CAPITOLO 3: MATERIALI E METODI
3.1 Materiali
3.1.1 Terreni di coltura e supplementi
Il terreno di coltura RPMI 1640, la penicillina, la streptomicina, la glutammina, la tripsina, l’ albumina bovina sierica (BSA), il siero fetale bovino (FBS), il Ficoll/Hysyopaque, etilendiamminotetracetico (EDTA), il tampone fosfato salino (PBS), il destrano, il Trypan blue sono stati acquistati presso la SIGMA-Aldrich s.r.l. Milano, Italia. Il Bronchial Epithelial Cell Growth Media System (BEGM) e l’inibitore della tripsina (TNS) sono stati acquistati da Lonza, Verviers, Belgio.
3.1.2 Trattamenti
Il Calcio-ionoforo A23187 (C29H37 N3O6) è stato acquistato da SIGMA-Aldrich
s.r.l. Milano, Italia. Il 15-deoxy-∆12,14-prostaglandina J2 (C20H28O3), è stato
acquistato da Cayman Chemical, USA. Il Rosiglitazone (C18H19N3O3S•C4H4O4) è
stato gentilmente fornito da Glaxo Smith Kline (GSH), Verona, Italia. Il Desametazone è stato fornito dalla farmacia dell’ospedale di Cisanello, il Fattore
3.1.3 Kit ELISA
Per il dosaggio di IL-8 ed MCP-1 sono stati utilizzati KIT BIOSOURCE acquistati da Biosource International Inc. Camarillo, CA (USA).
3.1.4 Kit per l’estrazione delle proteine nucleari
Il kit per l’estrazione delle proteine nucleari è stato acquistato da Vinci-Biochem, Firenze, Italia.
3.1.5 Primers e reagenti per RT-PCR e REAL TIME PCR
Kit per l’estrazione dell’RNA è stato acquistato da Macherey-Nagel, USA, “l’iQ SYBR Green supermix” e “l’Iscript cDNA synthesis kit” per la retrotrascrizione sono stati acquistati da BIO-RAD California, CA (USA).
La RedTaq DNA polymerase Superpack e il DNA ladder 100Kb, sono stati acquistati da SIGMA-Aldrich s.r.l. Milano, Italia.
I primers per la RT-PCR sense e antisense per IL-8 ed MCP-1 umane sono stati da noi disegnati e acquistati da Invitrogen Milano, Italia.
La sequenza dei primers per RT PCR :
IL-8 : Sense,5’-ATGACTTCCAAGCTGGCCGT-3’ Antisense, 5’-CCTCTTCAAAAACTTCTCCACACC-3’ MCP-1: Sense, 5’-GCCTCCAGCATGAAAGTCTC-3’ Antisense, 5’-CAGATCTCCTTGGCCACAAT-3’
La sequenza dei primers per REAL TIME PCR: IL-8: Sense, 5’- GAATGGGTTTGCTAGAATGTGATA 3’ Antisense, 5’- CAGACTAGGGTTGCCAGATTTAAC 3’ MCP-1: Sense, 5’- CATTGTGGCCAAGGAGATCTG 3’ Antisense, 5’- CTTCGGAGTTTGGGTTTGCTT 3’
3.1.6 Soluzioni e buffers
Le soluzioni impiegate nel dosaggio immunoenzimatico ELISA di IL-8 ed MCP-1 sono state preparate nel nostro laboratorio ( Tabella 3).
Soluzioni
Composizione
Assay Buffer (MCP-1 e IL-8) NaCl 8.0g
KCl 0.2g
Na
2HPO
41,13g
KH
2PO
40.2g
BSA 5g
Tween 20 1ml
q.s to 1 liter with distilled H2O, pH: 7,4
Wash Buffer (MCP-1)
NaCl 9g
Tween 20 1ml
q.s to 1 liter with distilled H2O, pH: 7,4
Wash Buffer (IL-8)
KH
2PO
40,2g
K
2HPO
4.3H
2O 1,9g
EDTA 0,4g
Tween 20 0,5ml
q.s to 1 liter with distilled H2O, pH: 7,4
Coating Buffer (MCP-1)
NaHCO
34,3g
Na
2CO
£5,3g
q.s to 1 liter with distilled H2O, pH: 9,4Coating Buffer (IL-8)
NaCl 8,0g
Na
2HPO
41,13g
KH
2PO
40,2g
KCl 0,2g
q.s to 1 liter with distilled H2O, pH: 7,4
Substrate solution
Tetramethylbenzidine (TMB)
Stop solution
H
2SO
41,8 N
3.1.7 Modelli sperimentali
A549
Linea cellulare A549 di cellule neoplastiche in coltura continua ottenute da un paziente affetto da carcinoma bronchiolo-alveolare (Giard, 1973). Sebbene si tratti
di cellule maligne, e come tali non direttamente equiparabili a cellule umane
normali, esse hanno la caratteristica di essere le uniche cellule in coltura che mantengono un fenotipo alveolare umano. Tale linea c’ è stata gentilmente fornita dal Dott. Romano Danesi, Dip. di Farmacologia dell'Università di Pisa.
