LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
VYTAUTAS ŠAULYS
PELARGONIUM SIDOIDES DC ŠAKNŲ SAUSOJO EKSTRAKTO
KAPSULIŲ GAMYBA
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. habil. dr. Arūnas Savickas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data:
PELARGONIUM SIDOIDES DC ŠAKNŲ SAUSOJO EKSTRAKTO
KAPSULIŲ GAMYBA
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Prof. habil. dr.. Arūnas Savickas Data:
Recenzentas: Data:
Darbą atliko: Magistrantas Vytautas Šaulys Data:
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
PADĖKA ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Paprastoji pelargonija (Pelargonium sidoides DC) ... 10
1.1.1. Paprastoji pelargonija ir jos sudėtis ... 10
1.1.2. Istorija ... 11 1.1.3. Antibakterinis aktyvumas ... 11 1.1.4. Antivirusinis aktyvumas ... 11 1.2. Kapsulių samprata ... 12 1.2.1. Kapsulės... 12 1.2.2. Kietosios kapsulės ... 12
1.2.3. Kapsulių privalumai ir trūkumai ... 14
1.2.4. Kapsulių užpildymas ... 14 1.2.5. Pagalbinės medžiagos ... 15 1.2.6. Kapsuliavimas ... 16 1.2.7. Milteliai ... 16 1.3. Fenoliai ... 17 1.3.1. Fenoliniai junginiai ... 17
1.3.2. Fenolinių junginių klasifikacija ... 17
1.3.3. Fenolinės rūgštys ... 18
1.3.4. Spektrofotometrija ... 19
1.3.5. Plonasluoksnė chromatografija ... 19
2. TYRIMO METODIKA ... 20
2.1. Tyrimo metodai ... 20
2.1.1. Tyrimo metu naudotos medžiagos ... 20
2.1.2. Tyrimo metu naudota aparatūra ... 21
2.1.3. Miltelių mišinio birumo įvertinimas ... 21
2.1.4. Laisvai išbyrėjusio miltelių mišinio kūgio kampas ... 22
2.1.6. Didžiausio miltelių mišinio suberiamojo tankio nustatymas ... 23
2.1.7. Miltelių mišinio Carr indekso ir Hausner koeficiento nustatymas ... 23
2.1.8. Medžiagų kiekio skaičiavimas ... 24
2.1.9. Kietųjų kapsulių užpildymas ... 26
2.1.10. Užpildytų kapsulių masės vienodumo nustatymas ... 26
2.1.11. Pagalbinių medžiagų pasirinkimas ... 27
2.1.12. Tiriamojo mėginio paruošimas ... 27
2.1.13. Bendro fenolinių junginių nustatymas spekrofotometriniu metodu ... 27
2.1.14. Standartinių tirpalų ruošimas ir kalibracinių kreivių sudarymas ... 28
2.1.15. Sausojo pelargonijų šaknų įvertinimas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 28
2.1.16. Duomenų statistinis įvertinimas ... 29
3. REZULTATAI ... 30
3.1. Miltelių masė ... 30
3.2. Miltelių technologinės savybės, suberiamasis tankis ... 30
3.3. Carr indeksas ir Hausner koeficientas ... 31
3.4. Miltelių birumas ... 32
3.5. Kapsulių užpildymas miltelių mišiniais ... 33
3.6. Kapsulių vienodumo nustatymas ... 33
3.7. Stabilumo tyrimai ... 35
3.8. Pelargonium sidoides dc šaknų sausojo ekstrakto ir pagamintų kapsulių tapatybės įvertinimas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 36
3.9. Pelargonium sidoides dc šaknų sausojo ekstrakto ir pagamintų kapsulių bendro polifenolinių junginių įvertinimas spektrofotometriniu Folin - Ciocalteu metodu ... 38
IŠVADOS ... 39
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 40
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 41
SANTRAUKA
Vytautas Šaulys. Magistro baigiamasis darbas Pelargonium Sidoides DC šaknų sausojo ekstrakto kapsulių gamyba“, mokslinio darbo vadovas prof. Arūnas savickas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra – Kaunas.
Tyrimo tikslas: Parinkti tinkamiausią Pelargonium sidoides DC šaknų sausojo ekstrakto
kapsulių gamybos technologiją, pagaminti kapsules ir įvertinti jų kokybę. Atlikti kokybinę fenolinių junginių analizę Pelargonium sidoides ekstrakte ir kapsulėse.
Darbo uždaviniai:
1. Išanalizuoti mokslinę literatūrą apie kapsuliavimo technologijas, kurias būtų galima pritaikyti gaminant Pelargonium sidoides DC šaknų sausojo ekstrakto kapsules.
2. Parinkti geriausiai tinkamą kapsuliavimo technologiją. Aprašyti technologijos parametrus, reikalingus gaminant Pelargonium sidoides šaknų sausojo ekstrakto kapsules.
3. Atlikti Pelargonium sidoides DC šaknų sausojo ekstrakto kapsulių kokybės ir stabilumo vertinimą. 4. Identifikuoti polifenolinius junginius sausajame pelargonijų šaknų ekstrakte.
5. Nustatyti bendrą polifenolinių junginių kiekį ekstrakte.
Tyrimo objektas ir metodai: tyrimo objektas pagamintos Pelargonium sidoides DC sausojo
šaknų ekstrakto kapsulės. Norint įvertinti kapsuliuojamų miltelių technologines savybes, buvo nustatinėjamas laisvai beriamų miltelių kūgio kampas ir išbyrėjimo greitis, suberiamasis ir didžiausias suberiamasis tankiai. Vertinant pagamintų kietųjų želatinos kapsulių rodiklius, buvo nustatytas masės vienodumas ir kapsulių suirimo laikas. Taip pat buvo stebėtas kapsulių stabilumas vertinant užpildytų
kapsulių masės vienodumą, suirimo laiką.
Norint kiekybiškai įvertinti polifenolinius junginius tiriamajame pelargomijų ekstrakte ir pagamintose kapsulėse, buvo taikomas VIS-spektrofotometrijos metodas. Gauti rezultatai padoroti naudojant Microsoft Office Excel 2007 programą.
Tyrimo rezultatai ir išvados: atlikus tyrimus, buvo nustatyta, kad skirtingi pagalbinių
medžiagų kiekiai, turi įtakos pagamintų kapsulių kokybei. Taip pat nustatytas tinkamiausias pagalbinių medžiagų kiekis, kuris mažiausiai paveikė pagamintų kapsulių kokybės rodiklius. Taip pat buvo nustatyti polifenoliniai junginiai.
SUMMARY
Vytautas Šaulys. Master‘s degree final project “Pelargonium Sidoides DC. dry extract capsule manufacturing”. Scientific supervisor prof. Arūnas Savickas; Lithuanian Health Science Univesity, Medical Academy, Faculty of Pharmacy; Department of Drug Technology and Social Pharmacy – Kaunas.
Objective of the study: To select the appropriate method of dry extract capsule production from the
roots of Pelargonium sidoides DC. and evaluate the quality of the capsules. To measure the overall quantity of phenolic compounds in the extract of Pelargonium sidoides DC.
Tasks of the study:
1. Analyze the scientific literature pertaining to the matter of encapsulation technologies which could be suitable for the manufacturing of dry extract capsules from the roots of Pelargonium sidoides DC. 2. Select the most effective method of encapsulation. Describe the technological parameters necessary in
the production of dry extract capsules from the roots of Pelargonium sidoides DC. 3. Assess the quality and stability of Pelargonium sidoides DC root dry extract capsules. 4. Identify the polyphenol compounds in the extract of Pelargonium sidoides DC. 5. Measure the overall quantity of phenolic compounds in the extract of pelargonium.
Object and methods: the object of the study was manufactured dry extract capsules from the roots of
Pelargonium sidoides DC. The angle of repose and flow speed, bulk and tapped density were evaluated to assess the technological properties of the encapsulated powder. Evenness of mass and capsule decomposition time was evaluated to indicate the properties of the manufactured hard gelatin capsules. Capsule stability was evaluated by assessing the evenness of mass and capsule decomposition time of filled and sealed hard gelatin capsules. VIS- spectrophotometry was used to measure the overall quantity of phenolic compounds in the extract of pelargonium. The obtained results were processed using Microsoft Office Excel 2007.
Results and conclusions: The results show that different concentrations of auxiliary substances have
an impact on quality of the capsules. As result of the study the optimal amount of auxiliary substances that affected the quality of the capsules the least was calculated.
PADĖKA
Už konsultacijas ir nuoširdžią pagalbą dėkoju magistrinio darbo vadovui prof. habil. dr. Arūnui Savickui bei visiem vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedros darbuotojams, kurie maloniai konsultavo ir prisidėjo prie mano atliekamo darbo.
