FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
KAMILĖ BIELIAUSKAITĖ
POLIMERINIŲ PLĖVELIŲ SU PELARGONIUM
SIDOIDES DC. SAUSUOJU ŠAKNŲ EKSTRAKTU
TECHNOLOGIJA IR KOKYBINĖ – KIEKINĖ ANALIZĖ
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
prof. dr. Nijolė Savickienė
Konsultantas
prof. habil. dr. Arūnas Savickas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. Ramunė Morkūnienė
Data
POLIMERINIŲ PLĖVELIŲ SU PELARGONIUM SIDOIDES DC.
SAUSUOJU ŠAKNŲ EKSTRAKTU TECHNOLOGIJA IR
KOKYBINĖ – KIEKINĖ ANALIZĖ
Magistro baigiamasis darbas
Konsultantas Darbo vadovė
prof. habil. dr. Arūnas Savickas prof. dr. Nijolė Savickienė
Data Data
Recenzentas Darbą atliko
... Magistrantė
... Kamilė Bieliauskaitė
Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 7
SANTRUMPOS ... 10
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 11
LITERATŪROS APŢVALGA ... 12
1.1. Pelargonium sidoides DC. sausojo šaknų ekstrakto cheminė sudėtis ... 12
1.1.1. Proantocianidinų biologinis aktyvumas ... 12
1.1.2. Proantocianidinų kokybinės sudėties tyrimo metodai ... 13
1.1.3. Proantocianidinų kiekinės sudėties tyrimo metodai ... 14
1.2. Pelargonium sidoides DC. sausojo šaknų ekstrakto biologinis poveikis ir pritaikymo medicinoje galimybės ... 14
1.2.1. Priešmikrobinis Pelargonium sidoides DC. sausojo šaknų ekstrakto poveikis... 16
1.3. Vaistų ir maisto papildų su pelargonijų šaknų sausuoju ekstraktu technologijos formos ... 17
1.4. Uţdegiminės burnos ligos ... 18
1.4.1. Priemonės ir būdai periodontito gydymui ... 19
1.4.2. Polimerinės plėvelės su veikliosiomis medţiagomis ir jų vartojimo ypatumai periodontito profilaktikai ir gydymui ... 21
1.4.2. Polimerinių plėvelių, skirtų periodontito gydymui, pagalbinės medţiagos ... 22
1.5. Polimerinių plėvelių technologinių savybių nustatymas ... 23
2. TYRIMO METODIKA ... 26
2.1. Tyrimo medţiagos ... 26
2.1.1. Reagentai ... 26
2.1.2. Įranga ... 26
2.2. Tyrimo metodai ... 27
2.2.1. Proantocianidinų kiekio nustatymas ... 27
2.2.1.1. Proantocianidinų kiekio spektrofotometrinis nustatymas sausajame Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakte ... 28
2.2.1.2. Proantocianidinų išskyrimas iš Pelargonium sidoides DC. sausojo šaknų ekstrakto ... 30
2.2.1.3. Proantocianidinų kiekio nustatymas liofilizuotoje proantocianidinų frakcijoje ... 30
2.2.3. Polimerinių plėvelių su sausuoju Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstraktu gamyba ... 31
2.2.4. Polimerinių plėvelių su sausuoju Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstraktu technologinių savybių nustatymas ... 31
2.2.4.1. Polimerinių plėvelių mikroskopinių savybių ir storio įvertinimas ... 32
2.2.4.2. Polimerinių plėvelių paviršiaus pH nustatymas ... 32
2.2.4.3. Proantocianidinų atsipalaidavimo iš polimerinių plėvelių tyrimas ... 32
2.2.4.4. Polimerinių plėvelių suirimo laiko nustatymas ... 33
2.2.4.5. Polimerinių plėvelių plyšimo jėgos nustatymas ... 33
2.2.5. Statistinis duomenų vertinimas ... 34
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 34
3.1. Proantocianidinų kiekio nustatymas sausajame Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakte ir liofilizuotoje proantocianidinų frakcijoje ... 34
3.2. Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakto priešmikrobinio aktyvumo nustatymas ... 34
3.3. Polimerinių plėvelių su sausuoju Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstraktu gamyba ir technologinių savybių nustatymas ... 36
3.3.1. Polimerinių plėvelių mikroskopinių savybių įvertinimas ... 36
3.3.2. Polimerinių plėvelių storio nustatymas ... 37
3.3.3. Polimerinių plėvelių paviršiaus pH nustatymas ... 37
3.3.4. Proantocianidinų atsipalaidavimo iš polimerinių plėvelių tyrimas ... 38
3.3.5. Polimerinių plėvelių suirimo laiko nustatymas ... 39
3.3.6. Polimerinių plėvelių plyšimo jėgos nustatymas ... 39
4. IŠVADOS ... 41
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS TOLIMESNIEMS TYRIMAMS ... 42
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 43
SANTRAUKA
Kamilės Bieliauskaitės magistro baigiamasis darbas. Mokslinė vadovė – prof. dr. Nijolė Savickienė1
. Konsultantas: prof. habil. dr. Arūnas Savickas2.
1
Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra, Kaunas.
2Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų technologijos ir socialinės
farmacijos katedra, Kaunas.
Darbo tikslas: pagaminti polimerines savaime burnos gleivinėje suyrančias plėveles su sausuoju
pelargonijų šaknų ekstraktu ir įvertinti jų technologines savybes.
Darbo uţdaviniai: 1. Nustatyti proantocianidinų kiekį sausajame Pelargonium sidoides DC.
šaknų ekstrakte. 2. Išskirti proantocianidinų frakciją iš sausojo Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakto ir, atlikus liofilizaciją, nustatyti proantocianidinų kiekį frakcijoje. 3. Atlikti priešmikrobinį sausojo
Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakto tyrimą. 4. Pagaminti polimerines savaime suyrančias plėveles
su sausuoju Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstraktu. 5. Įvertinti polimerinių plėvelių su sausuoju
Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstraktu technologines savybes.
Darbo metodai: 1. Proantocianidinų kiekiai nustatyti spektrofotometrijos su DMAC reagentu
metodu. 2. Priešmikrobinis sausojo Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakto tyrimas atliktas diskų difuzijos metodu Petri lėkštelėse su 6 mm skersmens vatmano diskeliais. 3. Naudojant chitozano pagrindą pagamintos polimerinės plėvelės su Pelargonium sidoides DC. sausuoju šaknų ekstraktu. 4. Polimerinių plėvelių su Pelargonium sidoides DC. sausuoju šaknų ekstraktu technologinės savybės įvertintos, naudojant mikroskopinių savybių, plėvelės storio, paviršiaus pH, suirimo laiko įvertinimo, vaistinės medţiagos atsipalaidavimo bei plyšimo jėgos nustatymo metodus.
Tyrimo rezultatai: 1. Sausajame Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakte esančių
proantocianidinų kiekis yra 61,11 ± 4,27 (mg/g), o liofilizuotoje proantocianidinų frakcijoje – 30,15 ± 1,40 (mg/g). 2. 20 proc. pelargonijų šaknų ekstrakto vandeninis tirpalas pasiţymėjo stipriausiu priešmikrobiniu poveikiu, veikiant S. aureus bakterijų kultūrą. Silpniausias poveikis pasireiškė, inhibuojant E. faecalis bakterijų kultūrą. Nustatyta, kad Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstraktas nepasiţymi priešmikrobiniu ir priešgrybeliniu aktyvumu, veikiant E. coli ir C. albicans kultūras. 3. Pagamintos polimerinės plėvelės ir įvertintos jų technologinės savybės: • Polimerinių plėvelių struktūra yra pakankamai homogeniška, vis dėlto, vietomis, matomos neištirpusio arba plėvelės dţiovinimo metu iškritusio į nuosėdas sausojo Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakto dalelės. • Polimerinių plėvelių storis varijuoja nuo 101,80 ± 2,68 (μm) iki 118,80 ± 2,17 (μm). Vidutinis polimerinės plėvelės storis yra
109,13 ± 2,17 (μm). • Polimerinių plėvelių paviršiaus pH varijuoja tarp 6,17 ± 0,05 ir 6,63 ± 0,05. • Proantocianidinų atsipalaidavimas iš polimerinių plėvelių yra sąlyginai nedidelis – šviesoje – 32,13 ± 8,58 (proc.), tamsoje – 30,94 ± 9,61 (proc.). Nustatyta, kad šviesa įtakos proantocianidinų atsipalaidavimui neturi. • Polimerinė plėvelė su Pelargonium sidoides DC. sausuoju šaknų ekstraktu suyra per 7 paras. • Polimerinių plėvelių plyšimo jėga yra 7,28 ± 1,89 (N), o atstumas, nueitas iki plėvelės suplyšimo taško – 8,00 mm.
Išvados: 1. Liofilizuotoje proantocianidinų frakcijoje, išskirtoje iš pelargonijų šaknų sausojo
ekstrakto, nustatytas maţesnis proantocianidinų kiekis nei sausajame Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakte. Toks rezultatas galėjo būti gautas dėl kitų fenolinių junginių, esančių sausajame Pelargonium
sidoides DC. šaknų ekstrakte, kiekinio nustatymo, šiems junginiams sureagavus su DMAC reagentu. 2. Pelargonium sidoides DC. sausasis šaknų ekstraktas pasiţymi priešmikrobiniu aktyvumu prieš S. aureus, E. faecalis ir P.aeruginosa bakterijų kultūras, tačiau nerodo aktyvumo prieš E. coli bakterijų ir C. albicans
grybelio kultūras. 3. Pagamintų polimerinių plėvelių su Pelargonium sidoides DC. sausuoju šaknų ekstraktu paviršiaus pH atitinka burnos gleivinės pH, todėl neturėtų sukelti burnos gleivinės paţeidimų. • Polimerinių plėvelių su Pelargonium sidoides DC. sausuoju šaknų ekstraktu mechaninės savybės: storis, suirimo laikas ir plyšimo jėga tenkina šių polimerinių plėvelių gamybos reikalavimus. • Mikroskopiškai įvertinus polimerines plėveles, matoma neištirpusio arba plėvelių dţiuvimo metu iškritusio į nuosėdas sausojo Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakto. • Proantocianidinai iš polimerinių plėvelių su
Pelargonium sidoides DC. sausuoju šaknų ekstraktu atsipalaiduoja tik dalinai – iki 32,13 ± 8,58 proc. •
Šviesa neturėjo įtakos proantocianidinų atsipalaidavimui. 4. Pagamintų polimerinių plėvelių su sausuoju
Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstraktu kokybė yra patenkinama ir galėtų būti toliau vystoma, siekiant
visiško veikliosios medţiagos ištirpimo ir pasiskirstymo polimerinėse plėvelėse bei geresnio proantocianidinų atsipalaidavimo iš polimerinių plėvelių.
