UŽDEGIMO ŽYMENŲ ĮTAKOS OPINIAM KOLITUI ANALIZĖ BEI KIEKYBINIS ŽYMENŲ (COX−2, iNOS, PGE

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MA FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

ODILIJA BARTLINGAITĖ

UŽDEGIMO ŽYMENŲ ĮTAKOS OPINIAM KOLITUI ANALIZĖ BEI

KIEKYBINIS ŽYMENŲ (COX−2, iNOS, PGE2 IR NO) POKYČIŲ

VERTINIMAS PELIŲ KRAUJO PLAZMOJE IR GAUBTINĖS

ŽARNOS AUDINIŲ MĖGINIUOSE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovai Doc. dr. Raimondas Benetis

Prof. dr. Giuseppe Esposito

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MA FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. Vitalis Briedis

2015 – mėn. – d.

UŽDEGIMO ŽYMENŲ ĮTAKOS OPINIAM KOLITUI ANALIZĖ BEI KIEKYBINIS

ŽYMENŲ (COX−2, iNOS, PGE2 IR NO) POKYČIŲ VERTINIMAS PELIŲ KRAUJO

PLAZMOJE IR GAUBTINĖS ŽARNOS AUDINIŲ MĖGINIUOSE Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Doc. dr. Raimondas Benetis

TURINYS

SANTRAUKA ... 4

SUMMARY ... 5

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10 1.1. OPINIS KOLITAS ... 10 1.2. EPIDEMIOLOGIJA ... 11 1.3. ETIOPATOGENEZĖ ... 12 1.3.1. Aplinkos veiksniai ... 12 1.3.2. Genetiniai veiksniai ... 13

1.3.3. Imuninio atsako sutrikimai ... 14

1.3.4. Žarnyno mikrofloros ir uždegiminių procesų kitimai ... 15

1.4. DIAGNOSTIKA ... 16

1.4.1. Ligos anamnezė bei medicininė apžiūra ... 16

1.4.2. Laboratoriniai testai ... 17 1.4.3. Endoskopinis tyrimas ... 17 2. TYRIMO METODIKA ... 18 2.1. TYRIMO ORGANIZAVIMAS ... 18 2.2. TYRIMO OBJEKTAS ... 18 2.3. TIRIAMŲJŲ KONTINGENTAS ... 18

2.4. TYRIMO METODAI IR NAUDOTOS MEDŽIAGOS ... 18

2.4.1. Baltymų ekstrakcija ir „Wester blot“ analizė ... 19

2.4.2. Kiekybinis NO kiekio nustatymas ... 20

2.4.3. Imunofermentinė PGE2 analizė ... 20

2.5. DUOMENŲ ANALIZĖS METODAI ... 21

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 22

3.1. UŽDEGIMINIŲ PROCESŲ ŽYMENYS, JŲ POKYČIAI OK METU BEI ĮVERTINIMO METODAI ... 22

3.1.1 Uždegiminių procesų žymenys opinio kolito metu ... 22

3.1.2 Uždegiminių procesų žymenų pokyčiai opinio kolito metu ... 23

3.1.3 Kiekybinis žymenų pokyčių vertinimas ex vivo mėginiuose ... 25

3.2. COX−2 IR INOS RAIŠKOS POKYČIŲ ĮVERTINIMAS PELIŲ ŽARNŲ GLEIVINĖS AUDINIUOSE ... 30

3.3. PGE2IR NO GAMYBOS POKYČIAI PELIŲ KRAUJO PLAZMOJE ... 32

4. IŠVADOS... 35

5. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 36

SANTRAUKA

O. Bartlingaitės magistro baigiamasis darbas. Uždegimo žymenų įtakos opiniam kolitui analizė bei kiekybinis žymenų (COX−2, iNOS, PGE2 ir NO) pokyčių vertinimas pelių kraujo plazmoje ir gaubtinės žarnos audinių mėginiuose. Moksliniai vadovai doc. dr. R. Benetis ir Prof. Giuseppe Esposito (La Sapienza, Vittorio Erspamer fiziologijos ir farmakologijos katedra, Roma, Italija). Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Farmacijos fakultetas, Vaistų chemijos katedra. – Kaunas, 2015.

Raktiniai žodžiai: opinis kolitas, uždegimo žymenų raiška, Western blot, ELISA.