ĮVADAS
Cheminių vaistų vartojimas yra labai paplitęs Lietuvoje ir daugelyje pasaulio šalių. Dažnai pasitaikančias ligas - gripą, virusinius susirgimus, peršalimą - pirmiausia gydoma cheminiais vaistai, tačiau gydant peršalimo ligas reiktų rinktis natūralius vaistus. Ūmių ir sunkių ligų atvejais skiriamas gydymas cheminiais vaistiniai preparatais, o sergant lėtinėmis ligomis ar kasdieniniais negalavimais geriau rinktis augalinius vaistus, kadangi jie labai retai sukelia pašalinius poveikius. Medicinai žengiant į priekį, nuolat sukuriama vis efektyvesnių cheminių preparatų ligų gydymui, tačiau dabartiniu metu vis labiau domimasi ir augaliniais preparatais. Iš vaistingųjų augalų pagaminti vaistai pasižymi švelnesniu ir platesniu poveikiu, lyginant su cheminiais preparatais. Tai yra svarbu gydant vyresnio amžiaus žmones ir vaikus, nes jų organizmai jautriai reaguoja į cheminius preparatus. Tinkamas vaistinių augalų vartojimas gali ne tik išgydyti ligas, bet ir apsaugoti organizmą nuo daugelio ligų, aprūpinant jį naudingomis medžiagomis. Vienas iš natūralių vaistų sudėdamųjų dalių yra daugiau nei prieš 100 metų atrastas iš pelargonijos šaknų – augalinis fitobiotikas. Jis sustipriną organizmo atsparumą virusinėms infekcijoms, taip pat trugdo bakterijų ir virusų dauginimuisi, bei normalizuoja žarnyno mikroflorą.
Pelargonijų šaknų ekstraktas turi antivirusinį ir antibakterinį poveikį. Jis efektyvus gydant sinusitą, tonzilofaringitą, tonzilitą, lėtinį ar ūminį bronchitą, taip pat gripą bei kitas viršutinių kvėpavimo takų ligas. Šių ligų priežastys dažniausiai būna virusinės (rinovirusai, Corona virusai, adenovirusai, paragripo, gripo, respiracinis sincitinis virusas, koksakio virusas) arba bakterinės (įvairūs streptokokai, Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia pneumoniae ir
Mycoplasma pneumoniae) infekcijos. Pelargonium sidoides DC esančios veikliosios medžiagos
padeda gydyti lėtinę obstrukcinę plaučių ligą (LOPL). Pelargonijų ekstrate esančios antibakterinės medžiagos ir imunomoduliatoriai gali būti naudojami kaip antibiotikai.
Dėl atibakterinių ir antivirusinių augalo savybių ir išanalizavus mokslinę literatūrą, nuspręsta pagaminti Pelargonium sidoides šaknų sausojo ekstrakto kapsules. Kad būtų priimtinos vartoti žmonėms, kapsulės turi atitikti kokybės reikalavimus, dozavimą ir stabilumą. Dėl nemalonaus augalo kvapo ir skonio, pasirinktas miltelių dozavimas kapsulėmis. Siekiant pagaminti kokybiškas kapsules su Pelargonium sidoides DC šaknų sausuoju ekstraktu, pasirinktos ir pagalbinės medžiagos, kurios padės pagerinti miltelių technologines savybes.
DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Parinkti tinkamiausią kapsulių gamybos technologiją, pagaminti Pelargonium
sidoides DC šaknų sausojo ekstrakto kapsules bei įvertinti jų kokybę. Identifikuoti polifenolinius
junginius Pelargonium sidoides ekstrakte.
Darbo uždaviniai:
1. Išanalizuoti mokslinę literatūrą apie kapsuliavimo technologijas, kurias būtų galima pritaikyti
gaminant Pelargonium sidoides DC šaknų sausojo ekstrakto kapsules;
2. Parinkti geriausiai tinkamą kapsuliavimo technologiją aprašyti jos parametrus, reikalingus gaminant
kokybiškas Pelargonium sidoides DC šaknų sausojo ekstrakto kapsules.
3. Atlikti Pelargonium sidoides DC šaknų sausojo ekstrakto kapsulių kokybės ir stabilumo vertinimą. 4. Atlikti kiekybinę polifenolinių junginių analizę ir nustatyti ekstrakte esančias medžiagas.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Paprastoji pelargonija (Pelargonium sidoides DC)
1.1.1. Paprastoji pelargonija ir jos sudėtis
Pelargonium sidoides – tai žemas daugiametis augalas, priklausantis snaputinių (Geraniaceae) šeimos atstovams. Šis augalas yra kilęs iš Pietų Afrikos kraštų. Lapai užapvalintos – širdiškos
formos, kurie yra prisikabinę ant ilgų lapkočių. Lapo paviršius šiek tiek panašus į šilką. Augalas žydi ilgai – visą vasarą, žiedai yra maži, vamzdiškos formos, rausvos – kaštoninės, beveik juodos spalvos. Vaistinė žaliava – išdžiovintos šaknys su gumbais. [7]
1. Pav. Paprastoji pelargonija [27]
Į pelargonijos cheminę sudėtį įeina šešios pagrindinės junginių grupės: 1. Purino dariniai (2%) 2. Kumarinai (2%) 3. Peptidai (10%) 4. Angliavandeniai (12%) 5. Mineralai (12%) 6. Taninai (40%) [6]
1.1.2. Istorija
Pelargonium sidoides DC yra tradicinis Pietų afrikos augalas. Šį vaistinį augalą išgarsino
anglas Čarlis Henris Stivensas. Jis paklausęs savo gydytojo patarimo, atvyko į Pietų Afrikos kalnus gydytis nuo tuberkuliozės. Ten jis susipažino su vietinės Zulu genties gydytoju, kuris Stivensą gydė išvirtais pelargonijų šaknų preparatais. Praėjus trim mėnesiams, jis pradėjo jaustis geriau ir grįžęs į Didžiąją Britaniją įsteigė kompaniją, prekiaujančią vaistais nuo džiovos.
Po pirmojo pasaulnio karo, 1920 metais, Stivenso gydymo metodą pradėjo naudoti, Prancūzijos bei šveicarijos gydytojas A. Sechehaye. Per 9 metus, jis užregistravo 800 ligonių
pasveikusių nuo tuberkuliozės ir sėkmingai pristatė šį gydymo metodą medicinos draugijai Ženevoje. [6]
1.1.3. Antibakterinis aktyvumas
Tirtas Pelargonium sidoides DC ekstrakto antibakterinis aktyvumas prieš gram+
(staphylococcus aureus, streptococcus pneumoniae ir beta hemolizinį streptokoką) ir gram- bakterijas
(escherichia coli, klebsiella pneumoniae, proteus mirabilis, pseudomonas aeruginosa, haemophilus influenzae). Šie patogenai yra pgrindiniai veiksniai sukeliantys kvėpavimo takų ligas. Taip pat buvo
ištirtas Pelargonium sidoides DC šaknų ekstraktakto imunostimuliuojantis poveikis – suaktyvinami makrofagai, jie gamina azoto oksidą, kuris naikina bakterijas ir stabdo jų dauginimąsi.[6]
1.1.4. Antivirusinis aktyvumas
Remiantis atliktais tyrimais in vitro įrodyta, kad vandeninis Pelargonium sidoides DC šaknų ekstraktas pasižymi antivirusiniu poveikiu. Tyrimuose buvo naudoti herpes simplex 1 (HPS1) ir
herpes simplex 2 (HSP2) tipo virusai, kurie sukelia pasikartojančius burnos ar veido arba lytinių
organų pažeidimus. Nustatyta, kad ekstraktas slopina abiejų tipų virusų adheziją prie gleivinės sienelių.
Kitų tyrimų in vitro metu nustatyta, kad pelargonijų šaknų ekstrakto veikimas prieš gripo H1N1 virusą pasireiškia netiesiogiai. Veikiant virusui baltieji kraujo kūneliai neutrofilai aktyvuoja baktericidinius peptidus defensinus, kurie sunaikiną virusą. [7]
1.2. Kapsulių samprata
1.2.1. Kapsulės
Medicinoje kapsulės apibūdinamos kaip įvairios formos ir talpos preparatai, turintys kietą arba minkštą apvalkalą, kuriame dažniausiai būna vienos ar kelių veikliųjų medžiagų vienkartinė dozė. Šios kapsulės vartojamos per burną. [4]
Pirmąją želatininę kapsulę pagamino ir patentavo M. ir D. Blankai. 1834 metais. Tuo metu gamintos kapsulės buvo sudarytos iš vienos dalies ir nebuvo plastifikuotos, tikėtina ir tai, kad jos nebuvo klasifikuojamos pagal formą, turinį ar kitokias savybes. Tuo metu gamintos kapsulės per labai trumpą laiką išpopuliarėjo, nes maskavo nemalonų vaistinio preparato skonį. Šiandien kapsulės gali būti klasifikuojamos į kietas ir minkštas, priklausomai nuo kapsulės apvalkalo prigimties. Dauguma darbar gaminamų kapsulių yra pritaikytos vartoti per burną, tačiau kaikurios minkštosios želatinos kapsulės yra pritaikytos rektaliniam arba vaginaliniam naudojimui, panašiai kaip žvakutės.
Yra skiriamios šios kapsulių kategorijos: 1. Kietosios kapsulės
2. Minkštosios kapsulės
3. Modifikuoto atpalaidavimo kapsulės [9]
1.2.2. Kietosios kapsulės
Tuščios kapsulės sudarytos iš kūno (dugno) ir viršutinės dalies – kepurėlės, kuri yra mažesnė ir susijungia kapsulės kūnu. Žmonėms vartoti skirtos kapsulės yra aštuonių skirtingų dydžių, kurie pavaizduoti 1 paveiklėlyje. [34]
Kapsulės gali būti įvairios talpos. Tai pavaizduota 1 lentelėje.
