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CAPITOLO 8
ALLEGATO 1
>Calreticulin
tttcgatctc acaacagtgg ccatggctac tcaacgaagg gcaaacccta gctctctcca 61 tctaattact gtattctctc tgctcgtcgc tgtcgtctcc gctgaggtct tcttcgagga 121 gagtttcaac gatggttggg aaagcaggtg ggtgaaatct gaatggaaga aagatgaaaa 181 catggctgga gagtggaatc acacatctgg caagtggaat ggagacgcaa atgacaaagg 241 tatccaaacc agtgaagact acaggttcta tgccatttca gctgagtttc ctgaattcag 301 caacaaggga aaaaacttag tgttccagtt ctctgtgaag catgagcaga agcttgactg 361 tggtggtggg tacatgaagt tgcttagtgg ggacgttgac caaaagaaat tcggtggtga 421 cactccctac agcatcatgt ttggcccaga catctgtggc tacagcacca agaaggttca 481 tgctattctc acttataatg acacaaacca cttgatcaag aaggaagtac cttgtgagac 541 tgatcaactg acccatgtct acactttcat cctccgtcct gatgctacat acagcattct 601 cattgataat gtggagaaac agtctggtag cttgtactct gactgggacc ttctcccacc 661 aaagacaatc aaggatccaa gtgccaagaa gcctgaagat tgggatgaga aggaattcat 721 tgatgatcct gaggataaga agccagaggg ctatgatgac attccagaag agataactga 781 tcctgatgcc aagaagccag aggactggga tgatgaagaa gatggtgaat ggacagcccc 841 aaccattccc aaccccgagt acaagggccc atggaagcca aagaaaatta agaaccccaa 901 ctacaagggg aagtggaagg ctcctttgat tgacaaccca gacttcaagg atgacccaga 961 tctctatgtt ttcccaaagc tgaagtatgt gggagttgaa ctgtggcaag tgaaatctgg 1021 aaccttgttt gacaatattg tcatatgcga cgatccagag tatgccaagg caattgctga 1081 agaaacatgg ggaaagcaga aggatgcgga aaaggctgct tttgaggaag cagagaagaa 1141 gagagaggag gaggaatcaa aggctgctcc agctgactct gatgccgagg aagatgatga 1201 tgccgatgat gattctgatg atgctgatga caagtcggag tccaaggatg atgaagcaca 1261 tgatgaactg taagggccaa agcattttga tttaagctga caaagatgct agcaagatga 1321 gctacgtggc agttcccccc cccccccccc ccccccaaaa cccccttttt tccctttcta 1381 ttagtgaatt gtagcccctt tccattttta gcaaaaagac acagatttga gggtggctga 1441 ttgctttgat gtcattggga ctcggccaat aggaaacatg tttgattttg actagaatct 1501 actaaatagt tttgaaatta caccagcgtt aattttccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa // >Cal_N.plumbaginifolia MATQRRANPSSLHLITVFSLLVAVVSAEVFFEESFNDGWESRWVKSEWKKDENMAGEWNHTS GKWNGDANDKGIQTSEDYRFYAISAEFPEFSNKGKNLVFQFSVKHEQKLDCGGGYMKLLSGD VDQKKFGGDTPYSIMFGPDICGYSTKKVHAILTYNDTNHLIKKEVPCETDQLTHVYTFILRP DATYSILIDNVEKQSGSLYSDWDLLPPKTIKDPSAKKPEDWDEKEFIDDPEDKKPEGYDDIP EEITDPDAKKPEDWDDEEDGEWTAPTIPNPEYKGPWKPKKIKNPNYKGKWKAPLIDNPDFKD DPDLYVFPKLKYVGVELWQVKSGTLFDNIVICDDPEYAKAIAEETWGKQKDAEKAAFEEAEK KREEEESKAAPADSDAEEDDDADDDSDDADDKSESKDDEAHDEL
ALLEGATO 2
Sistema di clonaggio “Zero Blunt TOPO PCR cloning (INVITROGEN)
Per il clonaggio del costrutto CalHSP70, è stato scelto il sistema di clonaggio “Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit” che permette l’inserzione di un frammento ad estremità piatte prodotto da PCR con una polimerasi di tipo proofreading che non lascia residui T in fondo ai frammenti amplificati. Dato che non c’è un’estremità sporgente “appiccicosa” sul frammento, invece di usare una ligasi per legare il frammento nel polilinker del vettore, usiamo l’enzima Topoisimerasi I dal virus Vaccinia. Il topo isomerasi agisce in maniera diversa rispetto all’enzima Ligasi. La topoisomerasi I lega il vettore in siti specifici di riconoscimento e scinde il legame tra un fosforo e uno zucchero solo su una elica. Il vettore si apre e si linearizza quando un altro enzima topoisomerasi I lega l’atro elica nello stesso sito e scinde lo stesso legame sulla seconda elica (vedere figura XX pagina XX). La topoisomerasi attacca un gruppo funzionale =O presente sul fosfato poi rimane legato a quest’atomo di ossigeno (che fa parte del gruppo fosfato). Il punto di legame sull’enzima è su un residuo di tirosil in posizione 274. Il gruppo funzionale –OH sullo zucchero in 5’ dell’elica scissa può attaccare il legame fosfo-tirosil che lega il vettore all’enzima, realizzando la reazione inversa, liberando quindi l’enzima e ristabilendo la struttura originale dello scheletro fosfo-zucchero del DNA è portando alla richiusura del vettore. Ovviamente il gruppo funzionale –OH che attacca il legame fosfo-tirosil tra l’enzima e il vettore può anche essere quello presento sul frammento da inserire. È questo il fenomeno che permette l’inserzione del frammento da clonare nel vettore.