Raktiniai ţodţiai: Pelargonium sidoides DC., proantocianidinai, DMAC, spektrofotometrija,
SUMMARY
The Master thesis of Kamilė Bieliauskaitė: Technology of polymeric films with Pelargonium
sidoides DC. dry root extract and qualitative – quantitative analysis. Supervisor of the research paper:
prof. dr. Nijolė Savickienė1
, Professor, Ph.D. Consultant: Arūnas Savickas, Professor, Ph.D2.
1
Department of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences, Kaunas, Lithuania.
2
Department of Drug Technology and Social Pharmacy, Faculty of pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences, Kaunas, Lithuania.
Aim of the study: To prepare the biodegradable in the oral cavity polymeric films that contain
Pelargonium sidoides DC. dry root extract and evaluate their technological properties.
Tasks of the study: 1. To determine the amount of proanhocyanidins in Pelargonium sidoides
DC. dry root extract. 2. To separate the fraction of proanthocyanidins from Pelargonium sidoides DC. dry root extract and, after the lyophilization process, to determine the amount of proanthocyanidins in this fraction. 3. To perform the antimicrobial tests of Pelargonium sidoides DC. dry root extract. 4. To prepare the biodegradable polymeric films containing Pelargonium sidoides DC. dry root extract. 5. To evaluate the technological properties of polymeric films containing Pelargonium sidoides DC. dry root extract.
Methods: 1. The quantities of proanthocyanidins determined by the spectrophotometric method
with DMAC reagent. 2. The antimicrobial tests of Pelargonium sidoides DC. dry root extract were performed by the disc diffusion method in Petri dishes with 6 mm diameter wattman disks. 3. Using chitosan as a base, polymeric films containing Pelargonium sidoides DC. dry root extract were prepared.
4. The technological properties of polymeric films containing Pelargonium sidoides DC. dry root extract
were defined by analysing microscopic structure of the polymeric film, the film thickness, surface pH, disintegration time, burst strength and the release of the active substance.
Results: 1. The amount of pronthocyanidins in Pelargonium sidoides DC. dry root extract is
61.11 ± 4.27 (mg/g), while in the lyophilized fraction it is – 30.15 ± 1.40 (mg/g). 2. The aqueous solution (concentration – 20 percent) of Pelargonium sidoides DC. dry root extract has the strongest effect on S.
aureus bacterial culture. The weakest effect of this extract is on E. faecalis bacterial culture. It was found
that Pelargonium sidoides DC. dry root extract does not have any antimicrobial and antifungal effect on E.
coli and C. albicans cultures. 3. Polymeric films were prepared and technological properties were
determined: • The structure of polymeric films is sufficiently homogeneous, however, at some places, there are some visibe particles of Pelargonium sidoides DC. dry root extract which did not dissolved or
settled as sediment during film drying. • The thickness of polymeric films varies from 101.80 ± 2.68 (μm) to 118.80 ± 2.17 (μm). The average thickness of polymeric films is 109.13 ± 2.17 (μm). • The surface pH of polymeric films varies from 6.17 ± 0.05 to 6.63 ± 0.05. • The release of proanthocyanidins from the polymeric films is relatively small – in the light – 32.13 ± 8.58 (percent), in the dark – 30.94 ± 9.61 (percent). It was found that the light has no effect on the releasing of proantocyanidins. • The polymeric film containing Pelargonium sidoides DC. dry root extract disintegrates in 7 days. • The burst strength of polymeric films is 7.28 ± 1.89 (N) and the distance up to the point of burst of the film is 8.00 mm.
Conclusions: 1. The amount of proanthocyanidins determined in the lyophilized fraction of
proanthocyanidins, isolated from the Pelargonium sidoides DC. dry root extract, is lower than in
Pelargonium sidoides DC. dry root extract. This result could have been obtained because of other phenolic
compounds (which exist in Pelargonium sidoides DC. dry root extract) reaction with DMAC reagent. 2.
Pelargonium sidoides DC. dry root extract shows an antimicrobial effect against S. aureus, E. faecalis and P. aeruginosa bacterial cultures but does not show any activity against E. coli bacterial and C. albicans
fungal culture. 3. • Surface pH of the prepared polymeric films containing Pelargonium sidoides DC. dry root extract corresponds to pH of the oral mucosa, therefore should not cause any injuring. • Mechanical properties of the prepared polymeric films containing Pelargonium sidoides DC. dry root extract: thickness, disintegration time and burst strength meets the requirements of these polymeric films preparation. • During the microscopic evaluation, at some places there are some visibe particles of
Pelargonium sidoides DC. dry root extract which did not dissolved or settled as sediment during film
drying. • The release of proanthocyanidins from the polymeric films is relatively small – up to 32.13 ± 8.58 (percent). • The light has no effect on the releasing of proantocianidins. 4. Quality of the prepared polymeric films containing Pelargonium sidoides DC. dry root extract is good enough and could be improved further in order to dissolve and distribute the active substance completely throughout the polymeric films and to achieve better release of the active substance from the polymeric films.
Key words: Pelargonium sidoides DC., proanthocyanidins, DMAC, spectrophotometry,
PADĖKA
Nuoširdţiai dėkoju mokslinio darbo vadovei prof. Nijolei Savickienei uţ trijų metų bendradarbiavimą ir visokeriopą pagalbą, idėjų palaikymą bei ţinių puoselėjimą baigiamojo magistro darbo rengimo metu.
Dėkoju prof. habil. dr. Arūnui Savickui uţ konsultacijas ir patarimus, įgyvendinant kilusias idėjas bei dėst. Linai Raudonei uţ visokeriopą pagalbą, atliekant fitocheminius tyrimus.
Taip pat noriu padėkoti Kauno technologijos universiteto, Maisto mokslo ir technologijos katedros prof. Daivai Leskauskaitei bei lekt. dr. Viktorijai Eisinaitei uţ suteiktą galimybę atlikti polimerinių plėvelių plyšimo jėgos nustatymo tyrimą. Dėkoju doc. Ritai Plančiūnienei uţ pagalbą ir patarimus, atliekant priešmikrobinį tyrimą Veterinarijos fakulteto Mikrobiologijos ir virusologijos institute.
SANTRUMPOS
DMAC 4 – (dimetilamino)cinamaldehidas
LB terpė Luria – Bertani mitybinė terpė
MALDI-TOF-MS Matrix – assisted laser desorption ionization – time – of – flight–mass spectrometry
ĮVADAS
Tyrimo objektas – Pelargonium sidoides DC. sausasis šaknų ekstraktas, gautas iš Frutarom Industries Ltd., Šveicarijos, bei polimerinės plėvelės, pagamintos su šiuo ekstraktu. Pelargonium sidoides DC. – snaputinių šeimos augalas, kilęs iš Pietų Afrikos. Sausasis pelargonijų šaknų ekstraktas pasiţymi antiseptiniu, imuninę sistemą moduliuojančiu, priešmikrobiniu bei antioksidaciniu poveikiais. Šiame ekstrakte nustatyta purino darinių, kumarinų, peptidų, proantocianidinų ir kitų junginių. Viena svarbiausių junginių frakcijų, apsprendţianti šiuos poveikius – proantocianidinai [1].
Nors yra atliekami įvairūs moksliniai tyrimai, analizuojant ekstrakto sudėtį bei teigiamus poveikius sveikatai įvairių ligų metu, vis tik, vaistinių preparatų ar maisto papildų su pelargonijų šaknų sausuoju ekstraktu indikacija jau daugelį metų išlieka ta pati – kvėpavimo takų funkcijos palaikymas arba gydymas. Todėl vienas iš mūsų tyrimo uţdavinių buvo – nustatyti kiekinę proantocianidinų, esančių
Pelargonium sidoides DC. šaknų sausajame ekstrakte ir išskirtoje iš šio ekstrakto bei liofilizuotoje
proantocianidinų frakcijoje, sudėtį, bei atlikti priešmikrobinį ekstrakto tyrimą. Priešmikrobinis tyrimas atliktas su bakterijų ir grybelių kultūromis, aptinkamomis burnos gleivinėje bei galinčiomis sukelti uţdegimines burnos ligas. Šie tyrimai gali būti naudingi, siekiant praplėsti vaistinių preparatų bei maisto papildų su Pelargonium sidoides DC. sausuoju šaknų ekstraktu indikacijas.