1 lentelė. Kietųjų kapsulių dydžiai ir talpa [1]
Numeri Tūris ml
Eli Lilly Parke-Davis Scherer
000 1,24 1,37 1,35 00 0,92 0,95 0,95 0 0,67 0,68 0,70 1 0,48 0,50 0,50 2 0,37 0,37 0,40 3 0,27 0,30 0,30 4 0,20 0,21 0,21 5 0,13 0,13 0,13
Želatininės kapsulės gali būti permatomos arba įvairių spalvų. Vaistininkas gali naudoti skirtingomis spalvomis nudažytas kapsulių dalis, kad galėtų išskirti skirtingas vaistų formuluotes tam pačiam pacientui, arba siekiant, kad kapsulė atrodytų patraukliau. Prieš pildant permatomas kapsules, į miltelius galima įdėti dažiklių, kurie suteiktų kapsulei spalvą, ji atrodytų estetiškesnė ir ją būtų galima lengviau identifikuoti. [29]
Pagamintos kietosios kapsulės turi atitikti joms keliamus reikalavimus, t.y. turi būti sandariai uždarytos, vienodo dydžio, be pažeidimų ar įtrūkimų. Tinkamiausia kapsulių laikymo temperatūra yra 20oC, o santykinės drėgmės kiekis 50%. [2]
Kapsulės lengvai tirpsta vandenyje esant 37 oC. Esant žemesnei temperatūrai, kapsulių tirpumas
sumažėja. Esant žemesnei temperatūrai nei 30 oC, kapsulės tampa netirpiomis, sugeria vandenį ir
išbrinksta. Šios savybės yra svarbios atliekant tirpumo ir suirimo testus, todėl dauguma farmakopėjų yra nustačiusios 37±1 oC ribą atliekant šiuos testus.
Kietųjų kapsulių užpildų tipai:
Sausosios kietosios medžiagos – milteliai, granulės, tabletės; Pusiau kietosios medžiagos – suspensijos arba pastos; Skyščiai – nevandeniniai skyščiai. [10]
1.2.3. Kapsulių privalumai ir trūkumai
Kapsulių privalumai:
1. Kapsules paprasta vartoti, nes jų paviršius lygus, slidus, todėl jos lengvai nuryjamos. 2. Gaminti šią vaistų formą yra pigu.
3. Galima pasirinkti skirtingas kapsulių formas, spalvas, kad būtų lengviau jas atpažinti. 4. Gaminant kapsules yra paslepiamas nemalonus vaisto kvapas ir skonis.
5. Milteliai gali būti išduodami ir vartojami nesuspausta forma, taip pagerinamas vaisto tirpumas ir absorbcija.
6. Kapsulės yra universali vaisto forma, kuri gali padėti vaistininkui pagaminti įvairias vaistų formas norimomis dozėmis.
7. Kapsulės gali būti modifikuoto atpalaidavimo.
Kapsulių trūkumai
1. Kapsules lengva suklastoti (tačiau yra prevencinių metodų nuo kapsulių klastojimo). 2. Kapsulių kokybę gali paveikti netinkamas drėgmės kiekis.
3. Kaikuriem žmonėm jas sunkiau nuryti.
4. Kapsulių laikymui keliami specialūs reikalavimai. [30] [34]
1.2.4. Kapsulių užpildymas
Kietosios kapsulės gali būti užpildytos įvairiomis medžiagomis, turinčiomis skirtingas fizikines – chemines savybes, skirtingų agregatinių būsenų medžiagas, jei jos nereguoja tarpusavyje. Kapsulės gali būti užpildomos kietomis medžiagomis – milteliais, peletėmis, granulėmis, mikrokapsulėmis, tabletėmis. Pusiau kietomis medžiagomis – pastomis, kremais, mikstūromis ir skysčiais bei tarpusavio dariniais. [11]; [12]
Prieš pradedant pildyti kapsules, reikia išsiaiškinti ar kapsuliuojamos medžiagos nesureaguos su želatininiu kapsulės apvalkalu. Tokios savybės būdingos aldehidams, todėl reikėtų vengti pildyti kapsules šios grupės junginiais. Kapsulių apvalkalo vientisumui kenkia ir tos medžiagos turičios laisvo vandens, kuris suminkština kapsulę. [13]
Visoms kapsuliuojamosioms medžiagoms keliami du pagrindiniai reikalavimai: kiekvienoje kapsulėje turi būti tikslus vaistinės medžiagos dozavimas bei vaistinė medžiaga privalo išsiskirti per
tam tikrą nustatytą laiką. [2]
1.2.5. Pagalbinės medžiagos
Pasirenkant pagalbines medžiagas siekiama, kad jos tabletuojamai ar kapsuliuojamai masei suteiktų reikalingas technologines savybes, t.y. tabletuojama masė būtų geriau dozuojama ir presuojama, pagaminamos kokybiškos tabletės ar kapsulės. Vienoje kapsulėje sausojo ekstrakto kiekis yra nedidelis, todėl reikalingos pagalbinės medžiagos, kurios pagerintų kapsuliuojamų miltelių technologines savybes, suteiktų reikiamą masę ir būtų galima pagaminti kokybiškas kapsules. [3]
Dažnai pagalbinės medžiagos dedamos, kad būtų išlaikomas vaisto stabilumas, maksimali vaistinės medžiagos dozė būtų atpalaiduota ten, kur ir buvo tikimasi vaisto vartojimo metu. Kita dalis pagalbinių medžiagų yra naudojamos skaidyti vekliąsias medžiagas iki tokio smulkumo, kad joms būtų lengviau patekti į kraujotakos sistemą. Kai kurių medžiagų dedama tam, kad būtų galima identifikuoti vaistą, be to pagalbinės medžiagos padeda užmaskuoti nemalonų vaisto skonį ir kvapą.[14]
2 lentelė. Pagalbinių medžiagų grupės, naudojamos kapsulių gamyboje [14]
Medžiagų grupė Pagalbinė medžiaga Funkcija
Skiedikliai Mikrokristalinė celiuliozė,
Kalcio karbonatas, Laktozė,
Manitolis, Magnio oksidas, Magnio karbonatas
Padidina miltelių masės tūrį
Tepikliai Magnio stearatas, Stearino rūgštis,
Hidrintas ricinos aliejus, Natrio benzoatas, Natrio laurilsulfatas
Mažina miltelių prilipimą prie metalinių paviršių, mažina trintį tarp
slankiojančių paviršių, kurie liečiasi su milteliais Suirimą gerinančios medžiagos Krakmolas, Kukurūzų krakmolas, Natrio alginatas, Algino rūgštis, Karboksimetilceliuliozė
Pagerina miltelių suirimą, tirpumą
Slidinamosios medžiagos Aerosilas, Talkas
1.2.6. Kapsuliavimas
Kapsulių pildymo milteliais stadijos:
1. Veikliųjų ir pagalbinių medžigų kiekių skaičiavimai. 2. Miltelių masės paruošimas.
3. Miltelių masės savybių įvertinimas. 4. Kapsulių pildymas.
5. Kokybės kontrolė. 6. Fasavimas.
Kapsuliavimo mašinų kategorijos: 1. Rankinės kapsulių pildymo mašinėlės
2. Pusiau automatinės kapsulių pildymo mašinėlės 3. Automatinės kapsulių pildymo mašinėlės [31]
Naudojant rankines kapsulių pildymo mašinėles, per valadą galima pagaminti nuo 200 iki 2000 kapsulių. Į apatinę mašinėlės plokštelę, kuri turi reikiamo dydžio skylutes, sudedami tuščių kapsulių kūnai. Viršutinės kapsulių dalys (kepurėlės) sudedamos į laisvas viršutinės plokštelės skylutes. Kapsulių užpildymui paruošti milteliai išberiami ant apatinės plokštelės ir paskirstomi taip, kad visi kapsulių kūnai būtų vienodai užpildyti. Atlikus šią procedūrą, ant apatinės plokštelės su užpildytais kapsulių kūnais uždedama plokštelė su kapsulių viršutinėmis dalimis ir stipriai paspaudžiama žemyn, kad skirtingos kapsulių dalys užsidarytų. [15]; [16]
1.2.7. Milteliai
Milteliai – tai kieta, biri medžiaga, kuri gali būti dozuota arba nedozuota vaistų forma, o jų vartojimas gali būti išoriškas arba vidinis. Ši vaistų forma gaunama smulkinant ir maišant vieną ar kelias birias vaistines medžiagas. Paprasti milteliai yra sudaryti iš vienos vaistinės medžiagos, o sudėtiniai iš kelių ar daugiau vaistinių medžigų mišinio. Milteliai pagal dozavimą skirstomi į dozuotus arba neduozuotus. Gaminanat miltelius, jie yra smulkinami, maišomi, dozuojami ir pakuojami. [9]
1.3. Fenoliai
1.3.1. Fenoliniai junginiai
Fenoliniai junginiai – tai antriniai metabolitai, kurie gaunami šikimate/fenilpropanoidų metaboliniu keliu, arba acetato/malonato metaboliniu keliu. Acetato /malonato metaboliniu keliu gaunami netik fenonoliai, bet ir polifenoliai. Per visą augalo gyvavimo laiką, fenoliai bei polifenoliai atlieka svarbias fiziologines funkcijas. Aukštesniosios klasės augalai gamina net iki kelių tūkstančių fenolinių junginių, kurie yra gerai žinomi mokslininkams. Augalų savybė sintetinti fenolius, sparčiai vystėsi vykstant ilgalaikiam evoliucijos procesui, kaip priemonė skirta prisitaikyti prie nepastovių aplinkos sąlygų. Galima teigti, kad šių junginių pagrindinė funkcija yra apsaugoti augalus nuo nepalankių, nuolat kintančių aplinkos veiksnių. Mūsų planetoje yra dokumentuota per 300 000 aukšteniųjų augalų, kurie pagamina didelius kiekius skirtingų cheminių medžiagų. Nustatyta daugiau nei 200 000 tokių cheminių medžiagų, kurios yra suskirstytos į pirminius bei antrinius metabolitus. Piminiai metabolitai tai įvairūs cukrūs, nukleorūgštys, riebiosios rūgštys, amino rūgštys ir kitos medžiagos, kurios reikalingos augalo gyvavimui. Antriniai metabolitai chemine struktūra yra labai įvairūs, jie nėra labai reikšmingi tokiems procesams, pavyzdžiui, kaip, fotosintezė, tačiau jie padeda augalui prisitaikyti ir gyvuoti laukinėje aplinkoje. [17]; [18]; [19]
1.3.2. Fenolinių junginių klasifikacija
Fenoliniai junginiai, kurie savo savo struktūroje turi vieną arba keletą (polifenoliai) fenilo žiedą bei prie jo prisijungusią vieną ar daugiau hidroksi grupę. Remiantis struktūra, fenoliniai junginiai skirstomi į keletą gupių.
