Kauno medicinos universitetas
Odeta Arandarčikaitė
ESTRADIOLIO IR AZOTO MONOKSIDO
POVEIKIO MITOCHONDRIJOMS,
APSAUGANT NUO MIOKARDO IŠEMINIO
PAŽEIDIMO, MECHANIZMAI
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai, biologija (01 B)
Disertacija rengta 2005–2009 metais Kauno medicinos universitete, Biomedicininų tyrimų institute, Biochemijos laboratorijoje.
Mokslinis vadovė
prof. dr. Vilmantė Borutaitė (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01 B)
Konsultantas
prof. habil. dr. Adolfas Toleikis (Kauno medicinos universitetas, biome-dicinos mokslai, biologija – 01 B)
Disertacija ginama Kauno medicinos universiteto Biologijos mokslo krypties taryboje:
Pirmininkė – dr. Ilona Sadauskienė (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01 B)
Nariai:
prof. dr. Dainius Haroldas Pauža (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01 B)
dr. Regina Mačianskienė (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, biofizika – 02 B)
prof. habil. dr. Vida Mildažienė (Vytauto Didžiojo universitetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01 B)
prof. dr. Antanas Sederevičius (Lietuvos veterinarijos akademija, biomedicinos mokslai, veterinarinė medicina – 12 B)
Oponentai:
habil.dr. Leonid Ivanov (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01 B)
prof.dr. Rimas Daugelavičius (Vytauto Didžiojo universitetas, fiziniai mokslai, biochemija – 04 P)
Disertacija bus ginama viešame Biologijos mokslo krypties tarybos posėdyje 2010 m. rugpjūčio 27 d. 10 val. Kauno medicinos universiteto Mokomojo laboratorinio korpuso 430 auditorijoje (Eivenių g. 4, LT-50009 Kaunas).
Disertacijos santrauka išsiųsta 2010 liepos 27d.
Su disertacija galima susipažinti Kauno medicinos universiteto bibliotekoje. Adresas: Eivenių g. 6, LT-50161 Kaunas.
Turinys
Įvadas 6
1. Miokardo pažeidimai išemijos/reperfuzijos metu 10
2. Mitochondrijų nespecifinio pralaidumo pora 12
2.1. Mitochondrijų nespecifinio pralaidumo poros komponentai 12
2.2. MNPP atsidarymą sąlygojantys veiksniai širdies išemijos-reperfuzijos metu 14
2.3. MNPP atsidarymo pasekmės 15
2.4. Mitochondrijų nespecifinio pralaidumo poros MNPP aktyvikliai ir slopikliai 16
3. Apsauginiai miokardo mechanizmai nuo išemijos/reperfuzijos pažeidimų 19
4. Apsauginis estrogenų poveikis širdžiai išemijos/reperfuzijos metu 23
5. Apsauginis NO poveikis širdžiai išemijos/reperfuzijos metu 27
6. Metodai 30
6.1. Tyrimų pobūdis 30
6.2. Širdies perfuzija bei išemijos sukėlimas 31
6.3. Mitochondrinės bei citoplazminės frakcijų išskyrimas 31
6.4. Mitochondrijų baltymo kiekio nustatymas biureto metodu 32
6.5. Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimas 32
6.6. Citochromų c ir a kiekio mitochondrijose 32 6.7. Citochromo c kiekio nustatymas citoplazminėje frakcijoje 33
6.8. Kaspazių aktyvumo matavimas 33
6.9. DNR trūkių žymėjimas imunofermentiniu būdu 34
6.10. Laktato dehidrogenazės aktyvumo reperfuzate matavimai 35
6.11. Mitochondrijų sukaupiamo kalcio kiekio iki nespecifinio pralaidumo poros susiformavimo matavimas 35
6.12. Statistinė duomenų analizė 36
6.13 Reagentai 37
7. Rezultatai ir jų aptarimas 39
7.1 Estradiolio poveikis mitochondrijų gebėjimui kaupti Ca2+ 39
7.2 Apsauginio estradiolio poveikio mitochondrijoms išemijos ir išemijos/reperfuzijos metu tyrimas 40
7.3 Estradiolio poveikis išemijos sukeliamam kaspazių aktyvinimui ir branduolio DNR fragmentacijai 46
7.4 Estrogenų poveikis patinėlių širdies mitochondrijoms 60 min. išemijos metu 48
7.5 Estrogenų receptorių α ir β vaidmens mitochondrijoms veikiant
estradioliui ilgalaikės išemijos metu tyrimas 50
7.6 Aktyvios Akt kinazės poveikis mitochondrijoms veikiant estradioliui ilgalaikės išemijos metu tyrimas 54 7.7 Estradiolis apsaugo širdies mitochondrijas nuo išemijos sukeliamų pažaidų dėl azoto monoksido sintazės ir baltymų kinazės G aktyvinimo 57
8. Širdžių perfuzijai naudotų inhibitorių tiesioginis poveikis širdies mitochondrijų kvėpavimui 62
9. NO poveikio širdies mitochondrijoms išemijos metu mechanizmo tyrimas 64
10. GSK 3β slopinimo poveikio mitochondrijoms ilgalaikės išemijos metu tyrimas 73
11. Apibendrinimas 78
Išvados 83
SANTRUMPOS
Acetil-Co-A – Acetil kofermentas A, ATPazė – ATP-sintezė,
ANT - adenino nukleotidų nešiklis,
cAMP – ciklinis 3‘,5‘-adenozinmonofosfatas, cGMP – ciklinis 3‘,5‘-guanozinmonofosfatas, DNR – dezoksiribonukleininė rūgštis,
NADH – nikotino amido adenino dinukleotidas, redukuota forma, FADH2 – flavino adenino dinukleotidas, redukuota forma,
FMN – flavino mononukleotidas,
FSH – folikulus stimuliuojantis hormonas, Ko-Q – kofermentas Q,
KATP – ATP jautrūs kalio kanalai,
GSK 3β – glikogeno sintazė kinazė 3β, LDH – laktato dehidrogenazė,
MNPP – mitochondrijų nespecifinio pralaidumo pora, Iš – išemija,
NO – azoto monoksidas,
NOS – azoto monoksido sintazė,
iNOS – inicijuojanti azoto monoksido sintazė, eNOS – endotelinė azoto monoksido sintazė, nNOS – neuroninė azoto monoksido sintazė, RNS – reaktyvūs azoto junginiai,
ROS – reaktyvūs deguonies junginiai, PI3K – fosfoinozitolio 3 kinazė PKG – baltymų kinazė G, PKC – baltymų kinazė C, R – reperfuzija,
ĮVADAS
Išeminė širdies liga yra viena svarbiausių žmonių mirtingumo ir nedarbingumo priežasčių. Sutrikus kraujotatai kardiomiocituose vystosi funkciniai bei struktūriniai pokyčiai, kurie, ilgėjant išemijos trukmei, tampa negrįžtami, ir ląstelės žūsta nekrozės ir apoptozės būdu. Išemijos/re-perfuzijos metu širdies ląstelėse padidėjus kalcio jonų koncentracijai, suaktyvėjus reaktyvių deguonies junginių gamybai, sumažėjus energijos yra pažeidžiamos mitochondrijos, pradeda formuotis taip vadinama mitochond-rijų nespecifinio pralaidumo pora. Dėl mitochondmitochond-rijų nespecifinio pralai-dumo iš mitochondrijų į citozolį patenka citochromas c [Kantrow et al., 1997; Borutaite et al., 1999], o tai ne tik sutrikdo ATP sintezę [Chan et al., 1992], bet aktyvina ir apoptotinius procesus [Li et al., 1997, Green et al., 1998].
Jau senokai pastebėta, kad jaunos moterys išemine širdies liga bei miokardo infarktu serga žymiai rečiau, nei to paties amžiaus vyrai, o sergamumas susilygina tik vyresniame amžiuje, būtent post-menopauziniu laikotarpiu. Šia estrogenų savybe buvo susidomėta ir įvairiais eksperi-mentiniais modeliais pradėta tirti galimus apsauginius būdus. Yra parodyta, kad estrogenai gali sumažinti miokardo infarkto zoną, pagerinti širdies funkcijų atsistatymą, slopinti viduląstelinę kalcio jonų akumuliaciją [Zhai et al., 2000] ir laisvųjų deguonies radikalų generaciją po išemijos reperfuzijos [Sovershaev et al., 2006]. Taip pat pastebėta, kad pagerėja ir mitochondrijų funkcija, tačiau estradiolio apsauginis veikimo mechanizmas ir taikiniai iki šiol nenustatyti. Jo poveikis ląstelėms gali būti dvejopas: klasikinis, genetinis, kai estradiolis, prisijungęs prie estrogenų receptorių aktyvuoja tam tikrus genus, ir ne genetinis, kuomet šis hormonas, veikdamas per estrogenų receptorius citoplazmoje gali aktyvinti signalinių molekulių kas-kadą [Simoncini et al., 2004]. Pastarųjų metų tyrimai rodo, kad apsaugant kardiomiocitus nuo žūties išemijos/reperfuzijos metu dalyvauja nemažai baltymų kinazių. Iki šiol nėra pilnai ištirta, kokios citozolinės kinazės gali būti aktyvuojamos veikiant estradioliui ir koks jų apsauginio poveikio mitochondrijoms mechanizmas.
Maža fiziologinė molekulė, azoto monoksidas, organizme yra gaminama iš L-arginino veikiant azoto monoksido sintazei. Organizme azoto monok-sidas dalyvauja įvairiuose fiziologiniuose ir patologiniuose procesuose. Eksperimentais yra parodyta, kad širdies pripratinimo metu padidėja azoto monoksido sintazės aktyvumas bei azoto monoksido ir cGMP koncentracija [Han et al., 2008], aktyvinama baltymų kinazė G [Downey et al., 2007, Rastaldo et al., 2007]. Kardioprotekcinis baltymų kinazės G veikimas galėtų
būti dėl kalcio transporto reguliavimo [Piper et al., 2004], mitochondrijų KATP kanalų atidarymo [Costa et al., 2005], baltymų kinazių fosforilinimo
[Costa et al.,2005; Das et al., 2008]. Tyrimuose su astrocitų kultūromis buvo parodyta, kad aktyvi baltymų kinazė G gali slopinti mitochondrijų nespecifinį pralaidumą [Takuma et al., 2001]. Kiti autoriai teigia, kad kardioprotekcinis azoto monoksido poveikis yra dėl kraujagysles plečiančio poveikio [Gewaltig et al., 2002], ar mitochondrijų kvėpavimo grandinės darbo reguliavimo [Nadtochy et al., 2007, Gewalting et al., 2002]. Taigi, azoto monoksido poveikis išemijos metu gali būti įvairus, tačiau tikslus apsauginis veikimo mechanizmas ar mechanizmų kombinacija ir taikiniai ląstelėje nėra iki galo ištirti.
Šiame darbe tyrėme, ar estradiolis ir azoto monoksidas gali apsaugoti širdies mitochondrijas nuo išemijos/reperfuzijos sukeliamo mitochondrijų nespecifinio pralaidumo poros atsidarymo, ir kokios apsauginės baltymų kinazės dalyvauja šiame procese.