Įvertinus proantocianidinų kiekinę sudėtį ekstrakte, atlikus priešmikrobinį tyrimą ir gavus teigiamus rezultatus, nuspręsta pagaminti polimerines, suyrančias burnos ertmėje, plėveles, kurios galėtų būti skiriamos uţdegiminių burnos ligų, pavyzdţiui, periodontito atvejais. Šiuo metu periodontitui gydyti yra skiriami antibiotikai arba antiseptikas chlorheksidinas – jie daţniau vartojami vietiškai. Jeigu liga nepasiduoda gydymui, tuomet skiriamas sisteminis gydymas antibiotikais. Periodontologijoje gali būti vartojamos polimerinės plėvelės, juostelės, geliai, pluoštai, mikro dalelės, nano dalelės bei liposomos su veikliąja medţiaga – chlorheksidinu ar antibiotikais. Deja, buvo pastebėta nepageidaujamų šio antiseptiko poveikių sveikatai: skonio pojūčių ir dantų spalvos pasikeitimų, burnos arba (ir) gerklės skausmo, lieţuvio
sudirginimo, švokštimo ir kvėpavimo sutrikimo atvejų, o vartojant antibiotikus, kartais nepavyksta išvengti nepageidaujamų reakcijų, taip pat, vystosi rezistentiškumas. Dėl šių prieţasčių buvo nuspręsta pagaminti polimerines,burnos ertmėje suyrančias, plėveles su veikliąja medţiaga – Pelargonium sidoides DC. šaknų sausuoju ekstraktu. Pagaminus polimerines plėveles, atliktas šių plėvelių kokybės nustatymas, visų pirma, technologinių savybių tyrimai.
Baigiamojo magistro darbo tyrimai atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedroje, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedroje, Veterinarijos fakulteto Mikrobiologijos ir virusologijos institute bei Kauno technologijos universiteto Maisto mokslo ir technologijos katedroje.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Tyrimo objektas: Sausasis Pelargonium Sidoides DC. šaknų ekstraktas, gautas iš Frutarom
Industries Ltd., Šveicarijos, bei polimerinės plėvelės, pagamintos su šiuo ekstraktu.
Temos aktualumas ir tyrimo problema: Iki šiol nėra sukurtos medicininės priemonės –
polimerinių plėvelių su sausuoju Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstraktu, pasiţyminčių antiseptiniu poveikiu, kurias būtų galima skirti uţdegiminių burnos ligų, pavyzdţiui, periodontito gydymui ar būklės lengvinimui. Vis dar trūksta mokslinės informacijos apie vietiškai vartojamas medicinines priemones, tokias kaip polimerinės plėvelės su pelargonijų šaknų sausuoju ekstraktu. Taip pat nėra atliktų polimerinių plėvelių su sausuoju pelargonijų šaknų ekstraktu medţiagos atsipalaidavimo testų ir technologinių kokybės rodiklių tyrimų.
Darbo tikslas: pagaminti polimerines savaime burnos gleivinėje suyrančias plėveles su sausuoju
pelargonijų šaknų ekstraktu ir įvertinti jų technologines savybes.
Darbo uţdaviniai:
1. Nustatyti proantocianidinų kiekį sausajame Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakte.
2. Išskirti proantocianidinų frakciją iš sausojo Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakto ir, atlikus
liofilizaciją, nustatyti proantocianidinų kiekį frakcijoje.
3. Atlikti priešmikrobinį sausojo Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakto tyrimą.
4. Pagaminti polimerines savaime suyrančias plėveles su sausuoju Pelargonium sidoides DC. šaknų
5. Įvertinti polimerinių plėvelių su sausuoju Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstraktu technologines
savybes.
LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Pelargonium sidoides DC. sausojo šaknų ekstrakto cheminė sudėtis
Sausajame Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakte nustatyti kondensuotų taninų dariniai – prodelfinidinai (polimeriniai flavan-3-oliai), kiti fenoliniai junginiai (fenolinės rūgštys, flavonoidai, procianidinai), fitosteroliai, kumarinai (skopoletinas, umkalinas, fraksetinas, artelinas, kumarino glikozidai, kumarino sulfatas), peptidai [2]. Taip pat ekstrakte randami flavonoidai – proantocianidinai, pasiţymintys teigiamu poveikiu sveikatai virusinių bei bakterinių ligų metu. Dėl šių savybių proantocianidinų tyrimams yra skiriamas ypatingas dėmesys [3, 4, 5].
1.1.1.
Proantocianidinų biologinis aktyvumas
Proantocianidinai – tai oligomeriniai flavonoidai. Dauguma jų yra katechino bei epikatechino ir jų galo rūgšties esteriai. Proantocianidinai – bespalvės medţiagos [6], pasiţyminčios priešmikrobiniu ir antioksidaciniu poveikiais [1, 7]. Įrodyta, kad proantocianidinai slopina maţo tankio lipoproteinų oksidaciją, sukeldami kraujagyslių atsipalaidavimą. Proantocianidinai pasiţymi priešuţdegiminiu poveikiu – slopina neuropatijos, retinopatijos ir nefropatijos vystymąsi. Moksliškai įrodytas šių biologiškai aktyvių junginių priešbakterinis poveikis šlapimo takų ir burnos gleivinėms [8]. Kinijoje atlikto eksperimento metu buvo siekiama nustatyti proantocianidinų, išskirtų iš vynuogių sėklų, priešuţdegiminį poveikį ir mechanizmą. Pelėms buvo sukeltas ausų patinimas ir kojų edema. Nustatyta, kad 10 mg/kg paros dozė pasiţymėjo priešuţdegiminiu poveikiu – slopino uţdegiminių citokinų susidarymą, maţino tinimą [9]. Italijoje atlikto tyrimo metu nustatytas skrudintų kakavos pupelių proantocianidinų antioksidacinis aktyvumas [10].
1.1.2. Proantocianidinų kokybinės sudėties tyrimo metodai
Kondensuotieji raugai yra identifikuojami kaip procianidinų bei prodelfinidinų mišinys. Šios raugų grupės tarpusavyje skiriasi B ţiedo hidroksilinimo pobūdţiu – procianidinai sudėtyje turi katecholio pagrindo B ţiedą, o prodelfinidinai – pirogalolio pagrindo B ţiedą. Proantocianidinai – sudėtingos kompleksinės struktūros junginiai. Šių junginių kokybinės analizės metodai išvystyti ribotai. Daţniausiai taikomi metodai, kurie atliekami po efektyviosios skysčių chromatografijos, išskirsčius medţiagas, ir yra skirti nustatyti proantocianidinus. Vienas kokybinės analizės metodų – UV – DAD spektrofotometrijos (ultravioletinio ir diodų matricos detektorių spektrofotometrijos) metodas, panaudojant ultravioletinį ir diodų matricos detektorius. Minėtas metodas – nesudėtingas, bet turi trūkumą, nes monomerų, oligomerų bei kai kurių jų skilimo produktų spektras daţniausiai neparodo statistiškai patikimo skirtumo. Netgi diastereomerai – (2R,3R) – epikatechinas ir (2R,3S) – katechinas, negali būti tinkamai atskirti [11].
Dar vienas daţnai taikomų proantocianidinų kokybinės sudėties nustatymo metodų (prieš tai atlikus efektyviosios skysčių chromatografijos išskirstymą) yra fluorescencija. Fluorescencinis detektorius pagerina proantocianidinų atrankumą ir sumaţina kitų absorbuojamų junginių siunčiamus signalus. Tačiau šis metodas turi ir neigiamą ypatumą – junginių nustatymo jautrumas yra apie tūkstantį kartų maţesnis negu nustatant UV detektoriumi [11].
Moksliniuose literatūros šaltiniuose aprašomas masių spektrometrijos metodas MALDI–TOF– MS (angl. Matrix–assisted laser desorption ionization – time–of–flight – mass spectrometry). Šis metodas ypač tinkamas polidispersiškų ir heterogeninių proantocianidinų nustatymui, nes gali būti tiksliai nustatoma didelė junginių masė [12].
Skysčių chromatografija – elektropurkštuvinės jonizacijos masių spektrometrija (angl. LC–ESI– MS) yra vienas moderniausių šiuolaikinės chromatografijos metodų ir gali aptikti nepaţeistus molekulinius jonus, kurių molekulinė masė yra didelė (> 100 000 Da) [12]. Naudojant šį metodą, proantocianidinai gali būti aptinkami ir identifikuojami sudėtinguose tiriamuosiuose pavyzdţiuose. Pavyzdţiui, Portugalijos mokslininkai šiuo metodu tirdami vyne esančius proantocianidinus, nustatė 41 skirtingą junginį, iš kurių 8 buvo proantocianidinų dimerai ir 13 proantocianidinų trimerų [13].
Tiek kokybinės sudėties, tiek proantocianidinų kiekio nustatymui gali būti taikomas ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodas su tandeminiu masių detektoriumi. Šiuo metodu galima identifikuoti du proantocianidinų junginius – procianidinus ir prodelfinidinus. Taip pat, galima įvertinti oligomerų ir polimerų polimerizacijos laipsnį [14].
1.1.3. Proantocianidinų kiekinės sudėties tyrimo metodai
Daţniausiai taikomi proantocianidinų kiekinės analizės metodai: UV spektrofotometrija arba efektyvioji skysčių chromatografija, naudojant DMAC (4–(dimetilamino)cinamaldehidas) reagentą bei efektyvioji skysčių chromatografija su tandeminiu masių detektoriumi [12, 14].
DMAC yra aromatinis aldehidas, kuris reaguoja su flavan–3–oliais ir c–proantocianidinais ir po reakcijos sudaro ţalią chromoforą, kurio didţiausia absorbcija yra esant 640 nm bangos ilgiui. Tiriamajam tirpalui sureagavus su DMAC reagentu ir susidarius chromoforui, absorbcija išmatuojama UV spektrofotometru. Taip pat gali būti taikomas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas, kuomet proantocianidinų kiekio nustatymui yra naudojama pokolonėlinė derivatizacija su DMAC reagentu. Šis reagentas nereaguoja su hidroksicinamo, hidroksibenzoino rūgštimis, flavonais, flavonoliais ir yra jautrus bei tikslus proantocianidinų kiekio nustatymui [11, 12].
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas su tandeminiu masių detektoriumi gali būti taikomas, siekiant nustatyti bendrą proantocianidinų kiekį tiriamajame mėginyje arba norint nustatyti bendrą procianidinų ir prodelfinidinų kiekį, įvertinant procianidinų ir prodelfinidinų santykį [14].
