NEUTROFILŲ IR MAKROFAGŲ FUNKCINIAI YPATUMAI SERGANT LĖTINE OBSTRUKCINE PLAUČIŲ LIGA

KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS

Agnė Babušytė

NEUTROFILŲ IR MAKROFAGŲ FUNKCINIAI

YPATUMAI SERGANT LĖTINE OBSTRUKCINE

PLAUČIŲ LIGA

Daktaro disertacija

Biomedicinos mokslai, biologija (01 B)

Disertacija rengta 2005 – 2009 metais Kauno medicinos universitete Biomedicininių tyrimų instituto Pulmonologijos laboratorijoje bei Pulmonologijos ir imunologijos klinikoje.

Mokslinis vadovas:

dr. Jolanta Jeroch (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01 B)

Konsultantai:

prof. dr. Raimundas Sakalauskas (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 07 B)

TURINYS

SANTRUMPOS ... 5

1. ĮVADAS ... 6

1.1 Darbo tikslas ir uţdaviniai ... 8

1.2 Mokslinis darbo naujumas ... 8

2. LITERATŪROS APŢVALGA ... 10

2.1 Lėtinės obstrukcinės plaučių ligos patogenezė ... 10

2.2 Kvėpavimo takų ir sisteminis uţdegimas sergant lėtine obstrukcine plaučių liga ... 12

2.3 Rūkymas – vienas pagrindinių lėtinę obstrukcinę plaučių ligą sąlygojančių veiksnių ... 14

2.4 Neutrofilai ir makrofagai – pagrindinės lėtinės obstrukcinės plaučių ligos patogenezėje dalyvaujančios ląstelės ... 15

2.5 Uţdegimui tarpininkaujančių ląstelių sintetinami ţymenys ir jų svarba lėtinės obstrukcinės plaučių ligos patogenezei ... 21

2.5.1 Matrikso metaloproteinazė-12 ... 22

2.5.2 Interleukinas-8 ... 23

2.6 Kraujo neutrofilų chemotaksis kvėpavimo takų uţdegimo metu ... 24

2.7 Neutrofilų fagocitozė ir ją aktyvinantys veiksniai ... 27

2.8 Oksidacinis stresas ir reaktyviųjų deguonies formų susidarymo ypatumai sergant lėtine obstrukcine plaučių liga ... 29

3. TYRIMŲ ORGANIZAVIMAS IR METODIKA ... 34

3.1 Tiriamųjų kontingentas ... 34

3.1.1 Kvėpavimo takų sekreto ląstelių ir uţdegimo ţymenų tyrimai ... 35

3.1.2 Kraujo neutrofilų funkcinių savybių analizė ... 36

3.2 Mėginių paruošimas ... 37

3.2.1 Indukuoti skrepliai ... 37

3.2.2 Bronchoalveolinio lavaţo skystis ... 38

3.2.3 Periferinis kraujas ... 39

3.2.4 Neutrofilų kultūros ... 39

3.3 Tyrimų metodai ... 40

3.3.1 Uţdegime dalyvaujančių ląstelių sudėties kvėpavimo takų sekrete nustatymas ... 40

3.3.2 Matrikso metaloproteinazės-12 raiškos tyrimas ... 41

3.3.3 Interleukino-8 koncentracijos nustatymas ... 42

3.3.4 Neutrofilų funkcinių savybių vertinimas ... 43

3.3.4.2 Fagocitozė ... 46

3.3.4.3 Reaktyviųjų deguonies formų susidarymas ... 47

3.4 Matematinė-statistinė duomenų analizė ... 49

4. REZULTATAI ... 50

4.1 Kvėpavimo takų sekreto ląstelių sudėties vertinimas ... 50

4.1.1 Indukuotų skreplių ląstelių sudėtis ... 50

4.1.2 Bronchoalveolinio lavaţo skysčio ląstelių sudėtis ... 51

4.2 Uţdegimo ţymenų raiškos ir koncentracijos ypatumų nustatymas ... 52

4.2.1 Matrikso metaloproteinazės-12 raiška ... 52

4.2.2 Interleukino-8 koncentracija ... 53

4.3 Biologiniais ir cheminiais veiksniais aktyvintų kraujo neutrofilų funkcinių savybių tyrimas ... 54

4.3.1 Neutrofilų chemotaktinis aktyvumas ... 54

4.3.2 Neutrofilų fagocitinis aktyvumas ... 59

4.3.3 Reaktyviųjų deguonies formų susidarymo pokyčiai ... 63

5. REZULTATŲ APTARIMAS ... 72

5.1 Indukuotų skreplių ir bronchoalveolinio lavaţo skysčio ląstelių sudėties ypatumai ... 72

5.2. Matrikso metaloproteinazės-12 raiškos kvėpavimo takų sekrete analizė ... 74

5.3 Interleukino-8 koncentracija kvėpavimo takų sekrete ir kraujyje ... 76

5.4. Interleukino-8 ir kvėpavimo takų sekreto įtakoti kraujo neutrofilų chemotaksio pokyčiai ... 77

5.5 Biologiniais veiksniais stimuliuotos kraujo neutrofilų fagocitozės analizė ... 80

5.6 Biologinių ir cheminių veiksnių sąlygoti reaktyviųjų deguonies formų susidarymo kraujo neutrofiluose ypatumai ... 82

6. IŠVADOS ... 86

7. DARBO PRAKTINĖ REIKŠMĖ ... 88

8. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 89

SANTRUMPOS

AAT alfa-1 antitripsinas ATP adenozino trifosfatas BAL bronchoalveolinis lavaţas

BSA jaučio serumo albuminas (angl. k. bovine serum albumin) CO2 anglies dioksidas dH2O distiliuotas vanduo DHR-123 dihidrorodaminas-123 DMSO dimetilsulfoksidas DNR dezoksiribonukleino rūgštis DTT ditiotreitolis

EDTA etilendiamino tetraacto rūgštis ERS Europos respiratologų sąjunga

FVC forsuota gyvybinė plaučių talpa (angl. k. forced vital capacity)

FEV1 forsuoto iškvėpimo tūris per pirmąją sekundę (angl. k. forced expiratory volume in 1

sec.)

FITC fluoresceino izotiocianatas H2O2 vandenilio peroksidas IgG imunoglobulinas G IL interleukinas

LOPL lėtinė obstrukcinė plaučių liga

nAChR nikotino klasės acetilcholino receptoriai NADPH nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas MMP matrikso metaloproteinazė

PBS fosfatinio buferio tirpalas

PMA forbolio 12-miristato 13-acetatas

PKA, -B, -C baltymų kinazė A, -B, -C (angl. k. protein kinase A, -B, -C) ROS reaktyviosios deguonies formos (angl. k. reactive oxygen species) S. aureus Staphylococcus aureus

1. ĮVADAS

Lėtinė obstrukcinė plaučių liga (LOPL) – lėtai progresuojanti iš dalies išnykstanti kvėpavimo takų obstrukcija, atsirandanti dėl nenormalaus uţdegiminio plaučių atsako į ţalingas su oru įkvepiamas daleles ar dujas [1, 2]. Šiuo metu visame pasaulyje ir Lietuvoje [2, 3] LOPL yra viena daţniausių mirties prieţasčių, todėl intensyviai tiriami šios ligos patogenezės ypatumai, kuriami nauji tyrimų modeliai, padedantys įvertinti uţdegiminių signalų perdavimo ypatumus. Tačiau iki šiol ligos patogenezė nėra visiškai ţinoma.

Neabejotinai pagrindiniu LOPL lemiančiu aplinkos veiksniu įvardijamas rūkymas, tačiau tai yra sisteminė daugiakomponentė liga, todėl manoma, jog patofiziologinius šios ligos ypatumus lemia ne vienas, o keli veiksniai [1, 2]. Daţniausiai uţdegiminius procesus sąlygoja įvairių ląstelių sintetinami uţdegimo ţymenys, kurie sąveikaudami su aplinkos veiksniais (pvz. cigarečių dūmuose esančiomis medţiagomis) dar labiau skatina ţalingų biologiškai aktyvių medţiagų sintezę ir sąlygoja intensyvesnį tiek sisteminį, tiek kvėpavimo takuose vykstantį uţdegiminį procesą [4-7].

Sergant LOPL plaučių audinyje ir kvėpavimo takų sekrete, t.y. indukuotuose skrepliuose ir bronchoalveolinio lavaţo (BAL) skystyje pagausėja aktyvių uţdegime dalyvaujančių ląstelių, ypatingai neutrofilų ir makrofagų [4-9], sutrinka proteinazių/antiproteinazių santykis [10]. Šie procesai lemia įvairius kvėpavimo takų ląstelių ir audinio paţeidimus. Padidėjus proteinazių koncentracijai ir aktyvumui, maţėja apsauginėmis savybėmis pasiţyminčių antiproteinazių, slopinamos jų funkcinės savybės. Matrikso metaloproteinazės (MMPs) yra vienos svarbiausių degeneracinius procesus lemiančios proteinazės, gebančios skaidyti daugumą ekstraląstelinio matrikso makromolekulių, neigiamai įtakoti imunines reakcijas ir skatinti uţdegiminių citokinų sintezę. Makrofaguose sintetinamos MMP-12 svarba rūkymo sąlygotai emfizemai susidomėta nustačius, jog transgeniniai gyvūnai, kurių ląstelėse nevyksta šios proteinazės sintezė, nėra jautrūs ţalingam rūkymo poveikiui [11-14]. Sveikų nerūkančių asmenų plaučių audinyje ir kvėpavimo takų ląstelėse MMP-12 gali būti nesekretuojama, o indukuojama tik uţdegiminio signalo, pvz. cigarečių dūmų, poveikyje [15]. Nepaisant tyrimų atliktų su modeliniais gyvūnais, MMP-12 vaidmuo rūkymo sukeltiems kvėpavimo takų emfizeminiams pokyčiams ţmonių ląstelėse nėra aiškus. Publikuoti tik kelių mokslinių tyrimų rezultatai apie destrukcinį MMP-12 poveikį plaučių audiniui [15, 16], tačiau nėra įvertinti MMP-12 raiškos kvėpavimo takų ląstelėse ypatumai sergant LOPL ir galimos sąsajos su rūkymo įtakotais pokyčiais.