Estradiolio ir azoto monoksido apsauginio poveikio mitochondrijoms po miokardo išemijos ir išemijos/reperfuzijos mechanizmo ištyrimas padėtų suprasti šių fiziologinių medžiagų veikimą širdies ląstelėse išemijos metu bei leistų ieškoti naujų fiziologinių ir farmakologinių priemonių miokardo pažaidos sumažinimui patologinėmis sąlygomis.
Darbo mokslinis naujumas
Mes pirmieji parodėme, kad širdies perfuzija su estradioliu ar azoto monoksidu padidina mitochondrijų atsparumą kalcio sukeliamam nespecifi-niam pralaidumui, dėl baltymų kinazė G aktyvinimo. Taip pat parodėme, kad priešišeminė širdies perfuzija su estradioliu ar azoto monoksidu apsaugo nuo išemijos sukeliamo mitochondrijų nespecifinio laidumo ir to sąly-gojamo citochromo c patekimo į citozolį, kaspazių aktyvinimo bei ląstelės žūties. Estradiolio ir azoto monoksido apsauginio veikimo mechanizmo išaiškinimas galėtų būti saugus ir efektyvus gydymo būdas kardiologijoje.
Tikslas:
Išaiškinti estrogenų ir NO poveikio mitochondrijoms mechanizmus, kurie yra svarbūs apsaugant širdies ląsteles nuo žūties išemijos metu.
Uždaviniai:
1. Ištirti estrogenų poveikį mitochondrijų atsparumui kalcio sukeliamam mitochondrijų nespecifinio pralaidumo poros atsidarymui.
2. Ištirti estrogenų apsauginio poveikio mitochondrijoms išemijos metu mechanizmą:
a) nustatyti, ar šis poveikis yra susijęs su estrogenų receptorių α ir β aktyvinimu;
b) ištirti, ar estrogenai apsaugo mitochondrijas nuo išemijos sukelto nespecifinio laidumo poros atsidarymo ir su tuo susijusios apopto-zės/nekrozės;
c) nustatyti, ar estrogenų poveikis mitochondrijoms yra susijęs su signalinių kelių aktyvacija ir kokios baltymų kinazės yra aktyvi-namos, koks jų poveikis mitochondrijų funkcijoms.
3. Nustatyti, ar estrogenų apsauginis efektas mitochondrijoms išemijos metu yra susijęs su NO sintazės aktyvacija.
4. Ištirti NO-aktyvuojamos baltymų kinazės G poveikį mitochondrijoms išemijos metu.
Ginami teiginiai:
• Estradiolis padidina mitochondrijų atsparumą Ca2+-sukeliamam
mito-chondrijų nespecifiniam pralaidumui dėl baltymų kinazės G akty-vinimo.
• Estradiolis slopina išemijos sukeliamą citochromo c išėjimą iš mito-chondrijų ir dėl to padidina mitomito-chondrijų kvėpavimą, bei apsaugo kardiomiocitus nuo apoptozės.
• Apsauginiame estradiolio mechanizme dalyvauja aktyvinti estrogenų receptoriai, azoto monoksido sintezė, guanilato ciklazė, Akt ir baltymų kinazė G.
• Apsauginis estradiolio poveikis širdies mitochondrijoms išemijos metu nepriklauso nuo lyties.
• Azoto monoksidas padidina mitochondrijų atsparumą Ca2+-sukeliamam
mitochondrijų nespecifiniam pralaidumui, apsaugo širdies mito-chondrijas nuo išemijos ar išemijos/reperfuzijos sukeliamo citochromo c netekimo, slopina apoptozinius ir nekrozinius procesus širdies ląstelėse dėl baltymų kinazių G ir C aktyvinimo.
1. MIOKARDO PAŽEIDIMAI IŠEMIJOS/
REPERFUZIJOS METU
Išemija yra būsena, kai audinyje ar jo dalyje sutrinka kraujotaka, dėl to ląstelėms ima trūkti deguonies, substratų, nepašalinami metabolizmo produktai [Jennings et al.,1969]. Išemija gali atsirasti sumažėjus arteriniam kraujospūdžiui ar dėl deguonies nepakankamumo kraujyje (santykinė iše-mija), taip pat dėl arterijų spindžio susiaurėjimo, dėl dalinio arba visiško jų užsikimšimo: susidarius krešuliui (trombui) ar kraujo srovės atneštam dujų burbului, stambesnėms dalelėms (embolija). Priklausomai nuo pažeistos organo dalies dydžio išemija gali būti totalinė, globalinė ir regioninė.
Širdis dirba nuolat, ir dėl to širdies ląstelėms yra būtinas didelis kiekis energijos (ATP), kurios apie 90% susidaro mitochondrijose oksidacinio fosforilinimo būdu. Išemija sukelia mitochondrijų pažeidimus: padidėja vidinės membranos pralaidumas, krinta membraninis potencialas, lėtėja substratų oksidacijos greitis, mažėja ATP-sintazė (ATPazės) aktyvumas [Toleikis et al., 1985, Rouslin et al., 1983]. Mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo sistema yra labai jautri deguonies trūkumui, nes šio proceso intensyvumas priklauso nuo arteriniame kraujyje esančio deguonies kiekio, todėl sumažėjus jo koncentracijai kraujyje progresyviai mažėja ir ATP koncentracija širdies ląstelėse. Nustatyta, kad mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje naudojant kvėpavimo grandinės komplekso I substratus po 30 min. išemijos sumažėjo 25–41% lyginant su kontrolinių mitochondrijų kvėpavimu, po 1 val. – nuo 12% iki 98% [Jen-nings et al., 1969, Toleikis et al., 1989]. Kvėpavimo greičio sumažėjimas yra nevienodas dėl įvairių eksperimentinių sąlygų ir skirtingo tiriamų gyvūnėlių jautrumo išemijai. Mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo greitis išemijos metu sulėtėja dėl kvėpavimo grandinės kompleksų pažeidimo. Dar ankstyvoje išemijos stadijoje pastebėtas kvėpavimo grandinės komplekso I aktyvumo sumažėjimas [Pamagami et al.,1965; Calva et al., 1966; Jennings et al., 1969; 1976; Schwartz et al., 1973]. Manoma, kad kvėpavimo gran-dinės komplekso I aktyvumas sumažėja dėl nekovalentiškai prijungto FMN disociacijos. Šio komplekso aktyvumą gali slopinti matrikse sumažėjusi H+ koncentracija, vidinės membranos pažeidimai ir laisvieji deguonies radi-kalai. Mažesniu laipsniu išemija veikia ir kitus kvėpavimo grandinės komp-leksus: 24% sumažėja komplekso II aktyvumas, 9–14% komplekso III, ir 9–13% komplekso IV aktyvumai [Piper et al., 1985; Rouslin et al., 1983; Toleikis et al., 1989].
Miokardo išemijos metu dėl sulėtėjusio kvėpavimo grandinės darbo su-mažėja elektrocheminis protonų gradientas, su-mažėja ATPazės aktyvumas.
ATPazė pradeda vykdyti atvirkštinę reakciją – hidrolizuoja ATP į ADP ir neorganinį fosfatą, o tai dar padidina ATP deficitą ląstelėje [Jennings et al., 1969; 1976]. Dėl sumažėjusio ATP kiekio ląstelėse prasideda anaerobinis, bedeguoninis kvėpavimas. Citozolyje glikolizės reakcijų metu susidaręs pi-ruvatas laktato dehidrogenazės pagalba yra verčiamas į laktatą. Susidaręs didelis laktato kiekis sumažina ląstelės citozolio pH (parūgština) [Reimer et al., 1981; Jennings et al., 1981; Rouslin et al., 1991].
Išemijos/reperfuzijos metu sutrinka Ca2+ homeostazė ir citozolyje
padidėja laisvo Ca2+ koncentracija, kuri ląstelei yra žalinga, nes sukelia laisvųjų deguonies radikalų gamybą, aktyvina fosfolipazes, pažeidžia mitochondrijas [Prasad et al., 1991]. Mitochondrijos gali sugerti dalį Ca2+. Tyrimais yra parodyta, kad slopinant ląstelėse Ca2+ patekimo, pašalinimo ir surišimo kelius mitochondrijos gali sukaupti iki 70% citozolyje esančio Ca2+. Mitochondrijų matrikse Ca2+ yra prijungiamas prie Ca2+ surišančių baltymų, o nesujungtas Ca2+ pašalinamas atgal į citozolį Na+/Ca2+ nešiklio pagalba [Gunter et al., 1994].
2. MITOCHONDRIJŲ NESPECIFINIO
PRALAIDUMO PORA
Išemijos metu dėl deguonies trūkumo, sumažėjus ATP, padidėjus Ca2+ koncentracijai, esant didelei neorganinio fosfato koncentracijai mitochond-rijose atsidaro mitochondrijų nespecifinio pralaidumo pora (MNPP) [Bernardi et al., 1992; Crompton et al., 1999; Halestrap et al., 2004]. Pir-mieji duomenys apie poros atsidarymą yra publikuoti Martino Cropmtono dar 1987 m. Jis parodė, kad išemijos/reperfuzijos metu Ca2+ koncentracijos padidėjimas citozolyje ir oksidacinis stresas aktyvina tariamos poros atsi-darymą mitochondrijose. Dėl šio reiškinio mitochondrijose yra atskiriama substratų oksidacija nuo fosforilinimo ir sumažėja membraninis potencialas [Crompton et al., 1987]. MNPP yra kanalas susidarantis vidinėje mito-chondrijų membranoje, per kurį gali praeiti vanduo, jonai, ir nedidesnės kaip 1,5 kDa dydžio molekulės [Zoratti et al., 1995]. Dėl to krinta mitochondrijų membraninis potencialas, sulėtėja ATP gamyba [Chan et al., 1992], į citozolį gali išeiti proapoptotiniai mitochondriniai baltymai [Kantrow et al., 1997; Scarlett and Murphy, 1997; Hengartner et al.,2000; Joza et al., 2001], dėl ko ląstelės žūsta.
2.1 Mitochondrijų nespecifinio pralaidumo poros komponentai MNPP pastebėta jau daugiau nei prieš 20 m. ir iki šiol yra daugelio pasaulio mokslininkų grupių tyrimų objektu, tačiau jos struktūros, atsida-rymo ir reguliacijos mechanizmai nėra iki galo ištirti. Ilgą laiką buvo ma-noma, kad poros komponentai yra: matrikse esantis ciklofilinas D, vidinėje mitochondrijų membranoje esantis adenino nukleotidų nešiklis (ANT), ir išorinėje mitochondrijų membranoje esantis įtampos valdomas jonų kanalas (VDAC) [Crompton et al., 1998; Halestrap et al., 2003]. Teigiama, kad yra keli poros reguliatoriai: vidinėje mitochondrijų membranoje esantis fosfato jonų nešiklis, kreatino kinazė, ir heksokinazė II [Pastorino et al., 2003; Halestrap et al., 2009].