Tiek efektyvioji skysčių chromatografija, tiek UV spektrofotometrija turi tam tikrų privalumų bei trūkumų. Pavyzdţiui, efektyvioji skysčių chromatografija yra tikslesnis metodas nei UV spektrofotometrija, tačiau pastaroji yra pigesnis bei paprastesnis metodas (lengviau naudotis aparatūra), taip pat, pasiruošimas UV spektrofotometrijai atlikti gali būti paprastesnis nei efektyviajai skysčių chromatografijai. Be to, tyrimą atliekant UV spektrofotometrijos metodu, UV spektras yra uţfiksuojamas per labai trumpą laiką (rezultatas gaunamas greičiau nei tyrimą atliekant efektyviosios skysčių chromatografijos metodu) [11, 12, 14].
1.2. Pelargonium sidoides DC. sausojo šaknų ekstrakto biologinis poveikis ir
pritaikymo medicinoje galimybės
Pelargonijų šaknų sausasis ekstraktas pasiţymi antioksidaciniu, priešmikrobiniu, priešvirusiniu, imuninę sistemą moduliuojančiu, priešvėţiniu ir priešuţdegiminiu poveikiais [1, 7, 8, 15, 16]. Literatūros duomenimis, šiuos poveikius apsprendţia fenoliniai junginiai, o ypač – polifenolinių junginių klasė – proantocianidinai [1].
Vykdyti tyrimai su Pelargonium sidoides DC. sausuoju šaknų ekstraktu in vitro ir in vivo įrodė nuo dozės priklausantį aktyvumą prieš gripo – pandeminio viruso H1N1, sezoninio viruso H3N2 ir laboratorinio viruso H1N1 A/Puerto Rikas/8/34 padermes, esant netoksiškoms preparatų dozėms [17].
Nors moksliniuose šaltiniuose galima rasti duomenų, kad pelargonijų šaknų ekstraktas pasiţymi priešvėţiniu poveikiu, atliktų tyrimų, atskleidţiančių priešvėţinį ekstrakto poveikį, nėra daug. Viename iš mokslinių eksperimentų buvo tiriamas šio ekstrakto poveikis T–leukemijos Jurkat ląstelėms (šios ląstelės yra imortalizuota ţmogaus T limfocitų ląstelių linija, naudojama T ląstelių ūminės leukemijos tyrimui). Tyrimo metu buvo nustatyta, kad Pelargonium sidoides DC. sausasis šaknų ekstraktas sumaţina vėţio ląstelių, ypatingai, leukemijos tipo ląstelių augimą ir gyvybingumą. Manoma, kad šį poveikį apsprendţia polifenoliniai junginiai (jų tarpe ir proantocianidinai), identifikuoti tyrimo metu ultra efektyviosios skysčių chromatografijos su tandeminiu masių detektoriumi metodu [18].
Literatūros šaltiniuose galima rasti mokslinių tyrimų, kuriuose daromos išvados, kad
Pelargonium sidoides DC. sausasis šaknų ekstraktas pasiţymi priešmikrobiniu ir priešgrybeliniu
poveikiais, tačiau pagrindinė preparatų su šiuo ekstraktu indikacija Lietuvoje ir Europoje išlieka virusinės kilmės kvėpavimo takų ligos [2]. Pelargonium sidoides DC. sausasis šaknų ekstraktas moduliuouja imuninę sistemą netiesiogiai, tokiu būdu sukeldamas imuninės sistemos atsaką. Imuninę sistemą moduliuojančių procesų metu yra aktyvinami makrofagai, kurie išskiria citokinus, suţadinančius imuninių ląstelių veiklą. Tokiu būdu patogenas pašalinamas fagocitozės būdu arba išskiriant reaktyvųjį deguonį ir azoto oksidą [1, 19].
Kitų tyrimų metu nustatyta, kad imuninę sistemą moduliuojantis ekstrakto poveikis pasireiškia reguliuojant nespecifines imuninės sistemos reakcijas [1]. Siekiant įvertinti Pelargonium sidoides DC. šaknų sausojo ekstrakto poveikį aktyvių sportininkų imuniniam atsakui, buvo tirta imunoglobulino A gamyba sportininkų seilėse ir citokinuose tiek lokaliai, tiek sistemiškai. Dalis sportininkų tris kartus per parą vartojo po 30 lašų tirpalo, kurio 100 ml buvo 80 g pelargonijų šaknų sausojo ekstrakto, okita dalis – placebą. Rezultatai parodė, kad Pelargonium sidoides DC. šaknų sausasis ekstraktas moduliuoja sekrecinio imunoglobulino A gamybą seilėse, interleukino–15 bei interleukino–6 gamybą serume ir interleukino–15 gamybą nosies gleivinėje. Tyrimo rezultatų išvada – pelargonijų šaknų sausasis ekstraktas moduliuoja imuninį atsaką, susijusį su viršutinių kvėpavimo takų gleivine [20, 21].
Medicinoje jau kelis dešimtmečius yra vartojami vaistiniai preparatai su pelargonijų šaknų sausuoju ekstraktu, sergant viršutinių kvėpavimo takų ligomis – bronchitu, tonzilofaringitu bei sinusitu. Vaistiniu preparatu Umckaloabo (kompozicijoje – dvi pelargonijų rūšys – Pelargonium sidoides DC. ir
Vaistų kontrolės Tarnyba patvirtino Umckaloabo vaisto statusą. Mokslinėje literatūroje galima rasti atliktų tyrimų, įrodančių priešmikrobinį ir imunomoduliacinį šio vaisto poveikius [2].
1.2.1.
Priešmikrobinis Pelargonium sidoides DC. sausojo šaknų ekstrakto poveikis
Europos Vaistų Agentūros duomenimis metanolinis ir acetoninis pelargonijų šaknų ekstraktas pasiţymi priešmikrobiniu aktyvumu šioms bakterijų padermėms: Bacillus cereus, Staphylococcus
epidermidis, Staphylococcus aureus, Micrococcus kristinae, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Salmonella pooni, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae ir penkioms
grybelių rūšims – Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Mucor hiemalis,
Penicillium notatum [2].
Nuo devynioliktojo amţiaus liaudies medicinoje pelargonijų šaknų nuoviras ir milteliai buvo vartojami, gydant tuberkuliozę. Nuo 1920 metų prancūzų–šveicarų kilmės gydytojas A. Sechehaye pacientus (virš 800 pacientų), sergančius tuberkulioze, gydė pelargonijų šaknų preparatais. Medikas analizavo pelargonijų šaknų preparatus laboratorijoje ir įrodė priešmikrobinį jų poveikį [2]. Vis dėlto, remiantis mokslinių tyrimų, atliktų nuo 2005 metų duomenimis, nustatyta, kad stipresniu aktyvumu prieš
Mycobacterium tuberculosis sukėlėją pasiţymi Pelargonium reniforme Curt., o Pelargonium sidoides DC.
pasiţymi labai silpnu poveikiu šiai bakterijų padermei. Šiek tiek stipresnį poveikį Mycobacterium
tuberculosis padermei išreiškia butanolinis Pelargonium sidoides DC. ekstraktas. Tyrimų metu buvo
pastebėta, kad atskirų bakterijų ar grybelio padermių inhibicija priklauso ne tik nuo Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakto, bet ir nuo ekstrahento, naudojamo ekstrakto gamyboje [22, 23].
Vokietijos mokslininkai tyrė priešbakterinį Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakto poveikį penkioms gram neigiamoms padermėms – Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiella pneumonia ir Proteus mirabilis bei penkioms gram teigiamoms bakterijų
padermėms – Staphylococcus aureus, beta-hemolizinis Streptococcus ir Streptococcus pneumoniae. Tyrimas buvo atliekamas agaro praskiedimo metodu, nustatyta minimali inhibuojanti pelargonijų šaknų ekstrakto koncentracija. Buvo paruošti trys atskiri skystieji ekstraktai su skirtingais tirpikliais: vandeniu, butanoliu ir etilacetatu. Pelargonijų šaknų ekstraktas rodė aktyvumą prieš visas tirtas bakterijų kultūras [24].
Kitų tyrimų metu pagaminti du – acetoninis ir etanolinis ekstraktai iš sausojo Pelargonium
sidoides DC. šaknų ekstraktas pasiţymi aktyvumu prieš Aspergillus niger ir Fusarium oxysporum, o
grybelio kultūros Rhizopus stolonifer augimas yra tik nuslopinamas [22].
Remiantis mokslinės literatūros duomenimis, Pelargonium sidoides DC. sausasis šaknų ekstraktas pasiţymi aktyvumu ne tik prieš daugelį bakterijų kultūrų, bet ir prieš tam tikras grybelio rūšis. Vis tik, nustatyta, kad poveikis priklauso ne tik nuo paties ekstrakto, bet ir nuo tirpiklio, kuriame ištirpinamas Pelargonium sidoides DC. sausasis šaknų ekstraktas.
1.3. Vaistų ir maisto papildų su pelargonijų šaknų sausuoju ekstraktu technologijos
formos
Tiek Lietuvoje, tiek ir kitose Europos šalyse yra registruotų vaistinių preparatų su Pelargonium
sidoides DC. sausuoju šaknų ekstraktu. Farmacijos rinkoje yra ir notifikuotų maisto papildų su šio augalo
ekstraktu [2, 20, 21, 25]. Šiuo metu Lietuvoje yra registruotos tik dvi vaistinio preparato su pelargonijų šaknų ekstraktu formos – Umckalor geriamieji lašai (tirpalas) ir Umckalor 20 mg plėvele dengtos tabletės, jų indikacija – ūminio bronchito simptominis gydymas, atsikosėjimo lengvinimas [26, 27]. Lietuvoje yra notifikuotas tik vienas maisto papildas su šiuo ekstraktu – Herbitassin geriamasis skystis su pelargonijų šaknų ekstraktu 120 ml, kuris palaiko kvėpavimo takų funkciją [28].