3 lentelė. Fenolio junginių klasifikacija
C6 Paprastieji fenoliai, benzochinonai
C6 - C1 Fenolinės rūgštys
C6 - C2 Acetofenonai, fenilacto rūgštys
C6 - C3 Hidroksicinamo rūgštys, kumarinai,
fenilpropanai, chromonai
C6 – C1 - C6 Ksantonai
C6 – C2 - C6 Stilbenai, antrachinonai
C6 – C3 – C6 Flavonoidai, izoflavonoidai, neoflavonoidai
(C6 – C3 – C6)2,3 Biflavonoidai, triflavonoidai
(C6 - C3)2 Lignanai, neolignanai
(C6 - C3)n Ligninai
(C6)n Katecholmelaninai
(C6 – C3 - C6)n Kondensuoti taninai
Augaluose fenoliniai junginiai atlieka apsauginę funkciją prieš nepalankius aplinkos veiksnius (biotinius ir abiotinius), tokius kaip stipri saulės šviesa, žema temperatūra, įvairios patogeninės infekcijos, žoleėdžiai, maistinių medžiagų trūkumas. Remiantis atliktais mokslinais tyrimais, augalai reaguodami į sukeltus stresinius faktorius, prisijungia laisvuosius radikalus. Vykstant antrinio metabolizmo aktyvinimui, atsako į stresą metu dalyvauja salicilo rūgštis ar jasmono rūgštis ir kiti šių medžiagų dariniai. [17] [20] [21]
1.3.3. Fenolinės rūgštys
Dažniausiai pasitaikančios ir geriausiai žinomos fenolinės rūgštys yra galo, p-hidroksibenzoinė, protokatechino rūgštis, vanilino bei siringo rūgštys. Fenolinės rūgštys dažniausiai randamos tirpiuose junginiuose, sudarytose jiems prisijungiant cukrus arba organines rūgštis, taip pat jos yra kaip komponentas tokiuose kompleksiniuose junginiuose kaip ligandai ir vandenyje tirpūs taninai. Hidroksibenzoinės rūgšties glikozidai aptinkami kai kuriuose žolėse ar prieskoniuose, augaluose taip pat randama ir fenolinių rūgščių aldehidų (salicilaldehidas, p-hidroksibenzaldehidas, p-anyžių aldehidas p-proktokatecholaldehidas). Vanilino aldehidas, dažniausiai siejamas su vanilės lazdelėmis, tačiau jis labai paplitęs ir kituose augaluose. [17]; [22]; [23]
1.3.4. Spektrofotometrija
Spektrofotometrinis metodas taikomas įvairios sudėties medžiagų analizei. Metodas yra pagrįstas flavonoidų savybe sugerti šviesą UV – spektro dalyje. Absorbcijos dydis matuojamas trumpabangėje ar ilgabangėje spektro dalyje, kurios būdingos daugeliui flavonoidų. Fenolinių junginių identifikavimas paremtas fenolinės grupės dalyvavimu oksidacijos – redukcijos reakcijoje, jei tos pačios reakcijos metu yra oksiduojama fenolinė grupė ir redukuojamas reagentas, tuomet yra galimas kiekybinis nustatymas. UV spektrofotometrija dažnai taikoma bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti. Nustatant bendrą fenolinių junginių kiekį dažniausiai yra naudojamas Folin-Ciocalteau reagentas ir reakcija su juo. Flavonoidų kiekio įvertinimas tiriamojoje žaliavoje spektrofotometriniu metodu nėra efektyvus ir ne visuomet tiksliai atspindi žaliavos cheminę sudėtį, todėl rečiau taikomas laboratorinėje praktikoje. [22] [21]
1.3.5. Plonasluoksnė chromatografija
Plonasluoksnė chromatografija naudojama organinių ir bioorganinių junginių atskyrimui, identifikavimui, jų valymui po ekstrakcijos iš vaistinių preparatų, biologinių skysčių bei kitų įvairių medžiagų. Plonasluoksnė chromatografija yra paprastas, patikimas, selektyvus, tikslus, lengvai atliekamas, pigus bei plačiai pritaikomas metodas fenolinių junginių nustatymui augalinėse žaliavose. Metodas naudojamas, kai: tiriamosios medžiagos yra neklampios arba labai mažai klampios; medžiagos stipriai polinės, vidutiniškai polinės, nepolinės arba joninės; didelis kiekis tiriamųjų junginių turi būti analizuojami greitai, turint mažas finansavimo galimybes ir ribotą laiko limitą; medžiagos, kurios negali būti aptinkamos skysčių ar dujų chromatografijos metodais. Plonasluoksnės chromatografijos privalumai, lyginant su dujų ir skysčių chromatografija yra tai, kad tyrimams atlikti nereikalinga brangi įranga, galima naudoti labai įvairias tirpiklių sistemas bei sorbentus, tiriama medžiaga lieka ant chromatografinės plokštelės, nesuskyla dėl temperatūros poveikio, nes kaitinimas chromatografavimo metu nėra atliekamas [22], [8].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo metodai
Norint įvertinti miltelių technologines savybes, buvo nustatytas laisvai beriamų miltelių kūgio kampas ir išbyrėjimo greitis, subiarmasis tankis. Vertinant pagamintų kietųjų želatinos kapsulių rodiklius, buvo nustatytas masės vienodumas ir kapsulių suirimo laikas. Taip pat buvo stebėtas kapsulių stabilumas vertinant užpildytų kapsulių masės vienodumą, suirimo laiką. Norint idintifikuoti fenolinius junginius tiriamajame pelargomijų ekstrakte, buvo taikomas plonasluoksnės chromatografijos metodas.
2.1.1. Tyrimo metu naudotos medžiagos
Visi naudoti reagentai, tirpikliai ir standartai buvo analitinio švarumo. Pelargonium sidoides DC šaknų sausasis ekstraktas;
Prosolv HD 90 (Vokietija); Magnio stearatas;
Kietosios 1 dydžio želatininės kapsulės „capsuline“, JAV; Folin-Ciocalteau reagentas (Steinheim, Vokietija);
Etilacetatas (> 99,9 %) gautas iš Sigma-Aldrich GmbH (Steinheim, Vokietija); Metanolis (> 99,9 %) gautas iš Sigma-Aldrich GmbH (Steinheim, Vokietija); Kalio hidroksidas ≥ 99 % gautas iš (Sigma-Aldrich GmbH (Steinheim, Vokietija);
Išgrynintas dejonizuotas vanduo (18,2 mΩ/cm), ruošta „Millipore“ vandens valymo Sistema (JAV); Analizėje naudotas standartas skopoletinas (97,11 %) gautas iš HWI ANALYTIK GMBH (Steinheim
Vokietija);
Analizėje naudotas standartas eskulinas (98 %) gautas iš HWI ANALYTIK GMBH (Steinheim Vokietija);
Chromatografinėje analizėje naudotos 10 cm aukščio ir 10 cm pločio HPTLC (silikagelis 60F254 ; Merck, Vokietija) stiklo plokštelės
2.1.2. Tyrimo metu naudota aparatūra
Aparatas birumui nustatyti „ERWEKA AG“, Vokietija; Elektroninės svarstyklės „AND“, Japonija;
Kapsulių užpildymo mašinėlė „Capsuline - 15“, JAV; Tankinimo prietaisas „Copley“, Didžioji Britanija;
Vaizdo ir dokumentavimo sistema skirta TLC/HPTLC hromatogramoms „CAMAG TLC
VISUALIZER 2“;
Spektrofotometras UV-VIS HaloDB-20, Vokietija; Elektrinis džiovintuvas (Philips, Vokietija);
Mechaninis purkštuvas;
Pusiau automatinis mėginių užnešėjas „Camag Linomat 5“, Vokietija
2.1.3. Miltelių mišinio birumo įvertinimas
Pasveriama 25,0 g miltelių mišinio 0,01 g tikslumu ir atsargiai, nepurtant, supilame į prietaiso piltuvėlį. Kartu su prietaisu įjungiamas chronometras. Praėjus 20 s purtymo nuo purtymo pradžios, atidaromas piltuvėlis. Tuomet stebime, per kiek laiko miltelių masė išbyra iš piltuvėlio į išdavimo indą. Siekiant gauti tikslesnius rezultatus, bandymas kartojamas 5 kartus. Birumas turi būti ne mažesnis kaip 4 – 5g/s.
