione di fase per 15 minuti in camera fredda per poi essere immessa in un bagno d’acqua a 37°C per ulteriori 15 minuti, così che le proteine idrofobiche insieme alle antocianine e ai fenoli iniziassero a precipitare, aggregandosi in particelle torbide. A questo punto, la soluzione, diventata spontaneamente torbida, è stata centrifugata (10000 x g, 10 min., 25°C) e la fase superiore (chiara), prelevata con una pipetta pasteur stoccata a -20°C, fino al saggio enzimatico.
3.3.2.2 Analisi dell’attività delle PPO
Per misurare l’attività delle PPO è stato utilizzato come substrato il TBC (tert-butil-catecolo) che viene convertito dal nostro enzima in TBQ (tert-butil-chinone). In presenza di ossigeno, le polifenolossidasi ossidano i due gruppi alcolici dell’anello benzenico formando cosi un chinone. L’attività delle PPO è stata valutata a 400 nm, utilizzando il coefficiente di estinzione molare del TBC (e400 = 1150 M-1 cm-1). Nello standard di reazione 2,6 µg/ml di PPO parzialmente purificate, 10 mM di sodio acetato buffer (pH 3,0) e 2,5 mM di TBC, per un volume finale di 1 ml sono stati
messi a reagire a 25°C. L’attività dell’enzima è stata espressa come µmoli di TBQ formate in un minuto da 1 mg di proteina (Núñez-Delicado et al. 2005a).
3.3.3 Perossidasi (POD) 3.3.3.1Estrazione
L’estrazione delle perossidasi è stata la stessa delle polifenolo ossidasi.
3.3.3.2 Analisi dell’attività delle POD
Per saggiare l’attività delle POD, come substrato è stata utilizzata la dianisidina e come catalizzatore il perossido di idrogeno (H2O2), dalle quale le POD liberano ossigeno (O2.). 750 µl di tampone Na acetato (20 mM, pH 5.0), 25 µl di soluzione dianisidina 1% in metanolo, 50 µl di estratto e 100 µl di H2O 2 (30 mM) sono stati messi a reagire per 2 minuti a 25°C e l’attività è stata monitorata a 470 nm, e calcolata utilizzando il coefficiente di estinzione molare della dianisidina (e470= 1.13 x 104 M-1 cm-1). L’ossigeno prodotto dalla reazione delle POD con l’acqua ossigenata ossida la dianisidina formando un composto colorato che assorbe a 470 nm. L’attività dell’enzima è stata espressa come mmol di dianisidina ossidata prodotta in un minuto da un mg di proteina.
3.3.4 ß-glucosidasi (ßG) 3.3.4.1 Estrazione
Da circa 10 g di acini, si sono tolti i vinaccioli, ed il materiale è stato poi risotto a polvere con l’aiuto di azoto liquido. A 5 g di materiale ridotto in polvere sono stati aggiunti 4 mL di sodio acetato buffer (50 mM, pH 5,2), NaCl 1,4 mM, cisteina 0,2 % (w/v), l’1% (w/v) di PEG 3350 e PMSF (50 mg/mL). Il cloruro di sodio facilita la precipitazione delle proteine, la cisteina inibisce gli enzimi che potrebbero degradare inizialmente le proteine, il PEG serve ad incamerare i fenoli. Dentro una provetta “falcon” immersa in un bagno di ghiaccio, si è omogeneizzata la soluzione con l’Ultraturrax per circa due minuti. L’omogeneizzato è stato poi centrifugato per 30 minuti a 35000 x g, a 4°C (Fils-Lycaon and Buret et al.,1991). Dal centrifugato, si prelevano 2,5 ml di surnatante che vengono filtrati mezzo con l’utilizzo delle colonnine Sephadex G-25 (4°C) precedentemente pre-equilibrate con 10 ml di sodio acetato buffer (50 mM, pH 5,2). Dopo aver versato il surnatante nel filtro, si eluisce con 3,5 di sodio acetato e si recupera il filtrato ottenuto in una provetta di vetro (che costituisce l’estratto proteico).
3.3.4.2 Analisi dell’attività delle ß-G
Il substrato della reazione è il para-nitrofenile legato a uno zucchero, il β-glucopiranoside. Le ß-glucosidasi idrolizzano il legame tra lo zucchero e il para-nitrofenile. Il mezzo di reazione era costituito da 0,1 ml di estratto enzimatico e 0,9 ml di substrato. La reazione è avvenuta a 37°C e dopo un’ora è stata bloccata con l’aggiunta di 0,1 M di carbonato di sodio. A questo punto si procedeva con la lettura allo spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 405 nm. L’attività dell’enzima è stata espressa come µmoli di para-nitrofenolo (e405= 18.43 x 103 M-1 cm-1) prodotto in un minuto da 1 mg di proteina.