Lėtinio uţdegimo metu aktyvintos ląstelės išskiria ir chemokinus – daugelio ląstelių sintetinamus maţos molekulinės masės baltymus. Vienas svarbiausių chemokinų ir neutrofilų chemotaktinių veiksnių, sekretuojamas aktyvintų neutrofilų [17], alveolinių makrofagų [18, 19] ir kitų ląstelių bei dalyvaujantis daugumoje uţdegimo reakcijų yra interleukinas-8 (IL-8). IL-8, kurio

chemotaksį tiek į stambiuosius, tiek į smulkiuosius kvėpavimo takus ir alveoles [1, 8, 19, 20]. Reaguodami į uţdegimo metu kvėpavimo takuose padidėjusį chemotaktinėmis savybėmis pasiţyminčių medţiagų aktyvumą, kraujo neutrofilai juda į infekcijos ţidinį, kur išskirdami savo granulėse sukauptas medţiagas dar labiau skatina ir stiprina uţdegiminius procesus.

Iki šiol literatūroje nėra vieningų duomenų, paaiškinančių LOPL metu pakitusį kraujo neutrofilų chemotaksį [20, 21]. Nepaisant chemotaktinių IL-8 savybių, nėra ţinoma, kaip kraujo neutrofilų chemotaksį įtakoja pats sergančiųjų LOPL skirtingų kvėpavimo takų sričių sekretas.Nėra publikuota duomenų ne tik apie potencialų šių biologinių veiksnių poveikį neutrofilų chemotaksiui, bet ir apie galimą skirtingą jų poveikį atsiţvelgiant į rūkymo įprotį.

Be to, skelbiama vis daugiau duomenų apie sutrikusį neutrofilų fagocitinį aktyvumą sergant LOPL [22, 23]. Atsiţvelgiant į tai, jog fagocitozė įvardijama pagrindine neutrofilų funkcija [22], silpnesnė sergančiųjų LOPL neutrofilų fagocitozė, lemianti nepakankamą gebėjimą efektyviai pašalinti patogenines daleles, gali būti vienu pagrindinių lėtinį kvėpavimo takų uţdegimą skatinančių veiksnių. Iki šiol publikuoti nevienareikšmiški tokio pobūdţio tyrimų rezultatai, o galima tiesioginė kvėpavimo takų sekreto įtaka neutrofilų fagocitozei atsiţvelgiant į biologinių veiksnių intesyvumą ir rūkymo įprotį nebuvo tirta.

Fagocitozės metu patogenams sunaikinti neutrofiluose susidaro ir išskiriamos reaktyviosios deguonies formos (ROS), svarbios daugeliui biologinių procesų ir uţdegiminių signalų perdavimui uţtikrinti, tačiau pernelyg intensyvus ROS susidarymas gali sąlygoti ne tik atskirų ląstelių, bet ir plaučių audinio ar sisteminius paţeidimus. Sergant LOPL, o ypač rūkant, ROS susidarymas ląstelėse vyksta intensyviau [24-29], tačiau galimas tiesioginis kvėpavimo takų sekreto poveikis ROS sintezei biologiniais ar cheminiais veiksniais aktyvintuose kraujo neutrofiluose ir galimi ypatumai atsiţvelgiant į rūkymo įprotį nėra ţinomi.

Todėl neutrofilų ir makrofagų funkcinių savybių analizė, atţvelgiant į potencialių šias savybes įtakojančių biologinių veiksnių intensyvumą ir pagrindinį LOPL sąlygojantį aplinkos veiksnį – rūkymo įprotį, suteiktų galimybę išsamiau įvertinti ląstelinius tiek sisteminio, tiek kvėpavimo takų uţdegimo mechanizmus.

1.1 Darbo tikslas ir uţdaviniai

Darbo tikslas. Įvertinti neutrofilų ir makrofagų funkcinių savybių ypatumus sergant lėtine

obstrukcine plaučių liga ir galimus jų skirtumus priklausomai nuo rūkymo įpročio.

Darbo uţdaviniai:

1. Ištirti sergančiųjų lėtine obstrukcine plaučių liga indukuotų skreplių ir bronchoalveolinio lavaţo skysčio ląstelių sudėties ir matrikso metaloproteinazės-12 raiškos ypatumus;

2. Nustatyti galimus lėtinės obstrukcinės plaučių ligos sąlygotus interleukino-8 koncentracijos skirtumus periferiniame kraujyje, indukuotuose skrepliuose ir bronchoalveolinio lavaţo skystyje;

3. Įvertinti periferinio kraujo neutrofilų chemotaksio ypatumus bei galimą indukuotų skreplių ir bronchoalveolinio lavaţo skysčio poveikį jų chemotaksiui sergant lėtine obstrukcine plaučių liga;

4. Nustatyti biologiniais veiksniais aktyvintos periferinio kraujo neutrofilų fagocitozės ypatumus bei galimą papildomą indukuotų skreplių ir bronchoalveolinio lavaţo skysčio poveikį sergant lėtine obstrukcine plaučių liga;

5. Ištirti sergančiųjų lėtine obstrukcine plaučių liga biologiniais ir cheminiais veiksniais akyvintų periferinio kraujo neutrofilų reaktyviųjų deguonies formų susidarymo kiekybinius ypatumus bei galimą indukuotų skreplių ir bronchoalveolinio lavaţo skysčio poveikį.

1.2 Mokslinis darbo naujumas

Pradedant vykdyti tyrimus daktaro disertacijai parengti, pasaulinėje literatūroje buvo publikuoti tik su modeliniais gyvūnais atliktų tyrimų rezultatai apie makrofaguose sintetinamos MMP-12 įtaką rūkymo sukeltiems emfizeminiams pokyčiams. Todėl vykdant šioje disertacijoje aprašomus mokslinius tyrimus, buvo įvertinti MMP-12 raiškos ypatumai ţmogaus kvėpavimo takų sekreto makrofaguose sergant LOPL ir atsiţvelgiant į rūkymo įprotį. Pirmą kartą mokslinėje literatūroje publikuoti sergančių LOPL rūkančiųjų ir neberūkančiųjų MMP-12 raiškos kvėpavimo takų sekreto makrofaguose ypatumai.

Vykdant šiame darbe numatytus tyrimus, įvertinti sergančiųjų LOPL biologiniais ir cheminiais veiksniais aktyvintų kraujo neutrofilų funkciniai ypatumai (chemotaksis, fagocitozė,

indukuotų skreplių ir BAL skysčio, poveikis minėtoms kraujo neutrofilų funkcinėms savybėms. Pirmą kartą mokslinėje literatūroje publikuoti kvėpavimo takų sekreto poveikio ROS susidarymui kraujo neutrofiluose ypatumai.

Moksliniame darbe pateikiami rezultatai suteikia informatyvesnių duomenų apie sergančiųjų LOPL kvėpavimo takų sekreto ląstelių sudėties, neutrofilų ir makrofagų sintetinamų uţdegimo ţymenų raiškos ir koncentracijos skirtumus, neutrofilų funkcinių savybių ypatumus ir parodo jų priklausomumą nuo rūkymo įpročio.

2. LITERATŪROS APŢVALGA

2.1 Lėtinės obstrukcinės plaučių ligos patogenezė

Lėtinė obstrukcinė plaučių liga (LOPL) – tai liga, pasireiškianti nevisiškai išnykstančia, įprastai progresuojančia kvėpavimo takų obstrukcija ir susijusi su nenormalia plaučių uţdegimine reakcija į įkvepiamas kenksmingas daleles ar dujas [1, 2].

Tai yra sisteminė daugiakomponentė liga [1, 2], todėl patogenetinius LOPL ypatumus lemia išorinių (pvz. rūkymo) ir vidinių veiksnių tarpusavio sąveika, sąlygojanti uţdegiminį procesą kvėpavimo takuose [4-7].

Sergamumas LOPL nuolat didėja ir tai yra viena daţniausių mirties prieţasčių visame pasaulyje [1] ir Lietuvoje [2, 3]. Dėl sisteminės ligos kilmės ir skirtingų plaučių funkcijos vertinimo kriterijų Lietuvoje kol kas nėra atlikta vieningų LOPL paplitimo tyrimų, tačiau remiantis Lietuvos sveikatos apsaugos ministerijos duomenimis 2007 m. buvo uţregistruota daugiau nei 33,5 šios ligos atvejų 1000-čiui gyventojų [3].

Sergant LOPL, uţdegiminis procesas labiausiai paţeidţia kvėpavimo organų sistemą [1, 2, 30], kurią sudaro kvėpavimo takai, plaučiai ir kvėpuojamieji raumenys (tarpšonkauliniai, diafragma). Kvėpavimo takai skiriami į viršutinius ir apatinius. Pagrindinė viršutinių kvėpavimo takų, kuriuos sudaro nosies ertmė, prienosiniai ančiai, nosiaryklė ir gerklos, funkcija yra išvalyti ir sudrėkinti įkvėpiamą orą prieš jam patenkant į apatinius kvėpavimo takus [30].

Apatiniams kvėpavimo takams priskiriama trachėja ir bronchai, sudarantys bronchų medį. Trachėja šakojasi į du pagrindinius bronchus, nuo kurių atsišakoja skiltiniai bronchai, toliau skylantys į segmentinius, o šie į subsegmentinius ir t.t. Iš viso yra 16-28 bronchų generacijų. Ties 7-14-ąja generacija bronchų sienelėje išnyksta kremzlinis audinys ir šie kvėpavimo takai jau vadinami bronchiolėmis. Jų spindis paprastai būna maţesnis nei 2 mm. Bronchiolės toliau šakojasi į alveolinius takus, o šie į smulkias pūslelių pavidalo struktūras – alveolinius maišelius. Atsiţvelgiant į bronchų spindį, apatinius kvėpavimo takus galima skirti į stambiuosius ir smulkiuosius kvėpavimo takus [30].

LOPL metu labiausiai paţeidţiami apatiniai smulkieji kvėpavimo takai [1, 2, 30, 31]. Lėtinio uţdegimo metu, dėl nuolatinio aktyvių uţdegimui tarpininkaujančių ląstelių sintetinamų biologiškai aktyvių medţiagų [4-9] ir intensyvaus oksidacinio streso poveikio [24-29], sukeliami struktūriniai pokyčiai - parenchiminio plaučių audinio irimas, elastingumo praradimas ir smulkiųjų kvėpavimo takų spindţio susiaurėjimas. Šie pokyčiai paţeidţia regeneracinius procesus, lemia emfizeminius pokyčius bei smulkiųjų kvėpavimo takų fibrozę [1, 2, 30, 31].

UŽDEGIMAS

Parenchiminio audinio irimas

Smulkiųjų kvėpavimo takų pažeidimas

Kvėpavimo takų uždegimas

Kvėpavimo takų remodeliaciniai procesai

IŠKVĖPIMO SROVĖS GREIČIO SUMAŢĖJIMAS

UŽDEGIMAS

Parenchiminio audinio irimas

Smulkiųjų kvėpavimo takų pažeidimas

Kvėpavimo takų uždegimas

Kvėpavimo takų remodeliaciniai procesai

IŠKVĖPIMO SROVĖS GREIČIO SUMAŢĖJIMAS

1 pav. Patogenetiniai procesai, lemiantys struktūrinius lėtinės obstrukcinės plaučių ligos pokyčius [parengta pagal 1].