BEAS-2B
Le cellule della linea continua denominata BEAS-2B sono state ottenute a partire da cellule di epitelio bronchiale umano normale e sono state immortalizzate attraverso trasformazione con il virus SV40 (Reddel, 1988). Tali cellule hanno dunque un fenotipo di epitelio bronchiale, non sono cellule maligne, ma sono cellule in coltura continua, facilmente espandibili in laboratorio e in grado di generare dati confrontabili da laboratorio a laboratorio. Le cellule BEAS-2B sono coltivate in BEGM medium .
Monociti
I monociti sono stati isolati da sangue periferico di normali donatori in seguito a centrifugazione per gradiente con Ficoll/ Hysyopaque.
3.2 Metodi
3.2.1 Le colture cellulari
A549 e BEAS-2B
Le cellule sono state coltivate in fiasche da 75 cm2, successivamente incubate a 37°C con il 95% di umidità e il 5% di anidride carbonica. La manipolazione delle colture cellulari è stata condotta in condizioni di sterilità mediante l'impiego di una cappa a flusso laminare. il terreno di coltura delle A549 ( RPMI 1640, 10% siero fetale bovino, 1% penicillina/streptomicina, 1% L-Glutammina), e delle BEAS-B (50% di RPMI 1640 + 50% di BEGM ) è stato cambiato ogni 48-72 ore. Raggiunto l’80% di confluenza le cellule sono state sottoposte a serie di passaggi per la propagazione. A tale scopoil terreno è stato aspirato dalla fiasca e le cellule lavate con PBS 1x per rimuovere ogni traccia di siero o fattori che possano inibire l'azione della tripsina. Successivamente le cellule sono state staccate dalla piastra mediante
aggiunta di Tripsina 0.25% e poste in incubatore per 3-5 minuti. La tripsina veniva quindi inibita dall’aggiunta di terreno contenente siero (o inibitore specifico della tripsina per le cellule coltivate in assenza di siero). Le cellulle successivamente sono state centrifugate per sette minuti a 1400 rpm e risospese in
1 mL di terreno di coltura. Al fine di mantenere una riserva sempre disponibile, le cellule sono state risospese in un appropriato mezzo di congelamento (terreno di coltura
specifico e 5% DMSO), preparate aliquote da 106 cellule/ml che sono state congelate progressivamente fino a -80°C ed infine trasferite in azoto liquido.
Le cellule utilizzate negli esperimenti venivano piastrate su piastre da 96 pozzetti a densità variabile da 25000 a 50000 cellule/pozzetto a seconda del tipo cellulare, dopo essere state staccate dalle T75 con procedura analoghe a quelle descritte.