3.3.5 Pectin metil esterasi (PME) 3.3.5.1 Estrazione
Da circa 10 mg di acini, si sono tolti i vinaccioli, e poi il materiale è stato ridotto in polvere con azoto liquido. 5 g di polvere sono stati estratti con l’aggiunta di 10 ml di fosfato buffer 0,2 M (pH 7,5), 1 mM EDTA, 5% PVPP, NaCl 2 M e 20 µl di PMSF (50 mg/mL). La soluzione è stata omogeneizzata a 4°C per 15 minuti, con l’aiuto di uno stirrer. Successivamente è stata sottoposta a centrifugazione (4000 x g, 15 min., 4°C) ed il surnatante è stato prelevato e stoccato a -20°C per le successive analisi di attività enzimatica (Bellincontro et al. 2009).
3.3.5.2 Analisi dell’attività delle PME
Per l’analisi enzimatica dell’attività delle PME è stato seguito il metodo di Koslanund (2005) con alcune modifiche. Come substrato è stata utilizzata la pectina 0,5 % (w/v), disciolta in una soluzione di fosfato buffer 0,1 M (pH 7.5). Ad 1 ml di pectina sono stati aggiunti 0,5 ml di estratto proteico anch’esso a pH 7.5 (con l’aggiunta di NaOH) e p-nitrofenile (0,065% w/v). L’attività dell’enzima è stata misurata con lo spettrofotometro a 405 nm per 4 minuti (30°C) ed espressa come mmoli di p-nitrofenolo formato al minuto per mg di proteina (e405= 18.43 x 103 M-1 cm-1).
3.3.6 Poligalatturonasi (PG) 3.3.6.1 Estrazione
Per l’estrazione è stato seguito il protocollo di Bellincontro et al. (2009). Da circa 10 mg di acini, si sono tolti i vinaccioli, ed il materiale è stato ridotto a polvere con l’aiuto di azoto liquido. 5 g di suddetto materiale sono stati estratti con l’aggiunta di 10 ml di 0,2 M fosfato buffer (pH 7,5), 1 mM EDTA, 5% PVPP, 0,5 M NaCl, 2% PEG e PMSF (50 mg/mL). Per circa 30 minuti la soluzione è
stata fatta agitare con l’aiuto di uno stirrer a 4 °C e poi è seguita una centrifugazione (6000 x g, 15 min., 4°C). l’enzima è stato recuperato utilizzando le colonnine Sephadex G-25 è stata portata avanti con sodio acetato buffer (20 mM, pH 4.0).
Dopo aver versato il surnatante nel filtro (2,5 ml), si è eluito con 3,5 ml di sodio acetato 20 mM (pH 4,0) e il materiale è stato stoccato a – 20°C per le successive analisi.
3.3.6.2 Analisi dell’attività delle PG
Come substrato è stato utilizzato l’acido poligalatturonico che viene idrolizzato dalle PG in acido galatturonico. A 0,4 ml di estratto sono stati aggiunti 0,6 ml sodio acetato buffer 0,2 M (pH 4,0) nel quale è stato sciolto l’acido poligalatturonico (0,5%). La soluzione è stata sottoposta ad un’incubazione a 37°C per 90 minuti. A questo punto, sono stati prelevati 0,2 ml dalla soluzione e a questi sono stati aggiunti 0,8 mL sodio-tetraborato (100 mM, pH 9,0), 0,2 ml di acqua e 0,4 ml di ciano-acetammide (1%); la soluzione è stata fatta bollire a 100°C. per 10 minuti, dopodiché si è proceduto alla lettura allo spettofotometro a 276 nm. Per la retta di taratura, acido galatturonico e acqua sono stati utilizzati al posto di acido poligalatturonico e dell’estratto rispettivamente. L’attività dell’enzima è stat espressa come µmol di acido galatturonico prodotto in un minuto da 1 mg di proteina.
3.3.7 Analisi statistica
I valori riportati nelle figure rappresentano la media di tre repliche per ogni punto di campionamento. L’effetto del trattamento con etilene o con biossido di carbonio è stato valutato tramite l’ANOVA ad una via. Il livello di significatività è stato settato a P=0.05 ed effettuato tramite il test di Tukey-Kramer.