Ciklofilinas D yra branduolio DNR koduojamas mitochondrijų matrikso baltymas, kurio molekulinė masė yra 18 kDa. Į mitochondrijų matriksą ciklofilinas patenka dėl nukreipiamosios sekos, kuri po pernašos yra nu-kerpama mitochondrijose [Connern et al., 1992; Johnson et al., 1999]. Tyrimai su mitochondrijomis izoliuotomis iš pelių, kurioms buvo išveik-lintas ciklofilino D genas (knockout), parodė, kad jos gali sukaupti daugiau Ca2+ iki MNPP atsidarymo lyginant su normaliomis mitochondrijomis [Krauskopf et al., 2006], bet neturėjo įtakos elektrocheminio protonų
gradiento susidarymui ir ATP gamybai. Taip pat buvo nustatyta, kad cik-losporinas A yra selektyvus ciklofilino D slopiklis [Crompton et al.,1988], kuris blokuoja MNPP [Basso et al., 2005; Bainess et al., 2005; Schinzel et al.,2005].
Ciklofilino D fiziologinės funkcijos normaliomis sąlygomis dar neiš-tirtos. Eksperimentuose su pelėmis, kurioms buvo išveiklintas ciklofilino D genas, nepasireiškė jokie fenotipiniai požymiai [Luvisetto et al., 2008]. Neatmetama galimybė, kad ciklofilino D funkcija mitochondrijose yra reguliuoti fiziologiškai grįžtamą MNPP atsidarymą/užsidarymą [Rasola et al., 2010]. Nustatyta, kad pelėms su išveiklintu ciklofilino D genu širdies ir smegenų išemijos/reperfuzijos sukeliami pažeidimai (infarkto zona, LDH aktyvumas reperfuzate) buvo mažesni nei kontrolinės grupės [Baines et al., 2005; Schinzel et al., 2005]. Iš tokių pelių izoliuotos mitochondrijos buvo atsparesnės Ca2+, ROS ir atraktilozido sukeliamam MNPP, o ciklosporinas A neturėjo jokio poveikio. Tai parodė, kad ciklofilinas D dalyvauja MNPP atsidaryme [Baines et al., 2005].
Teigiama, kad veikiant Ca2+ ciklofilinas D jungiasi su c konformacijoje esančiu ANT ir taip skatina MNPP susiformavimą [Griffihs et al., 1991; Halestrap et al., 2003]. Taipogi pastebėta, kad ATP, ADP ir bongkrenkinė rūgštis, kuri yra specifinis ANT slopiklis, padidina mitochondrijų atsparumą Ca2+ jonams ir slopina MNPP atsidarymą [Hunter et al., 1979; Halestrap et al., 1990].
Eksperimentai su išgrynintu klonuotu į Neurospora crassa ANT parodė, kad esant aukštai Ca2+ koncentracijai pats nešiklis gali formuoti nespecifinį kanalą, o šį procesą aktyvina aukštas membraninis potencialas ir ciklofilinas D [Brustovetsky et al., 1996; 2002]. Kituose tyrimuose su modifikuotų pelių, kurioms buvo nuslopinti ANT1 ir ANT2 genai (knockout), kepenų izoliuotose mitochondrijose Ca2+ sukėlė MNPP atsidarymą [Kokoszka et al., 2004]. Šiose mitochondrijose MNPP buvo mažiau jautri Ca2+, ir nejautri ANT ligandams: ADP, karboksiatraktilozidui ir bongkreninei r. [Basso et al., 2005; Kokoszka et al., 2004]. Tokius rezultatus galima paaiškinti tuo, kad pelių modifikavimo metu ne visų ANT formų genai buvo nuslopinti, kiek vėliau pelių kepenų mitochondrijose buvo rasta ANT4 forma [DaCruz et al., 2005]. Taip pat gali būti , kad MNPP susidaryme dalyvauja ir kiti komponentai. Taigi, atlikti tyrimai leidžia teigti, kad ANT galėtų būti MNPP reguliatorius, bet nėra būtinas komponentas porai susiformuoti [Halestrap et al., 2009].
Ilgą laiką MNPP komponentu buvo laikomas VDAC, esantis mito-chondrijų išorinėje membranoje [Crompton et al., 2000; Brdiczka et al., 2006]. Buvo manoma, kad MNPP susidaro išorinės ir vidinės mitochondrijų membranų sąlyčio vietose, kai VDAC jungiasi su ANT, o iš matrikso pusės
prisijungia ciklofilinas D [Crompton et al., 2000; Brdiczka et al., 2006]. Chromatografiniai tyrimai parodė, kad detergentais suardžius širdies mitochondrijas ANT, VDAC ir ciklofilinas-D sudaro kompleksą [Crompton et al., 1998]. Susidaręs VDAC-ANT-ciklofilino D kompleksas taip pat buvo jautrus Ca2+, ir jo reakcija su ciklosporinu A buvo tokia pati, kaip ir normalių širdies mitochondrijų [Crompton et al., 1998]. Bet kitai tyrimų grupei nepavyko to pakartoti su kepenų mitochondrijomis [Woodfield et al., 1998]. Tai, kad VDAC nėra MNPP komponentas buvo išaiškinta ekspe-rimentuose su transgeninėmis pelėmis (knockout), kurioms buvo išveik-lintos visos trys VDAC izoformos [Krauskopf et al., 2006]. Šių pelių kepenų mitochondrijos, taip pat kaip ir normalių pelių kepenų mitochon-drijos reagavo į Ca2+ sukeliamą MNPP atsidarymą, o ciklosporinas A šį procesą blokavo. Tyrimai su modifikuotais, neturinčiais visų trijų VDAC formų fibroblastais parodė, kad šie yra jautresni oksidacinio streso suke-liamai ląstelių žūčiai, tai leidžia teigti, kad VDAC gali dalyvauti ląstelių žūties procesuose nepriklausomai nuo MNPP [Javadov et al., 2009].
MNPP atsidarymą gali aktyvinti didelės neorganininio fosfato, koncen-tracijos [Crompton et al., 1988]. Galėtų būti, kad prie fosfato nešiklio prisijungus fosfatui susidaro palankesnės galimybės formuotis MNPP. Taip pat naudojamas MNPP slopiklis – NEM iš tikrųjų yra fosfato nešiklio slopiklis [Chernyak et al., 1996; McStay et al., 2002]. Oksidacinio streso metu fosfato nešiklis gali prisijungti prie ciklofilino D ir šis procesas yra jautrus ciklosporinui A [Leung et al., 2008]. Eksperimentuose su HeLa ląstelėmis, kurioms buvo išveiklintas (knockout) fosfato genas, padidėjo atsparumas staurosporino sukeliamai apoptozei, o padidinus fosfato nešiklio genų raišką (overexpression) suaktyvėjo apoptotiniai procesai [Alcala et al., 2008]. Tai rodo, kad fosfato nešiklis dalyvauja nuo mitochondrijų priklau-somame apoptozės reguliavime. Pilnam fosfato nešiklio funkcijos MNPP susiformavime išaiškinimui reikėtų pabandyti išveiklinti (knockout) fosfato nešiklio geną ir įvertinti tokių mitochondrijų atsparumą Ca2+ bei ciklo-sporinui A.
2.2 MNPP atsidarymą sąlygojantys veiksniai širdies išemijos-reperfuzijos metu
Išemijos metu, sutrikus kraujotakai širdies audinio ląstelėse sumažėja deguonies kiekis, dėl ko sutrinka mitochondrijų funkcijos: ATP sintezė, didėja ADP ir neorganinio fosfato kiekiai. Padidėjęs laktato kiekis sukelia metabolinę acidozę, dėl to ląstelėje pradeda veikti Na+/H+ keitiklis, taip padidėja citozolinė Na+ koncentracija, slopinamas Na+/K+-ATPazės akty-vumas, sparčiai didėja citozolinė Ca2+ koncentracija, o Ca2+ išmetimas per
Na+/ Ca2+ keitiklį sulėtėja. Ca2+ koncentracija padidėja ir dėl sulėtėjusios sarkoplazminiame tinkle esančios Ca2+ATPazės veiklos. Deguonies likučiai tokiose ląstelėse yra panaudojami laisvųjų deguonies junginių gamybai. Yra parodyta, kad laisvųjų deguonies junginių kiekis perfuzuotose širdyse didėja ilgėjant išemijos laikotarpiui [Kevin et al., 2003; Murphy et al., 2009]. Taip išemijos metu susidaro visos palankios sąlygos MNPP atsidaryti: sumažėjęs ATP kiekis, padidėjusi Ca2+, neorganinio fosfato ir laisvųjų deguonies jun-ginių koncentracija. Pirmosiomis reperfuzijos sekundėmis yra sustiprinami išemijos sukelti pakitimai: deguonis yra panaudojamas laisvųjų radikalų gamybai, dar nėra atsistatę Ca2+ homeostazės palaikymo sistemos, tai padidina MNPP atsidarymo galimybę. Tačiau kiti tyrimai naudojant DOG (2-deoxy [(3)H]glucose ([(3)H]) metodą rodo, kad MNPP reperfuzijos metu gali užsidaryti [Kerr et al., 1999]. Tuomet mitochondrijos vėl pradeda gaminti ATP, palaipsniui sumažėja Ca2+ koncentracija iki įprastos fiziologinės, slopinama laisvųjų radikalų gamyba, ir ląstelės grįžta į normalų metabolinį ir funkcinį ritmą. Taigi, išemijos sukeliami pažeidimai nulemia reperfuzijos sukeliamus pažeidimus mitochondrijoms [Javadov et al., 2009].
2.3 MNPP atsidarymo pasekmės
MNPP atsidarymas įvairių patologijų metu sąlygoja vidinės mitochond-rijų membranos laidumo padidėjimą, elektrocheminio protonų gradiento išnykimą, dėl ko sulėtėja ATP sintezė, mitochondrijos pradeda brinkti, suyra išorinė mitochondrijų membrana, iš mitochondrijų į citozolį patenka apop-tozę sukeliantys baltymai: citochromas c, Smac/DIABLO, HtrA2/Omi, apoptozę inicijuojantis faktorius, endonukleazė G [Hengartner et al., 2000].
Mitochondrijoms netekus citochromo c sulėtėja jų kvėpavimo greitis, nes citochromas c yra kvėpavimo grandinės komponentas, pernešantis elektronus nuo citochromo bc1 citochromoksidazei. Citochromas c yra ne-didelis, 12 kDa hemą turintis baltymas, silpna elektrostatine jungtimi susirišęs su mitochondrijų vidinės membranos išoriniu paviršiumi. Intak-tiška išorinė mitochondrijų membrana nepralaidi citochromui c, todėl citochromo c išėjimas iš mitochondrijų galimas padidėjus išorinės mito-chondrijų membranos laidumui. Citoplazmoje citochromas c jungiasi su apoptotones proteazes aktyvinantis faktorius (Apaf-1) [Li et al., 1997; Green et al., 1998], prokaspaze-9 ir dATP, susiformuoja apoptosoma, kuri reikalinga prokaspazės-9 aktyvinimui. Aktyvi kaspazė-9 aktyvuoja kaspazę-3 ir tokiu būdu inicijuoja kaspazių kaskadą ląstelėje [Acehan et al., 2002]. Apoptosomos susidarymas ir kaspazės-3 aktyvacija laikoma kritiniu įvykiu apoptotinių reakcijų grandinėje, po kurio ląstelės žūties jau nebegalima sustabdyti. Apoptozės metu yra sukarpoma ląstelės branduolio DNR,
fragmentuojasi branduolys, nesuirę organoidai ir branduolio fragmentai pasidalina į mažas plazminės membranos apgaubtas dalis, vadinamas apoptotiniais kūneliais. Apoptotinius kūnelius fagocituoja makrofagai ar kaimyninės ląstelės. Tokia ląstelės žūtis nesukelia uždegiminių reakcijų, ir jos pasekmės audiniui yra palankesnės nei nekrozė [Eguchi et al., 1997], tačiau didelis apoptozės laipsnis audiniui taip pat yra nepageidautinas [Hengartner et al., 2000].