Isolamento dei monociti
Lo stesso giorno in cui si piastravano le cellule si piastravano anche i monociti. Il Buffy coats veniva recuperato in una falcon da 50mL con una pipetta da 10mL dalla sacca e fatto centrifugare una volta per 10 minuti a 200 × g. Il plasma residuo si aspirava e si riportava al volume originario con aggiunta di PBS-EDTA fino a raggiungere un volume massimo di 20-25mL. Il Destrano T500 al 2% in fisiologica veniva messo in una falcon da 50mL in una quantità pari a quella iniziale del buffy che era gradualmente aggiunto dopo la centrifugazione e lasciato per 40 minuti per la sedimentazione degli eritrociti. Il surnatante ricco di leucociti veniva raccolto in una falcon da 50mL, si aggiungeva un volume pari di PBS-EDTA e si centrifugava per 10 minuti a 200 × g. Il surnatante formatosi veniva aspirato e il pellet ottenuto risospeso in 30mL di PBS-EDTA. La sospensione si stratificava su Hysyopaque con una diluizione 1:2 e centrifugata per 30 minuti esatti a 400 × g. Il surnatante veniva aspirato facendo attenzione a non aspirare l’anellino di linfo-monociti. L’anellino con i mononucleati veniva quindi recuperato in una falcon da 50mL, risospeso in 10-15mL di PBS-EDTA e centrifugato per 7 minuti a 250 × g. Il surnatante veniva aspirato e il pellet risospeso nel terreno per le A549. A questo punto si passava alla conta cellulare mediante la camera conta globuli Neubauer (circa 2 milioni per pozzetto) e la popolazione di linfo-monociti si seminava in piastre da 24 pozzetti, con l’aggiunta di terreno per le A549 con un volume finale in ogni pozzetto di 500µL, e incubata a 37°C O.N. Il giorno dopo i linfo-monociti venivano lavati con 100µL di PBS 1× allo scopo di separare i linfociti in sospensione dai monociti che si erano attaccati alla piastra.
3.2.2
Induzione
di
microparticelle
da
parte
dei
monociti/macrofagi attivati con Calcio-ionoforo A23187 (C
29H
37N
3O
6) e stimolazione di A549 e BEAS-2B.
Una volta raggiunto l’80% di confluenza le cellule sono state staccate, contate mediante una camera conta globuli Neubauer e seminate in piastre da 96 pozzetti, 100µl di terreno di coltura per pozzetto alla concentrazione di 2,5-5 x 104 cellule e incubate a 37°C O.N.
Lo stesso giorno i monociti sono stati isolati, contati e posti in piastre da 24 pozzetti, 500µl di RPMI +10% di siero per pozzetto alla concentrazione di 2 x 106 cellule e stimolate con A23187 alla concentrazione di 12µM per 15 minuti per indurre la produzione di microparticelle. Al termine dei 15 minuti i sovranatanti sono stati raccolti e centrifugati a 14000 rpm per 1 minuto per eliminare i monociti. A questo punto le A549 o BEAS-2B nei pozzetti sono state lavate con 200µl di PBS per una volta e trattate per 2 ore con 100µl di terreno contenente un agonista dei PPAR.-γ, o contenente un controllo a seconda dei campioni. Trascorse le 2 ore sono stati aggiunti a seconda dei campioni o 50µl di RPMI, o 50µl di stimolo e le cellule sono state incubate a 37°C O.N. Gli stimoli usati sono stati il sovranatante dei monociti, il sovranatante dei monociti stimolato con calcio-ionoforo A23187(MP).
3.2.3 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) per la
misurazione di MCP-1 e IL-8
I livelli di MCP-1 (Monocyte Chemotactic Protein-1) e IL-8 (Interleukin-8) nei surnatanti delle colture cellulari sono stati misurati mediante un saggio immunoenzimatico (ELISA). La superficie di poliestere di ogni pozzetto di una piastra da 96 è stata ricoperta con 100µL di anticorpo, specifico per la proteina di interesse, diluito in coating buffer e incubato a 4°C O.N. Il giorno dopo ogni pozzetto è stato bloccato con 300µL di Assay buffer per 1 ora a temperatura
ambiente. Passata un’ ora è stato eliminato l’Assay buffer, sono stati aggiunti 100µl di ogni campione diluito in Assay buffer ed è stata costruita la curva di calibrazione attraverso la quale è stato possibile valutare la concentrazione di MCP-1 e IL-8. Immediatamente dopo i campioni e lo standard sono stati aggiunti 50µL di anticorpo biotinilato specifico per la proteina in esame diluito in Assay Buffer. La piastra è stata incubata a temperatura ambiente per 2 ore in condizioni di lenta agitazione. Dopo tre lavaggi con 300µL di Wash Buffer sono stati aggiunti 100µL/pozzetto di Streptavidin-HRP diluito 1:400 in Assay Buffer e la piastra è stata incubata per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo ulteriori cinque lavaggi con Wash Buffer sono stati aggiunti 100µL di substrato cromogeno 3, 3’, 5, 5’ tetrametil benzidina (TMB) e la piastra è stata incubata per 5 minuti a temperatura ambiente, dopo è stata bloccata la reazione con 100µL di acido solforico 1,8 N (H2SO4) per pozzetto, ed è stata effettuata la lettura a
450/650 nm mediante spettrofotometro.