Darbo tikslas: Apžvelgti uždegimo žymenų įtaką sergant opiniu kolitu bei kiekybiškai įvertinti uždegimo žymenys (COX−2, PGE2, iNOS, NO) ūminiu opiniu kolitu sergančių pelių kraujo plazmoje ir gaubtinės žarnos audinių mėginiuose.

Darbo uždaviniai: 1) Atlikti literatūros paiešką ir analizę apie uždegiminių procesų žymenis ir jų pokyčius opinio kolito metu; 2) Parinkti metodus, kuriais būtų galima kiekybiškai įvertinti uždegimo žymenis: COX−2, PGE2, iNOS ir NO; 3)Ištirti COX−2 ir iNOS baltiminių fermentų kiekį pelių žarnų gleivinės audiniuose bei palyginti jų raiškos pokyčius esant ūmiam žarnų uždegimui; 4) Įvertinti PGE2 ir NO gamybą bei jų kitimus DSS sukeltu opiniu kolitu sergančių ir kontrolinių grupių pelių kraujo plazmoje.

Tyrimų metodika: Baltymų ekstrakcijai ir iNOS, COX−2 kiekybinei analizei naudojome Western analizę, dėmės buvo analizuojamos skenuojant densitometru. PGE2 koncentracijai matuoti naudota ELISA analizė, absorbcija (optinis tankis) buvo matuota mikroplokštelių skaitytuvu. NO koncentracija buvo matuojama kaip nitrito jonų (NO2 – ) kaupimasis pelių kraujo plazmoje, tiriama spektrofotometrijos metodu, pagrįstu Griess reakcija. Tyrimams buvo naudotos šešių savaičių amžiaus laukinio tipo vyriškos lyties CD – 1 pelės. Pelės atsitiktinai suskirstytos į dvi grupes (kontrolinė ir sergančioji). Sergančiosios grupės pelėms opinis kolitas buvo sukeltas girdant 4% DSS tirpalu per os geriamąjame vandenyje 6 dienas iš eilės. Tyrimams širdies punkcijos metu paimti kraujo mėginiai, biopsijos metu pelių gaubtinių žarnų audinių mėginiai.

SUMMARY

Master thesis of Odilija Bartlingaite. The evaluation of inflammatory markers role in ulcerative colitis and quantitative determination of markers (COX–2, iNOS, PGE2 and NO) in mice plasma and colon tissues. Research supervisors doc. Dr. R. Benetis and Prof. Giuseppe Esposito (Sapienza, „Vittorio Erspamer“ department of Physiology and Pharmacology, Rome, Italy). Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Chemistry, Kaunas 2015.

Keywords: ulcerative colitis, inflammatory markers expression, Western blot, ELISA.

The purpose of the study is to review the influence of inflammatory markers in ulcerative colitis and quantitative determination of inflammatory markers (COX–2, PGE2, iNOS, NO) in mice with acute ulcerative colitis blood plasma and colon tissues.

Objectives of the study: 1) The research and analysis of literature about inflammatory markers and their expression in ulcerative colitis; 2) To select methods that can allow quantification of inflammatory markers COX–2, PGE2, iNOS and NO; 3) To examine the amount of COX–2 and iNOS protein enzymes in mice intestinal mucosal tissues, and compare changes of their expression in acute intestinal inflammation; 4)To evaluate the production of PGE2 and NO in mice with DSS–induced ulcerative colitis mice plasma in comparison to a control group.

Metods: For protein extraction and quantitative determination of iNOS, COX–2 Western analysis was used, spots were analyzed by scanning with densitometer. PGE2 concentration was measured using an ELISA analysis, absorption (optical density) was measured with a microplate reader. NO concentration was measured as nitrite ions (NO2–) accumulation in mice plasma, analysed by spectrophotometric method, based on Griess reaction. Research used six–week–old wild–type male CD – 1 mice. Mice were randomly divided into two groups (control and the sick). Ulcerative colitis for the sick group of mice was induced by oral administration of 4% DSS in the drinking water. Blood samples (by heart puncture), and murine colon tissue samples (by biopsy) were taken for the research.