Kitas svarbus LOPL komponentas - lėtinis bronchitas, pasireiškiantis kosuliu bei padidėjusia gleivių produkcija, kuriuos sąlygoja daţniausiai rūkymo sukeltas ištekamųjų liaukų latakų išsiplėtimas, bronchų liaukų hipertrofija, taurinių ląstelių hiperplazija stambiuosiuose kvėpavimo takuose [1, 2, 30, 31].

Kvėpavimo takuose ir plaučių parenchiminiame audinyje vykstantis uţdegimas ir negrįţtami struktūriniai pokyčiai skatina gleivių sekrecijos ir bronchų reaktyvumo didėjimą, kvėpavimo takų obstrukciją, sukelia oro spąstų fenomeną [1, 2, 30, 31]. Dėl sutrikusios kvėpavimo takų sekreto apykaitos ir imuninio atsako, juose kaupiasi ne tik uţdegime dalyvaujančios ląstelės, bet ir įvairūs mikroorganizmai ir patogeninės dalelės, lemiantys ne tik vietinius, bet ir kitas audinių bei organų sistemas paţeidţiančius [32], t.y. sisteminius pokyčius.

Tiek vietinį, t.y. kvėpavimo takuose vykstantį, tiek sisteminį uţdegiminį procesą kontroliuoja ir reguliuoja uţdegime dalyvaujančių ląstelių sintetinamos ir sekretuojamos biologiškai aktyvios medţiagos - uţdegimo tarpininkai, kurie veikdami kartu arba vienas po kito, stiprina pradinę uţdegimo reakciją ir įtakoja jo eigą [30-32].

Pagrindinė ginamoji kvėpavimo takų ir kraujo ląstelių reakcija į uţdegimą sukėlusius veiksnius – patogeninių dalelių fagocitozė bei jų pašalinimas [20, 21, 33]. Uţdegiminės reakcijos pobūdis, eiga ir intensyvumas priklauso nuo paţeidimo pobūdţio, intensyvumo, organizmo imuninės sistemos būklės ir imuninio atsako reakcijų [34].

2.2 Kvėpavimo takų ir sisteminis uţdegimas sergant lėtine obstrukcine plaučių liga

Sergant LOPL intensyviausi patologiniai procesai vyksta apatiniuose kvėpavimo takuose ir plaučių parenchiminiame audinyje - paţeidęs smulkiuosius kvėpavimo takus lėtinis uţdegimas plinta į parenchiminį audinį, kuriame prasideda emfizeminiai pokyčiai [1, 2, 30, 31].

Nors intensyviausias uţdegiminis procesas vyksta kvėpavimo takuose, tačiau dėl daugiakomponentinės ligos kilmės, sergančių LOPL asmenų kraujyje nustatomos ir didesnės sisteminio uţdegimo ţymenų (naviko nekrozės veiksnio-α (TNF-α), interleukino-8 (IL-8)) koncentracijos, lemiančios įvairius sisteminio pobūdţio paţeidimus [32, 35]. Padidėjusi uţdegimo ţymenų koncentracija kraujyje gali būti dėl didesnės jų koncentracijos kvėpavimo takuose, tačiau daugėja prielaidų [35], jog uţdegimo ţymenų raiška ir koncentracija pirmiausia padidėja kraujyje ir tuomet įtakoja kvėpavimo takų ţymenų ypatumus.

Visgi, nepaisant intensyvių tiek kvėpavimo takuose vykstančio [4, 5, 36], tiek sisteminio uţdegimo tyrimų [32, 35], jų sąveika ir galimos tarpusavio sąsajos šiuo metu dar nėra visiškai aiškios. Atsiţvelgiant į LOPL heterogeniškumą ir siekiant nustatyti patogenetinius LOPL mechanizmus, svarbu įvertinti vietinį ir sisteminį uţdegimą jungiančius ypatumus bei principus.

Šiuo metu visuotinai sutarta, jog dar iki pasireiškiant klinikiniams simptomams, liga prasideda nuo biocheminių ir ląstelinių kvėpavimo takų pokyčių bei greitai plinta į smulkiuosius kvėpavimo takus ir alveoles [5, 7]. Todėl kvėpavimo takų sekreto analizė ir galimas moduliacinis jo poveikis uţdegime dalyvaujančių ląstelių funkcinėms savybėms bei jose vykstantiems procesams, galėtų suteikti išsamesnės informacijos apie patogenetinius LOPL procesus.

Vietinio LOPL metu vykstančio uţdegiminio proceso ypatumai tiriami kvėpavimo takų sekrete - indukuotuose skrepliuose ir bronchoalveolinio lavaţo (BAL) skystyje. BAL skysčio ėminiai gaunami bronchoskopijos metu, į subsegmentinius bronchus sušvirkščiant ir atsiurbiant sterilaus fiziologinio tirpalo [37]. Manoma, jog šių ėminių cheminė, biologinė ir ląstelinė sudėtis suteikia informacijos apie smulkiuosiuose kvėpavimo takuose ir alveolėse vykstantį uţdegiminį procesą [38, 39]. Tuo tarpu, indukuotų skreplių tyrimas vertingas tiriant stambiuosiuose kvėpavimo takuose vykstantį uţdegimą [37-39]. Indukuotų skreplių ėminiai gaunami neinvazinės procedūros metu, inhaliuojant sterilų hipertoninės druskos tirpalą [40].

Nepaisant skirtingų indukuotų skreplių ir BAL skysčio mėginių paruošimo technologijų, abiejų tipų kvėpavimo takų sekreto mėginiai naudojami ląsteliniams uţdegimo ypatumams vertinti [37-40]. Tiek indukuotų skreplių, tiek BAL skysčio ėminių paėmimo ir mėginių paruošimo procedūroms taikomos visuotinai standartizuotos metodikos [37, 40]. BAL skysčio procedūrą ir taikymą galima laikyti sąlygai naujais, tuo tarpu spontaniškai atkosėtų skreplių tyrimai jau seniai naudojami mikrobiologijoje ir citologinėje analizėje. Tiek indukuotų skreplių, tiek BAL skysčio

ląstelinės sudėties normos standartizuotos [37-40] ir šie tyrimai sėkmingai taikomi klinikinėje praktikoje.

Kadangi indukuotų skreplių ir BAL skysčio ypatumai suteikia informacijos apie uţdegiminius procesus, vykstančius skirtinguose kvėpavimo takų srityse, ląstelinė šių mėginių sudėtis taip pat skiriasi. Tiek sergančiųjų LOPL, tiek sveikų asmenų BAL skystyje vyrauja makrofagai [38, 39], tuo tarpu indukuotuose skrepliuose labiau būdingi neutrofilai [7, 9, 38, 39, 41]. Svarbu paminėti, jog indukuotų skreplių ėminių sudėtis yra daug labiau koncentruota nei BAL skysčio. Indukuotuose skrepliuose nustatomos ir didesnės uţdegimo ţymenų koncentracijos [8, 39].

Kvėpavimo takų sekreto komponentai sąlyginai gali būti skiriami į ląstelinius, neląstelinius ir ne plaučių kilmės komponentus (mikroorganizmus, su oru įkvepiamas daleles) [39, 40]. Nepaisant ląstelinės sudėties normų, neląstelinių komponentų ir ţymenų dėl didelės įvairių baltymų gausos, įvertinimas dar tik atliekamas. Biocheminė kvėpavimo takų sekreto sudėtis, oksidacinių ir antioksidacinių medţiagų norminiai dydţiai indukuotuose skrepliuose ir BAL skystyje taip pat dar nėra standartizuoti. Tokio pobūdţio tyrimus apsunkina kvėpavimo takų sekreto komponentų gausa. Be to, indukuotų skreplių sudėtyje gausu kvėpavimo takų epitelio komponentų [40].

Periferinio kraujo ląstelių funkcinių savybių ir jų ţymenų sintezės ypatumai suteikia informacijos apie uţdegiminius procesus, būdingus ne vietiniam kvėpavimo takuose vykstančiam, bet sisteminiam uţdegimui. Iki šiol buvo teigiama, jog uţdegimas pirmiausia vyksta infekcijos ţidinyje, t.y. sergant LOPL – kvėpavimo takuose, o jam sustiprėjus stebimi ir sisteminiai pokyčiai. Tačiau neseniai buvo iškelta prielaida [35], teigianti apie uţdegimo pradţią periferiniame kraujyje ir tik vėlesnį jo plitimą į uţdegimo ţidinius, t.y. kvėpavimo takus.

Šiuo metu nėra publikuota daug tyrimų rezultatų, skelbiančių apie vietinio ir sisteminio uţdegimo ţymenų sąsajas. Todėl tiek kvėpavimo takų sekreto, tiek kraujo ląstelių sudėties ir funkcinių savybių analizė gali suteikti informatyvesnių ţinių apie LOPL patogenezę.

Nors indukuotų skreplių ir BAL skysčio ląstelinių ir neląstelinių komponentų sudėtis intensyviai tiriama vertinant uţdegiminio signalo ypatumus, tačiau duomenų kaip tiesioginiai pats kvėpavimo takų sekretas įtakoja vienų svarbiausių LOPL patogenezėje dalyvaujančių kraujo ląstelių – neutrofilų, chemotaksį, fagocitozę ir reaktyviųjų deguonies formų (ROS) susidarymą sergant LOPL iki šiol nėra publikuota. Be to, nėra tirti šių uţdegiminiame procese svarbių ląstelių funkcinių savybių ypatumai priklausomai nuo rūkymo įpročio nei sergančiųjų LOPL, nei sveikų asmenų neutrofiluose.

2.3 Rūkymas – vienas pagrindinių lėtinę obstrukcinę plaučių ligą sąlygojančių veiksnių

Apie 90 proc. sergančiųjų LOPL yra aktyviai rūkantys asmenys [1, 6, 42-45]. Todėl neabejotinai pagrindiniu aplinkos rizikos veiksniu įvardijamas rūkymas, tačiau klinikinius ligos simptomus skatina ir kiti rizikos veiksniai - uţterštame ore sklandančios ţalingos dalelės, besikartojančios bakterinės ir virusinės kvėpavimo takų infekcijos, įvairių genų polimorfizmas, nepakankama mityba ir kt. (2 pav.) [1, 2, 30].