Il vettore plasmidico fornito con il kit contiene il polilinker in mezzo a un gene LacZα. Un gene letale in E. coli – il gene ccdB, è fuso all’estremità C-terminale del gene LacZα – in modo che il polipeptide letale viene prodotto se viene espresso anche il gene LacZα L’inserzione di un frammento da clonare nel vettore interrompe il gene LacZα, quindi non viene espresso la fusione genica letale LacZα-ccdB. Per questo motivo crescono soltanto quelle colonie batteriche che hanno acquisito un vettore nel quale è stato inserito il frammento e non è necessario un screenaggio bianco-blu come nei clonaggi tradizionali.
110 CalHSP5’int
TCTAGATCTCACAACAGTGGCCATGGCTACTCAACGAAGGGCAAACCCTAGCTCTCTC AtHSP5’Bam CATCTAATTACTGTATTCTCTCTGCTCGTCGCTGTCGTCTCCGCTATGGCGGGTAAAGGT GAAGGTCCAGCTATCGGTATCGATCTCGGTACAACCTACTCTTGCGTCGGTGTTTGGCA ACATGACCGCGTCGAAATCATCGCCAACGATCAAGGCAACCGTACCACTCCTTCCTAC GTTGCTTTCACTGACAGCGAGCGTCTCATCGGGGATGCTGCCAAGAATCAAGTCGCCA TGAACCCTACCAACACCGTCTTCGATGCTAAGCGTCTAATCGGAAGAAGATACAGTGA TCCCTCTGTTCAAGCGGATAAGAGTCACTGGCCTTTTAAGGTTGTTTCCGGTCCAGGTG AGAAGCCTATGATTGTGGTTAACCACAAGGGAGAGGAGAAACAGTTCTCTGCTGAGGA HSPter_int3’ AATCTCGTCGATGGTTCTTATTAAGATGCGGGAGATTGCAGAAGCTTTCCTTGGTTCTC CTG TTAAGAACGCTGTCGTTACAGTTCCTGCTTATTTCAACGACTCTCAGCGTCAAGCGACT AAGGACGCTGGAGTTATCTCTGGTCTCAACGTGATGCGTATCATCAATGAGCCAACTG CTGCTGCTATTGCTTACGGTCTTGACAAGAAGGCGTCGAGTGTTGGCGAGAAGAATGT TTTGATCTTTGATTTGGGAGGTGGTACTTTTGATGTGTCTTTGCTTACGATTGAGGAAG GTATCTTTGAAGTCAAGGCAACTGCTGGTGACACGCATCTTGGTGGTGAGGACTTCGA CAACAGGATGGTTAATCATTTTGTTCAGGAGTTTAAGAGGAAGAACAAGAAGGATATT ACTGGGAACCCGAGAGCTTTGAGGAGGCTTAGGACAGCTTGTGAGCGGGCGAAGAGA ACTCTTTCTTCGACTGCTCAGACGACTATAGAGATTGACTCTCTTTTTGAGGGTATTGAT TTCTACACTACCATCACTCGTGCTAGGTTCGAGGAGCTCAACATGGATTTGTTTAGGAA GTGTATGGAGCCAGTGGAGAAGTGTTTGAGGGATGCTAAGATGGACAAG HSP5’int AGCAGTGTTCATGATGTTGTTCTTGTTGGTGGCTCTACAAGGATTCCCAAAGTGCAGCA GCTTTTGCAAGACTTCTTCAATGGGAAAGAGCTCTGTAAAAGCATTAACCCGGACGAG GCTGTTGCTTACGGAGCAGCTGTGCAAGCTGCAATCTTGAGCGGTGAAGGGAATGAGA AGGTCCAGGACTTGTTACTTCTTGATGTCACTCCTCTGTCCTTGGGTTTGGAAACTGCC GGTGGTGTTATGACTGTTTTGATTCCGAGGAACACCACAATTCCGACCAAGAAAGAGC AGATATTCTCTACCTATTCAGACAACCAGCCCGGTGTACTGATCCAGGTCTACGAAGG