PADĖKA

SANTRUMPOS

COX – Ciklooksigenazė (angl.: Cyclooxygenase)

DMEM – „Dulbeko pakeista Eagle“ terpė (angl.: Dulbecco’s modified Eagle's medium) DSS – Natrio dekstrano sulfatas (angl.: Dextran sodium sulphate)

EDTA – Etilendiamintetra acto rūgštis

ELISA – Imunofermentinė analizė (angl.: Enzyme – linked immunosorbent assay) IL – Interleukinas

INF – Interferonas

JVS – Jaučio vaisiaus serumas KL – Krono liga

MAPK – Mitogeno aktyvuota proteinkinazė NDS – Natrio dodecilsulfatas

NDS – PAGE – Natrio dodecil lauril sulfato poliakrilamido gelio elektroforezė (angl.: Sodium dodecyl

sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

NK – Natūralios ląstelės žudikės (angl.: Natural killer cells) NLR – Nukleotido oligomerizacijos domeno receptorius NO – Azoto monoksidas

NOD – Nukleotido oligomerizacijos domenas (angl.: Nucleotide oligomerization domain) OK – Opinis kolitas

PAG – Poliakrilamido gelis

PBS – fosfatinis buferis (angl.: phosphate buffered saline) PG – Prostaglandinas

PVDF – Polivinilideno difluoridas

RIG−I – Retino rūgštį indukuojantis genas 1

RLRs – Retino rūgštį indukuojančio geno 1 receptoriai Th – T pagalbinės ląstelės (angl.: T helper cells)

TLR – Varpelio tipo receptoriai (angl.: Toll – like receptors) TNF – Navikų nekrozės veiksnys (angl.: Tumor necrosis factor) TSSA – Tarptautinė skausmo studijų asociacija

ĮVADAS

Opinis kolitas (OK) − tai simbiotinių bakterijų, virusų, grybelinių sporų ar kitos kilmės patogenų nuolatinio antigeninio poveikio į žarnos spindį rezultatas, kuris sukelia chroninį uždegimą asmenims turintiems genetinį polinkį, gleivių barjero funkcijos, imunoreguliacijos ar mikrobų sunaikinimo sutrikimų [1]. Europoje didžiausias sergamumas yra Skandinavijoje (20−26 iš 100 000 gyventojų) ir Jungtinėje Karalystėje (19/105

). Žemiausias dažnis skaičiuojamas Pietų (0,7−7 / 105) ir Rytų (8,1/ 105) Europos šalyse [2]. Lietuvoje uždegiminėmis žarnų ligomis serga 7066 pacientai, opiniu kolitu serga didesnis procentas gyventojų nei Krono liga (4584 ir 2482 pacientų, 65% ir 35% atitinkamai) [119]. Kiudelio 2007–2009 metais atlikto tyrimo [118] duomenimis sergamumo dažnis OK 6.56/ 105. Lietuvos gyventojų. Sergančiųjų opiniu kolitu skaičius kasmet auga [4], vien 2013m. diagnozuoti 155 nauji OK atvejai [119].

Opinis kolitas yra keturių pagrindinių komponentų bendras uždegiminis padarinys [5]: aplinkos ir genetinių veiksnių, imuninio atsako sutrikimų bei mikrofloros ir uždegiminių procesų pakitimai žarnyno epitelio ląstelėse. Tradiciškai uždegiminė žarnų liga vertinama klinikiniais, histologiniais, radiologiniais ir endoskopiniais rodikliais [41], tačiau uždegimo žymenų nustatymas yra neinvazinis būdas objektyviai įvertinti uždegimą, kuris gali vaidinti papildomą ar net pagrindinį vaidmenį ligos aktyvumo įvertinime. Uždegimo žymenys ūmios uždegimo fazės metu tiesiogiai koreliuoja su ligos aktyvumu ir, kai kurie jų, gali būti naudojami siekiant tirti ligos etiopatogenezę bei prognozuoti recidyvą. Citokinai ir adhezijos molekulės netolygiai didėja ūmios ligos metu, todėl vertinant OK reikėtų įvertinti papildomų žymenų raiškos duomenis. Uždegimo žymenys išmatose yra naudingi vertinant ligos aktyvumą bei recidyvo riziką, nes vienas iš klinikinių OK simptomų − rektalinis kraujavimas [6].