Esant dideliems išeminiams pažeidimams – sumažėjus energetiniams resursams, sutrikus jonų homeostazei, padidėjus Ca2+ koncentracijai, ir dėl oksidacinio streso didelė dalis ląstelės mitochondrijų pradeda brinkti, ląstelėse aktyvuojasi degradacinius procesus sąlygojantys fermentai, ląstelės brinksta, sutrūkinėja jų membranos ir ląstelė žūsta nekrozės būdu. Degra-daciniai fermentai, išėję iš membranų apsupties, pažeidžia gretimas ląsteles, kurios dažniausiai taip pat žūsta nekrotiškai. Šitaip ląstelės žūva grupėmis, sukeldamos uždegiminį imuninį atsaką, kuriam pasibaigus, susidaro nefunk-cionuojanti audinio dalis, kur palaipsniui susidaro jungiamojo audinio randas. Nekrozė nesiregeneruojančiame širdies audinyje sąlygoja funkcinius sutrikimus [Eguchi et al., 1997].
2.4 Mitochondrijų nespecifinio pralaidumo poros aktyvikliai ir slopikliai
MNPP slopinimas apsaugo širdies ląsteles nuo išemijos /reperfuzijos sukeliamų pažeidimų ir žūties [Halestrap et al., 1997]. Todėl ieškoma įvairių būdų slopinti MNPP išemijos/reperfuzijos metu ir taip sumažinti širdies pažeidimo laipsnį. Farmakologiniai preparatai, slopinantys MNPP, skirstomi į tris grupes: veikiantys poros komponentus, slopinantys jos atsi-darymą, arba netiesiogiai, slopinantys porą sukeliančius veiksnius, tokius kaip Ca2+ ir H+ koncentraciją, ROS. Farmakologiniai preparatai, veikiantys MNPP komponentus, yra skirstomi į dvi grupes: medžiagos sąveikaujančios su ciklofilinu-D arba su ANT.
Pirmasis apie mitochondrijų nespecifinio pralaidumo slopinimą veikiant ciklofiliną D aprašė Crompton. Jų tyrimų grupė pirmoji parodė, kad ciklo-sporinas A apsaugo širdies ląsteles nuo išeminių/reperfuzinių pažeidimų dėl MNPP slopinimo [Nazareth et al., 1991]. Vėliau, naudojant įvairius eks-perimentinius modelius, buvo patvirtinta, kad ciklosporinas A slopina MNPP atsidarymą ir taip apsaugo nuo išemijos/reperfuzijos sukeliamų pažeidimų [Griffiths et al., 1995; Hausenloy et al., 2003; Argaud et al., 2005]. Ciklosporinas A yra imunosupresantas, slopinantis T-limfocitų aktyvumą, taip pat jungiasi su ciklofilinu D ir blokuoja MNPP atsidarymą. Be to, nustatyta, kad ciklosporinas A slopina aktyvumą ląstelių citozolyje
esančio ciklofilino A [Halestrap et al., 1990; Tanveer et al., 1996] ir Ca2+ aktyvinamų baltymų fosfatazių (kalcineurino). Šis imunosupresantas, susijungęs su citozoliniu ciklofilinu-D, jungiasi prie kalcineurino katalitinio subvieneto, ir taip slopina jo kaip fosfatazės aktyvumą, kartu slopindamas NFAT defosforilinimą ir patekimą į branduolį [Crabtee, 2001]. Norint išvengti ciklosporino A poveikio kalcineurinui buvo atrasti ciklosporino A analogai neslopinantys imuninės sistemos: 6-Me-Ala-CsA, N-Me-4-Ile-CsA(NIM811), D-3-Me-Ala-4-EtVal-CsA (Debio-025). Šie junginiai taip pat slopina ciklofilino-D aktyvumą, bet neturi poveikio kalcineurinui. Ciklo-sporino A analogai apsaugojo žiurkių širdis nuo išemijos/reperfuzijos suke-liamų pažeidimų [Griffiths et al., 1995] ir sumažino infarkto zoną triušių [Argaud et al., 2005] bei pelių [Gomez et al., 2007] širdyse. Todėl galima teigti, kad MNPP galima slopinti veikiant ciklofiliną-D, bet ne kalcinuerino aktyvumą [Javadov et al., 2009].
Neseniai MNPP slopikliai, būtent ciklosporinas A ir jo analogai neimunosupresantai, tokie kaip sanglifehrinas A, pradėti taikyti klinikinėje medicinos praktikoje. MNPP slopinimas naudojant ciklosporiną A ir sanglifehriną A širdies prieširdžių operacijos metu apsaugojo ląsteles nuo žūties ir pagerino susitraukimo funkciją [Shanmuganathan et al., 2005]. Pacientams, kuriems širdys buvo reperfuzuojamos ciklosporinu A, kreatino kinazės koncentracija kraujyje sumažėjo iki 40% [Piot et al., 2008]. Ciklosporino A ir sanglifehrino A panaudojimas yra efektyvus – slopinamas tik MNPP, o ne jį sukeliantys faktoriai Ca2+, oksidacinis stresas, ir adenino nukleotidų sumažėjimas [Halestrap et al., 2009], bet turi trūkumų, nes šie junginiai sąveikauja su kitais ciklofilinais, pvz. citoplazminiu ciklofilinu A [Halestrap et al., 2004].
Kiti farmakologiniai preparatai MNPP slopinti yra ANT slopikliai. Daugiausiai tyrimuose yra naudoti du ANT slopikliai: atraktilozidas ir bongkrekinė rūgštis. Bongkrekinė rūgštis padidina širdies ir kepenų mitochondrijų atsparumą Ca2+ iki MNPP atsidarymo [Halestrap et al., 1990]. Deja, atraktilozido poveikis yra priešingas: jis padidina mitochond-rijų jautrumą Ca2+ [Haworth et al., 2000]. Taip yra todėl, kad atraktilozidas ir bongkrekinė rūgštis ANT slopina skirtingose konformacijos būsenose. Bongkrekinė rūgštis jungiasi prie ANT iš matrikso pusės, o atraktilozidas iš citoplazminės pusės [Klingenberg et al., 2008]. Kiti tyrimai parodė, kad bongkrekinė rūgštis apsaugo mitochondrijas nuo hipoksijos sukeliamo MNPP ir membraninio potencialo sumažėjimo, bet neapsaugo nuo citochromo c netekimo. Manoma, kad hipoksijos metu atsidaranti MNPP ir membraninio potencialo sumažėjimas yra ne vienintelė citochromo c išėjimą sukelianti priežastis [Gurevich et al., 2001]. Bongkrekinė rūgštis slopina oksidacinio streso sukeliamą MNPP ir ląstelių žūtį [Regula et al.,
2002], bet jos panaudojimas praktikoje yra komplikuotas, nes slopinant ANT yra slopinamas ADP/ATP pernešimas [Javadov et al., 2009].
Netiesioginis MNPP slopinimo būdas galimas reguliuojant jos inicia-torių Ca2+ ir ROS koncentraciją ląstelėje. Vien tik laisvųjų deguonies radi-kalų padidėjimo nepakanka MNPP atsidarymui, jie tik padidina mito-chondrijų jautrumą Ca2+ ir taip padidėja galimybės MNPP susiformavimui [Kim et al., 2006], nes Ca2+ sukeliamas mitochondrijų nespecifinis pralaidumas priklauso ir nuo bendros ląstelės būklės [Halestrap et al., 1997]. Poros atsidarymas slopinamas esant žemam pH ir didelei dvivalenčių katijonų (Mg2+, Mn2+, Sr2+) koncentracijai, o aktyvinamas Ca2+ prisijungus prie vidinės mitochondrijų membranos iš matrikso pusės, o dvivalenčiai katijonai gali jungtis išorinėje vidinės membranos pusėje ir taip slopinti mitochondrijų nespecifinį pralaidumą [Halestrap et al., 2009].
Yra parodyta, kad antioksidantai apsaugo širdies ląsteles nuo hipoksijos ir oksidacinio streso sukeliamų pažeidimų slopindami MNPP [Javadov et al., 2009]. Antioksidantas MCI-186 ženkliai sumažino žiurkių širdžių išemijos/reperfuzijos sukeliamą MNPP ir infarkto zonos dydį [Rajesh et al., 2003]. Žiurkių širdžių darbą ir mitochondrijų nespecifinį pralaidumą slopino piruvatas, kuris taip pat pasižymi antioksidantiniu poveikiu, yra kaip substratas ATP sintezei ir ląstelės pH rūgštėjimo iniciatorius [Kerr et al., 1999]. Pagrindinis laisvųjų deguonies radikalų gaudyklių taikinys ląstelėje yra mitochondrijos, todėl dabar plačiai yra tiriamas laisvųjų radikalų gaudyklių naudojimo klinikoje galimybės.
Tiriant įvairius Ca2+ kanalų blokatorius, plačiai naudojamus širdies ligų gydyme, apsauginio poveikio MNPP nebuvo pastebėta, nebent preparatai turėjo papildomą poveikį, pvz. slopindami pH atsistatymą reperfuzijos metu [Javadov et al., 2009].
3. APSAUGINIAI MIOKARDO MECHANIZMAI
NUO IŠEMIJOS/REPERFUZIJOS PAŽEIDIMŲ
Vienas iš būdų sumažinti išemijos sukeliamus pažeidimus yra širdies pripratinimas (preconditioning). Širdies pripratinimas išemijai yra apsaugi-nių mechanizmų inicijavimas sukeliant kelis trumpus išemijos/reperfuzijos periodus, naudojant farmakologinius preparatus arba taikant hipotermiją [Downey et al., 2007]. Pirmieji širdies pripratinimą aprašė Murrey su kolegomis 1986 m. Ši grupė savo eksperimentuose naudojo šunis, kuriems atvėrus krūtinės ląstą buvo 5 min. užspaudžiama vainikinė arterija, po to sekdavo 5 min. reperfuzija. Tokie trumpi išemijos ir reperfuzijos ciklai buvo kartojami 4 kartus, po to buvo sukeliama 40 min. išemija. Lyginant su 60 min. išemijos grupe buvo aptiktos mažesnės infarkto zonos [Murry et al., 1986].