Birumas apskaičiuojamas pagal formulę:
𝐵𝑐 = 𝑚 𝑡 − 20 𝐵𝑐 – birumas (g/sek.)
m – pasvertų miltelių mišinio masė t – bandymo laikas (sek.)
20 – purtymo laikas (sek.)
Bandymų duomenys apskaičiuojami naudojant formulę: 𝑉𝑐 =∑ 𝐵𝑐
𝑛 𝑣𝑐 – birumo vidurkis
n – 5 (bandymų skaičius) 𝐵𝑐 – birumas (g/sek.)
2.1.4. Laisvai išbyrėjusio miltelių mišinio kūgio kampas
Naudojant tą patį prietaisą, nustatomas laisvai išbyrėjusių miltelių kūgio kampas (kampas tarp išbyrėjusių miltelių kūgio ir horizontalaus paviršiaus).
4 lentelė. Miltelių birumo įvertinimas pagal kūgio kampą remiantis Eur.Ph.2.9.367
Birumas Kūgio kampas laipsniais
Puikus 25 – 30 Geras 31 – 35 Vidutinis 36 – 40 Priimtinas 41 – 45 Blogas 46 – 55 Labai blogas ≥ 56
Remiantis Eur.ph.01/2008:200916 straipsniu, kai išbyrėjusių miltelių kūgio kampas yra 25 – 30° tai reiškia, kad birumas yra geras, jei kūgio kampas siekia iki 60° - milteliai yra mažai birūs, jei miltelių kūgio kampas yra intervale tarp 60 – 70° - miltelių birumas yra nepakankamas.
2.1.5. Miltelių mišinio subiaremojo tankio nustatymas
Suberiamasis tankis (𝑇𝑠) – tai laisvai subertos medžiagos masė (M) ir tūrio (𝑉0) santykis, kuris
išreikštas g/ml. Pagal Ph.Eur.2.9.34 straipsnį, milteliųmišinių suberiamasis tankis matuojamas beriant tiksliai pasvertą miltelių kiekį į matavimo cilindrą.
Apskaičiuojama pagal formulę:
𝑇𝑠 = 𝑀 𝑉0
𝑇𝑠 – suberiamasis tankis (g/ml) M – Medžiagos masė (g) 𝑉0 – medžiagos tūris (ml)
2.1.6. Didžiausio miltelių mišinio suberiamojo tankio nustatymas
Remiantis Eur.Ph2.9.34 straipsniu, nustatytas didžiausias suberiamasis tankis (𝑇𝑚𝑎𝑥)
apibrėžiamas kaip medžiagos masė (M) ir medžiagos tūrio sutankinimo (𝑉𝑆) santykis, išreiškamas
g/ml. Didžiausiam miltelių mišinio suberiamajam tankiui apskaičiuoti naudotas tankinimo prietaisas Copley (Jungtinė Karalystė). Prietaisas susideda iš 250 ml graduoto matavimo cilindro, kuris yra
įtvirtintas ant prietaiso platformos.
Platformos pakilimo aukštis – 3 mm. Į matavimo cilindrą suberiamas tiksliai pasvertas miltelių mišinio kiekis. Tiriamų miltelių kiekis turi sudaryti du trečdalius cilindro tūrio. Parenkame prietaiso veikimo režimą, nustatome bandymo parametrus. Tankinimas vyksta cilindrui judant aukštyn ir žemyn. Miltelių mišinio tūris tikrinamas po 2500 sutankinimų. Tyrimas tęsiamas atliekant sutankinimus mažesniais intervalais iki 2500 sutankinimų, kol skirtumas tarp didžiausių suberiamųjų tankių bus mažesnis už 2%. Užrašomas galutinis miltelių masės tūris cilindre.
Miltelių mišinio didžiausias suberiamasis tankis apskaičiuojamas pagal formulę:
𝑇𝑚𝑎𝑥= 𝑀
𝑉𝑠
𝑇𝑚𝑎𝑥 – didžiausias medžiagos suberiamasis tankis (g/ml) M – medžiagos masė (g)
𝑉𝑠 – medžiagos tūris po sutankinimo (g/ml)
2.1.7. Miltelių mišinio Carr indekso ir Hausner koeficiento nustatymas
Carr indeksas (Carr index), dar vadinamas suspaudžiamumo indeksu ir Housner koeficientas – tai rodikliai naudojami miltelių mišinio birumui apibūdinti. Atlikus suberiamojo tankio matavimus po 2500 sutankinimų apskaičiuojami Carr indeksas ir Hausner koeficientas. Jie apskaičiuojami pagal formules:
𝐶𝐼 = (𝑇𝑚𝑎𝑥 − 𝑇𝑠)𝑥100
𝑇𝑚𝑎𝑥 %
CI – Carr indeksas
𝑇𝑠 – medžiagos suberiamasis tankis (g/𝑐𝑚3)
𝐻𝑅 = 𝑇𝑚𝑎𝑥 𝑇𝑠 HR – Hausner koeficientas
𝑇𝑠 – medžiagos suberiamasis tankis (g/𝑐𝑚3)
𝑇𝑚𝑎𝑥 – medžiagos didžiausias suberiamasi tankis (g/𝑐𝑚3)
Vertinimas: mažesnis Carr indeksas parodo geresnes miltelių mišinio birumo savybes. Kai miltelių Carr indeksas siekia iki 20, turi vidutinio birumo savybes, 11 – 15 birumas geras, jei rodiklis
yra iki 10 – miltelių birumas yra puikus.
Hausner koeficiento reikšmės: 1,17 – 1,25 birumas vidutinis, 1,12 – 1,18 birumas geras, 1,00 – 1,11 birumas puikus.
5 lentelė. Miltelių birumo vertinimas pagal Carr indeksą ir Hausner koeficientą
Carr indeksas (%) Birumas Hausner koeficientas
<10 Puikus 1.00 – 1.11 11 – 15 Geras 1.12 – 1.18 16 – 20 Vidutinis 1.19 – 1.25 21 – 25 Priimtinas 1.26 – 1.34 26 – 31 Prastas 1.35 – 1.45 32 – 37 Labai prastas 1.46 – 1.59
>38 Labai, labai prastas >1.60
2.1.8. Medžiagų kiekio skaičiavimas
Skaičiuojant medžiagų kiekį, kuris bus patalpintas į kapsules atliekami šie etapai: 1. Pasirenkamos reikiamo dydžio kapsulės.
2. Apskaičiuojama visų miltelių masė dauginant vieno miltelio masę iš reikiamo dozių skaičiaus: 𝑴𝒎 = 𝑴 ∗ 𝑫 g
𝑀𝑚 – miltelių mišinio masė (g) M – vieno miltelio masė (g) D – reikiamas dozių skaičius
3. Atleikamas medžiagų svėrimas. Jos dedamos į grūstuvėlę ir yra disperguojamos bei maišomos 2 – 3 min. remiantis miltelių maišymo taisyklėmis. Pagamintas miltelių mišinys suberiams į graduotą
matavimo cilindrą, kuriame nustatomas tūris mililitrais. Taikant formulę apskaičiuojamas miltelių mišinio tankis:
𝑻𝑴=𝑴𝒎 𝑽𝑴 g/ml
𝑇𝑀 – miltelių mišinio tankis (g/ml) 𝑀𝒎 – miltelių mišinio masė (g)
𝑉𝑀 – miltelių mišinio tūris (g/ml)
4. Kapsulėje telpa tam tikras kiekis miltelių mišinio, kuris priklauso nuo tankio. Nustačius miltelių mišinio tankį, apskaičiuojamas vieno miltelio tūris:
𝑉 = 𝑀
𝑇𝑀 ml
V – miltelio tūris (ml) M – miltelio masė (g)
𝑇𝑀 – miltelių mišinio tankis (g/ml)
5. Atsižvelgiant į miltelio tūrį, yra pasirenkamas reikiamas kapsulės dydis. Kapsulės tūrio skaitinė vertė privalo būti panaši, bet nemažesnė miltelio tūriui. Jei miltelio tūris lygus kapsulės tūriui, tuomet nereikia atlikinėti tolimesnio skaičiavimo, o miltelių mišinys gali būti kapsuliuojamas į pasirinkto dydžio kapsules. Jei miltelių tūris yra mažesnis už kapsulės tūrį, papildomai reikia pridėti pagalbinių medžiagų, kad kapsulė pilnai užsipildytų.
6. Papildomas pagalbinės medžiagos kiekis, kuris reikalingas užpildyti reikalingą kiekį kapsulių apskaičiuojams kai yra žinomi miltelių ir kapsulių tūriai. Pritaikome formulę:
𝑉𝑝 = (𝑉𝐾− 𝑉) ∗ 𝐷 ml
𝑉𝑝 – papildomas pagalbinės medžiagos tūris (ml) 𝑉𝐾 – vienos kapsulės tūris (ml)
V − vieno miltelio tūris (ml) D – dozių skaičius
7. Miltelių mišinio tūrį sudaro pradinio miltelių mišinio ir papildomos pagalbinės medžiagos tūrių suma: 𝑉𝐾 = 𝑉𝑀 + 𝑉𝑝 ml
𝑉𝐾 – kapsuliavimui reikalingas miltelių mišinio tūris (ml) 𝑉𝑀 – miltelių mišinio tūris (ml)
𝑉𝑝 – papildomas pagalbinės medžiagos tūris (ml)
2.1.9. Kietųjų kapsulių užpildymas
Kapsulės užpildomos naudojant rankinę kapsulių užpildymo mašinėlę: ”Capsuline- 15”. Tuščios kapsulės atsargiai atidaromos ir korpusai statomi į apatinę mašinėlės plokštelę, atvirais galai į viršų. Tuomet ant plokštelės išberiama kapsuliavimui paruošta miltelių masė, kuri tolygiai paskirstoma, kad kapsulės būtų užpildytos. Kitas etapas – kapsulių uždarymas. Kepurėlės atvirais galais žemyn yra sudedamos ant kitos plokštelės, kuri montuojasi mašinėlės viršutinėje dalyje. Paspaudus viršutinę plokštelę žemyn, kapsulės uždaromos.