Rūkymas Aplinkos veiksniai Oksidacinis stresas Ląstelių aktyvinimas Imuninės reakcijos Genetiniai ir epigenetiniai veiksniai Uždegiminių ląstelių aktyvinimas ir chemotaktiniai signalai Autoimuninės reakcijos Uždegimo žymenų sintezė ir išskyrimas Ląstelių proliferacija Apoptozė Sisteminis uždegimas Etiologija Amplifikuojantys procesai Ląsteliniai procesai Gleives gaminančių liaukų hiperplazija Smulkiųjų kvėpavimo takų obstrukcija Emfizeminiai pokyčiai Bakterinės infekcijos Virusinės infekcijos Patologiniai procesai Rūkymas Aplinkos veiksniai Oksidacinis stresas Ląstelių aktyvinimas Imuninės reakcijos Genetiniai ir epigenetiniai veiksniai Uždegiminių ląstelių aktyvinimas ir chemotaktiniai signalai Autoimuninės reakcijos Uždegimo žymenų sintezė ir išskyrimas Ląstelių proliferacija Apoptozė Sisteminis uždegimas Etiologija Amplifikuojantys procesai Ląsteliniai procesai Gleives gaminančių liaukų hiperplazija Smulkiųjų kvėpavimo takų obstrukcija Emfizeminiai pokyčiai Bakterinės infekcijos Virusinės infekcijos Patologiniai procesai

2 pav. Išorinių ir viduląstelinių veiksnių sąlygoti ląsteliniai ir patologiniai procesai, lemiantys lėtinę obstrukcinę plaučių ligą [parengta pagal 1, 31].

Cigarečių dūmuose gausu komponentų, iš kurių apie 1015

priskiriama chemiškai aktyviems junginiams [24], ypatingai ROS. Cigarečių ekstrakte gausu nikotino, formaldehidų, acetaldehidų, akroleino ir kitų biologiškai aktyvių medţiagų [46]. Šie junginiai ląstelėse aktyvina uţdegiminio signalo perdavimo sistemas besijungdami prie uţdegimui tarpininkaujančių ląstelių paviršiuje esančių nikotino klasės acetilcholino receptorių (nAChR), formuojančių kalcio ar natrio jonais valdomus joninius kanalus [47, 48]. Nuolatinis nikotino poveikis sąlygoja šių receptorių inaktyvinimą, o taip pat sutrikdo ląstelinių paţaidų reparacijos sistemą, apoptozės ir ląstelių augimo procesus, lemiančius kvėpavimo takų sienelės standėjimą, aktyvina uţdegime dalyvaujančių ląstelių judėjimą į kvėpavimo takus ir įvairių uţdegimo veiksnių – citokinų, proteinazių sintezę bei sekreciją [1, 7, 9, 30, 49, 50].

Nustatyta, jog ţmogaus smulkiųjų kvėpavimo takų epitelio ląstelės ekspresuoja α2 ir α4 tipo nAChR, tuo tarpu bronchų epitelinės ląstelės – α3 ir α5. Abiejų tipų ląstelių paviršiuje nustatomi α7, α9, α10, ß2 ir ß4 tipų receptoriai [47, 48].

Visgi, dėl cigarečių dūmuose esančių komponentų gausos šiuo metu sudėtinga nustatyti konkrečius jų komponentus, aktyvinančius signalines uţdegiminio proceso sistemas ir skatinančius

patologinius kvėpavimo takų pokyčius. Todėl daţniausiai tiriamas patobiologinis rūkymo, o ne atskirų cigarečių dūmuose esančių komponentų sukeltas poveikis.

Atsiţvelgiant į rūkymo, kaip pagrindinio LOPL sąlygojančio rizikos veiksnio svarbą, dauguma tyrimų atlikta vertinant galimus patofiziologinius ir uţdegimo ţymenų skirtumus tarp rūkančių ir nerūkančių asmenų [6, 9, 26, 29, 43-45]. Tuo tarpu, pasaulio mokslinėje literatūroje iki šiol nėra publikuota vieningų duomenų apie ląstelinius ypatumus tarp sergančių LOPL rūkančiųjų ir neberūkančiųjų.

2.4 Neutrofilai ir makrofagai – pagrindinės lėtinės obstrukcinės plaučių ligos patogenezėje dalyvaujančios ląstelės

Sergančiųjų LOPL plaučių audinyje ir kvėpavimo takų sekrete pagausėja aktyvių uţdegime dalyvaujančių ląstelių, ypatingai neutrofilų ir makrofagų, sintetinančių ir į tarpląstelinę terpę sekretuojančių įvairius uţdegimą sukeliančius ir jį stiprinančius citokinus, chemokinus ir kitas biologiškai aktyvias uţdegimines medţiagas [4-9, 51]. Be to, lėtinio uţdegiminio proceso ir aktyvaus rūkymo metu ţenkliai padidėjus neutrofilų ir makrofagų išskiriamų įvairių proteinazių aktyvumui [10-12, 16], sutrinka fiziologinis proteinazių/antiproteinazių santykis, lemiantis įvairius ne tik ląstelių, bet ir audinių bei sisteminius paţeidimus.

Uţdegiminiame procese svarbios įvairios ląstelės, kurios gali būti skiriamos į 2 pagrindines grupes - granuliocitus (neutrofilus, eozinofilus, makrofagus) ir agranuliocitus (limfocitus) [5]. Sergančiųjų LOPL ir aktyviai rūkančių asmenų kraujyje, indukuotuose skrepliuose ir BAL skystyje pagausėja uţdegime dalyvaujančių ląstelių, kurių svarbiausiomis įvardijamos neutrofilai ir makrofagai [4, 5, 7, 9]. Sergant LOPL šios aktyvintos ląstelės gausiai sintetina uţdegimą skatinančius biologinius ţymenis [4-9, 51]. Vieni jų – citokinai ir chemokinai, daugelio ląstelių sintetinami maţos molekulinės masės baltymai, daţniausiai atliekantys uţdegimo tarpininkų vaidmenį. Jie jungiasi prie ląstelių taikinių membranoje esančių receptorių ir taip aktyvina uţdegiminius signalus bei sukelia uţdegimui būdingus pokyčius. Citokinų grupei priskiriami interleukinai, limfokinai, interferonai, granuliocitų ir makrofagų kolonijas stimuliuojantys veiksniai, navikų nekrozės veiksniai ir daugelis kitų [52].

Neutrofilai, dar vadinami polimorfonukleariniais leukocitais, yra nedidelės (9-10 µm) ląstelės, sudarančios didţiąją baltųjų kraujo ląstelių dalį (50-70 proc.) [34, 53, 54]. Tai – grūdėtieji ir patys judriausi leukocitai, infekcijos metu pirmieji iš kraujo patenkantys į uţdegimo ţidinį. Morfologiškai, šios ląstelės pasiţymi segmentuotu iš kondensuoto chromatino sudarytu branduoliu ir citoplazmoje esančiomis granulėmis [55, 56].

Pagrindinė neutrofilų funkcija – fagocitozė [22, 23], t.y. patekusių mikroorganizmų skaidymas ir pašalinimas. Jie sunaikina į organizmą patekusius grybelius, bakterijas, virusus,

virusais infekuotas ir navikines ląsteles, dalyvauja tirpdant fibriną bei ţuvusias ląsteles, audinius gyvame organizme, tad jų gausu uţdegimo ir nekrozės ţidiniuose [57]. Trūkstant neutrofilų, t.y. esant neutropenijai arba jiems esant funkciškai nevisaverčiams, organizmas negali tinkamai apsisaugoti nuo bakterinių ir virusinių infekcijų [34].

Neutrofilai, kaip ir kitos ląstelės, bręsta kaulų čiulpuose apie 2 savaites. Bręsdami jie pereina 6 vystymosi stadijas – mieloblasto, promieloblasto, mielocito, metamielocito, nesegmentuoto ir segmentuoto neutrofilo. Segmentuotieji neutrofilai ir yra visiškai susiformavę ir funkciškai aktyvios ląstelės [53].

Kaulų čiulpus neutrofilai palieka visiškai susiformavę, neaktyvinti ir pasiţymintys visomis antimikrobinėmis savybėmis. Kiekvieną dieną į kraują patenka ir iš jo pasišalina apie 100 milijardų neutrofilų, kur praleidę kelias valandas jie yra sunaikinami arba iškeliauja į audinius, kuriuose būna 1-2 dienas. Fiziologinėmis sąlygomis neutrofilai juda netvarkingai, gali neţymiai migruoti tarp kraujo ir audinių [54]. Plaučių audinyje esantys neutrofilai įprastai nėra judrūs. Tai sąlygoja sąlyginai siauras plaučių kapiliarų spindis (5 µm) [35].

Didţioji dalis kaulų čiulpuose subrendusių neutrofilų, kur jų skaičius apie 30 kartų didesnis nei periferiniame kraujyje, niekada nepatenka į kraują. Tai – „atsarginiai“ neutrofilai, į kraują ir audinius patenkantys tik esant reikalui, t.y. uţdegiminio proceso metu [54].

Pagrindines neutrofilų funkcijas lemia jų citoplazmoje esančios granulės, kuriose kaupiamos antimikrobinėmis ir citotoksinėmis savybėmis pasiţyminčios biologiškai aktyvios medţiagos – įvairios proteinazės, rūgštinės hidrolazės ir dauguma citozolyje esančių organoidų membranų receptorių [55, 58]. Šios granulės susiformuoja neutrofilų diferenciacijos metu. Pagal funkcines savybes ir kaupiamų biologiškai aktyvių medţiagų sudėtį, skiriamos 3 pagrindinės granulių rūšys – azurofilinės, specifinės ir maţosios kaupiamosios [58]. Jose esančių fermentų pagalba neutrofilų fagocituotos bakterijos yra suvirškinamos. Neutrofilų granulių funkcija neapsiriboja tik hidrolitinių fermentų, būtinų patogenų sunaikinimui, saugojimu ir išskyrimu. Jos taip pat sekretuoja ir įvairias biologines medţiagas, reguliuojančias ir dalyvaujančias daugelyje fiziologinių ir patologinių ląstelių procesų [55, 56].

Pirmiausia, promielocito stadijoje susiformuoja azurofilinės (pirminės), t.y. morfologiškai didţiausios, granulės. Kiek vėliau, metamielocito stadijoje – savitosios (antrinės) granulės. Iškart po jų susiformuoja ir maţosios (tretinės) granulės. Subrendusiame neutrofile būna apie 60-70 azurofilinių ir apie 120-140 specifinių granulių [54, 58].