Pripratinimo metu signalai ląstelės išorėje inicijuoja apsauginius mecha-nizmus citoplazmoje, kurių, manoma, galutinis taikinys yra MNPP slopini-mas. Pripratinimo metu aktyvintos apsauginių (prosurvival) baltymų kinazių kaskados yra aktyvios apie 1–2 valandas. Apsauginiai reiškiniai gali pasi-reikšti po 24 val. ir gali išlikti apie 4 dienas. Tai dar yra vadinama vėlyvuoju pripratinimu, kai vykstančios signalinės kaskados aktyvina tam tikrų bal-tymų genų raišką ir taip širdis adaptuojasi prie išemijos sukeltų pakitimų [Costa et al., 2008]. Šiuo periodu gali būti aktyvinama šiluminio-šoko baltymų, antioksidantinių fermentų, azoto monoksido sintazės, riebalų r. pernašos baltymų, o taip pat keleto mitochondrinių baltymų [Rizvi et al., 1999; Marber et al., 1993].
Išeminio pripratinimo metu aktyvuojamos kinazės: fosfoinozitol 3 ki-nazė (PI3K), baltymų kiki-nazė C (PKC), p38 kiki-nazės, cAMP ar cGMP priklausomos kinazės, p42/p44 [Burley et al., 2007]. PI3K yra aktyvinama prie plazminės membranos receptorių prisijungus ligandams. PI3K veikia nuo fosfolipidų priklausomas kinazes (phospholipid dependent kinases) ir taip aktyvina signalines kaskadas citoplazmoje. PI3K skatina fosforilintų lipidų metabolitų fosfatidilinozitol (3,4,5) trifosfato ar fosfatidilinozitol (3,4) bifosfato susidarymą. Susidarę fosfatidilinozitolio junginiai aktyvina nuo 3-fosfoinositolių priklausomą baltymų kinazę-1, kur fosforilina ir taip aktyvina baltymų kinazę B, dar vadinamą baltymų kinaze Akt [Alessi et al., 1997; Downey et al., 2007]. Aktyvi Akt kinazė reguliuoja daugelį ląstelinių procesų: gliukozės metabolizmą, baltymų sintezę, transkripcijos faktorių reguliaciją, ląstelės vystimąsi ir dalijimąsi. Greitas PI3K/Akt aktyvinimas širdies pripratinimo metu slopina apoptotinius procesus, taip mažindamas išemijos/reperfuzijos sukeliamus pažeidimus kardiomiocituose [Murphy,
2004; Ravingerova et al., 2009]. Eksperimentiškai nustatyta, kad PI3K slopikliai vortmaninas ar LY294002 slopina inicijuojamus išemijos/reper-fuzijos epizodų apsauginį poveikį žiurkių širdims [Tong et al., 2000]. Tyrimai su ląstelių kultūromis, kur padidinta Akt kinazės geno raiška parodė, kad mitochondrijų funkcijos yra pagerinamos, nes yra aktyvinama glikolizė ir taip padidindama substratų kiekį mitochondrijų elektronų per-nešimo grandinei [Plas et al., 2001]. Širdies ląstelėse, kuriose buvo
padidinta Akt kinazės geno raiška, buvo slopinamas MNPP [Davidson et al., 2006]. Taip pat buvo nustatyta, kad PI3K/Akt slopikliai, slopindami šias kinazes, neapsaugo kardiomiocitų mitochondrijų nuo MNPP [Davidson et al., 2006]. Tai, kaip PI3K/Akt kinazių kaskada slopina MNPP nėra ištirta. Viena iš hipotezių yra ta, kad aktyvi Akt kinazė gali „pereiti“ iš citozolio į mitochondrijas. Yra parodyta su žmogaus neuroblastomos ląstelėmis, kad insulinu aktyvinta PI3K fosforilino Akt kinazė po 3 min. buvo aptinkama mitochondrijose, kur fosforilino ATPazės b-subvienetą ir glikogeno sintazės kinazę 3β (GSK 3β) [Bijur et al., 2003]. Širdies pripratinimas taip pat sukelia Akt kinazės „perėjimą“ į mitochondrijas [Ahmad et al., 2006]. Eritropoetinu aktyvinant PI3K/Akt kinazių kaskadą triušių širdies mito-chondrijose buvo aptinkama aktyvi Akt kinazė susijungusi su ANT [Kobayashi et al., 2008]. Gali būti, kad būtent Akt kinazės kompleksas su ANT slopina MNPP atsidarymą, nors ANT jau nelaikomas poros kompo-nentu, tik galimu reguliatoriumi. Manoma, kad aktyvi Akt kinazė tiesiogiai neslopina MNPP, bet perduodama signalą tolesniems efektoriams gali būti svarbi MNPP reguliavime.
Kiti Akt kinazės substratai gali būti eNOS, 6-fosfo-frukto-2-kinazė, c-RAF, keletas antiapoptotinių efektorių citoplazmoje, mitochondrijose ir branduolyje, bei GSK 3β [Oudit et al., 2009]. eNOS gamina NO, kuris veikia per guanilato ciklazę ir cGMP ir taip aktyvina nuo cGMP priklau-somą baltymų kinazę G (PKG). Baltymų kinazė G yra 75 kDa homo-dimeras. Yra atrastos dvi šio fermento izoformos, kurių paplitimas audi-niuose yra skirtingas. PKG Iα yra aptinkama kardiomiocituose, kraujagyslių ląstelėse, plaučiuose, inkstuose, smegenėlėse. PKG Iβ vyrauja šlapimo sistemoje [Hausenloy et al., 2006]. Yra žinoma, kad aktyvi PKG gerina širdies susitraukimus [Schulz et al., 2004], veikia kaip vazodilatatorius [Gewaltig et al., 2002], blokuoja sarkolemos Ca2+ kanalus [Rastaldo et al., 2007], apsaugo širdį nuo išemijos/reperfuzijos sukeliamų pažeidimų. Mechanizmas, kaip aktyvi PKG sumažina išemijos/reperfuzijos sukeliamus pažeidimus nėra žinomas. Manoma, kad galutinis PKG veikimo efektorius yra mitochondrijos. Yra parodyta, kad aktyvi PKG slopino apoptotinius procesus astrocitų ląstelių kultūroje, nes blokavo MNPP [Takuma et al., 2001].
PKG gali aktyvinti ir baltymų kinazę C (PKC), kuri taip pat pasižymi kardioprotekciniu poveikiu. Yra identifikuota 11 PKC izoformų, skirstomų į tipines aktyvinamas kalcio ir lipidų (α, βI, βII, γ), aktyvinamas lipidų, bet ne kalcio (δ, ε, θ, µ) ir netipinės PKC (λ, τ, ξ) kurių neveikia nei lipidai, nei kalcis [Amstrong, 2004]. 1994 m. Amstrongo tyrimų grupė parodė, kad pripratinimo sukelta apsauga yra panaikinama naudojant specifinius PKC inhibitorius [Amstrong, 1994]. Pripratinimo metu aktyvinta PKC slopina išemijos sukeliamą citoplazmos acidozę [Rehring et al., 1998], apoptotinius procesus [Okamura et al., 1999] ir sumažina oksidacinį stresą reperfuzijos metu [Vanden Hoek et al., 2000]. Taip pat yra parodyta, kad aktyvios PKG ir PKC kinazės atidaro mitochondrinius KATP kanalus ir taip sumažina
išemijos/reperfuzijos sukeliamus pažeidimus. Atsidarius mitochondriniams KATP kanalams slopinamas Ca2+ kaupimasis mitochondrijose ir oksidacinis
stresas, dėl to sumažėja mitochondrijų brinkimas, MNPP atsidarymas, ir taip širdies ląstelės apsaugomos nuo žūties [Facundo et al., 2005]. Manoma, kad mitochondrijų KATP kanalai yra atidaromi farmakologinio pripratinimo metu
aktyvinamų apsauginių kinazių PKG ir PKCε [Costa et al., 2005; 2006]. Viena iš hipotezių yra ta, kad PKG aktyvina tarpmembraninėje mito-chondrijų ertmėje esančią PKCε, kuri atidaro KATP kanalus [Costa et al.,
2005].
Mechanizmas, kaip Akt ir PKG apsaugo širdį nuo išemijos/reperfuzijos sukeliamų pažeidimų nėra žinomas. Galbūt tai tik tarpinės kinazės apsau-ginių kinazių kaskadoje slopinančios MNPP. Abi minėtos kinazės gali fosforilinti GSK 3β. Nefosforilinta GSK 3β yra aktyvi, o jos fosforilinimas Ser9 padėtyje šią kinazę slopina. GSK 3β fosforilina kinazės PKC, Akt
[Juhaszova et al., 2004], PKG [Das et al., 2008]. Teigiama, kad GSK 3β dalyvauja daugelyje širdį apsaugančių signalinių kaskadų. Širdies tinimas trumpais išemijos/reperfuzijos epizodais ar farmakologinis pripra-tinimas eritrpoetinu slopina GSK 3β aktyvumą ir taip sumažina širdies infarktinės zonos dydį [Nishihara et al., 2006]. Eksperimenatai su širdies ląstelėmis parodė, kad aktyvių apsauginių signalinių kaskadų galutinis efektorius yra GSK 3β funkcijų reguliavimas. Inhibuota GSK 3β gali slo-pinti MNPP atsidarymą [Juhaszova et al., 2004], tačiau veikimo me-chanizmas nėra žinomas. Tyrimai, nustatant GSK 3β vietą ląstelėje parodė, kad prieš sukeliant išemiją/reperfuziją, GSK 3β buvo aptikta citoplazmoje, o po išemijos/reperfuzijos fosforilintos GSK 3β padaugėjo citozolyje ir mito-chondrijose. Mitochondrijose fosforilinta GSK 3β gali sudaryti kompleksus su VDAC ir ANT, po išemijos/reperfuzijos šių kompleksų padaugėja apie 50% [Miura et al., 2009]. Manoma, kad GSK 3β susijungus su ANT, pastarasis nedalyvauja MNPP susiformavime [Nishihara et al., 2007].
Naujausios publikacijos teigia, kad mitochondrijų matrikso baltymas, MNPP poros komponentas, ciklofilinas D gali būti reguliuojamas per fosforilinamą/defosforilinimą, būtent, veikiant GSK 3β [Rasola et al., 2010]. Manoma, kad apsauginių signalinių kaskadų kinazės fosforilina ir taip slopina GSK 3β aktyvumą, todėl ši negali fosforilinti ciklofilino D, ir taip yra slopinamas MNPP susiformavimas [Rasola et al., 2010].
4. APSAUGINIS ESTROGENŲ POVEIKIS ŠIRDŽIAI
IŠEMIJOS/REPERFUZIJOS METU
Yra pastebėta, kad jaunos moterys širdies ir kraujagyslių ligomis serga rečiau nei to paties amžiaus vyrai. Vyresniame amžiuje (po 60) tiek vyrai, tiek moterys širdies ir kraujagyslių ligomis serga vienodai. Manoma, kad tai galėtų būti dėl moteriško hormono estradiolio kiekio organizme suma-žėjimo.