2.1.10. Užpildytų kapsulių masės vienodumo nustatymas
Atliekant šį tyrimą buvo taikomas vienadozių preparatų masės vienodumo testas, kuris aprašytas Eur. Ph01/2008:20905 straipsnyje. Analizė atliekama visos serijos kapsulėm. Nepažeista kapsulė sveriama 0,001 tikslumu. Pagaminta kapsulė atidaroma, jos turinys išberiamas ir sveriamas kapsulės apvalkalas. Turinio masė yra užpildytos, nepažeistos kapsulės masės bei tuščios kapsulės apvalkalo masių skirtumas: Kapsulės turinio masė = užpildytos kapsulės masė – tuščios kapsulės masė. Svėrimai atliekami visoms kapsulėms ir apskaičiuojama vidutinė vienos kapsulės masė.
6 lentelė. Leistinas svėrinių masės nuokrypis
Vaisto forma Vidutinė masė (mg) Leistinas nuokrypis (%) (mažiausiai 18 kapsuliū)
Leistinas nuokrypis (%) (daugiausia 2 kapsulėms)
Kapsulė <300 10 20
>300 7,5 15
Pagal Eur.Ph.2.9.6 straipsnį, kai vidutinė kapsulės masė yra mažesnė už 300 mg, leistinas nuokrypis yra 10 %, iš kurių nedaugiau kaip dviem kapsulėm iš dvidešimties galimas 20 % leistinas nuokrypis. Kai vidutinė kapsulės masė didesnė arba lygi 300 mg, galimas nuokrypis 7,5 %, daugiausiai dviem kapsulėm iš dvidešimties leistinas nuokrypis gali būti dvigubai didesnis – 15 %. Jei vidutinė
kapsulės masė lygi arba mažesnė už 40 mg, reikia atlikti ir vienadozių preparatų turinio vienodumo nustatymą.
2.1.11. Pagalbinių medžiagų pasirinkimas
Norint pagaminti tinkamą masę kapsuliavimui, reikia pasirinkti pagalbines medžiagas, kurios pagerintų birumą ir suteiktų kapsuliuojamam mišiniui reikiamas technologines savybes, užtikrintų kokybišką kapsulių užpildymą. Gaminant kapsuliuojamąją masę buvo naudotos pagalbinės medžiagos: Prosolv HD 90, kurį sudaro mikrokristalinė celiuliozė (Ph.Eur. 1997:0316) ir bevandenis koloidinis silicio dioksidas (Ph. Eur. 1997:0738). Ši medžiaga naudojama kaip skiediklis, kuris padidina kapsuliuojamos medžiagos masę, kaip tepiklis – gerina miltelių birumą, mažina miltelių prikibimą prie paviršių. Dar Prosolv HD 90 naudojamas kaip slidiklis, kuris pagerina miltelių birumo savybes. Papildomai kaip tepiklis naudotas magnio stearatas (Ph.Eur.2011:0229), kuris taip pat sumažinina kapsuliuojamojo mišinio prikibimą prie paviršių.
2.1.12. Tiriamojo mėginio paruošimas
Fenolinių rūgščių ekstrakcija iš Pelargonium sidodes DC. sausojo ekstrakto atlikta remiantis Žvikas ir kt. mokslinėje literatūroje pateikta metodika. Tiriamojo mėginio sveriama 0,1 g sausojo ekstrakto, užpilama 10ml 60 porc. etanoliu, ir laikoma 15min ultragarso vonelėje, esant 45 oC
temperatūrai. Vėliau centrifūguojamas 10 min. Gautas ekstraktas supilamas į 20 ml kolbutę ir ta pati procedūra atliekama dar du kartus užpilant po 5 ml ekstrahento. Gautas ekstraktas skiedžiamas iki tikslaus tūrio ekstrahentu, filtruojama naudojant membraninius filtrus, gautas ekstraktas naudojamas plonasluoksnės chromatografijos tyrimams atlikti.
(Imta iš Algirdas Dirgincius)
2.1.13. Bendro fenolinių junginių nustatymas spekrofotometriniu metodu
Bendrasis fenolinių junginių kiekis nustatomas naudojant Folin-Ciocalteu reagentą. 0,2ml ekstrakto praskiedžiama 5 ml 96% (v/v) etanoliu ir gerai išmaišoma. Praskiestas ekstraktas veikiamas 5ml 10% Folin-ciocalteu reagentu ir 4ml 5% natrio karbonato tirpalais. Kad nusistovėtų reakcijos
pusiausvyra, gautas mišinys paliekamas stovėti tamsioje vietoje 60 min. Po to išmatuojama absorbcija spekrofotometru (765 nm bangos ilgyje) ir lyginama su tuščiu mėginiu, kuris paruoštas taip pat kaip tiriamasis, tik vietoj 0,2 ml ekstrakto naudojamas 96% (v/v) etanolis. Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu (mg/g) pagal kalibracijos kreivę.
𝑦 = 0.13𝑥 + 0.0176 𝑅2 = 0.9998
Galo rūgšties koncentracijų intervalas yra 0,016-1,00 mg/ml
2.1.14. Standartinių tirpalų ruošimas ir kalibracinių kreivių sudarymas
Tyrimams buvo naudoti chlorogeno rūgšties, skopoletino ir eskulino tirpalai. Standartiniai tirpalai buvo ruošiami 70 proc. etanolyje, iš chromatografinio švarumo standartinių medžiagų. Atsveriama 1mg skopoletino ir 2mg eskulino, jie tirpinami etanolio ir vandens mišinyje, 10 ml kolbutėje. Šie tirpalai naudoti kokybinei plonasluoksnei analizei atlikti.
2.1.15. Sausojo pelargonijų šaknų įvertinimas efektyviosios plonasluoksnės
chromatografijos metodu
Pagaminti etaloniniai skopoletino ir eskulino tirpalai ir tiriamasis sausojo pelargonijos šaknų ekstrakto tirpalai užnešti ant silikageliu dengtos chromatografinės plokštelės (10x10 cm HPTLC silikagelis 60F254 ; Merck, Vokietija) stiklo plokštelės, naudojant pusiau automatinį mėginių užnešėją
Camag Linomat 5 (užnešama brūkšnio pavidalo dėmė) su 100 µl tūrio mikrošvirkštu. Paruošta
plokštelė perkeliama į chromatografavimo kamerą, kuri užpildoma eliuantų sistemos mišiniu, sudarytu iš vandens, metanolio ir etilacetato (10:14:76V/V/V). Į chroamtografavimo kamerą kartu įdėtas ir filtratinio popieriaus, siekiant užtikrinti tolygų garų pasiskirstymą joje. Tirpikliui pakilus 7cm nuo mėginių užnešimo linijos (2,5cm nuo plokštelės apačios), plokštelė išimama iš kameros ir džiovinama elektriniu džiovintuvu. Išdžiovinta plokštelė, mechaninio purštuvu apipurškiama alkoholiniu kalio hidroksido tirpalu. Plokštelė išdžiovinama ir pernešama į Camag vizualizacijos sistemą ir apšvitinamos 366 nm bangos ilgio UV šviesa, apšvitinta plokštelė fotografuojama. WinCats programinės įrangos pagalba nustatomos Rf reikšmės. Kiekybiniam biologiškai aktyvių junginių nustatymui naudotas
2.1.16. Duomenų statistinis įvertinimas
Tyrimų duomenys apdoroti pasitelkus Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, JAV), Camag
WinCats programiniais paketais. Visi bandymai kartoti po tris kartus, o rezultatai pateikti kaip vidutinė
3. REZULTATAI
3.1. Miltelių masė
7 lentelė. Miltelių masių sudėtys Miltelių serijos
numeris
Ekstrakto kiekis (g) Prosolv HD kiekis (g)
Magnio stearato kiekis (g)
AA1 10 14,75 0,25
BB1 15 9,75 0,25
CC1 20 4,75 0,25
Tyrimui buvo gaminamos trys serijos skirtingos sudietės miltelių masės. Kiekvienoje serijoje skyrėsi sausojo ekstrakto ir Prosolv HD 90 kiekiai. AA1 serijoje sausojo ekstrakto įdėta 10 g, Prosolv HD - 90 14,75 g. BB1 serijoje - sausojo ekstrakto įdėta 15 g, Prosolv HD 90 - 9,75 g. CC1 serijoje – 20 g sausojo ekstrakto, Prosolv HD 90 4,75 g, o magnio stearato visose serijose buvo dėta tiek pat – 0,25g.
3.2. Miltelių technologinės savybės, suberiamasis tankis
Suberiamasis tankis yra priklausomas nuo miltelių dalelių dydžio, jų formos, dalelių tankio ir drėgmės kiekio. Pasveriama 5,0 g tiriamųjų miltelių 0,001 g tikslumu ir beriama į prietaiso matavimo cilindrą. Nustatomas purtymo intervalas 150 – 200 svyravimų per minutę, įjungiamas prietaisas ir stebimas miltelių kitimas cilindre. Kai miltelių kiekis cilindre nebekinta, prietaisas išjungiamas. Purtymo laikas trunka 5 – 10 min. Norint gauti tikslesnius duomenis bandymas kartojamas 5 kartus. Rezultatai pateikti 8 lentelėje.