Didţioji dalis antimikrobinėmis savybėmis pasiţyminčių baltymų kaupiama anksčiausiai susiformuojančiose – azurofilinėse granulėse [59]. Vienas svarbiausių tokių fermentų – mieloperoksidazė (MPO), kuri dalyvaujant chloro jonams katalizuoja vandenilio peroksido virsmą

sudaro defensinai – nedidelės molekulinės masės katijoniniai antimikrobinėmis savybėmis pasiţymintys peptidai, citotoksiški daugumai bakterijų, grybelių ir kai kuriems virusams. Azurofilinėse granulėse taip pat saugomos ir serino proteazės (pvz. elastazė ir katepsinas G), naikinančios bakterijas hidrolizuodamos jų apvalkalėlio baltymus [59]. Padidėjęs neutrofilų elastazės aktyvumas labai svarbus ir LOPL patogenezėje [7, 12, 43].

Savitųjų granulių komponentai paprastai dalyvauja pradinėse uţdegiminio proceso reakcijose. Šiose granulėse kaupiama didţioji dalis viduląstelinių plazminės membranos, komplemento komponentų. Savitosiose granulėse kaupiamos ir įvairios matrikso metaloproteinazės, skaidančios daugumą ekstraląstelinio matrikso komponentų [56].

Neutrofilų skaičiaus padidėjimas tiek indukuotuose skrepliuose, tiek BAL skystyje siejamas su sunkesne klinikine LOPL eiga [4-7]. Sergant LOPL ţenklus neutrofilų skaičiaus padidėjimas ypatingai stebimas indukuotuose skrepliuose (iki 10 ar daugiau kartų) [4-7, 61], o taip pat BAL skystyje [21, 28] ir parenchiminiame plaučių audinyje [38]. Sergant LOPL padidėja ir kraujo neutrofilų aktyvumas, lemiantis daugelį sisteminių pokyčių [35].

Teigiama, jog rūkymas tiesiogiai skatina granuliocitų susidarymą kaulų čiulpuose [62]. Visgi, nepaisant gerai ţinomo neutrofilų skaičiaus padidėjimo kvėpavimo takuose, iki šiol nedaug ţinoma apie sergančiųjų LOPL kraujo neutrofilų funkcines savybes ir jų pokyčius priklausomai nuo rūkymo įpročio. Taip pat nėra vieningų duomenų apie kraujo neutrofilų funkcinių savybių ir indukuotų skreplių bei BAL skysčio komponentų sąsajas.

Makrofagai yra pagrindinės lėtinio uţdegimo ir gynybinės sistemos ląstelės [30]. Veikiami adhezijos molekulių ir chemotaktinių veiksnių siunčiamų signalų, makrofagų pirmtakai monocitai, pirmosiomis ūmaus uţdegimo valandomis pradeda migruoti į uţdegimo ţidinį, kur transformuojasi į didesnes fagocituojančias ląsteles – makrofagus bei reaguodami į kitų uţdegimo tarpininkų siunčiamus aktyvinančius signalus sekretuoja biologiškai aktyvias medţiagas – citokinus, proteinazes, sąlygojančius ne tik atskirų ląstelių, bet ir audinių paţeidimus, irimą ir kitus lėtiniam uţdegimui būdingus pokyčius [34, 63].

Šios ląstelės sudaro mononuklearų makrofaginę sistemą, kuriai priskiriami kaulų čiulpų monocitų pirmtakai, kraujo monocitai ir audinių makrofagai. Plaučių makrofagai skiriami į alveolinius, intersticinio audinio ir pleuros makrofagus [30]. Makrofagai fagocituoja didesnes nei 6 nm daleles, ne tik mikroorganizmus, bet ir savo funkciją atlikusias bei ţuvusias ląsteles (pvz. eritrocitus, fagocitavusius neutrofilus) [64].

Skirtingai nei neutrofilai, makrofagai – ilgaamţės ląstelės [64]. Fiziologinėmis sąlygomis jų gyvavimo periodas gali trukti iki pusės metų. Tuo tarpu, rūkančių asmenų makrofagai išlieka gyvybingi dar ilgiau – iki 2 metų. Tai gali būti dėl sumaţėjusio rūkančių asmenų mukociliarinio klirenso [63].

Prieš fagocituodami patogenus ir savo funkciją atlikusius neutrofilus, veikiami kitų ląstelių sekretuojamų citokinų ir įvairių uţdegimo ţymenų, makrofagai yra aktyvinami, ląstelės didėja, citoplazmoje daugėja lizosominėmis savybėmis pasiţyminčių fermentų, aktyvėja medţiagų apykaita. Teigiama, kad makrofagai geba sintetinti ir išskirti daugiau kaip 30 biologiškai aktyvių medţiagų [10].

Kaip ir neutrofilų, pagrindinė makrofagų funkcija – fagocitozė [65] ir įvairių uţdegimą skatinančių tarpininkų (citokinų, prostaglandinų, leukotrienų, oksidacinio streso ţymenų) sintezė. Šios ląstelės pasiţymi ir baktericidinėmis savybėmis [66]. O taip pat, makrofagai dalyvauja imuninės reguliacijos reakcijose – pateikia antigeną T limfocitams ir natūralioms ląstelėms ţudikėms (NK), aktyvina bei palaiko limfocitų subpopuliacijų pusiausvyrą [34].

Pasaulyje atliktų mokslinių ir klinikinių tyrimų metu nustatyta, jog sergant LOPL, makrofagai daţniausiai kaupiasi alveolėse, bronchiolėse ir smulkiuosiuose kvėpavimo takuose [7, 38, 39, 45]. Šios ląstelės yra pagrindinės kvėpavimo takų sekreto uţdegiminės ląstelės, sudarančios 80 – 90 proc. visų BAL skystyje esančių ląstelių. Būtent makrofagai sudaro gynybinį barjerą [30, 63], apsaugantį kvėpavimo takus nuo su oru įkvepiamų infekcinių, toksinių ar alerginių dalelių.

Sergant LOPL, kaip ir neutrofilų, makrofagų skaičius kvėpavimo takuose, plaučių parenchimoje, indukuotuose skrepliuose ir BAL skystyje ţenkliai padidėja [4, 5, 31]. Tuo tarpu sergančių LOPL rūkančiųjų makrofagų skaičius minėtose uţdegimo paţeistose vietose gali padidėti dar labiau [6, 11, 42], o cigarečių dūmuose esančios medţiagos geba ne tik skatinti makrofagų proliferacinį aktyvumą, bet ir aktyvinti gausybę makrofaguose sintetinamų uţdegimą skatinančių veiksnių. Makrofagai yra vienos svarbiausių ląstelių, skatinančių rūkymo sukeltus emfizeminius pokyčius [42, 44, 45].

Neutrofilų ir makrofagų tarpusavio sąveika. Ţmogaus organizmas – vienalytė sistema, kurioje visi vykstantys procesai yra kontroliuojami ir reguliuojami. Įvairių signalų pagalba ląstelės geba perduoti informaciją kaimyninėms ląstelėms ir audiniams. Todėl atskirų ląstelių bei jų savybių tyrimai nesuteikia tiek informacijos apie ląstelinius uţdegiminio proceso mechanizmus, kiek kelių ląstelių tarpusavio sąveikos sąsajos.

Sergant LOPL ypatingai svarbi neutrofilų ir makrofagų bei jų išskiriamų uţdegimo ţymenų tarpusavio sąveika (3 pav.). Tokio pobūdţio tyrimai pradėti vykdyti 1995 m. paskelbus prielaidas, jog neutrofilų granulėse esantis fermentas MPO geba jungtis prie makrofagų paviršiuje esančių receptorių [67].

3 pav. Pagrindinės uţdegiminiame procese dalyvaujančios ląstelės ir jų sintetinami ţymenys, sąlygojantys patogenetinius pokyčius sergant lėtine obstrukcine plaučių liga [parengta pagal 31].

CD8+ – citotoksiniai T limfocitai, CCL2/MCP-1 – monocitų chemotaktinis baltymas-1, CCL5/RANTES (angl. k Regulated on Activation, Normal T Expressed and Secreted) – T limfocitų ir monocitų chemotaktinis veiksnys, CRB – C reaktyvinis baltymas, CXCL10/IP-10 – interferonu-γ indukuojamas baltymas-10, IFN – interferonas, IL – interleukinas, LTB – leukotrienas B, MMP – matrikso metaloproteinazė, TNF – auglių nekrozės veiksnys.

Makrofagai pašalina ir apotozės būdu ţuvusius neutrofilus, kurie ţūdami savo paviršiuje pradeda sintetinti fosfatidilserino liekanas [65]. Neutrofilų plazminės membranos paviršiuje atsirandančios fosfatidilserino liekanos – signalas makrofagams fagocituoti apoptozės būdu ţūvančius neutrofilus [68]. Literatūroje daugėja duomenų, jog neutrofilai, išskirdami savo granulėse esančius baltymus įtakoja kitų ląstelių, ypatingai makrofagų, funkcines savybes [69].

Teigiama, jog apoptozės būdu ţūdami neutrofilai netgi geba perduoti kai kurias savo funkcines savybes juos fagocituojantiems makrofagams [70] ir toliau tęsti uţdegiminius procesus bei skatinti aktyvintų uţdegimui tarpininkaujančių ląstelių (neutrofilų, makrofagų) chemotaksį į kvėpavimo takus.

Nors neutrofilai ir makrofagai lemia pagrindinius LOPL patogenezės procesus, tačiau ţalingus lėtinės obstrukcinės ligos metu vykstančius procesus įtakoja ir kitos ląstelės. Eozinofilai, kaip ir neutrofilai, citoplazmoje esančiose granulėse kaupia įvairius fermentus (pvz. lizocimą, fagocitiną), išskyrus antibakterinius. Šios ląstelės dalyvauja neutralizuojant nuodingas medţiagas, fagocituoja imuninius kompleksus [71].

LOPL patogenezėje šių ląstelių vaidmuo kol kas nėra visiškai aiškus. Sveikų asmenų plaučiuose šių ląstelių paprastai nebūna ar būna labai maţai. Eozinofilinis uţdegimas labiau siejamas su astmai ir alerginėms reakcijoms, o ne LOPL būdingais uţdegiminiais procesais [72, 73]. Vis dėlto, pastaruoju metu keliama prielaida apie bendrą LOPL ir astmos patogenezės kilmę [74]. Eozinofilų funkcinėmis savybėmis ir ypatumais buvo susidomėta ir tiriant LOPL. Paskelbta prielaida, jog cigarečių dūmuose esantys komponentai geba tiesiogiai skatinti eozinofilų skaičiaus padidėjimą sergančiųjų LOPL ir sveikų asmenų indukuotuose skrepliuose [75]. Todėl eozinofilų svarba LOPL patogenezei negali būti atmesta.