Estradiolis yra steroidinis hormonas, gaminamas kiaušidėse, nedideli kiekiai antinkščių žievėje, riebaliniame audinyje, vyrų organizme sėklidėse. Ląstelėje sintezuoti hormonai patenka į kraują ir yra išnešiojami po organiz-mą. Estrogenai kraujyje jungiasi su baltymais – 60% su albuminais ir 38% su gonadų steroidus pernešančiu globulinu. 2% estrogenų kraujo apytakoje cirkuliuoja laisvi ir yra fiziologiškai aktyvūs. Estradiolio kiekis moters organizme padidėja prieš ovuliaciją ir liuteininės fazės viduryje: ankstyvosios folikulinės fazės metu estradiolio išsiskiria 0,37 nM/l, o prieš ovuliaciją – 2,2 nM/l, nėštumo metu apie 70nM/l. Estrogenai veikia ne tik moteriškame organizme, jų poveikis pastebimas ir vyriškai reprodukcinei sistemai, vyro organizme estradiolis išsiskiria nuolat apie 0,18–0,74 nM/l [Mendelson et al., 1999].
Estrogenai reguliuoja fiziologinius procesus reprodukciniuose ir nere-produkciniuose audiniuose: kauluose, smegenyse, širdies ir kraujagyslių sistemoje. Estrogenai įvairius audinius veikia per estrogenų receptorius, kurie yra randami branduolyje, citozolyje ir plazminėje membranoje. Estradioliui prisijungus prie estrogenų receptorių gali būti aktyvinama genų raiška ląstelėje (genominis veikimo būdas) ir aktyvinamos baltymų kinazių kaskados citozolyje (negenominis veikimo būdas) [Simoncini et al., 2004; Fu et al., 2007]. Yra du estrogenų receptorių tipai α ir β, kurių paplitimas organizme yra skirtingas. Estrogenų receptorius α sutinkamas beveik visuo-se organizmo audiniuovisuo-se, o estrogenų receptoriaus β didesnė raiška yra kiaušidėse, prostatoje, plaučiuose, pagumburyje, kauluose, smegenyse, širdies ir kraujagyslių sistemoje [Taylor et al., 2000]. Skirtingas estrogenų α ir β receptorių aktyvumas skirtinguose audiniuose leidžia estrogenui veikti selektyviai, priklausomai nuo veikiamo organo funkcijos. Organizme esant nedideliai estrogenų koncentracijai, estrogenų receptoriai gali būti aktyvi-nami prisijungus augimo faktoriams [Mendelsohn et al., 1999].
Negenominis estrogenų poveikis pirmą kartą yra paminėtas prieš trisdešimt metų [Pietras et al., 1977], bet šio veikimo mechanizmas yra tyrinėjamas iki šiol. Greitas estrogenų veikimas pastebėtas nerviniame audinyje, vėžinėse ląstelėse, kauluose ir kremzlėse, makrofaguose, širdies ir
kraujagyslių sistemoje [Govind et al., 2003]. Estrogenai reguliuoja ląste-linius atsakus per plazminėje membranoje esančius estrogenų receptorius α [Pappas et al., 1995] ir β [Razandi et al., 1999]. Citoplazmoje estrogenų receptoriai dalyvauja antrinio signalo perdavimo kaskadų MAPK, tirozino kinazių, PI3K/Akt aktyvinime [Simoncini et al., 2004; Simoncini et al., 2007]. Yra parodyta, kad tiesioginė estrogenų receptorių α sąveika su reguliacinio PI3K subvienetu p85 aktyvina PI3K endotelio ląstelėse [Simoncini et al., 2000; Haynes et al., 2000].
Pastebėta, kad estrogenai dalyvauja ne tik reprodukcijoje, bet ir ląstelės žūties procesų reguliavime. Tyrimai su gimdos kaklelio ląstelių kultūromis parodė, kad estradiolis slopina proapoptotzinio P2X7 receptoriaus veikimą.
Esant aktyviems P2X7 receptoriams padidėja Ca2+ koncentracija citozolyje ir
mitochondrijose ir taip yra inicijuojama nuo mitochondrijų priklausoma apoptozė. Estradiolis, slopindamas P2X7 receptorių aktyvumą, mažina DNR
fragmentavimąsi, kaspazės-9 geno raišką ir aktyvumą, taip pat slopina Ca2+
sukeliamą mitochondrijų brinkimą ir MNPP [Wang et al., 2004].
Eksperimentai su žiurkėmis parodė, kad išemijos sukeliami pažeidimai patelių miokarde yra 11% mažesni nei patinėlių [Bae et al., 2005]. Estra-diolis teigiamai veikia širdies ir kraujagyslių sistemą: veikia kaip vazodi-latatorius [Bell et al., 1995], slopina Ca2+ srautą kraujagyslių lygiuosiuose raumenyse [Jovanovic et al., 1997], apsaugo nuo hipertenzijos ir vainikinių arterijų ligų, gerina miokardo atsistatymą po infarkto [Ho et al., 2002]. Estradiolis slopina išemijos sukeliamas aritmijas dėl L tipo Ca2+ kanalo srovės slopinimo [Philp et al., 2006].
Estrogenai pasižymi antioksidacinėmis savybėmis. Yra parodyta, kad šie hormonai širdies ląstelėse mažina superoksido kiekį, išaugusį po išemi-jos/reperfuzijos, taip pat inhibuoja lipidų ir lipoproteinų oksidaciją [Kim et al., 1996]. Estradiolio antioksidacinis poveikis gali būti tiesioginis dėl jo struktūrinių savybių – steroidinės molekulės A žiede esančios hidroksilo grupės [Behl et al., 1997] ar dėl fenolinės struktūros [Speir et al., 2000], arba netiesioginis, aktyvinant antioksidantinius procesus ląstelėje [Kim et al., 2006].
Ištyrimui, ar estradiolis gali sumažinti išemijos/reperfuzijos sukeliamas pažaidas buvo atliekami eksperimentai su žiurkėmis, kurioms buvo pašalin-tos kiaušidės, bet organizme palaikoma estrogenų koncentracija. Tokių žiurkių širdys buvo perfuzuojamos Langendorfo perfuzinėje sistemoje, po to buvo sukeliama 30 min. išemija ir 120 min. reperfuzija. Gauti rezultatai parodė, kad estradiolis po išemijos reperfuzijos pagerino kairiojo skilvelio darbą, padidino pratekėjimą vainikine arterija, o miokardo sugeriamas Ca2+ kiekis buvo toks pat kaip ir kontrolinės grupės. Taipogi veikiant estradioliui
buvo išsaugota mitochondrijų struktūra, jos buvo neišbrinkusios [Zhai et al., 2000].
Manoma, kad estradiolis apsaugo nuo išemijos/reperfuzijos pažeidimų veikdamas per estradiolio receptorius, ir taip aktyvindamas citozolines signalines molekules [Wang et al., 2009]. Eksperimentai su pelėmis, ku-rioms buvo pašalintos kiaušidės ir palaikomas estradiolio koncentracija organizme, po vainikinės arterijos perrišimo apoptozė buvo mažesnė dėl Akt kinazės aktyvinimo. Apsauginis estradiolio poveikis buvo panaikintas naudojant estradiolio receptorių slopiklį ICI 182 780 ir PI3K slopiklius LY 294002 ar vortmaniną [Patten et al., 2004]. 17-β estradiolis apsaugojo neu-ronų ląsteles nuo oksidacinio streso sukeliamos ląstelių žūties veikdamas per PI3K/Akt kinazių kaskadą [Yu et al., 2004].
Estradiolis apsaugojo triušių širdis nuo išemijos/reperfuzijos sukeliamų pažeidimų veikdamas per estradiolio receptorius. Selektyvus estradiolio receptorių α aktyvikis – PPT kaip ir estradiolis sumažino tropanino kiekį reperfuzate ir sumažino infarkto zoną [Booth et al., 2005]. Estradiolio receptorių β specifinis aktyviklis DPN pagerina širdies funkcijų atsistatymą po išemijos/reperfuzijos. Genų raiškos tyrimai parodė, kad DPN pdidino šiluminio šoko baltymo 79, ciklooksigenazės 2, ir antiapoptotinių baltymų genų raišką [Nikolic et al., 2007].
Pelėms, kurioms buvo išveiklintas (knok out) estradiolio receptoriaus β genas, po išemijos/reperfuzijos sumažėjo PI3K/Akt aktyvumas, išaugo kas-pazės-3, ir kaspazės-8 aktyvumai, sumažėjo Bcl-2 lygis lyginant su norma-liomis pelėmis [Pelzer et al., 2005; Wang et al., 2009]. Tai rodo, kad estradiolio receptoriai β gali būti svarbūs PI3K/Akt kinazių ir antiapop-totinių signalų aktyvinime miokarde išemijos metu [Wang et al., 2009], bet galutinis šių molekulių efektorius ląstelėje nėra žinomas.
Stirone tyrimų grupė savo eksperimentuose naudojo žiurkių pateles, kurioms buvo pašalintos kiaušidės ir palaikoma estrogenų koncentracija organizme. Iš tokių gyvūnėlių buvo izoliuojamos smegenų kraujagyslių mitochondrijos. Western blot analizė parodė, kad dėl estradiolio veikimo padidėja citochromo c kiekis mitochondrijose. Norint papildomai ištirti estrogeno poveikį kraujagyslių mitochondrijoms, iš smegenų kraujagyslių izoliuotos mitochondrijos buvo 18 val. inkubuojamas su 10 nM estradiolio koncentracija ir matuojamas citochromo c kiekis. Šios grupės mitochond-rijose citochromo c kiekis buvo didesnis, nei mitochondmitochond-rijose neinkubuotose su estradioliu. Tai rodo, kad estradiolis apsaugo smegenų kraujagyslių mitochondrijas nuo citochromo c netekimo [Stirone et al., 2005]. Estradiolis taip pat slopino gliutamato sukeliamą neuronų apoptozę, nes apsaugojo mitochondrijas nuo citochromo c netekimo [Zhang et al., 2005].
Citochromas c iš mitochondrijų gali išeiti dėl MNPP atsidarymo [Hengartner et al., 2000], todėl manoma, kad estradiolis galėtų apsaugoti mitochondrijas nuo MNPP atsidarymo. Mechanizmas, kaip estradiolis apsaugo MNPP nėra žinomas. Manoma, kad estradiolis per aktyvius estra-diolio receptorius galėtų aktyvinti citozolines signalines kaskadas, arba estradiolis galėtų susijungti su mitochondrijose esančiais estrogenų recepto-riais [Pedram et al., 2006] ir taip slopinti išemijos sukeliamą MNPP atsidarymą [Borras et al., 2010].