8 lentelė. Miltelių suberiamasis ir didžiausias suberiamasis tankis
Miltelių serija Miltelių suberiamasis tankis (g/𝒄𝒎𝟑) Didžiausias miltelių
suberiamasis tankis (g/𝒄𝒎𝟑)
AA1 0,787 ± 0,33 0,857 ± 0,69
BB1 0,717 ± 0,09 0,761 ± 0,20
CC1 0,899 ± 0,13 0,924 ± 0,31
Mažesnės šių rodiklių reikšmės parodo geresnes miltelių birumo savybes. AA1, CC1, serijoje, milteliai gerai birūs, BB1 – puikiai birumas. Remiantis gautais tyrimo rezultatais, tinkamiausias suberiamasis tankis BB1 kapsulių serijoje.
3.3. Carr indeksas ir Hausner koeficientas
Mažesnės Carr indekso reikšmės parodo geresnes miltelių birumo savybes. Rezultatai pateikiami 3 paveikslėlyje.
3 pav. Carr indekso vertinimas
CC1 miltelių mišinio birumas geriausias, nes Carr indekso reikšmė – 2,705. AA1 serijos miltelių Carr indekso reikšmė 8,168, BB1 – 5.781. Atsižvelgiant į gautas Carr indekso reikšmes, visų serijų milteliai yra puikiai birūs, nes neviršija 10 procentų.
Miltelių vertinimas pagal Hausner koeficientą pateiktas paveikslėlyje.
4 pav. Hausner koeficiento vertinim
8,168 5,781 2,705 0 2 4 6 8 10 12 AA1 BB1 CC1 Carr in d eksas % Miltelių serijos
Carr indeksas
1,088 1,061 1,027 0,96 0,98 1 1,02 1,04 1,06 1,08 1,1 1,12 AA1 BB1 CC1 H au sn er ko ef ici en ta s Miltelių serijosHausner koeficientas
Pagal Hausner koeficiento reikšmes visi miltelių mišiniai puikiai birūs, nes visos koeficiento reikšmės mažesnės už 1,11.
3.4. Miltelių birumas
Birumas nustatomas pasvėrus 30 g miltelių iš kiekvienos kapsulių serijos 0,01 g tikslumu ir atsargiai suberiama į prietaiso piltuvėlį. Prietaisas ir chronometras jungiami vienu metu. Praėjus 20 s nuo purtymo pradžios atidaroma piltuvėlio užsklanda. Stebima per kiek laiko miltelių masė išbyra iš piltuvėlio į surinkimo indą. Norint gauti tikslius duomenis bandymas kartojamas 5 kartus. Tyrimas buvo atliekamas naudojant „Erveka“ gamintojo vibracinį prietaisą. Rezultatai pateikti 9 lentelėje.
9 lentelė. Miltelių mišinių birumo tyrimas
Miltelių mišinio serija Laikas (s) Kampas () Birumas (g/s) AA1 6,38 24,75 3,90 BB1 6,45 24,30 4,00 CC1 7,40 25,20 3,37
Tyrimas kartotas 3 kartus (n=3)
Atlikus eksperimentą, nustatyta, kad BB1 serijos miltelių birumas yra geriausias, 4,0g/s. Laisvai išbyrėjusių miltelių kam taip pat geriausias BB1 serijoje.
4.Pav. Birumo vertinimas
3,… 4,00 3,37 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 AA1 BB1 CC1 Birumas (g/ s) Miltelių serijos
Birumas
Atlikus tyrimą nustatyta, kad AA1 serijos miltelių birumas 3,90g/s (blogas), BB1 – 4,00g/s (geras), CC1 – 3,37 (blogas).
3.5. Kapsulių užpildymas miltelių mišiniais
Naudojant sudarytą medžiagų kiekio skaičiavimo metodiką, paskaičiuoti pagalbinių medžiagų kiekiai ir pagaminti skirtingų sudėčių miltelių mišiniai A, B ir C. Parinktas 1 kapsulės numeris ir kapsuliavimo mašinėlė „Capsuline – 15“.
5.Pav. Kapsulės užpildytos sausuoju pelargonijų šaknų ekstraktu
3.6. Kapsulių vienodumo nustatymas
Nustatinėjant kapsulių vienodumą, iš kiekvienos serijos atsitiktinai buvo pasirinkta 10 kapsulių. Tuščios kapsulės masė 0,048 g. Nepažeista kapsulė pasveriama 0,001 g tikslumu. Kapsulė atidaroma, išberiamas jos turinys ir sveriamsa jos apvalkalas. Turinio masė tai nepažeistos kapsulės masės ir tuščios kapsulės apvalkalo masės skirtumas: turinio masė – kapsulės apvalkalo masė. Apskaičiuojama vidutinė vienos kapsulės masė. Europos farmakopėjoje kiektoms kapsulėms yra taikomi reikalavimai: kai kapsulės vidutinė masė didesnė arba lygi 300 mg, leistinas masės nuokrypis yra 7,5 procentų, daugiausiai dviem kapsulėms iš dvidešimties leistinas nuokrypis gali būti 15 procentų.
10 lentelė. Kapsulių vienodumo nustatymas AA1 serijoje.
Serija AA1 Kapsulės numeris
Vienos kapsulės masės vidurkis su turiniu (g) 1 0,410±0,001 2 0,420±0,002 3 0,410±0,001 4 0,412±0,001 5 0,409±0,002 6 0,410±0,001 7 0,415±0,001 8 0,411±0,002 9 0,410±0,002 10 0,409±0,001 n=3
AA1 serijos kapsulės atitinka Europos farmakopėjos reikalavimus, taikomus kapsulių masės vienodumui.
Tiriant BB1 kapsulių masės vienodumą, gauti rezultatai pateikti 11 lentelėje.
11 lentelė. Kapsulių masės vienodumo nustatymas BB1 serijoje
Serija BB1 Kapsulės numeris
Vienos kapsulės masės vidurkis su turiniu (g) 1 0,410±0,001 2 0,409±0,001 3 0,401±0,002 4 0,417±0,001 5 0,39±0,002 6 0,410±0,001 7 0,408±0,001 8 0,410±0,001 9 0,407±0,002 10 0,411±0,002 n=3
BB1 serijos kapsulės atitinka Europos farmakopėjos reikalavimus, taikomus kapsulių masės vienodumui.
Tiriant CC1 kapsulių masės vienodumą, gaut rezultatai pateikti lentelėje.
12 lentelė. Kapsulių masės vienodumo nustatymas CC1 serijoje
Serija CC1 Kapsulės numeris
Vienos kapsulės masės vidurkis su turiniu (g) 1 0,403±0,002 2 0,410±0,001 3 0,405±0,002 4 0,417±0,001 5 0,420±0,001 6 0,420±0,001 7 0,415±0,002 8 0,412±0,002 9 0,410±0,001 10 0,420±0,002 n=3
CC1 serijos kapsulės atitinka Europos farmakopėjos reikalavimus, taikomus kapsulių masės vienodumui.
3.7. Stabilumo tyrimai
Kapsulių pavyzdžiai stabilumo tyrimo laiką buvo laikomi termo spintoje, tamsioje vietoje, 25° ± 2° C, esant 60 ± 5 procentų santykinei drėgmei. Suirimo testas buvo atliekamas 3 kartus, iš kiekvienos serijos imant po 6 kapsules: tyrimo pradţioje, po 6 mėnesių ir po 12 mėnesių. Kapsulių suirimo laiko rezultatai ir savybių duomenys pateikti 13 lentelėje.
13 lentelė. Stabilumo tyrimų duomenys
Serija Pagaminus kapsules laikas, min. Po 6 mėn. laikas, min. Po 12 mėn. laikas, min. Savybės (šviesiai rusva spalva) AA1 29 27 28 Atitinka BB1 30 29 26 Atitinka CC1 28 25 27 Atitinka
Vidutinis kapsulių suirimo laikas pateiktas 6 paveikslėlyje.
6. Pav. Suirimo testo verinimas
Greičiausiai suiro CC1 serijos kapsulės, per 26,6 min. Ilgiausias suirimo laikas buvo BB1 serijoje -28,3min. Gauti tyrimo rezultatai atitinka Europos farmakopėjos reikalavimus (kapsulė turi suirti per 30min).
3.8. Pelargonium sidoides dc šaknų sausojo ekstrakto ir pagamintų kapsulių
tapatybės įvertinimas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos
metodu
Išanalizavus mokslinę literatūrą, pasirinkta Europos farmakopėjoje rasta metodika, pagal kurią buvo atlikama kokybinė analizė skirta skopoletinui ir eskulinui identifikuoti, taikant plonasluoksnės chromatografijos metodą. (Eur.Ph. 01/2008:2264).