Europoje registruotų vaistinių preparatų su pelargonijų šaknų ekstraktu technologijos formos įvairios: tabletės, plėvele dengtos tabletės, geriamasis tirpalas, sirupas, geriamieji lašai. Austrijoje, Vokietijoje, Švedijoje ir Ispanijoje yra registruotos dvi vaisto formos su pelargonijų šaknų ekstraktu – geriamasis tirpalas: 10 g tirpalo yra 8 g ekstrakto ir plėvele dengtos tabletės: vienoje plėvele dengtoje tabletėje – 20 mg ekstrakto. Vaisto indikacija Austrijoje, Švedijoje ir Ispanijoje – peršalimui gydyti, Vokietijoje – ūmaus bronchito gydymui. Belgijoje registruotos trys vaisto formos – geriamasis tirpalas: 10 g tirpalo yra 8 g ekstrakto, tabletės: tabletėje – 20 mg ekstrakto ir sirupas: 100 g sirupo yra 0,25 g ekstrakto. Indikacija – peršalimo gydymas. Čekijoje registruota vaisto forma – geriamieji lašai: 1 g lašų – 800 mg ekstrakto. Vengrijoje ir Slovakijoje registruota vaisto forma – geriamasis tirpalas: 10 g geriamojo tirpalo yra 8 g ekstrakto, indikacija – ūmios viršutinių kėpavimo takų infekcijos, simptominis peršalimo gydymas. Italijoje registruotos trys tradicinio vaisto formos – geriamieji lašai, tirpalas ir 20 mg plėvele dengtos tabletės, indikacija – peršalimo gydymas, pagrįstas ilgalaikiu vartojimu [2].
Europoje notifikuotų maisto papildų formos taip pat įvairios: geriamieji lašai, milteliai, sirupas, karštas gėrimas, kramtomosios pastilės. Didţioji dalis šių maisto papildų yra notifikuoti Didţiojoje Britanijoje [29 – 31].
1.4. Uţdegiminės burnos ligos
Pagrindinės uţdegiminės burnos ligos yra stomatitas, gingivitas bei periodontitas. Stomatitas – burnos gleivinės uţdegimas, kurio metu gali patinti, parausti burnos gleivinė, daţnai atsiranda ţaizdelės ar pūslelės bet kurioje burnos vietoje: ant lieţuvio, dantenų, lūpų, gomurio ar skruostų gleivinėje. Gingivitas yra lėtinis dantenų uţdegimas. Pirminiai gingivito simptomai – paraudusios ir patinusios dantenos, ligai ūmėjant, atsiranda ertmė tarp danties ir dantenų. Negydomas gingivitas pereina į daug sudėtingesnę ligą – periodontitą [32].
Periodontitas yra uţdegiminė dantenų liga, apimanti periodonto raiščių degeneraciją, periodonto kišenės susidarymą ir alveolinio kaulo rezorbciją, dėl kurios sutrinka dantų atramos struktūra. Remiantis Pasaulio Sveikatos Organizacijos pateikta informacija, 10–15 proc. pasaulio gyventojų kenčia nuo sunkių periodontito formų [32 – 40].
Pagrindinė periodontito prieţastis – itin sparti bakterijų ir grybelių kolonizacija. Šios ligos metu, dėl dantenų epitelio migracijos, tarp dantenų ir danties susidaro tuščia erdvė išilgai danties paviršiaus, ji vadinama periodonto kišene. Ligos metu uţdegiminis atsakas aktyvuoja T–limfocitus, neutrofilus, išsiskiria antikūnai, uţdegimo mediatoriai (citokinai, chemokinai ir C reaktyvinis baltymas) bei lipopolisacharidai, esantys gramneigiamų bakterijų ląstelių sienelėse [32].
Mokslinės literatūros duomenimis, daţnai periodonto kišenėje randama padermė – grybelis
Candida albicans [41 – 44]. Daţniausiai Candida albicans randamas ne vienas, o kartu su bakterijų
kultūromis, pavyzdţiui, su gram teigiamomis Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Enterococcus
faecalis arba su gram neigiamomis, pavyzdţiui, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis
arba Prevotella intermedia [43]. Taigi, periodontitas niekuomet nebūna lydimas vienos grybelio ar bakterijų kultūros, šią ligą sukelia ir jos eigą apsunkina bakterijų ar grybelio kultūrų, besidauginančių periodonto kišenėje vienu metu, įvairovė.
1.4.1. Priemonės ir būdai periodontito gydymui
Ilgą laiką periodontitas buvo gydomas tik sistemiškai – per os vartojamais antibiotikais, tačiau buvo pastebėta nemaţai šalutinių poveikių, kuriuos šie vaistai sukelia, o vaisto koncentracija, kuri pasiekia periodonto kišenę, yra nepakankama ir labai greitai ima maţėti. Todėl yra būtinas daţnas vaisto dozavimas, o tai sąlygoja mikroorganizmų atsparumą antibiotikams. Nustatyta, kad geriausiai vaistai yra pasisavinami, vartojant juos vietiškai į periodonto kišenę. Šis audinys veikia kaip natūralus rezervuaras ir į jį yra nesudėtinga įvesti vaistinę medţiagą. Veiklioji medţiaga patenka ir pasiskirsto periodonto kišenėje [32, 37, 38, 45].
Vietinis (į periodonto kišenę) vaistų vartojimas turi daug privalumų, lyginant su sistemiškai vartojamais antibiotikais: vartojant vietiškai, vaistas tiesiogiai veikia ligos ţidinį, tokiu būdu pasireiškia didesnis vaisto terapinis aktyvumas, taip pat, išvengiama virškinamojo trakto dirginimo, pirmosios vaisto metabolizmo fazės kepenyse. Modifikuojant pagalbines medţiagas, galima pasiekti ilgesnę vaisto veikimo trukmę, kuomet preparato nereikia vartoti daţnai. Be išvardintų gydymo ypatumų, vietinis periodontito gydymas yra neskausminga, nesudėtinga procedūra, kuri yra saugesnė nei sisteminių vaistų vartojimas [32].
Odontologijos praktikoje vietinio poveikio priemonės periodontito gydymui pagal technologijos ypatumus yra skirstomos į: pluoštus (angl. fibers), juosteles (ang. strips), plėveles (angl. films), gelius, mikro daleles (angl. microparticles), nano daleles (angl. nanoparticles), liposomas, vezikulines ir kitas sistemas [35]. Vis tik, pacientams, kuriems pasireiškia ūmus periodontitas arba liga nepasiduoda vietiniam gydymui, yra skiriamas sisteminis gydymas, daţniausiai antibiotikais [38].
Pluoštai yra įvedami į periodonto kišenes, naudojant aplikatorių. Daţniausiai šių pluoštų veikliosios medţiagos būna antibiotikai – tetraciklino hidrochloridas, ciprofloksacinas, metronidazolas, gentamicino sulfatas, amoksicilino trihidratas arba antiseptikas – chlorheksidinas, o pluoštų gamyboje naudojamos šios polimerinės pagalbinės medţiagos: celiuliozės acetatas, etileno–vinil–acetatas, alginatas, kolagenas, polikaprolaktonas, chitozanas, nailonas, poli(D,L–laktido–ko–kaprolaktonas) arba poli–e– kaprolaktonas [32, 38, 45].
Juostelės – tai plonos, pailgos matricos, pagamintos iš lankstaus polimero. Juostelės gali būti pagamintos iš šių polimerų: etilceliuliozės, polimetilmetakrilato, poli(D,L–laktido/glikolido), hidroksipropilmetilceliuliozės, metilceliuliozės, akrilo bei polihidroksibutiro rūgšties. Veikliosios medţiagos – antibiotikai (minociklinas, tetraciklinas, metronidazolas, indometacinas, doksiciklinas, ofloksacinas, amoksicilinas su klavulano rūgštimi) bei antiseptikas chlorheksidinas [32, 38].
Geliai – tai pusiau kietos sistemos, plačiai naudojamos antibiotikų įterpimui į jas. Gelius lengva pagaminti bei patogu vartoti, dėl to tai yra labai plačiai vartojama technologinė forma. Daugybė antibiotikų yra vartojami gelių pavidale periodontito gydymui, tačiau skiriasi polimerai, sudarantys gelio pagrindą. Plačiausiai naudojami gelių gamyboje yra šie polimerai: chitozanas, ksantanas, karboksimetilceliuliozė, pluronikas ir lakto–glikolio rūgštis [32, 38].
Nano dalelės, makro dalelės bei liposomos – rečiau taikomos vaisto formos periodontito gydymui. Vis tik, jų veikliosios medţiagos daţniausiai yra antibiotikai, vartojami gelių, juostelių, plėvelių ir pluoštų gamyboje [32, 38].
Vienas iš vystomų perspektyvių periodonto raiščių atkūrimo būdų – gydymas kamieninėmis ląstelėmis. Tai yra regeneracinė terapija, kurios metu siekiama kontroliuoti uţdegimą, o kamieninių ląstelių pagalba atkurti naujus periodonto audinius [39]. Periodonto regeneracija gali būti pagreitinama dviem mechanizmais: kamieninės ląstelės naudojamos kaip nešikliai arba šios ląstelės gali dalintis į daugybę naujų ląstelių tipų ir tokiu būdu skatinti audinių regeneraciją. Literatūros duomenimis, gali būti taikoma ne tik ląstelių, bet ir genų terapija. Genų terapija apibrėţiama kaip ligos ar sutrikimo gydymas, perkeliant genetines medţiagas – įvedant, slopinant ar manipuliuojant specifiniais genais, kurie veikia tam tikras organizmo ląsteles ir sukelia terapinį poveikį [40].