Funkcines eozinofilų savybes kontroliuoja T limfocitai ir jų sekretuojami uţdegimo ţymenys, ypatingai IL-3 ir IL-5 [71].

Limfocitų populiacija, atsiţvelgiant į morfologinius kriterijus priskiriama agranuliocitų grupei. Pagal tam tikrus savituosius baltyminius ţymenis, t.y. CD molekules (angl. k. cluster of differentiation) esančias limfocitų membranos paviršiuje, limfocitai skiriami į T limfocitų, B limfocitų ir natūralių ląstelių ţudikių subpopuliacijas. Didţiąją jų dalį (apie 70 proc.) sudaro T limfocitai – 7-12 μm dydţio, nefagocituojančios ląstelės [34]. Pagrindinėmis T limfocitų funkcijomis įvardijamos – ląstelinio imuniteto uţtikrinimas, t.y. uţkrėstų ir vėţinių ląstelių pašalinimas bei kitos imuninės reakcijos [34, 76].

Sergant LOPL parenchiminiame plaučių audinyje, smulkiuosiuose ir stambiuosiuose kvėpavimo takuose pagausėja ir T limfocitų, ypatingai citotoksinių T limfocitų (CD8+) populiacija [4-9, 77], kurios sintetinami ir išskiriami uţdegimo ţymenys skatina granuliocitų migraciją į kvėpavimo takus [78]. Visgi, dar nenustatyta kokie veiksniai lemia citotoksinių T limfocitų kaupimąsi kvėpavimo takuose, plaučių audinyje, o taip pat ir kraujyje [79]. Ţinoma, jog citotoksiniai T limfocitai, sekretuodami perforinus, granzimą-B ir TNF-α, geba sąlygoti bei skatinti alveolių epitelinių ląstelių citolizę ir apoptozę [78]. Vis dėlto, kaip ir kitų uţdegime dalyvaujančių ląstelių, tiriant patogenetinius LOPL ypatumus, limfocitų vaidmuo nėra galutinai aiškus.

2.5 Uţdegimui tarpininkaujančių ląstelių sintetinami ţymenys ir jų svarba lėtinės obstrukcinės plaučių ligos patogenezei

Uţdegimo metu, aktyvintos ląstelės sintetina ir sekretuoja įvairius sisteminio ir vietinio kvėpavimo takų uţdegimo ţymenis – chemokinus, augimo veiksnius ir proteinazes, kurie dar labiau sustiprina jau vykstantį uţdegiminį procesą [6-8, 10, 15, 16, 20, 31, 61].

Sisteminiu poveikiu pasiţymintys uţdegimo tarpininkai, gebantys įtakoti įvairius degeneracinius procesus, gali būti sintetinami tiek kraujo ląstelėse [24, 32, 35, 79], tiek vietiškai, t.y. kvėpavimo takų ląstelėse [8, 9, 25, 27]. Uţdegimo ţymenų koncentracijos kraujyje padidėjimas įvardijamas sisteminio uţdegimo indikatoriumi. Sergant LOPL sisteminis uţdegimo ţymenų poveikis pasireiškia metabolizmo sutrikimais, svorio kritimu, raumenų silpnumu, širdies sutrikimais ir t.t. Svarbiausiais LOPL sisteminio uţdegimo ţymenimis įvardijami IL-6, IL-8, TNF-α, C reaktyvusis baltymas (CRB), selektinas-P, MPO [32, 35, 80].

Tiriant ląstelinius LOPL ypatumus patogenetiniams lėtinio uţdegimo mechanizmams vertinti, intensyviausiai analizuojami aktyvintų kvėpavimo takų ląstelių, ypatingai neutrofilų ir makrofagų, sintetinami uţdegimo ţymenys [8, 9, 25, 27].

Sparčiai daugėja naujai nustatomų šių ląstelių sintetinamų uţdegimo ţymenų skaičius, gausėja tyrimų, vertinančių šių ţymenų funkcines ir struktūrines savybes, tačiau kaip ir uţdegimui tarpininkaujančių ląstelių sudėties, taip ir jų ţymenų vaidmuo, ypatingai rūkymo poveikyje, nėra vienareikšmiškai nustatytas.

Vienais svarbiausių LOPL ir rūkymo aktyvinamų uţdegimo veiksnių įvardijamos neutrofilų ir makrofagų sintetinamos proteinazės [10-14, 16, 17]. Proteinazėms priskiriami fermentai, gebantys proteolitiškai skelti polipeptidų grandies vidines peptidines jungtis [10]. Atsiţvelgiant į proteinazių aktyviojo centro cheminę struktūrą, proteinazės gali būti skiriamos į 4 dideles šeimas: serino proteinazes, metaloproteinazes, cisteino ir asparto proteinazes. Daugelio ląstelių sintetinamos proteinazės lemia jungiamojo audinio komponentų irimą, sąlygojantį emfizeminius plaučių parenchimos pokyčius [10-14, 16, 17].

Sveikų asmenų organizme nuolat palaikoma fiziologinė proteinazių ir apsauginių viduląstelinių antiproteinazių pusiausvyra [10], uţtikrinanti normalią plaučių funkciją. Sergant LOPL ir padidėjus įvairių proteinazių aktyvumui, slopinamos apsauginių antiproteinazių funkcinės savybės, sąlygojami destrukciniai ląstelių pokyčiai [16, 81]. LOPL metu negrįţtamai paţeidţiamas baltymas elastinas. Šis baltymas yra priskiriamas vienam pagrindinių daugumos proteolitiniu poveikiu pasiţyminčių fermentų taikiniui. Proteinazės suskaido elastiną iki dezmozinų [10, 14, 82], todėl prarandamas plaučių parenchiminio audinio elastingumas ir vystosi negrįţtami emfizeminiai pokyčiai.

2.5.1 Matrikso metaloproteinazė-12

Matrikso metaloproteinazės (MMPs) yra vienos svarbiausių proteinazių, lemiančios daugelį LOPL patogenezei būdingų destrukcinių procesų [10, 81]. Aktyviajame centre cinko joną turinčių MMPs šeimą šiuo metu sudaro maţiausiai 26 sekreciniai ar transmembraniniai fermentai, gebantys proteolitiškai skaidyti daugumą ekstraląstelinio matrikso makromolekulių (pvz. kolageną, lamininą ir elastiną) [11, 83].

Kvėpavimo takuose vykstančio uţdegiminio proceso metu MMPs gali ne tik ardyti ekstraląstelinio matrikso komponentus, bet ir dalyvauti fiziologiniuose procesuose – reguliuoti koaguliacijos ir fibrinolizės procesus, ląstelėse vykstančius paţaidų taisymo procesus [10]. Visgi, pernelyg intensyvi MMPs raiška lemia destrukcinius pokyčius – ardo audinių struktūras, skatina vėţinių ląstelių augimą, emfizeminius pokyčius, ţalingas imunines reakcijas, uţdegiminių citokinų ir chemokinų sintezę [11, 84].

Visų MMPs 40 – 50 proc. struktūros sudaro vienoda amino rūgščių seka. Išskirtinė MMPs savybė – visi šie fermentai yra sekretuojami neaktyvūs latentinėje formoje ir aktyvinami tik proteolitiniu būdu pašalinus N-galinę baltymo pirmtako amino rūgšties liekaną [10]. Visų MMPs aktyvumą slopina viduląsteliniai slopikliai – kelių tipų MMPs audinių inhibitoriai (angl.k. tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs), formuojantys kompleksus su proteinazių aktyviuoju centru ir tokiu būdu slopinantys MMPs aktyvumą [10, 14].

Daugumą MMPs sintetina ir sekretuoja makrofagai ir struktūrinės plaučių ląstelės reaguodamos į įvairius uţdegimo ţymenų siunčiamus signalus [14]. Aktyvinti monocitai sintetina bei sekretuoja MMP-7. Tuo tarpu monocitams subrendus iki makrofagų, jie praranda šį gebėjimą, tačiau geba sekretuoti MMP-1, MMP-3, MMP-9, MMP-12, ir MMP-14 [10, 13, 14]. Pastebėta, jog MMP-1 ir MMP-9 sintezė vyksta intensyviau ne tik sergančiųjų LOPL, bet ir sveikų aktyviai rūkančių asmenų BAL skysčio makrofaguose [13, 85, 86].

LOPL patogenezei svarbiausiomis MMPs įvardijamos makrofagų ir neutrofilų sekretuojamos proteinazės, gebančios skaidyti svarbų plaučių struktūrinį komponentą – elastiną. Tai abiejų ląstelių tipų ekspresuojama MMP-9 ir makrofagų metaloelastazė MMP-12 [13, 15, 16]. Sveikų asmenų plaučių audinyje MMP-12 sintezė įprastai nevyksta arba esti labai silpna, o sąlygojama reaguojant į uţdegimo veiksnių siunčiamus signalus [15, 16], pvz. cigarečių dūmų poveikyje.

MMP-12 geba skaidyti daugelį ekstraląstelinio matrikso komponentų, o taip pat ir pagrindinę antiproteazę apsaugančią nuo emfizeminių pokyčių – alfa-1 antitripsiną (AAT) [87]. Pastebėta, jog transgeninės pelės, kuriose nevyksta MMP-12 sintezė (MMP-12–/–) yra 6 kartus atsparesnės ţalingam cigarečių dūmų poveikiui [16]. Tiriant šiuos modelinius gyvūnėlius taip pat nustatyta, jog laukinio tipo pelių (su nepakitusia MMP-12 raiška) ląstelėse cigarečių dūmai skatina 5 kartus

Nepaisant tyrimų atliktų su modeliniais gyvūnais [14-16], MMP-12 vaidmuo cigarečių dūmų sukeltiems emfizeminiams pokyčiams ţmogaus kvėpavimo takuose nėra ţinomas. Publikuoti tik kelių mokslinių studijų rezultatai apie galimą MMP-12 poveikį plaučių paţeidimui, vertinant šios proteinazės ypatumus indukuotuose skrepliuose, BAL skystyje ar plaučių audinio biopsijose [88, 89].

Kaip ir visos MMPs, MMP-12 sintetinama kaip neaktyvus pirmtakas, proteolitinio aktyvinimo metu skylantis į 45 kDa ir 22 kDa aktyvias formas. Manoma, jog MMP-12 sekretuoja aktyvinti makrofagai [10, 13]. Atyvinta MMP-12 geba aktyvinti ir kitas MMPs – MMP-2, MMP-3 [10, 13, 14].