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Apžvelgti uždegimo žymenų įtaką sergant opiniu kolitu bei kiekybiškai įvertinti uždegimo žymenų (COX−2, PGE2, iNOS, NO) raišką ūminiu opiniu kolitu sergančių pelių kraujo plazmoje ir gaubtinės žarnos audinių mėginiuose.

Darbo uždaviniai:

1. Atlikti literatūros paiešką ir analizę apie uždegiminių procesų žymenis ir jų pokyčius opinio kolito metu.

2. Parinkti metodus, kuriais būtų galima kiekybiškai įvertinti uždegimo žymenis: COX−2, PGE2, iNOS ir NO.

3. Ištirti COX−2 ir iNOS baltyminių fermentų kiekį pelių žarnų gleivinės audiniuose bei palyginti jų raiškos pokyčius esant ūmiam žarnų uždegimui.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Opinis kolitas

Uždegiminė žarnų liga (UŽL) – lėtinė, daugiaveiksmė, autoimuninė, recidyvuojanti liga, pažeidžianti paciento paviršinį žarnyno sienelės sluoksnį − gleivinę ir pogleivį, kliniškai pasireiškianti rektaliniu kraujavimu, pilvo spazmais, viduriavimu, vidurių putimu, pilvo skausmu, karščiavimu. Krono liga (KL) ir opinis kolitas (OP) yra dvi labiausiai paplitusios UŽL formos [8]. Žmogaus žarnynas yra didžiausią gleivinės sluoksnį turintis organas organizme, o jo epitelinės žarnyno ląstelės atlieka apsauginę funkciją prieš patogenines bakterijas ar mikrobinius antigenus patenkančius į žarnyną [9, 10]. Opinis kolitas atpažįstamas iš pasikartojančio ir epizodinio storosios žarnos uždegimo, kuriam būdingas paviršinių opų atsiradimas gleivinėje [11, 12]. OK ligos sunkumas grindžiama Truelove ir Witts kriterijais (1 pav.):

1 pav. Opinio kolito sunkumo klasifikacija pagal Truelove ir Witts kriterijus, kur ENG–eritrocitų nusėdimo greitis, CRB– C reaktyvus baltymas

(adaptuotas pagal Mahadevan, 2004, [96])

Uždegiminiai pokyčiai sergant OK prasideda nuo tiesiosios žarnos ir plinta proksimaliai, pažeisdami visą storosios žarnos gleivinę ir pogleivį, ryškiausi pokyčiai nustatomi distalinėse storosios žarnos dalyse. Būdingas histopatologinis požymis – pseudopolipai atsirandantys išopėjus gleivinei, kaip normalios gleivinės salelės su šiek tiek edemišku pogleiviniu sluoksniu. Uždegiminiai požymiai opinio kolito metu atsiranda tik žarnos sienelės gleivinėje ar pogleivyje (skirtingai nei Krono ligos metu).

Opinis kolitas klasifikuojamas pagal uždegiminio proceso paplitimą storąjame žarnyne (Montrealio klasifikacija)[120]:

2. E2 (kairiosios pusės OK, taip pat vadinamas distaliniu OK): uždegiminiai procesai apsiriboja iki skersinės žarnos vidurio, distaliau blužnies linkiui; 28% atvejų.

3. E3 (visos žarnos, taip pat vadinamas pankolitiniu OK): uždegiminiai procesai tęsiasi proksimaliai blužnies linkiui ir apima visą storąją žarną; 18% atvejų.

Sunkiai sergantiems pacientams uždegimas gali apimti visus žarnos sienelės sluoksnius (gleivinę, pogleivį ir raumeninį sluoksnį). Šiuo patologiniu atveju sutrinka žarnyno motorika, sunkėja tuštinimasis, kas gali lemti mirtiną komplikaciją – toksišką, padidėjusią gaubtinę žarną [14, 15]. Padidėjusi žarna – storosios žarnos išsiplėtimas (kartais ir pailgėjimas), kurį sukelia lėtinė gaubtinės žarnos obstrukcija, ilgalaikis vidurių užkietėjimas ar opinis kolitas (toksiška padidėjusi gaubtinė žarna) [16]. Lėtinis žarnyno uždegimas didina riziką susirgti storosios žarnos vėžiu, kuris yra vienas dažniausiai diagnozuojamų piktybinių navikų (trečias pagal dažnumą) [17].