Vis tobulėjant gydymui bei atsirandant naujoms technologinėms formoms, šiuo metu plėvelės yra viena labiausiai populiarėjančių vietiškai naudojamų medicinos priemonių, įvedamų tiesiai į periodonto kišenę. Savo populiarumo plėvelės sulaukė dėl daugybės teigiamų savybių: neskausmingo įvedimo į periodonto kišenę, pasiekiamo optimalaus veikliosios medţiagos pasiskirstymo periodonto kišenėje ir terapinio atsako, dėl tikslesnės dozuotės didesnės galimybės. Plėvelę gydytojas įterpia vizito metu ir jos poveikis gali trukti gerokai ilgiau nei vieną dieną, priklausomai nuo pagalbinių ir veikliųjų medţiagų. Taip pat, plėvelės gali būti suyrančios organizmo terpėje, o tai supaprastina ne tik pačią procedūrą vizito pas gydytoją metu (išvengiama papildomos intervencijos išimant plėvelę, sukeliama maţiau streso pacientui, maţiau skausminga), bet ir suteikia galimybę, panaudojant skirtingą suyrantį polimerą, modifikuoti polimerinės plėvelės suirimo, o tuo pačiu, ir terapinio poveikio trukmę [32]. Be to, polimerinės plėvelės gali būti vartojamos ne tik periodontito ligos atvejais, bet ir kitų, burnos uţdegiminių ligų, gydymui bei profilaktikai.
1.4.2. Polimerinės plėvelės su veikliosiomis medţiagomis ir jų vartojimo ypatumai
periodontito profilaktikai ir gydymui
Polimerinės plėvelės – tai medicinos priemonė, kurios pagrindą (matricą) sudaro polimeras, o veikliosios medţiagos iš plėvelės išsiskiria į reikiamą terpę. Vaistinė medţiaga iš plėvelės polimerinės matricos atsipalaiduoja difuzijos, matricos ištirpimo arba erozijos metu [32, 35].
Plačiausiai mokslinėje literatūroje aprašomos polimerinės plėvelės, kurios galėtų būti vartojamos periodontito gydyme, gaminamos su antibiotikais: metronidazoliu, tetraciklino hidrochloridu, minociklinu, amoksicilino ir metronidazolio deriniu, ornidazoliu bei klindamicinu. Taip pat, ciprofloksacino ir diklofenako derinio plėvelės, nesteroidinio vaisto nuo uţdegimo – meloksikamo, aminorūgšties taurino ir sintetinio izoflavono ipriflavono plėvelės [32, 34 – 36].
Vis tik, plėvelių su vaistinėmis medţiagomis, skirtų periodontito gydymui, asortimentas farmacijos rinkoje yra siauras – antibiotikai ir antiseptikas chlorheksidinas šiuo metu yra populiariausios plėvelių, skirtų periodontito gydymui, veikliosios medţiagos, nepaisant galimai nepageidaujamo jų poveikio. Vietinio poveikio antibiotikai ar kitos antiseptinės medţiagos sukelia nemaţai nepageidaujamų reakcijų, daţniausiai – alergijas, pastebėta net ir anafilaksinio šoko atvejų [46 – 49]. Vietiškai vartojant antiseptiką chlorheksidiną, kuris yra daugumos medicinos priemonių, skirtų periodontito gydymui, veiklioji medţiaga, buvo pastebėta skonio pojūčių ir dantų spalvos pasikeitimų, burnos arba (ir) gerklės skausmo, lieţuvio sudirginimo, švokštimo ir kvėpavimo sutrikimo atvejų [50]. Polimerinės plėvelės su augaliniu ekstraktu, t.y., su pelargonijų šaknų sausuoju ekstraktu, būtų ypač naudingos tiems ţmonėms, kurie negali vartoti antibiotikų (vietiškai ir sistemiškai) ar chlorheksidino dėl alergijų, kitų šalutinių reakcijų ar nesuderinamumo su kitais vaistais. Pavyzdţiui, populiarus antibiotikas metronidazolas gali sąveikauti su ličiu, disulfiramu, fluorouracilu, barbitūratais bei plačiai vartojamu varfarinu, o periodontito gydymui skiriamas ciprofloksacinas turi dar daugiau sąveikų su kitais vaistiniais preparatais. Remiantis įvairiais mokslo šaltiniais, sąveikų tarp Pelargonium sidoides DC. sausojo šaknų ekstrakto ir kitų vaistų, nenustatyta arba jos nėra patvirtintos. Nustatyta, kad Pelargonium sidoides DC. ekstraktas gali sukelti tik nepavojingus sveikatai nepageidaujamus poveikius, tokius kaip: virškinimo trakto negalavimai, nedidelis kraujavimas iš dantenų, nedidelis kraujavimas iš nosies, padidėjusio jautrumo reakcijos, vėmimas, viduriavimas. Todėl galima teigti, kad tam tikrais atvejais, Pelargonium sidoides DC. sausąjį šaknų ekstraktą vartoti yra saugiau nei antibiotikus ar chlorheksidiną [51, 52].
Vis dėlto, duomenų apie polimerines plėveles su augaliniais ekstraktais ar biologiškai aktyviais junginiais, išskirtais iš augalinių ţaliavų, galinčiais pakeisti ar papildyti sintetines medţiagas, trūksta.
Indijoje buvo sukurtos polimerinės plėvelės su fenoliniu junginiu, kurkuminoidų grupės atstovu – kurkuminu, išskirtu iš daţinės ciberţolės (lot. Curcuma longa) šakniastiebių. Kurkuminas pasiţymėjo plačiu priešbakteriniu, priešuţdegiminiu ir antioksidantiniu poveikiais. Tyrimas buvo atliktas in vitro sąlygomis, įvertinus polimerinių plėvelių fizikines ir chemines savybes, prieita išvados, kad polimerinės plėvelės su kurkuminu galėtų būti taikomos periodontito atveju [53].
1.4.2. Polimerinių plėvelių, skirtų periodontito gydymui, pagalbinės medţiagos
Polimerinių plėvelių kokybę apsprendţia ne tik veiklioji, bet ir pagalbinės medţiagos. Pagalbinės medţiagos keičia polimerinių plėvelių savybes, pavyzdţiui, prailgina arba sulėtina plėvelių suirimo bei veikliosios medţiagos atpalaidavimo laiką, reguliuoja plėvelių lipnumą (adhezines savybes), plastiškumą (lankstumą). Taip pat pagalbinės medţiagos turi įtakos veikliosios medţiagos stabilumui [54].
Pagrindinė plėvelės pagalbinė medţiaga, sudaranti matricą – polimeras, kuris gali būti suyrantis arba nesuyrantis organizmo terpėje. Daţniausiai periodontito gydymui skirtų polimerinių plėvelių gamyboje naudojami šie polimerai: chitozanas, kolagenas, karbopolis 934, polivinilalkoholis, ţelatina, karboksimetilceliuliozė, hidroksipropilceliuliozė, etilceliuliozė, metilceliuliozė, polietilenglikolis, atelokolagenas, kukurūzų baltymas zeinas bei polikaprolaktonas [32, 35, 54]. Pavyzdţiui, karboksimetilceliuliozė, hidroksipropilceliuliozė, etilceliuliozė ir metilceliuliozė pasiţymi puikiomis plėvelę formuojančiomis savybėmis, be to, šios vidutinio stiprumo pagalbinės medţiagos yra bekvapės, beskonės, labai lanksčios bei skaidrios. Chitozano pagrindu pagamintos plėvelės suformuoja pusiau pralaidţias dangas, jos yra stabilios, savaime suyrančios ir polimerinių plėvelių mechaninės savybės laikymo bei sandėliavimo metu nesikeičia arba pasikeičia neţymiai [55]. Plėvelės, kurių pagrindas yra kukurūzų baltymas zeinas, puikiai suyra organizmo terpėje. Deja, tokios plėvelės yra ganėtinai trapios, netvirtos, todėl lankstumui išgauti būtina pridėti plastifikatoriaus (lankstumą gerinančios medţiagos).
Viena pagrindinių lankstumą gerinančių medţiagų polimerinių plėvelių gamyboje yra glicerolis [56]. Taip pat gali būti naudojamos riebalinės kilmės medţiagos, pavyzdţiui, sojų pupelių aliejus. Kartais į plėvelių sudėtį dedama suirimą gerinančių medţiagų, pavyzdţiui, bulvių ar kukurūzų krakmolo [37].
Gaminant polimerines plėveles, svarbu tinkamai parinkti tirpiklį, kuriame tirpsta polimeras, suformuojantis plėvelės matricą – juo daţniausiai būna acto bei pieno rūgštys [32, 35, 54]. Tik tinkamai suformuota galutinio produkto sudėtis uţtikrins polimerinės plėvelės kokybę, efektyvumą, saugumą bei stabilumą.
1.5. Polimerinių plėvelių technologinių savybių nustatymas
Polimerinėms plėvelėms gali būti taikoma daug technologinių savybių nustatymo testų, tačiau daţniausiai jie atrenkami pagal poreikį (prailginto veikimo, greitesnio suirimo, efektyvesnio lipnumo plėvelės ir t.t.). Įprastai yra atliekami šie testai: mikroskopinių savybių ir plėvelės storio bei masės vienodumo nustatymas, paviršiaus pH, brinkimo, suirimo laiko, vaistinės medţiagos vienodumo, vaistinės medţiagos atsipalaidavimo, plyšimo bei tempimo jėgos testai [57 – 63].