MMP-12 skatina uţdegiminį plaučių audinio procesą, ne tik proteolitiniu būdu skaidydama kvėpavimo takų ir plaučių audinio ląstelių komponentus [87], bet ir stimuliuodama tokių uţdegime dalyvaujančių ląstelių, kaip monocitai ir makrofagai, judėjimą į uţdegimo ţidinius [14-16]. Be to, MMP-12 gali skatinti cigarečių dūmų sukeltą uţdegiminį procesą, sąlygodama TNF-α išsiskyrimą iš makrofagų [16]. Šis citokinas priskiriamas vienam iš daugelio neutrofilų chemotaktinių veiksnių, todėl skatinamas neutrofilų judėjimas į kvėpavimo takus [8].

Transgeninių gyvūnų modeliai yra neabejotinai svarbūs ir nepamainomi tiriant galimus uţdegimo mechanizmų ypatumus, tačiau jų prielaidos turi būti patikrintos ir ţmonių ląstelėse. Skiriama nemaţai biologinių skirtumų tarp pelių ir ţmogaus kvėpavimo takų struktūros, todėl ir MMPs raiška šių organizmų ląstelėse vyksta skirtingu būdu.

Vieningų duomenų apie MMP-12 sintezės ypatumus ţmonių kvėpavimo takų sekreto ląstelėse nėra publikuota. Todėl tikslinga įvertinti MMP-12 raiškos ypatumus sergančiųjų LOPL rūkančių ir neberūkančiųjų bei sveikų asmenų indukuotuose skrepliuose ir BAL skystyje.

2.5.2 Interleukinas-8

Šiuo metu ţinoma virš 50 skirtingų chemokinų – chemotaktinėmis savybėmis pasiţyminčių maţos molekulinės masės baltymų, gebančių jungtis prie 20 skirtingų ląstelių paviršiuje esančių receptorių [52, 90]. Savo funkcijas chemokinai atlieka besijungdami prie ląstelių taikinių paviršiuje esančių receptorių ir tokiu būdu aktyvindami viduląstelines signalo perdavimo sistemas, sąlygojančias ląstelių chemotaksį ar kitas funkcijas - proliferaciją, diferenciaciją ir gyvybingumą [21, 52, 90, 91].

Kai kurie chemokinai, geba jungtis tik prie vienos rūšies receptorių, kiti – jungdamiesi prie įvairių receptorių tipų tarpininkauja keliems procesams [52, 90, 91]. Šiuo metu chemokinai skiriami į 4 pošeimius atsiţvelgiant į disulfidine jungtimi sujungtų amino rūgšties cisteino liekanų vietą peptido sekoje – CC (cisteino liekanos neatskirtos viena nuo kitos), C (viena cisteino liekana), CXC (cisteino liekanos atskirtos viena amino rūgštimi), ir CX3C (cisteino liekanos atskirtos trimis

amino rūgštimis) [52]. Manoma, jog sergant LOPL, uţdegiminiame procese neutrofilų funkcijas labiausiai įtakoja CXC pošeimio chemokinai [91, 92].

Vienas svarbiausių LOPL uţdegiminius procesus lemiančių chemokinų ir neutrofilus aktyvinančių veiksnių – IL-8, priskiriamas CXC pošeimiui. Tai iš 72 amino rūgščių sudarytas 8,3 kDa molekulinės masės chemotaksinėmis savybėmis pasiţymintis baltymas. Šį chemokiną sekretuoja ne tik aktyvinti neutrofilai [17], bet ir epitelinės ląstelės, T limfocitai, keratinocitai, fibroblastai, endotelinės ląstelės, alveoliniai makrofagai [18, 19]. Įdomu tai, kad IL-8 yra vienas pagrindinių neutrofilų sekretuojamų citokinų ir tuo pačiu, neutrofilai esti pagrindiniu šio chemokino taikiniu.

IL-8 koncentracija ţenkliai padidėja sergančiųjų LOPL indukuotuose skrepliuose ir BAL skystyje [4, 6, 9], o taip pat šio chemokino koncentracija tiesiogiai siejama su didesniu neutrofilų skaičiumi kvėpavimo takuose [91]. Svarbu tai, jog IL-8 nebūdingas nuolatinis kaupimasis ląstelėje, o sintetinamas tik gavus signalą, pvz. rūkymo poveikyje [9], todėl ir šio chemokino šaltiniai esti labai įvairūs.

Kvėpavimo takų epitelinės ląstelės sintetina IL-8 reaguodamos į įvairius stimuliuojančius signalus – TNF-α, IL-1b, bakterijų produktų ir virusų siunčiamus signalus, oksidacinį stresą, cigarečių dūmuose esančias medţiagas [9, 93].

IL-8 sintezę ir sekreciją kontroliuoja įvairūs transkripcijos veiksniai, iš kurių svarbiausiu skatinamuoju poveikiu pasiţymi NF- B (angl. k. nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) [92]. Aktyvinus NF- B sukeliamas histonų hiperacetilinimas, sąlygojantis dezoksiribonukleino rūgšties (DNR) grandţių atsilaisvinimą, didesnę IL-8 geno raišką ir koncentraciją [92, 93]. Be to, šio chemokino sekreciją bei aktyvumą įtakoja ir kiti uţdegimo ţymenys, pvz. MMP-9 geba sąlygoti iki 10 kartų didesnį IL-8 aktyvumą [94, 95].

Nors IL-8 yra svarbus uţdegimo veiksnys, įtakojantis kvėpavimo takuose vystančius uţdegiminius procesus [7, 93, 95], o didelės šio chemokino koncentracijos nustatomos ir sergančiųjų LOPL kraujyje [91, 95], tačiau IL-8 koncentracijos ypatumai kvėpavimo takų sekrete ir kraujyje priklausomai nuo rūkymo įpročio nėra galutinai įvertinti.

2.6 Kraujo neutrofilų chemotaksis kvėpavimo takų uţdegimo metu

Skirtingai nei netvarkingas ląstelių judėjimas (chemokinezė), neutrofilų chemotaksis, t.y. judėjimas link chemotaktinių veiksnių siunčiamų signalų, yra tikslingas bei kryptingas šių ląstelių judėjimas [97]. Kaulų čiulpuose subrendę ir į kraujotaką patekę neutrofilai laisvai cirkuliuoja kraujyje, iš kurio dėl trumpaamţiškumo yra greitai pašalinami. Tuo tarpu, uţdegimo metu kraujyje cirkuliuojantys neutrofilai reaguodami į ląstelių sekretuojamų biologiškai aktyvių medţiagų,

daţniausiai pasiţyminčių chemotaktinėmis savybėmis, siunčiamus signalus, juda į infekcijos ţidinį [34, 92, 96] – sergant LOPL į kvėpavimo takus.

Chemotaktinėmis savybėmis pasiţyminčios medţiagos aktyvina ląstelių signalo perdavimo sistemas, sąlygojančias fiziologinius ir patologinius pokyčius. Neutrofilų, kaip ir kitų fagocitinių ląstelių, patekimas į uţdegimo ţidinį vyksta grieţtai kontroliuojama seka – iš pradţių leukocitai sudaro pasieninį sluoksnį, po to seka jų adhezija prie endotelio ląstelių, migravimas chemotaktinių veiksnių siunčiamų signalų kryptimi, fagocitozė ir granulėse sukauptų uţdegimo medţiagų išskyrimas [34, 90].

Pradinė neutrofilų sąveika su endotelio ląstelėmis pasiţymi nedideliu giminingumu, kurioms svarbios selektino-mucino sąveikos. Tai sulėtina neutrofilų judėjimą kraujyje. Sulėtintas neutrofilų judėjimas kraujyje įgalina juos priimti chemotaktinių veiksnių siunčiamus signalus [34]. Neutrofilų judėjimą kontroliuoja svarbūs citoskeleto komponentai – F-aktino ir miozino filamentai, padedantys neutrofiluose susiformuoti pseudopodijoms, kurių pagalba neutrofilai juda link chemotaktinio signalo [90, 91].

Antrasis etapas – tvirta neutrofilų adhezija prie endotelio, kuriai tarpininkauja ß2 integrinų šeimos receptoriai – CD11a/CD18, CD11b/CD18 ir D11c/CD18 tipų receptoriai, aktyvinantys neutrofilus ir uţtikrinantys tvirtą jų adheziją [97].

Iki šiol maţiausiai ţinoma apie neutrofilų judėjimą per viduląstelines endotelyje esančias jungtis. Šiame etapui tarpininkauja labai daug įvarių molekulių, pvz. vienos grandies 1-tipo glikoproteinas, trombocitų endotelio ląstelių adhezijos molekulės (angl. k. platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1)), su integrinu susiję baltymai (angl. k. integrin-associated protein) [97]. Šios molekulės sąveikauja su kelių tipų receptoriais, iš kurių svarbiausi – integrinai [98].

Integrinai yra ląstelės plazminėje membranoje išsidėstę heterodimeriniai receptoriai, sudaryti iš α ir β grandţių tarpusavyje sujungtų nekovalentine jungtimi. Šiuo metu ţinoma apie 18 integrino α grandţių ir 8 β grandţių. Dauguma β grandţių pasiţymi gebėjimu jungtis su daugiau nei viena α grandimi. Tokiu būdu uţtikrinama didţiulė šių heterodimerinių receptorių įvairovė, galinti atpaţinti ir prijungti įvarius ligandus [97]. Neutrofilų paviršiuje labiausiai paplitę β2(angl k. leukocyte cell

adhesion molecule (LeuCAM)) šeimos integrinai. Be to, integrinai svarbūs tarpininkai ne tik uţdegimui tarpininkaujančių ląstelių migracijos, bet ir tolesniame fagocitozės procese [98].

Selektinai yra kalcio jonais valdomi neutrofilų ir endotelio paviršiuje ekspresuojami I-ojo tipo transmembraniniai lektinai. Chemotaktiniam neutrofilų judėjimui svarbiausi selektinai – L-selektinas (CD62L), P-L-selektinas (CD62P) ir E-L-selektinas (CD62E). L-L-selektinas yra pastoviai ekspresuojamas visų leukocitų paviršiuje. Tuo tarpu E-selektino sintezė ir raiška endotelio ląstelėse vyksta tik gavus aktyvinančio citokino signalą (pvz. interferono-γ (IFN-γ)). P-selektinas saugomas

endotelio ląstelėse esančiuose Weible-Palade kūneliuose ir uţdegiminio signalo metu iškart pradedama jo raiška endotelinių ląstelių paviršiuje [34].

Neutrofilai pasiţymi skirtingu giminingumu įvairioms chemotaktinėmis savybėmis pasiţyminčioms biologiškai aktyvioms medţiagoms, todėl į skirtingus chemotaktinių veiksnių siunčiamus reaguoja skirtingu judėjimo greičiu [20, 90, 91]. Chemotaktiniams veiksniams prisijungus prie neutrofilų membranoje esančių receptorių aktyvinamos viduląstelinės signalo perdavimo sistemos, lemiančios neutrofilų judėjimą didesnės chemotaktinių medţiagų koncentracijos kryptimi [34, 52].