1.2.

Epidemiologija

OK sergamumo dažnis yra didelis Šiaurės Amerikoje bei Šiaurės ir Vakarų Europos šalyse, Indijoje, Australijoje, mažas Afrikoje, Rytų Europoje, Pietų Amerikoje, Azijoje ir Ramiojo vandenyno regionuose. Kita vertus, nauji tyrimai rodo, kad sergamumas stabilizavosi arba šiek tiek padidėjo šalyse, kuriose anksčiau buvo stebimas didelis sergamumo paplitimas, tuo tarpu šalyse, kur sergamumas buvo žemas – jis išaugo [18]. Liga gali susirgti bet kokio amžiaus žmonės nuo kūdikių iki pagyvenusių žmonių, tačiau dažniausi susirgimai registruojami tarp 15–30 bei 50–70 metų pacientams [20], OK nepriklauso nuo lyties [19]. Lietuvoje, lyginant su kitomis Europos šalimis, sergamumo UŽL paplitimas 2010 m. yra vienas iš žemiausių − 6,5/105 sergamumas opiniu kolitu bei 2,6/105 sergamumas Krono liga [104]. Ateityje OK gali tapti pasauline sveikatos problema, todėl svarbu suprasti ligos patogenezę.

1.3.

Etiopatogenezė

Tiksli OK etiopatogenezė ir tikslūs ligos mechanizmai yra nežinomi, tačiau buvo nustatyta keletas imunologinių, genetinių ir aplinkos veiksnių, turinčių įtakos ligos atsiradimui [21]. Per pastaruosius metus moksliniai tyrimai, susiję su opiniu kolitu, dažniau oreantuoti į žarnyno mikrofloros ir žarnyno barjero gynybos mechanizmų (daugiausia gleivinės sluoksnio ir gleivinės imuninės sistemos) sąveikos nagrinėjimą [22]. OK gali būti laikomas imuniniu sutrikimu, kuris išsivysto genetinį polinkį turintiems asmenims dėl disreguliuojamo imuninio atsako prieš vidaus ertmės antigenus [23]. Ankstyvojoje ligos stadijoje gleivinės barjero funkcija stipriai sumažėja dėl epitelio ląstelių apoptozės. Susilpnėjusios jungtys tarp epitelio ląstelių bei padidėjęs tarpląstelinis pralaidumas taip pat mažina gleivinės apsauginę (barjero) funkciją [24]. Opinis kolitas yra keturių pagrindinių komponentų bendras uždegiminis padarinys [25]:

1. Aplinkos veiksnių; 2. Genetinių veiksnių;

3. Imuninio atsako sutrikimų;

4. Žarnyno mikrofloros ir uždegiminių procesų pasikeitimai;

1.3.1. Aplinkos veiksniai

Šiuo metu OK patogenezę sutarta laikyti kaip rezultatą nuolatinio antigeninio stimuliavimo į žarnyno spindį, atsirandančio dėl simbiotinių bakterijų, virusų, grybelinių sporų ar kt. kilmės patogenų, kuris sukelia chroninį uždegimą genetinį polinkį turintiems asmenims, turintiems gleivių barjero funkcijos, imunoreguliacijos ar mikroorganizmų atpažinimo arba sunaikinimo sutrikimų. Deja, nėra nustatyto specifinio infekciją sukeliančio mikroorganizmo, nuosekliai izoliuoto OK metu, taip pat nutarta manyti, jog uždegimą sukelia ne vienas atskiras infekcinių ligų sukėlėjas [1].

Kiti aplinkos rizikos veiksniai, lemiantys OK, tai maisto produktai (kviečiai, karvės pienas, rafinuotas cukrus, vaisiai ir daržovės, alkoholis), geriamieji kontraceptikai, maisto priedai (silikono dioksidas) ir maitinimas krūtimi. Deja, nei vienas iš šių veiksnių neturi pakankamų įrodymų susijusių su OK tam, jog būtų laikomas rizikos veiksniu bei terapiniais tikslais reikalautų jų ribojimo ar gyvenimo būdo pakeitimo [1].