Mikroskopinių savybių nustatymas yra svarbus, vertinant plėvelių vidinės struktūros vienodumą, homogeniškumą. Plėvelės storis matuojamas skirtingose jos vietose, įvertinant plėvelės kokybę (kuo vienodesnis storis skirtingose plėvelės vietose, tuo ji kokybiškesnė) [57 – 60]. Plėvelės storis labai priklauso ne tik nuo jos naudojimo vietos (oda, gleivinė), suţalojimo/paţeidimo (ţaizda, opa, sumušimas, sudirgimas, atsivėrusi ertmė ir pan.), bet ir nuo veikliosios bei pagalbinių medţiagų pasirinkimo. Daţnai polimerinių plėvelių storis vyrauja nuo 100,0 iki 2310,0 mikrometrų [57, 58, 60, 63]. Pavyzdţiui, Indijos mokslininkai nustatė, kad jų sukurtų polimerinių plėvelių makšties uţdegimui gydyti storis – nuo 1,52 ± 0,25 iki 2,31 ± 0,09 mm [64]. Kiti Indijos mokslininkai pagamino plėveles, skirtas pritvirtinti burnos gleivinėje, su beta adrenoreceptorių blokatorių grupės atstovu – atenololiu ir įvertino šių plėvelių storį, kuris buvo 0,42 – 0,46 mm [63]. Lietuvos ir Čekijos mokslininkų grupės sukurtų plėvelių su ibuprofenu, skirtų vartoti vietiškai ant odoje esančių ţaizdų (skausmo malšinimui) nustatytas storis – nuo 152,3 ± 11,7 𝜇m iki 165,4 ± 13,9 𝜇m [57].
Plėvelių masės vienodumas nustatomas, remiantis Europos Farmakopėjos 2.9.5 straipsniu – plėvelės yra padalijamos į lygius (pagal ploto vienetą) gabalėlius, ir kiekvienas gabalėlis pasveriamas atskirai, nustatant masės vidurkį. Tuomet yra lyginamas kiekvieno gabalėlio svoris su masės vidurkiu ir skaičiuojamos procentinės paklaidos. Pavyzdţiui, Indijos mokslininkai, sukūrę polimerines plėveles makšties uţdegimui gydyti, nustatė, kad plėvelių masė varijavo nuo 57,18 ± 1,23 iki 98,00 ± 1,28 mg [64]. Kiti Indijos mokslininkai, sukūrę plėveles su klotrimazolu burnos gleivinei, nustatė, kad plėvelių masė svyruoja nuo 49 iki 52 mg. Daţniausiai yra atliekami keli tyrimai vienu metu – plėvelės masės vienodumo, storio ir paviršiaus pH nustatymas [58 – 60].
Plėvelės paviršiaus pH nustatymas yra svarbus vaistinio preparato saugumo uţtikrinimui – pH turi būti toks, koks yra odos ar gleivinės paviršiaus, ant kurio bus dedama plėvelė, pH (pavyzdţiui, burnos gleivinės terpės pH, paţeistos odos ir pan.). Priešingu atveju, gleivinė (ar oda) gali būti dirginama ir dar labiau paţeidţiama. Plėvelių paviršiaus pH gali skirtis nuo odos ar gleivinės, jeigu tam tikros ligos gydymui reikia sukurti rūgštinę arba šarminę terpę. Tyrimas gali būti atliekamas, panardinant plėveles į
nedidelį tūrį distiliuoto vandens (arba į imituotą, dirbtinai sukurtą terpę) kelioms valandoms, pastoviai matuojant tirpalo pH prie plėvelių paviršiaus [57 – 63]. Pavyzdţiui, Indijos mokslininkai (pagaminę plėveles su klotrimazolu) nustatė, kad plėvelių pH varijuoja nuo 5,84 ± 0,19 iki 7,16 ± 0,12 [60]. Indijos mokslininkai, pagaminę burnos gleivinei skirtas plėveles su ranitidinu, nustatė, kad jų pH svyravo nuo 6,56 ± 0,11 iki 6,66 ± 0,15 [59].
Plėvelės brinkimo nustatymas – pakankamai nesudėtingas ir daţnai naudojamas testas. Plėvelė yra padalijama į reikiamo dydţio gabalėlius, ir kiekvienas plėvelės gabalėlis yra pasveriamas. Tuomet gabalėlis panardinamas į atitinkamą buferinį tirpalą, o jam išbrinkus, tam tikrais laiko intervalais, sveriamas dar kartą. Brinkimo laipsnis apskaičiuojamas remiantis formule [57 – 62]. Mokslinių tyrimų duomenimis, daţniausiai, brinkimo laipsnis didėja (priklausomai nuo laiko) iki tam tikros ribos, o paskui gali likti stabilus arba šiek tiek sumaţėti [58, 60].
Vaistinės medţiagos vienodumo testas nusako, ar veikliosios medţiagos (medţiaga) pasiskirsto vienodai visoje plėvelėje [57]. Testas atliekamas, remiantis Europos Farmakopėjos 2.9.6. straipsniu – dešimt vienodo dydţio plėvelių gabalėlių iš skirtingų plėvelių vietų yra atskirai ištirpinami. Pagal gautus efektyviosios skysčių chromatografijos su UV detektoriumi duomenis apskaičiuojamos veikliosios medţiagos koncentracijos. Šis testas gali būti atliekamas, panaudojant ir UV spektrofotometrą [57 – 63]. Veikliosios medţiagos tolygiam pasiskirstymui didelės įtakos turi pagalbinės medţagos bei pasirinktas polimeras. Pavyzdţiui, Čekijos ir Lietuvos mokslininkai ištyrė pagamintas polimerines lidokaino plėveles su makrogoliu 300 ir gliceroliu. Gauti rezultatai parodė, kad vaistinės medţiagos kiekis ir pasiskirstymas plėvelėje priklauso nuo pasirinktų pagalbinių medţiagų [58].
Vaistinės medţiagos atsipalaidavimo testas daţniausiai yra atliekamas krepšelio metodu – plėvelė yra patalpinama į krepšelį, kuris yra panardintas 37 ± 0,5 o
C tirpale (terpėje). Krepšelis pastoviai sukasi. Tam tikrais intervalais yra imami tirpalo (terpės) mėginiai ir matuojamas vaistinės medţiagos kiekis mėginyje [57 – 62]. Šio tyrimo rezultatai parodo, per kiek laiko vaistinė medţiaga atsipalaiduoja iš plėvelės. Saudo Arabijoje atlikto tyrimo metu nustatyta, kad veiklioji medţiaga – metronodazolo benzoatas iš polimerinių plėvelių, skirtų periodontitui gydyti, atsipalaiduoja tolygiai (tirta 7 valandų laikotarpyje) [65]. Indijos mokslininkai, pagaminę polimerines chitozano plėveles su tetraciklinu, ištyrė veikliosios medţiagos atsipalaidavimą iš polimerinių plėvelių ir nustatė, kad pirmomis dienomis veiklioji medţiaga yra atpalaiduojama greičiau, o paskui atsipalaidavimas tolygiai didėja iki tam tikro taško [36].
Plėvelės mechaninių savybių – tempimo jėgos stiprumo ir plyšimo jėgos testai, atliekami, siekiant įvertinti pagaminto galutinio produkto tvirtumą. Plėvelės tempimo jėgos stiprumas yra jėga, reikalinga plėvelei suplėšyti ją tempiant [63]. Plyšimo jėga – tai slėgis, kuriam esant plėvelė suplyš. Tai yra
atsparumo plyšimui matas, kuris stipriai priklauso nuo medţiagos tamprumo bei lankstumo. Daţniausiai tempimo jėgos testas yra atliekamas su tekstūrų analizatoriumi: plėvelė įtvirtinama tarp dviejų gnybtų ir nustatytu greičiu viršutinis gnybtas juda aukštyn, tuo tarpu apatinis nejuda. Gnybtai tolsta vienas nuo kito tol, kol plėvelė plyšta – plyšimo taškas fiksuojamas, ir apskaičiuojama tempimo jėga bei juostelės prailgėjimas plyšimo metu. Nustatant plyšimo jėgą,plėvelė pritvirtinama rėmelyje ir liečiamasis prietaisas pastoviu greičiu spaudţiamas ţemyn nuo nustatyto atstumo, kol plėvelė plyšta. Jėga ir liečiamojo prietaiso nueitas atstumas nuo pradţios taško iki polimerinės plėvelės plyšimo taško yra išmatuojami plyšimo taške [57 – 60]. Šių testų gauti duomenys yra labai įvairūs, nes plyšimo jėga priklauso nuo kelių faktorių: naudotų pagalbinių medţiagų, polimero, sudarančio plėvelę, bei plėvelės storio.
Daţniausiai, vertinant polimerinių plėvelių kokybę, yra pasirenkami keli technologinių savybių įvertinimo testai. Visų šių testų rezultatai pateikia informaciją – ar pagaminta plėvelė yra kokybiška.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo medţiagos
Sausasis Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstraktas, gautas iš Frutarom Industries Ltd., Šveicarijos. Šis ekstraktas naudotas polimerinių plėvelių gamyboje, kaip veiklioji medţiaga.