Mūsų laboratorijoje atlikti tyrimai parodė, kad 100 nM estradiolio slopino Ca2+ sukeliamą citochromo c išėjimą izoliuotose širdies mitochond-rijose, bet neturėjo poveikio mitochondrijų brinkimui [Morkūnienė et al., 2002], taigi Ca2+ sukeliamas citochromo c netekimas yra dėl MNPP atsi-darymo. Apsauginis estradiolio poveikis citochromo c sulaikymui mito-chondrijose padidėjo esant ATP, tai rodo, kad šiame procese taip pat galėtų dalyvauti ANT. Estradiolis neturėjo poveikio Ca2+ sukeliamam mitochond-rijų kvėpavimo greičio slopinimui, tai leidžia teigti, kad estradiolis nekontroliuoja Ca2+ patekimo į mitochondrijas [Morkūnienė et al., 2002]. Atlikti tyrimai su izoliuotomis širdies mitochondrijomis rodo, kad estradio-lis gali apsaugoti mitochondrijas nuo MNPP sukelto citochromo c išėjimo. Citochromo c išėjimas yra vienas iš ankstyvųjų miokardo išemijos reiškinių. Ar gali estradiolis sustabdyti citochromo c netekimą ir su tuo susijusį mitochondrijų kvėpavimo sulėtėjimą bei apoptozės aktyvaciją išemijos metu nėra nustatyta.
5. APSAUGINIS AZOTO MONOKSIDO POVEIKIS
ŠIRDŽIAI IŠEMIJOS/REPERFUZIJOS METU
1980 m. azoto monoksidas (NO) buvo aprašytas kaip faktorius regu-liuojantis kraujagyslių spindį ir mažinantis kraujo spaudimą. Žinoma, kad NO aktyviai dalyvauja signalo perdavime neuronuose, organizmo imuninėse reakcijose, taip pat yra svarbus širdies ir kraujagyslių fiziologiniuose pro-cesuose, trombocitų aktyvinime ir agregacijoje, trombocitų-leukocitų są-veikoje [Naseem et al., 2005].
Ląstelėse NO yra gaminamas iš L- arginino O2 ir NADPH kanalizuojant
fermentui azoto monoksido sintazei (NOS) [Knowles et al., 1994]. NOS yra sudaryta iš oksiduojančios ir redukuojančios srities. Oksiduojančioje srityje yra prisijungęs hemas ir iš β-klosčių sudarytas L-argininą prijungiantis aktyvus centras, kuriame yra prisijungę Zn jonai. C-gale yra Ca2+ /kalmo-duliną prisijungiantis aktyvus centras. NOS redukuojančioje srityje yra FAD, FMN ir NADPH prijungiančios sritys. Elektronai iš FAD, FMN ir NADPH yra perduodami hemo grupei. Elektronų perdavimas iš minėtų kofermentų yra kontroliuojamas Ca2+/kalmodulino kompleksu, kai prisijun-gus šiam junginiui pasikeičia NOS konformacija [Garcin et al., 2004]. Eukariotų NOS monomerų molekulinė masė yra 120-161 kDa. NOS aktyvi forma yra dimeras, kurio susidarymo metu oksiduojančioje dalyje prisijun-gia tetrahidrobiopterinas [Wainwright et al., 2005]. Žinduolių ląstelėse yra randamos kelios NOS izoformos. Pirmoji buvo identifikuota kraujagyslių endotelyje – endotelinė azoto monoksido sintazė (eNOS). Vėliau buvo atrastos NOS izoformos smegenų ląstelėse – neuroninė (nNOS) ir akty-viuose makrofaguose – sužadinamoji NO sintazė (iNOS). eNOS ir nNOS yra panašios savo struktūra: ta pati baltymų kinazės A fosforilinama vieta, tokios pat NADPH, FMN, FAD ir Ca2+/kalmoduliną prijungiančios sritys. Bet eNOS, lyginant su nNOS, yra trumpesnis N galas ir prijungta miristoilo grupė. Manoma, kad būtent miristoilo grupė lemia eNOS prisijungimą prie ląstelių membranos [Knowles et al., 1994]. eNOS ir nNOS aktyvumas yra reguliuojamas Ca2+. Padidėjus Ca2+ koncentracijai ląstelės citozolyje susidaro Ca2+/kalmodulino kompleksas, kuris jungiasi prie nNOS ir eNOS ir taip yra pradedama NO gamyba iš L-arginino ir NADPH [Yu et al., 2005]. iNOS aktyvumas nepriklauso nuo Ca2+ koncentracijos, šią NO sintazę akty-vina padidėjusi citokinų ar lipopolisacharidų koncentracija uždegimo metu [Murad et al., 1992].
NO yra maža, hidrofobinė molekulė, lengvai pereinanti per ląstelių membranas. NO greitai gali difunduoti nuo sintezės vietos per atstumą lygų kelių ląstelių diametrui. NO difuzija per ląsteles yra kelis kartus greitesnė,
nei NO panaudojimas ląstelės viduje. Dažniausiai NO gaminančios ląstelės palaiko reikiamą šio junginio koncentraciją ir aplinkinėse ląstelėse [Murphy et al., 1999]. Pavyzdžiui, eNOS yra aktyvi tik endotelio ląstelėse, jose pagamintas NO difunduoja į kraujagyslių lygiųjų raumenų ląsteles [Know-les et al., 1994].
NO veikimas priklauso nuo sąveikos su kitomis molekulėmis ir nuo koncentracijos ląstelėse. Žema NO koncentracija (mažesnė nei 0,1nM) pagerina širdies skilvelio darbą [Rassaf et al., 2006], reguliuoja deguonies kiekio sunaudojamą miokarde. Didelė NO koncentracija (didesnė nei 100 nM) gali sukelti uždegimines reakcijas ir slopinti širdies susitraukimo funkcijas [Bolli et al., 2007]. Esant fiziologinei NO koncentracijai 0,1-100 nM NO gali sąveikauti ir su kai kuriais hemo grupę turinčių fermentais - guanilato ciklaze, citochromo oksidaze, katalaze, citochromu P-450 [Kerwin et al.,1995]. Fiziologinės NO koncentracijos reguliuoja viso organizmo kraujagyslių spindį [Moncada et al., 1997]. Padidėjusi NO koncentracija padidina kraujo pratekėjimą, ir taip sumažina kraujagyslių nepraeinamumą [Han 2002]. NO sąveika su guanilatciklazės hemo Fe2+ aktyvina cGMP gamybą. cGMP yra antrinis signalo tarpininkas veikiant NO [Han et al., 2008]. cGMP gali aktyvinti citozolines baltymų kinazių kaskadas: baltymų kinazę G [Takasago et al., 1991; Burley et al., 2007; Rastaldo et al., 2007] ir baltymų kinazę C [Takasago et al., 1991], kurios dalyvauja reguliuojant kraujagyslių spindį.
Manoma, kad širdies pripratinimo apsauginiuose mechanizmuose daly-vauja NO. Buvo atliktas tyrimas su žiurkių patelėmis, kurioms prieš su-keliant 30 min. išemiją ir 90 min. reperfuziją, buvo sukeliami trys trumpi išemijos/reperfuzijos ciklai, po to širdys buvo homogenizuojamos, centrifu-guojamos, supernatante buvo matuojamas NO kiekis, NOS aktyvumas, ir cGMP kiekis. Rezultatai parodė, kad širdies pripratinimas padidina NO, cGMP kiekį, bei NOS aktyvumą. Tai rodo, kad šio proceso metu yra aktyvinama NOS ir taip padidėja cGMP kiekis. Išemijos metu NOS aktyvumas galėtų padidėti dėl padidėjusios Ca2+ ir NADPH koncentracijos
citozolyje [Han et al., 2008].
Nustatyta, kad širdies pripratinimo metu padidėjusi iNOS geno raiška ir aktyvumas gali apsaugoti širdį nuo išeminių/reperfuzinių pažeidimų [West et al., 2008]. Dėl iNOS padidėjusios genų raiškos ir aktyvumo sumažėjo infarkto zona, buvo slopinama ROS generacija. MNPP tyrimui buvo matuojamas NAD+ kiekio padidėjimas. Padidėjęs iNOS aktyvumas slopino MNPP susidarymą ir atraktilozidas nepanaikino šio iNOS poveikio. Taip pat aktyvi NOS, kaip ir NO donoras(NOC-22), apsaugojo širdį nuo iše-minių/reperfuzinių pažaidų. NO donoras (NOC-22) gali aktyvinti apsau-gines kaskadas kardiomiocituose [West et al., 2008]. Egzogeninis NO gali
veikti sarkolemos baltymą 130, ar veikdamas per auglio nekrozės faktorių α aktyvinti janus-aktyvinamas kinazes, taip didindamas iNOS geno raišką branduolyje. Taip pat manoma, kad NO aktyvintos minėtos kinazės gali perduoti signalą mitochondrijoms [Heusch et al., 2008].
Mechanizmas, kaip NO apsaugo miokardą nuo išemijos/reperfuzijos sukeliamų pažeidimų, nėra pilnai išaiškintas. Aukšta NO koncentracija aktyvina MNPP ir citochromo c patekimą į citozolį [Bruwell et al., 2008], o nedidelės NO dozės (11 nM) gali uždaryti MNPP ir apsaugoti mitochond-rijas nuo citochromo c netekimo [Brookes et al., 2000]. NO gali skatinti reaktyvių azoto junginių susidarymą (RNS), kurie gali nitrozilinti baltymus ir taip keisti jų funkcijas [Arat et al., 2006]. Susidarę reaktyvūs azoto junginiai negrįžtamai slopina prie kvėpavimo grandinės I, II, III, ir IV kompleksus, ATPazę, kreatino kinazę, akonitazę [Brown et al., 2002]. Taip pat NO gali reguliuoti mitochondrijų kvėpavimą konkurentiškai prisijung-damas prie citochromo oksidazės. Taip NO netiesiogiai galėtų apsaugoti mitochondrijas nuo nespecifinio laidumo, nes slopinant citochromo oksi-dazės aktyvumą yra depoliarizuojama mitochondrijų membrana ir suma-žinamas Ca2+ patekimas į mitochondrijas [West et al., 2008; Jones et al.,
2006].
Atlikti tyrimai rodo, kad NO veiksmingai mažina išemijos/reperfuzijos sukeliamus miokardo pažeidimus, bet apsauginis mechanizmas nėra iki galo ištirtas. Šių dujų veikimas išemijos/reperfuzijos metu širdies ląstelėse yra labai platus, tai leidžia manyti, kad apsauginis mechanizmas yra sudėtingas ir daugialypis, o vienas iš taikinių galėtų būti mitochondrijos. Šiame darbe buvo tiriama kokį poveikį mitochondrijoms turės širdies perfuzija su NO donoru prieš sukeliant išemiją ar išemiją reperfuziją, ir koks gali būti NO poveikio mitochondrijoms mechanizmas. Tai leistų įvertinti NO veikiamas grandis, kurias būtų galima reguliuoti įvairių širdies patologijų atvejais.