Vakarų šalių gyvenimo būdo pasikeitimas yra susijęs su padidėjusia rizika susirgti OK [19]. Dar 1989 m. D.P. Stachanas pristatė „higienos hipotezę“, kurioje teigiama, jog švarus vanduo ir maistas, mažėjančios šeimos, mažesnė tikimybė susidurti su virusinėmis ligomis mažina įgyjamąjį imunitetą, todėl uždegiminės ligos gali būti siejamos su Vakarų šalių gyvenimo būdu [29]. Įdomu tai, kad asmenų, emigravusių iš mažo OK paplitimo zonos į vieną iš didelio OK paplitimo zonų, gimę vaikai parodė padidėjusią riziką sirgti OK, palyginti su tais pačiais imigrantais. Tai rodo, kad aplinkos veiksniai kūdikystėje ir ankstyvosios vaikystės metu turi įtakos besivystančiai imuninei sistemai ir mikrobiotai ir yra labai svarbūs OK patogenezei [19, 30]. Mityba, apimanti daug sočiųjų rūgščių, pieno riebalų, kuri būdinga Vakarų stiliaus mitybai, gali pakeisti žarnyno floros sudėtį ir taip didinti OK riziką [31].

1.3.2. Genetiniai veiksniai

1.3.3. Imuninio atsako sutrikimai

Normaliomis fiziologinėmis sąlygomis storosios žarnos kriptos yra taisyklingos formos, išsidėsčiusios lygiagrečiai viena kitai bei nukreiptos statmenai į bazinę membraną (imuninių ląstelių sudėtis ir vieta storojoje ir plonojoje žarnoje normaliomis fiziologinėmis sąlygomis pateikta 3 pav.). Kriptų bazinė membrana yra sudaryta iš smulkių, nesubrendusių, bazofilinių ląstelių, kurios diferencijuojasi į taurines, absorbcines ir endokrinines ląsteles. Žarnyno laminia propia sluoksnyje yra didelis skaičius įgimtų ir įgytų imuninių ląstelių, pavyzdžiui, T ir B limfocitai, natūralios ląstelės žudikės (NK), makrofagai (Mφ), dendritinės ląstelės (DCS), putliosios ląstelės, neutrofilai, eozinofilai, taip pat stromos ląstelės (pavyzdžiui, fibroblastai), tačiau didelis skaičius įgimtų ir įgytų imuninių ląstelių dar nėra patologinis pokytis. Uždegiminį procesą rodo pakitusi šių ląstelių koncentracija bazinėje membranoje [35]. Uždegiminė storosios žarnos audinių infiltracija imuninėmis ląstelėmis apima:

 Bendrai pagausėjusį lamina propia ląstelingumą;

 Atsirandančią eozinofilinę infiltraciją, kuri sukelia audinių pažaidą ir disfunkciją;  Bazalinę plazmocitozę (plazminių ląstelių infiltracija aplink ir žemiau kriptų);

 Bazalinius limfoidinius agregatus (limfocitų sankaupos tarp kriptų ir muscularis mucosae sluoksnio)[36].

Makrofagų ar kitų imuninių ląstelių vykdomas antigeno atpažinimas ir apdorojimas yra pirmasis imuninio atsako žingsnis prieš antigeną OK metu. [37]. Makrofagai pristato antigenus T

ląstelėms, bei išlaisvina IL – 1, kuris savo ruožtu aktyvuoja T ląsteles. Aktyvuotos T limfocitinės

ląstelės išlaisvina IL – 2 ir kitus uždegiminius citokinus, kurie skatina citotoksinų gamybą ir didina T pagalbinių ląstelių (Th) aktyvumą [38]. Yra trys T pagalbinių ląstelių tipai svarbūs UŽL metu: Th1, Th2 ir Th17. Ankstesni tyrimai parodė, jog su Th1 limfocitais susiję citokinai (pavyzdžiui: navikų nekrozės veiksnys (TNF), interferonas (INF) – γ, interleukinas (IL) – 12) bei su Th17 susiję citokinai (pvz.: IL – 17A, IL – 21, IL – 23) žymiai pagausėja Krono ligos metu gleivinės uždegimo vietoje. Th2 limfocitų citokinų (IL – 4 ir IL – 13) sąlygotas imuninis atsakas siejamas su OK, tačiau, dar nėra aišku, į kokius specifinius antigenus OK metu organizmas reaguoja uždegimiškai [39, 40].