2.1.1. Reagentai
Chitozanas, vidutinės molekulinės masės – deacetilinimo laipsnis – 75 – 85 proc. (Sigma–Aldrich, JAV); Pieno rūgštis 90 proc. (Carl Roth GmbH, Vokietija);
Glicerolis (Sigma–Aldrich, JAV);
Išgrynintasis vanduo (Lietuvos Sveikatos Mokslų Universitetas, Farmakognozijos, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra);
Para–dimetilaminocinnamaldehido (DMAC) reagentas (Sigma–Aldrich, JAV); Etanolis 96 proc. (Spiritus Vilnensis – Vilniaus degtinė);
Sieros rūgštis ≥37 proc. (Sigma–Aldrich, JAV);
0,5 mg/ml koncentracijos standarto epikatechino tirpalas (Sigma–Aldrich, JAV); Sephadex LH–20, gelio filtravimo medţiaga (Sigma–Aldrich, JAV);
Metanolis ≥99,9 proc. (Sigma–Aldrich, JAV); Acetonas ≥99,5 proc. (Sigma–Aldrich, JAV); LB terpė (Sigma–Aldrich, JAV);
Agaras (Sigma–Aldrich, JAV);
0,12 proc. Chlorheksidino digliukonato tirpalas (LSMU Vaistinė); Natrio šarmas ≥ 98 proc. (Sigma–Aldrich, JAV);
2.1.2. Įranga
Spektrofotometrai (Spectronic CamSpec M550, Jungtinė Karalystė; UV-1800 UV Spectrophotometer Shimadzu, Japonija);
Svarstyklės (AXIS AD510, Lenkija)
Elektroninės analitinės svarstyklės (Mettler Toledo, Šveicarija); Stiklinė kolonėlė (GE Healthcare Biosciences Inc., Švedija);
Šaldanti centrifuga (Biofuge Stratos. Thermo Fisher Scientific, JAV / UAB "Analytical solutions", Lietuva);
Optinis mikroskopas Motic su Moticam 2300 3.0M Pixel USB2.0 skaitmenine kamera; Termostatas (Binder, JAV);
pH-metras pH/ION 7320 su WinLab elektrodu;
„Sotax AT 7 smart“ tirpumo bandymo prietaisas (JAV);
Tekstūros analizatorius TA.XT plus (Stable Micro Systems, Jungtinė Karalystė); Liofilizatorius LyoQuest Telstar (Vokietija).
2.2. Tyrimo metodai
1. Proantocianidinų kiekiai nustatyti spektrofotometrijos su DMAC reagentu metodu. 2.
Priešmikrobinis sausojo Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakto tyrimas atliktas diskų difuzijos metodu. 3. Naudojant chitozano pagrindą pagamintos polimerinės plėvelės su Pelargonium sidoides DC. sausuoju šaknų ekstraktu. 4. Polimerinių plėvelių su Pelargonium sidoides DC. sausuoju šaknų ekstraktu technologinės savybės nustatytos, naudojant mikroskopinių savybių, plėvelės storio, masės vienodumo įvertinimo, paviršiaus pH, brinkimo, suirimo laiko, vaistinės medţiagos vienodumo, vaistinės medţiagos atsipalaidavimo, plyšimo bei tempimo jėgos metodus.
2.2.1. Proantocianidinų kiekio nustatymas
Proantocianidinų, esančių sausajame Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakte, kiekis bei išskirtoje liofilizuotoje proantocianidinų frakcijoje ir atsipalaidavusių iš polimerinių plėvelių proantocianidinų koncentracija nustatyti spektrofotometriniu metodu, naudojant para–
spektrofotometrinis metodas, todėl tikslinga lyginti gautus rezultatus tarpusavyje. Atliekant šią analizę, buvo laikomasi vientisumo – iš pradţių nustatomas proantocianidinų kiekis sausajame Pelargonium
sidoides DC. šaknų ekstrakte, po to, iš šio ekstrakto išskyrus proantocianidinų frakciją ir ją liofilizavus,
atliktas proantocianidinų kiekio nustatymas liofilizuotoje frakcijoje ir galiausiai, nustatytas proantocianidinų kiekis, atsipalaiduojantis iš polimerinėje plėvelėje esančio pelargonijų šaknų sausojo ekstrakto. Tikėtina, kad atliekant Pelargonium sidoides DC. sausojo šaknų ekstrakto kiekinę analizę, su DMAC reagentu reaguoja ne tik proantocianidinai, bet ir kiti fenoliniai junginiai, todėl atliekamas proantocianidinų nustatymas liofilizuotoje proantocianidinų frakcijoje, siekiant išsiaiškinti, kiek proantocianidinų yra ekstrakte iš tikrųjų.
2.2.1.1. Proantocianidinų kiekio spektrofotometrinis nustatymas sausajame
Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakte
Spektrofotometrinis tyrimas atliktas, naudojant DMAC reagentą, absorbciją matuojant spektrofotometru (Spectronic CamSpec M550).
Pagaminamas parūgštintas etanolis: 12,5 ml koncentruotos (36 proc.) druskos rūgšties sumaišoma su 12,5 ml išgryninto vandens ir 75 ml etanolio (93 proc.). DMAC reagentas yra jautrus šviesai ir oksidacijos procesui, todėl kiekvieną kartą prieš tyrimą ruošiamas švieţiai, ištirpinant 0,05 g DMAC miltelių 50 ml parūgštinto etanolio. Lyginamasis tirpalas gaminamas 2 ml DMAC reagento sumaišant su 20 μl išgryninto vandens [66].
Kalibracinės kreivės sudarymui naudotas standarto – epikatechino tirpalas, gaminant skirtingų koncentracijų (0,0156 mg/ml – 0,125 mg/ml) tirpalus. 20 μl paruošto skirtingų koncentracijų standarto tirpalo gerai sumaišoma su 2 ml DMAC reagentu. Tirpalai inkubuojami kambario temperatūroje 15 minučių. Tirpalų absorbcija matuojama esant 640 nm bangos ilgiui. Gauta kalibracinė kreivė pavaizduota 1 paveiksle.
1 pav. Spektrofotometrinio metodo su DMAC reagentu kalibracinė kreivė, skirta nustatyti
sausajame Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakte, liofilizuotoje proantocianidinų frakcijoje esančių ir iš polimerinių plėvelių atsipalaidavusių proantocianidinų koncentracijoms
Vandeninis 0,001 proc. kocentracijos tiriamasis tirpalas gaminamas 0,01 g sausojo Pelargonium
sidoides DC. šaknų ekstrakto ištirpinant 10 ml išgryninto vandens. Tiriamasis tirpalas gaminamas 2 ml
DMAC reagento tirpalo sumaišant su 20 μl 0,001 proc. vandeninio pelargonijų šaknų ekstrakto tirpalu. Tuomet tiriamasis tirpalas inkubuojamas 15 minučių kambario temperatūroje ir spektrofotometru išmatuojama absorbcija, esant 640 nm ilgio bangai. Matavimai kartojami tris kartus. Pagal gautus duomenis, remiantis kalibracine kreive, apskaičiuojama tiriamajame tirpale esančių proantocianidinų koncentracija. Pelargonium sidoides DC. sausajame šaknų ekstrakte esantis proantocianidinų kiekis išreiškiamas epikatechino ekvivalentu viename grame medţiagos ir yra apskaičiuojamas remiantis 1 formule:
EE = c × V/m, mg/g (1 formulė)
Čia: EE – bendras proantocianidinų kiekis, išreikštas epikatechino ekvivalentu (miligramais viename grame medţiagos);
c – epikatechino koncentracija (mg/ml);
V – tirpalo tūris (ml), kuriame ištirpsta ekstraktas;
m – Pelargonium sidoides DC. sausojo šaknų ekstrakto masė (g).
y = 1.972x + 0.1995 R² = 0.9947 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 A bsorbci ja
Standarto epikatechino koncentracija (mg/ml)
Kalibracinė kreivė
2.2.1.2. Proantocianidinų išskyrimas iš Pelargonium sidoides DC. sausojo šaknų
ekstrakto
Sephadex LH-20 kolonėlė (GE Healthcare Biosciences Inc., Švedija) paruošiama sumaišant 5 gramus gelio filtravimo medţiagos – sefadekso su 25 ml 50 proc. metanolio tirpalo. Mišinys perkeliamas į Sephadex LH-20 kolonėlę ir paliekamas 4 valandoms, kol pilnai išbrinks. 0,4 gramai Pelargonium
sidoides DC. sausojo šaknų ekstrakto ištirpinami 20 ml 50 proc. metanolio tirpalo. Tirpalas
centrifuguojamas 20 min. kambario temperatūroje 2000 G jėga. Gautas supernatantas filtruojamas 0,45 µm diametro filtru ir perkeliamas į kolonėlę. Siekiant iš gelio pašalinti fenolines rūgštis, cukrus ir kitas priemaišas, kolonėlė 4 kartus plaunama 25 ml 50 proc. metanolio tirpalu, kol eliuatas tampa skaidrus. Kolonėlę plaunant po 50 ml 70 proc. acetonu yra surenkami proantocianidinai. Gauta proantocianidinų frakcija yra liofilizuojama aparatu LyoQuest Telstar[67].
2.2.1.3. Proantocianidinų kiekio nustatymas liofilizuotoje proantocianidinų frakcijoje
Iš Pelargonium sidoides DC. šaknų sausojo ekstrakto išskirta ir liofilizuota proantocianidinų frakcija buvo tirta kiekiškai. Proantocianidinų kiekio nustatymas atliktas siekiant išsiaiškinti realų proantocianidinų kiekį, esantį sausajame Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakte, nes tiriant sausąjį šaknų ekstraktą, su DMAC reagentu galimai sureaguoja ir kiti fenoliniai junginiai, todėl nėra aišku, kiek proantocianidinų yra ekstrakte. Atliekant išskirtos proantocianidinų frakcijos kiekinę analizę, nustatoma, kiek iš tikrųjų yra proantocianidinų Pelargonium sidoides DC. sausajame šaknų ekstrakte.Tyrimas atliktas spektrofotometrijos metodu, naudojant DMAC reagentą [66]. Tyrimo eiga identiška aprašytai 2.2.1.1. skyriuje, tačiau tiriamoji medţiaga yra ne sausasis pelargonijų šaknų ekstraktas, o liofilizuota proantocianidinų frakcija. Matavimai pakartoti tris kartus. Proantocianidinų kiekis apskaičiuojamas naudojantis 2.2.1.1. skyriuje nurodyta kalibracine kreive ir remiantis 1 formule.
2.2.2. Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakto priešmikrobinio aktyvumo tyrimas
Sausojo Pelargonium sidoides DC. šaknų ekstrakto priešmikrobinio aktyvumo tyrimas buvo atliktas LSMU Mikrobiologijos ir virusologijos instituto laboratorijoje, diskų difuzijos metodu. Šiuo