6. METODAI IR MEDŽIAGOS
6.1 Tyrimų pobūdis
Eksperimentais buvo tiriamas pripratinimo estradioliu ar NO poveikis žiurkės širdies mitochondrijoms išemijos metu. Buvo naudojami Wistar veislės žiurkių patelės ir patinėliai. Žiurkių širdys prieš sukeliant išemiją buvo perfuzuojamos su Krebs-Henseleit tirpalu prisotintu NO donoru NOC-18 (50 µM) ar 17-β-estradioliu (100 nM) (aukšta fiziologinė koncentracija). Apsauginio medžiagų poveikio tyrimui buvo pasirinkti trys modeliai: 30 min. išemijos, 60 min. išemijos ir 30 min. išemijos/30 min. reperfuzijos. Iš tokių širdžių diferencinio centrifugavimo būdu skiriamos mitochondrijos ir tiriama išskirtų mitochondrijų funkcinis aktyvumas, bei spektrofotomet-riškai nustatytas citochromų cc1 ir aa3 kiekis jose. Mitochondrijų izoliavimo metu buvo atskiriama citozolinė frakcija, kuri buvo panaudojama citochromo c kiekio nustatymui imunofermentiniu metodu bei matuojamas kaspazių aktyvumas (spektrofotometriškai). Nekroziniams pažeidimams įvertinti buvo matuojamas laktato dehidrogenazės aktyvumas reperfuzate (spektrofotometriškai). Apoptozei nustatyti buvo daromi širdies audinio pjūviai, kuriuose buvo įvertinta kardiomiocitų branduolio DNR fragmen-tacija (imunofermentiškai).
Apsauginio estradiolio ir NO poveikio mechanizmo ištyrimui širdys buvo perfuzuojamas su slopikliais (6.1.1 lent.).
6.1.1 lentelė. Širdžių perfuzijai naudotos medžiagos
Medžiaga Koncentracija Perfuzijos trukmė
17-β-estradiolis 100 nM 15 min.
NO donoras NOC-18 50 µM 4 min.
Estradiolio receptorių slopiklis ICI 182780 10 µM 10 min.
Estradiolio receptorių β aktyviklis DPN 20 nM 10 min.
Akt kinazės slopiklis V 5 µM 15 min.
5-Hydroksidekanoinė r. (KATP blokatorius) 100 µM 15 min.
NOS slopiklis LNAME 100 µM 10 min.
PKG slopiklis KT 58231 1 µM 5 min.
GSK 3β slopiklis I 100 µM 10 min.
PKCε slopiklis Ro-32-0432 500 nM 10 min.
PKC slopiklis Ro-31-8220 1 µM 10 min.
Buvo tikrinamas perfuzijai pasirinktos medžiagos tiesioginis poveikis širdies mitochondrijų kvėpavimo greičiui, kaip substratus naudojant piruvatą ir malatą, ar sukcinatą terpėje esant rotenono. Taip pat buvo
atliekama širdžių perfuzija su pasirinktais slopikliais, ir tiriamas poveikis mitochondrijoms be išemijos.
6.2 Širdies perfuzija bei išemijos sukėlimas
Eksperimentui naudojamos Wistar veislės žiurkės anestezuojamos CO2
garais ir nutraukimas stuburo kanalas kaklo srityje. Atvėrus krūtinės ląstą, kraujo krešėjimui sustabdyti į kairįjį širdies skilvelį suleidžiama injekcijoms skirto heparino tirpalo (aktyvumo vienetai 5000TV/ml, 37 °C). Širdis perke-liama į pusiau uždarą termostatuojamą kamerą (37 °C), į aortą įstatoma plastikinė kaniulė, prijungta prie Langendorfo tipo širdies perfuzijos sis-temos. Perfuzijai yra naudojamas Krebs-Henseleit tirpalas: 11 mM gliuko-zės, 118 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 4,8 mM KCl, 1,2 mM KH2PO4, 1,2
mM – CaCl2, 1,6 mM MgSO4, 0,7 mM Na-piruvato, prisotintas 95% – O2 ir
5% – CO2, papildomai pridedant tirimui naudojamų medžiagų (6.1.1 lent.).
Srauto tekėjimo greitis – 20–25 ml/min. Tais atvejais, kai po širdies per-fuzijos buvo sukeliama išemija, tirpalo tekėjimas buvo sustabdomas ir širdis laikoma uždaroje drėgnoje termostatuojamoje kameroje 30 min. ar 60 min.. Reperfuzijos modeliui po 30 min. išemijos terpės tekėjimas atnaujinamas 30 min. Prieš izoliuojant mitochondrijas širdis kelias minutes buvo laikomos 0.9% 0 °C KCl tirpale, kad nustotų susitraukinėti ir sulėtėtų metabolizmas bei nevyktų autolizės procesai.
6.3 Mitochondrinės bei citoplazminės frakcijų išskyrimas
Mitochondrijos izoliuojamos diferencinio centrifugavimo metodu [Scholte et al., 1973]. Širdis yra smulkinama žirklutėmis ant ledų padėtoje Petri lėkštelėje ir homogenizuojama mechaniniu homogenizatoriumi (stik-las/teflonas) užpilant 10 ml/g audinio homogenizamo terpės (160 mM KCl, 10 mM NaCl, 20 mM TrisHCl, 2 mM EGTA, pH 7,7, 20 C temp.). Centrifuguojama 750×g 5 min. supernatantas perpilamas per dvigubą mar-linį filtrą, nenupilant nuosėdų ir paskutinių supernatanto lašų ir guojamas 6750×g 10 min. pakartotinai. Supernatantas papildomai centrifu-guojamas 10000×g 30 min. ir panaudojamas citochromo c kiekio nusta-tymui imunofermentiniu būdu. Mitochondrijos suspenduojamos suspenda-vimo terpėje (160 mM KCl, 20 mM TrisHCl, 1 mM EGTA pH 7,3, 2 °C temp.). Mitochondrijų suspensija yra laikoma leduose.
6.4 Mitochondrijų baltymo kiekio nustatymas biureto metodu Baltymo kiekis mitochondrijų suspensijoje nustatomas modifikuotu biureto metodu [Gornall et al., 1949]. Į 0.05 ml mitochondrijų suspensijos įpilama 0.95 ml 0.33% dezoksicholato tirpalo, gerai sumaišoma ir 5 min. inkubuojama vandens termostate 37 °C temperatūroje. Po to įpilama 4 ml biureto reagento, sumaišoma ir 15 min. inkubuojama 37 °C. Gauto tirpalo optinis tankis matuojamas fotometru Helios α 536 nm ilgio bangoje. Bal-tymo kiekis nustatomas pagal kalibracinę kreivę, kuriai sudaryti naudojamas standartinis baltymo tirpalas, pagamintas iš žmogaus serumo albumino.
6.5 Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimas
Mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo registruojamas poliarografiškai, naudojant uždarą Klarko tipo deguonies elektrodą ir poliarografą „Rank Brothers LTD, England“. Matavimus atlikome 37 °C temperatūroje. Nusta-tėme, kad 1 ml inkubacinės terpės yra 420 nanoatomų deguonies, kurį naudojome apskaičiuojant mitochondrijų kvėpavimo greičius. Kvėpavimo greitis išreiškiamas nmolO/min. mg mitochondrijų baltymo. Mitochondrijų kvėpavimo matavimai atliekami inkubacinėje terpėje (110 mM KCl, 10 mM Tris HCl, 5 mM KH2PO4, 1 mM laisvo Mg2+, pH 7.2 37°C). Kaip substratai
naudoti 1 mM piruvato + 1 mM malato, arba 1mM sukcinato papildomai pridedant 1 µM rotenono. Mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje meta-bolinėje būsenoje buvo registruojamas naudojant 50 mM kreatiną, 4 E/ml kreatino kinazę ir 1 mM ATP. Kreatino kinazė kreatino fosforilinimui naudoja ATP ir taip inkubacinėje terpėje yra palaikoma didelė ir pastovi ADP koncentracija. Citochromo c efektas matuotastrečioje metabolinėje būsenoje terpėje esant 75 µM egzogeninio citochromo c.
6.6 Citochromų c ir a kiekio mitochondrijose nustatymas
Izoliuotos širdies mitochondrijos (0,5 mg/ml) buvo ištirpinamos 0,3% Triton X-100 tirpale. Citochromų cc1 bei citochromo aa3 kiekis buvo nustatomas spektrofotometru (Hitachi 557) pagal redukuotų Na hidrosulfitu (keletas grūdelių) bei oksiduotų vandenilio peroksidu (0,3%) citochromų šviesos sugerties skirtumą. Sugertis buvo matuojama bangos ilgių ribose tarp 650 nm ir 500 nm, citochromo a sugerti yra ties 605 nm ilgio banga, o citochromo cc1 550 nm. Citochromų kiekis apskaičiuotas pagal formulę [Rieske et al., 1967]:
C= ε 1000 ⋅ ∆Α ,
∆Α– redukuotų ir oksiduotų citochromų šviesos sugerties skirtumas, ε – molinis sugerties koeficientas (citochromų cc1 – 14,5 mM–1 cm–1; citochromų aa3 – 16,5 mM–1 cm–1).
Citochromų kiekis išreikštas nmol/mg mitochondrijų baltymo. 6.7 Citochromo c kiekio nustatymas citoplazminėje frakcijoje Citochromo c kiekis citoplazminėje frakcijoje nustatomas imunofer-mentiškai naudojant ELISA rinkinį, skirtą žiurkių ir pelių citochromo c nustatymui subląstelinėse frakcijose. Į mikrolėkštelę buvo įlašinama 75 µl citochromo c konjugato tirpalo, po 50 µl standarto, kontrolės ar tiriamo pavyzdžio tirpalo. Atsargiai maišoma apie 1 min., uždengiama ir paliekama kambario temperatūroje 2 val. Citochromas c yra surišamas specifine sąveika antikūnas – antigenas. Po 2 val. nesurištos medžiagos išplaunamos su plovimo buferiu (400 µl). Po to į lėkštelę įlašinamas substrato tirpalas (100 µl). Inkubuojama 30 min. kambario temperatūroje, saugant nuo šviesos. Įvykus fermentinei reakcijai, tirpalas nusidažo mėlynai, o po Stop-tirpalo pridėjimo (100 µl) tampa geltonas. Nustatomas šių tirpalų optinis tankis 450 nm ir 540 nm ilgio bangose (spektrofotometriškai). Spalvos intensyvumas yra proporcingas surišto citochromo c kiekiui, kuris yra apskaičiuojamas iš kalibracinės kreivės, sudaromos pagal citochromo c standartinio tirpalo įvairių praskiedimų (0,78-100 ng/ml) optinio tankio reikšmes.
6.8 Kaspazių aktyvumo matavimas
Kaspazių aktyvumas širdžių citoplazminėse frakcijose buvo nustatomas spektrofotometru matuojant p-nitroanilino (pNA), susidariusio kaspazėms skaldant substratą z-DEVD-pNA, koncentracijos didėjimą. Matavimams buvo naudojama inkubavimo terpė (50 mM HEPES, 10% sacharozės, 1 mM MgCl2, 1 mM ATP, pH7.4, 37°C), kurioje citozolinės frakcijos baltymo
koncentracija galutiniame reakcijos mišinyje – 2 mg/ml. Į paruoštą reakcijos mišinį įdedama 0.1 mM kaspazių substrato z-DEVD-pNA, ir mišinys inkubuojamas 37 °C. Po 1 min., po 30 min. ir po 60 min. paimama 200 µl reakcijos mišinio ir praskiedžiama matavimo terpe iki 1 ml (50 mM HEPES, 10 % sacharozės ir 0.1 mg/ml jaučio serumo albumino pH=7,4, 37°C). pNA koncentracija praskiestame mišinyje matuojama spektrofotometru Hitachi 557 registruojant 405 nm bangos ilgio šviesos sugerties intensyvumą.