3.2.4 Estrazione di RNA
L’RNA è stato estratto dalle cellule A549 trattate con i sovranatanti dei monociti stimolati con A23187 (12µM) utilizzando il kit acquistato da Macherey-Nagel, USA. La procedura prevedeva il lavaggio delle cellule aderenti seguito dalla lisi delle stesse mediante un opportuno tampone di lisi allo scopo di liberare il materiale nucleare. Il lisato cellulare derivante è stato sottoposto a omogeneizzazione mediante il passaggio ripetuto dello stesso attraverso l’ago di una siringa di 20G. A questo punto l’omogenato è stato applicato su specifiche colonnine dotate di un filtro di silice-gel e centrifugato. Dopo la centrifugazione,
dell’assorbanza alla lunghezza d’onda di 260 nm, mentre la purezza è stata calcolata dal rapporto tra le assorbanze a 260 nm e 280nm. L’RNA è stato considerato puro per valori compresi tra 1,8 e 2. A questo punto l’RNA è stato conservato a -80°C fino al momento dell’uso.
3.2.5 RT-PCR
La retrotrascrizione dell’RNA a cDNA è stata eseguita utilizzando il kit commerciale “Iscript cDNA synthesis kit”.
In breve, una piccola quantità di RNA (10 ng) è stata aggiunta ad una miscela di reazione contenente deossinucleotidi (dNTP), l’enzima trascrittasi inversa con un buffer specifico ed Oligo-dT primers. La reazione di retrotrascrizione è stata fatta avvenire alla temperatura costante di 37 °C per 60 minuti in un ciclatore termico (MWG-Biotech). Il cDNA ottenuto è stato conservato a - 20 °C fino al momento dell’uso o in alternativa amplificato mediante PCR per evidenziare la presenza di mRNA specifico per le proteine di interesse. A tale scopo è stato utilizzato :
PCR Reaction components µl/sample
dNTP (10mM) Buffer (10x) 5’ Forward primer 3’ Reverse primer
Taq polymerase (5 units) ddH2O cDNA/Tube Totale 1 5 1 1 2,5 38 4 50 µl
Le condizione della PCR per l’amplificazione di IL-8 e MCP-1 da noi utilizzate sono state:
35 cicli di 94°C per 1 minuto, 55°C per 1 minuto, 72°C per 1 minuto seguiti da uno step a 72°C per 7 minuti e conservazione a 4°C. Per la PCR è stato usato il kit RedTaq DNA polymerase della SIGMA. I prodotti ottenuti dall’amplificazione sono stati sottoposti a elettroforesi su gel di agarosio all’1.5% contenente Bromuro d’etidio 1µl/100ml gel a 100V per la visualizzazione UV del DNA.
3.2.6 Real Time PCR
La PCR Real Time, denominata anche PCR quantitativa, è un metodo di amplificazione e quantificazione simultanee del DNA.
Il DNA è amplificato da reazioni a catena della DNA polimerasi. Dopo ogni turno di amplificazione, il DNA è quantificato. I metodi comuni di quantificazione includono l’uso delle colorazioni fluorescenti che intercalano con il DNA doppio filamento(ds) e gli oligonucelotidi modificati del DNA (denominati sonde) che sono fluorescenti una volta ibridati con il DNA. La sonda da noi utilizzata è stata SYBR Green.
3.2.7 Estrazione nucleare
I complessi DNA-proteina sono stati estratti dalle cellule A549 trattate con i sovranatanti dei monociti stimolati con A23187 (12µM) utilizzando il kit acquistato da Vinci-Biochem, Firenze. La procedura prevedeva il lavaggio delle cellule aderenti con un buffer contenete un inibitore delle fosfatasi, in seguito le cellule venivano lisate mediante due buffer: il primo necessario per rompere le membrane cellulari, mentre il secondo per rompere le membrane nucleari.
basa sul principio che i complessi DNA-proteina, in un gel di poliacrilammide, migrano più lentamente del DNA non legato producendo uno “shift” nella migrazione delle bande di DNA marcato.
3.3 Presentazione dei dati ed Analisi Statistica
I risultati sono stati presentati come media ± SEM di 5 esperimenti indipendenti. L’analisi statistica per le differenze tra le medie è stata condotta mediante il metodo dell’analisi della varianza (ANOVA). Valori di p inferiori a 0,05 sonno stati considerati statisticamente significativi.