AGAGAGGGCACGAACAAAGGACAACAACCTTTTGGGAAAGTTCGAGCTCAGTGGTAT ACCACCTGCTCCACGAGGTGTACCGCAGATTACTGTCTGTTTCGACATCGACGCAAATG GTATCCTGAATGTGTCGGCTG AGGACAAGACGACTGGTCAGAAGAACAAGATCACAATCACAAACGACAAGGGAAGGT TATCAAAGGAAGAGATCGAGAAGATGGTACAAGAGGCAGAGAAGTACAAGGCTGAGG ATGAAGAACACAAGAAGAAGGTGGATGCAAAGAACGCTCTCGAGAACTATGCATACA ACATGAGGAACACGATCAAGGACGAGAAGATCGCATCTAAGCTTGACGCAGCTGACA AGAAGAAGATTGAGGATGCAATCGACCAAGCTATTGAATGGTTAGATGGGAATCAACT GGCTGAGGCAGATGAGTTCGAGGATAAGATGAAGGAGCTCGAGTCTCTTTGCAACCCT ATTATTGCAAGAATGTACCAAGGAGCTGGGCCTGATATGGGTGGTGCAGGAGGAATGG ATGACGACACACCTGCTGGTGGTAGCGGCGGTGCTGGCCCAAAGATTGAAGAAGTTGA HSPBam3’ TTAAGCCTTTTGGCGGGATCC
ALLEGATO 4
Analisi sequenze Cal HSP70 1-6-06 Colonia #1bis
Appaiamento perfetto con l’atteso nel SP calmodulina e nell’ORF HSP70. è deleto il sito BAMH1 in 3’. Non ci sono problemi per il clonaggio in quanto si può utilizzare il sito Bam del pTopo.
Direzione di clonaggio: M13F 5’ 3’ M13R sequenza estremità 5’ ptopo_Cal_HSP70#1 TCTAGATCTCACAACAGTGGCCATGGCTACTCAACGAAGGGCAAACCCTAGCTCTCTCCA 60 CAL_HSP70_ipotizzata TCTAGATCTCACAACAGTGGCCATGGCTACTCAACGAAGGGCAAACCCTAGCTCTCTCCA 60 ************************************************************ ptopo_Cal_HSP70#1 TCTAATTACTGTATTCTCTCTGCTCGTCGCTGTCGTCTCCGCTATGGCGGGTAAAGGTGA 120 CAL_HSP70_ipotizzata TCTAATTACTGTATTCTCTCTGCTCGTCGCTGTCGTCTCCGCTATGGCGGGTAAAGGTGA 120 ************************************************************ ptopo_Cal_HSP70#1 AGGTCCAGCTATCGGTATCGATCTCGGTACAACCTACTCTTGCGTCGGTGTTTGGCAACA 180 CAL_HSP70_ipotizzata AGGTCCAGCTATCGGTATCGATCTCGGTACAACCTACTCTTGCGTCGGTGTTTGGCAACA 180 ************************************************************ sequenza estremità 3’ ptopo_Cal_HSP70#1 TGCAGGAGGAATGGATGACGACACACCTGCTGGTGGTAGCGGCGGTGCTGGCCCAAAGAT 2040 CAL_HSP70_ipotizzata TGCAGGAGGAATGGATGACGACACACCTGCTGGTGGTAGCGGCGGTGCTGGCCCAAAGAT 2040 ************************************************************ ptopo_Cal_HSP70#1 TGAAGAAGTTGATTAAGCCTTTTGGAAGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTA 2100 CAL_HSP70_ipotizzata TGAAGAAGTTGATTAAGCCTTTTGGC--- 2066 ************************* ptopo_Cal_HSP70#1 GTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTT 2126 CAL_HSP70_ipotizzata Cal-HSP70