Tyrimams buvo naudotos dvi standartinės medžiagos (skopoletinas ir eskulinas), kurie pasak mokslinių literatūros šaltinių yra identifikuojami pelargonijų veislių augalinėse žaliavose. Pagaminti tirpalai užnešami ant chromatografinių plokštelių po 2 µl, pusiau automatiniu mėginių užnešėju Camag Linomat 5. Chromatografinė plokštelė pernešama į chromatografinę kamerą, į kuria buvo iš anksto supilta eliuentų sistema, sudaryta iš vandens, metanolio ir etilacetato. Tirpikliui pakilus 7 cm nuo mėginių užnešimo linijos (2,5 cm), plokštelė ištraukiama ir džiovinama elektrinio džiovintuvo pagalba. Išdžiovinta plokštelė ryškinama mechaniniu purkštuvu užpurškiant kalio hidroksido tirpalą metanolyje (10 g/l). Plokštelė nudžiovinama traukos spintoje ir pernešama į Camag vizualizacijos sistemą, apšvitinama 365 nm bangos ilgio UV šviesa ir nufotografuojama. Atlikus kokybinę analizę iš
28,00 28,33 26,66 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 AA1 BB1 CC1 Vid u tin is suirim o laik as, m in . Miltelių serijos
Vidutinis suirimo laikas
tirtų standartinių junginių, identifikuojamas skopoletinas ir eskulinas. Skopoletino ir eskulino standartų Rf reikšmė sulygintos su ekstrakto Rf reikšmėmis. Tyrimai buvo kartoti tris kartus, skopoletino Rf (0.89±0.02), eskulino Rf(0,52±0.02). Gauti rezultatai pateikti 6,7 paveikslėluose.
6 Pav. Pelargonijų šaknų sauso ekstrakto chromatograma: a – skopoletinas, b – eskulinas, c – sausasis pelargonijų šaknų ekstraktas.
7 Pav. Kapsulių su pelargonijų šaknų sausuoju ekstraktu chromatograma: a – ekstraktas, b – skopoletinas, c – eskulinas.
Apibendrinus kokybinius analitinių tyrimų rezultatus, gautus EPC metodu, buvo nustatyta, kad sausajame pelargonijų ekstrakte yra polifenolinių junginių skopoletino ir eskulino.
3.9. Pelargonium sidoides dc šaknų sausojo ekstrakto ir pagamintų kapsulių
bendro polifenolinių junginių įvertinimas spektrofotometriniu Folin -
Ciocalteu metodu
Tyrimo metu nustatytas bendras polifenolinių junginių kiekis sausajame pelargonijų šaknų ekstrakte, bei pagamintose kapsulėse kurių sudėtyje yra sausojo pelargonijų šaknų ekstrakto. Tyrimui pasirinktas spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu metodas, kuris yra plačiai naudojamas, paprastas ir nereikalauja sudėtingos aparatūros. Kiekybiniai rezultatai išreikšti galo rūkšties ekvivalentu (mg/g). Atlikus tyrimus nustatyta, kad pelargojinų analizuotame šaknų ekstrakte bendras polifenolinių junginių kiekis sudarė 15,0±0,02 (GRE mg/g). Po šaknų ekstrakto tyrimų, buvo įvertintas bendras polifenolinių junginių kiekis pagamintoje kapsulėje, kuris atitiko 50,0±0,05 (GRE mg/g). Remiantis Europos farmakopėja
polifenolinių junginių kiekis turi būti nemažesnis kaip 12.5% kapsulės masėje, o pelargonijų šaknų ekstrakte nemažesnis kaip 14,5%. Atliktų tyrimų metu nustatyta, kad pagamintose kapsulėse esantis sausasis pelargonijų šaknų ekstraktas ir pelargonijų šaknų estraktas atitinka Europos farmakopėjos gaires.
IŠVADOS
1. Atlikus eksperimentinius tyrimus nustatyta, kad skirtingi pagalbinių medžiagų kiekiai, turi įtakos
pagamintų kapsulių kokybei.
2. Pagamintos trys kapsulių serijos su sausuoju pelargonijų šaknų ekstraktu. Pagalbinėmis medžiagomis
pasirinkta Prosolv HD ir magnio stearatas.
3. Nustatyti pagalbinių medžiagų kiekiai, reikalingi kokybiškom kapsulėm pagaminti.
4. Nustatyta, kad kokybiškiausiai pagamintos kapsulės, kuriuose ekstrakto kiekis buvo iki 15%. 5. Sausajame pelargonijų šaknų ekstrakte ir pagamintose kapsulėse nustatyti skopoletinas ir eskulinas. 6. Naudojant spektrofotometrinį Folin-Ciocalteu metodą nustatyta, kad ekstrakte bendras polifenolinių
junginių kiekis yra nemažesnis kaip 14,5%. Kapsulių gamybai naudojamame ekstrakte nustatyta, kad polifenolinių junginių kiekis yra nemažesnis kaip 12.5%.
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Atliktų tyrimų rezultatais, rekomenduojama želatinines kapsules su sausuoju pelargonijų šaknų ekstraktu užpildyti pagalbinėmis medžiagomis Prosolv Hd ir magnio stearatu. Rekomenduojamas sausojo ekstrakto kieki – 15%.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. A.Savickas, I. Švambaris I., Gendrolis A., Bernatonis D., Aleknavičienė B., Briedis V., Buragienė I., Štakėnaitė S. Vaistų technologija (2 tomas). Kaunas 1996
2. A. Savickas, G. Drakšienė, V. Briedis, S. Velžienė, R. Klimas – Pramoninės vaistų technologijos praktikos darbai 2012
3. Velžienė S. Tinktūros Neuroventralis 1, skystojo ekstrakto Ventralis technologijos ir jų vertinimas. Daktaro disertacija. Kaunas 2005.
4. Kazlauskienė D., Vainauskas P., Rakauskaitė D. Vaistų mišinio komponentų identifikavimas plonasluoksnės chromatografijos metodu ūminių apsinuodijimų atvejais. Medicina. 2003; 39(2): 132- 136.
5. Profile Monograph: Pelargonium sidoides Pelargonium sidoides root.
6. Assessment report on Pelargonium sidoides DC and/or Pelargonium reniforme Curt., radix
7. Investigation of the influence of EPs® 7630, a herbal drug preparation from Pelargonium sidoides, on replication of a broad panel of respiratory viruses Martin Michaelis, Hans Wilhelm Doerr, Jindrich Cinatl Jr
8. Revision of monograph on capsules. Final text for addition to the international pharmacopoeia. Document QAS/09.339. World health organization. 2011.
9. Pharmaceutical practice 5th edition. Editors: Ian Smith, Jannie Watson.2014
10. Dr. Bhawna Bhatt Delhi Institute of Pharmaceutical Science and Research Sector – 3, Pushp Vihar New Delhi. P.289
11. Podczeck F, Jones B E. Pharmaceutical capsules. 2nd ed. USA: Pharmaceutical press, 2007.
12. Cole G C. The design and operation of a facility for filling hard shell gelatin capsules.Capsugel library [online]. 1999. Avaible from Internet: <http://capsugel.com/media/library/the-design-and-operation-of-a-facility-for-filling-hard-shell-gelatin-capsules.pdf>.
13. Stegemann S., Bornem C. Hard gelatin capsules today and tomorrow. Prieiga per internetą: <http://www.capsugel.com/media/library/hard-gelatin-capsules-today-and-tomorrow.pdf>
14. Rutesh H., Dave, PhD. Overview of pharmaceutical excipients used in tablets and capsules.
15. Augsburger LL. Hard and soft shell capsules. In: Banker GS, Rhodes CT, editors. Modern Pharmaceutics. New York: Marcel Dekker Inc.; 2002. p. 338 – 374.
16. Allen HV, Ansel HC. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2014. p. 241–249.
17. Lattanzio V. Phenolic compounds: Introduction. Natural products. Springer – Verlag Berlin Heideberg;2013. p. 1543 – 73.
18. Fiehn O. Metabolomics – the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology 2002; 48: 155-71
19. Wu S, Chappell J. Metabolic engineering of natural products in plants; tools of the trade and challenges for the future. Current Opinion in Biotechnology 2008; 19: 145-52
20. Winkel-Shirley B. Biosynthesis of flavonoids and effects of stress. Current Opinion in Plant Biology 2002; 5: 218-23
21. Gould KS, Lister C. Falvonoid functions in plants. In: Flavonoids – chemistry, biochemistry and applications. Boca Raton: CRC Taylor & Francis; 2006. p. 397-411.
22. Van Sumere CF. Phenols and phenolic acids. In: Harborne JB (ed) Methods in plant biocheistry, vol 1. Plant phenolics. Academic, London 1989. p. 29-73.
23. Tomas-Barberan FA, Clifford MN. Dietary hydroxybenzoic acid derivatives – nature, occurrence and dietary burden. Journal if the Science of Food and Agriculture 2000; 80: 1024-32.
24. Dave R H. Overview of pharmaceutical excipients used in tablets and capsules. Drug topics;
25. Leturia M. et al. Characterization of flow properties of cohesive powders: A comparative study of traditional and new testing methods. Powder Technology.
26. Bloor S. J. Overview of methods for analysis and identification of flavonoids.Methods in enzymology 2001; 335: 3-14.
27. Naczk M., Shahidi F. Extraction and analysis of phenolics in food. Journal of Chromatography A 2004; 1054(1-2): 95-111. 28. https://gelcapsules.com.au 29. http://pharmlabs.unc.edu/labs/capsules/gelatin.htm 30. http://pharmlabs.unc.edu/labs/capsules/intro.htm 31. http://www.pharmainfo.net/book/pharmaceutical-machines/capsule-filling-machines 32. https://www.flickr.com/photos/sigridfrensen/5406016240 33. https://gelcapsules.com.au http://www.preservearticles.com/2011122319105/what-are-the-advantages-and-disadvantages-of-capsules.html