Chemotaktiniais neutrofilų veiksniais gali būti tiek viduląsteliniai komponentai, tiek aplinkos veiksniai. Viduląsteliniams chemoatraktantams priskiriami įvairūs citokinai, leukotrienas B4 ir daugelis kitų uţdegime dalyvaujančių ląstelių sintetinamų biologiškai aktyvių medţiagų. Aplinkos – cigarečių dūmuose esančios medţiagos ar kiti ţalingi aplinkos veiksniai, skatinantys ląsteles sintetinti ir sekretuoti neutrofilų chemotaktinius veiksnius, tokius kaip IL-8 [99].

Nors IL-8 įvardijamas pagrindiniu ir klasikiniu neutrofilų chemotaktinį aktyvumą skatinančiu veiksniu [20], tai nėra vienintelis kryptingą šių ląstelių judėjimą stiprinantis veiksnys. Nustatyta, jog nuslopinus šio chemokino aktyvumą blokuojančiais antikūnais, neutrofilų chemotaksis sumaţėja tik apie 30 proc. [100]. Tokie rezultatai leidţia daryti prielaidas, jog egzistuoja ir kiti šių ląstelių judėjimą į infekcijos ţidinius skatinantys veiksniai.

Chemotaktinės IL-8 savybės pasireiškia jam jungiantis prie 2 tipų receptorių, esančių neutrofilų paviršiuje: CXCR1 – pasiţyminčių dideliu giminingumu IL-8 ir CXCR2 – pasiţyminčių maţesniu giminingumu IL-8, bet gebančių prijungti ir kitus CXC chemokinus [50, 90]. Manoma, jog IL-8 ir kitoms chemotaktinėmis savybėmis pasiţyminčioms biologiškai aktyvioms medţiagoms jungiantis prie neutrofilų paviršiuje esančių receptorių, sąlygojami konformaciniai pokyčiai, lemiantys G baltymo α ir βγ subvienetų disociaciją [99]. Tokiu būdu, šie subvienetai aktyvina efektorinėmis savybėmis pasiţyminčius fermentus. Susidaręs inozitolio trifosfatas (IP3) skatina kalcio jonų išsiskyrimą į citozolį iš viduląstelinių saugyklų bei baltymų kinazės C (angl. k. protein kinase C (PKC)) aktyvinimą [101]. Svarbu paminėti, jog neutrofilų judėjimui chemotaktinių signalų kryptimi naudojama adenozino trifosfato (ATP) ryšiuose sukaupta energija [102].

Chemokinų receptorių aktyvinimas taip pat aktyvina ir prie guanozino trifosfato (GTP) besijungiančius maţos molekulinės masės baltymus Ras ir Rho [97]. Šie baltymai kontroliuoja ląstelių judėjimą įtakodami nuo aktino priklausomus procesus – F-aktino polimerizaciją, pseudopodijų susidarymą ir adhezinių kompleksų susidarymą [103].

Teigiama, jog chemotaktinėmis savybėmis pasiţyminčioms biologiškai aktyvioms medţiagoms besijungiant prie neutrofilų paviršiuje esančių CXCR2 labiausiai aktyvinamas jų

chemotaktinis judėjimas, tuo tarpu besijungiant prie CXCR1 skatinama neutrofiluose sukauptų uţdegimo ţymenų ir proteinazių sekrecija [104].

Sergant LOPL, neutrofilija stebima tiek stambiuosiuose, tiek smulkiuosiuose kvėpavimo takuose, tačiau jos prieţastis tebėra neaiški. Todėl, vienas šio mokslinio darbo uţdavinių ir buvo įvertinti ne tik ţinomų neutrofilų chemotaktinių veiksnių, bet ir potencialų tiesioginį skirtingų kvėpavimo takų sričių sekreto, suteikiančio informacijos apie kvėpavimo takuose vykstantį uţdegiminį procesą, poveikį sergančiųjų LOPL ir sveikų asmenų kraujo neutrofilų chemotaksiui ir galimus jų skirtumus atsiţvelgiant į rūkymo įprotį.

2.7 Neutrofilų fagocitozė ir ją aktyvinantys veiksniai

Reaguodami į chemotaktinių veiksnių siunčiamus signalus, į kvėpavimo takus patekę aktyvinti neutrofilai fagocitozės būdu sunaikina patekusius patogenus. Fiziologinėmis sąlygomis fagocitozė vyksta nuolat, tokiu būdu pašalinant įvairias į kvėpavimo takus su įkvėpiamu oru patekusias daleles, mikroorganizmus, o taip pat ţuvusias ląsteles, nepaţeidţiant aplinkinių audinių [23]. Tuo tarpu savo funkciją atlikusius, t.y. fagocitavusius neutrofilus, fagocituoja didesnės fagocitinės ląstelės – makrofagai [34, 65, 105].

Kontakto su patogenais metu, neutrofilai apgaubia fagocituojamą dalelę suformuodami fagocitinę vakuolę – fagolizosomą, kurioje išskiriant neutrofilų granulėse esančius komponentus ir naikinami mikroorganizmai. Jie įsiurbiami į fagolizosomos vidų, viduląstelinės granulės susilieja su fagolizosoma ir išskiria į ją savo komponentus, kurių pagalba patogenai nuţudomi ir suvirškinami [106]. Tai gali vykti oksidacinių (nuo deguonies priklausomų) ir neoksidacinių (nuo deguonies nepriklausomų) procesų metu. Nuo deguonies nepriklausomos fagocitozės metu, patogenai sunaikinami citoplazminėse granulėse esančių biologiškai aktyvių medţiagų pagalba [107]. Tuo tarpu, nuo deguonies priklausomo proceso metu, aktyvinus neutrofilus, kartu aktyvinama ir fagolizosomų membranoje esanti oksidacijos-redukcijos fermentinė sistema. Tokiu būdu leukocitai ne tik sunaikina mikroorganizmus, bet ir skatina intensyvesnį uţdegiminį procesą, išskirdami į tarpląstelinę terpę įvairius fermentus, uţdegimo veiksnius ir reaktyviasias deguonies formas (ROS) [106, 107].

Kaip ir chemotaktinių signalų kontroliuojamas neutrofilų judėjimas iš kraujo į uţdegimo ţidinius, fagocitozė ir fagocitavusių ląstelių pašalinimas – grieţtai kontroliuojami ir reguliuojami procesai [23, 34].

Neutrofilų fagocitozės procesas skiriamas į kelis etapus – fagocito priartėjimas prie fagocituojamosios dalelės, prisijungimas prie jos, įsiurbimas ir galiausiai jos suvirškinimas. Prie fagocituojamos medţiagos neutrofilai juda reaguodami į minėtų chemotaktinių veiksnių siunčiamus signalus. Prilipimą sąlygoja patogeno sienelėje esančių molekulių ir neutrofilo membranos sąveika.

Papildomai dar gali dalyvauti opsoninai, kurie iš pradţių prisijungia prie bakterijos ir tik vėliau bakterijos-opsonino kompleksas prisijungia prie fagocito membranoje esančio receptoriaus [23, 34, 105].

Kad neutrofilai galėtų fagocituoti į organizmą patekusius patogenus, pirmiausia jie turi juos atpaţinti.Lengviausiai neutrofilai atpaţįsta opsoninais (antikūnais, ypač imunoglobulinais G (IgG) ar komplemento komponentais, ypač C3b) padengtus mikroorganizmus ar patogenines daleles, o šių ląstelių paviršiuje esantys receptoriai sąveikaudami su opsonizuotų bakterijų paviršiuje ekspresuojamomis signalinėmis molekulėmis aktyvina fagocitozės procesą [108]. Toks fagocitozės skatinimas ir palengvinimas vadinamas opsonizacija [34]. Taigi, opsonizacijos metu patogenas „paţymimas“ jį fagocituoti, o neutrofilai gauna signalą judėti link fagocituojamo patogeno ir jį sunaikinti [108].

Vykstant opsonizacijai antikūno Fab sritis jungiasi prie antigeno, tuo tarpu antikūno Fc dalis – prie neutrofilo paviršiuje esančio receptoriaus, t.y. neutrofilo Fc tipo receptoriaus. Receptoriaus-opsonino kompleksas gali sąlygoti ir antrinių produktų susidarymą, pvz., C3b ir C4b, kurie yra svarbūs komplemeto sistemos komponentai [108].

Fagocitozė gali vykti ir be opsonizacijos – tuomet šiame procese nedalyvauja antikūnai ir komplemento sistemos komponentai [34, 108]. Visgi, neopsonizuotų mikroorganizmų ir patogeninių dalelių fagocitozė esti ne tik silpnesnė, bet ir ţalingesnė organizmui nei opsonizuotų [108]. Tad opsonizacija nors ir nebūtina fagocitozei, tačiau ţymiai ją palengvina ir maţiau kenkia aplinkinėms ląstelėms bei audiniams [106, 108].

Opsonizuoto mikroorganizmo prisijungimas prie Fc receptorių sąlygoja jo įsiurbimą į fagocito vidų, fagocituotos dalelės patekimą į fagosomą, sudarytą iš fagocito membranos. Tuomet fagosomos membrana susilieja su lizosomų membrana – susidaro fagolizosoma, į kurią išsilieja neutrofilų granulėse esantys fermentai ir mikroorganizmas suardomas. Tai fagocitozės virškinimo stadija [106, 108].

Neutrofilų fagocitozei svarbūs dviejų tipų minėtieji receptoriai, esantys šių ląstelių paviršiuje – Fc tipo ir komplemento receptoriai (CR3, CD11b/CD18, Mac-1) receptoriai [108]. Skiriasi šių sistemų ir signalo perdavimo mechanizmai.

Fc receptoriai. Šio tipo receptoriai sutinkami visų leukocitų paviršiuje [109]. Receptoriai, sąveikaujantys su antikūnais, vadinami Fc receptoriais (FcR) dėl jų sąveikos su imunoglobulinų sunkiosios grandinės Fc sritimi. Vieni geriausiai ištirtų – besijungiantys su IgG receptoriai (FcγR).

Neutrofilų paviršiuje išsidėstę FcγR skiriami į transmembraninius glikoproteinus – FcγRIIA (CD32) ir FcγRIIIB (CD16) [109]. Teigiama, jog fagocituojant Staphylococcus aureus (S. aureus) bakterijas svarbiausi FcγRII tipo receptoriai [110].