3 pav. Plonosios ir storosios žarnos histologinė sandara (adaptuotas pagal Maria T. Abreu, 2010 [56])

1.3.4. Žarnyno mikrofloros ir uždegiminių procesų kitimai

Pirmas mikroorganizmų infekcijos žingsnis yra jų adhezija prie paviršinių epitelinių ląstelių. Kai bakterijos, patogenai ar kiti antigenai patenka į organizmą jie susiduria su makrofagais ir kitomis fagocituojančiomis ląstelėmis, vykdančiomis patogeno atpažinimą. Tuomet jie fagocituojami ir transportuojami limfagyslėmis iki limfmazgių. Organizme funkcionuoja trys pagrindinės patogenų atpažinimą vykdančios sistemos: „varpelio“ tipo receptoriai (TLRs), nukleotido oligomerizacijos domeno (NOD) receptoriai (NLRs) ir RIG−I retino rūgštį indukuojančio geno 1 (RIG−I) receptoriai (RLRs) [46, 98]. NOD2 geno mutacijos siejamos su UŽL patogeneze, Krono ligos atveju sumažėja apsauginių baltymų sekrecija bei sutrinka patogenų atpažinimas, todėl net į normalią organizmo mikroflorą reaguojama aktyvuojant uždegiminius signalus [44].

1.4.

Diagnostika

Opinis kolitas, dėl ligos kompleksiškumo yra vertinamas įvairiais klinikiniais, histologiniais, radiologiniais ir endoskopiniais metodais [122]. Pirmasis diagnozės uždavinys yra nustatyti, ar pacientui yra pasireiškęs uždegiminis procesas bei kuo greičiau ir tiksliau įvertinti jo būklę, tam, jog būtų patikslinta diagnozė ir atmestos kitos panašiais simptomais pasireiškiančios ligos, pavyždžiui, dirgliosios žarnos sindromas, Krono liga. Atlikus koprologinį (išmatų) tyrimą nustatomas uždegiminis procesas jose radus uždegiminių leukocitų, taip pat atliekamas pasėlių tyrimas atmesti kitoms infekcinėms ligoms, kurios gali imituoti ar komplikuoti OK nustatymą, pavyzdžiui infekcijos sukeltos

Salmonella, Shigella, Campylobacter, hemoraginės Escherichia coli ir, ypatingai, Clostridium difficile.

Lengviausias būdas išskirti opinį kolitą yra tiesioginis rektosigmoidinės žarnos vertinimas su proktoskopu ar lanksčiu sigmoidskopu. Radiografiniai tyrimai (pvz.: išgėrus bario sulfato kontrastinės medžiagos) išstumiami jautrių endoskopiniu tyrimų [123].

1.4.1. Ligos anamnezė bei medicininė apžiūra

netekimą, karščiavimą, nugaros skausmą, atsiradusios odos žaisdos, akių uždegimai bei opos burnos srityje [124].

1.4.2. Laboratoriniai testai

Pacientui įtariant OK yra būtinas pilnas bendras kraujo tyrimas, taip pat mikrobiologinis testas atliekamas tirti galimus viduriavimo sukelėjus: parazitus, kiaušinėlius, žarnyno patogenus ir ypač C. Difficile [123]. Taip pat laboratorinių testų metu nustatomi išmatų žymenys bei serologiniai OK žymenys (dažniausiai ANSA bei pANSA) [125]. OK specifinis klinikinis ženklas yra neutrofilinė infiltracija į epitelio kriptas bei leukocitų eksudacija žarnų spindyje, kurie ir lemia viduriavimą. Be tiesioginio išmatų mėginio tyrimo leukocitams tirti su metileno mėlynuoju vis plačiau naudojami nauji išmatų testai [126]. Kalprotektinas yra ganuliocitų išskiriamas baltymas, kuris buvo tirtas bei rodo naujas OK nustatymo bei kiekybinio uždegimo aktyvumo galimybes [127].

1.4.3. Endoskopinis tyrimas

OK beveik visuomet gali būti diagnozuojamas endoskopijos tyrimo metu tiriant tiesiąją ir riestinę žarnas [123]. OK uždegimas prasideda nuo tiesiosios žarnos ir plinta pacientams individualiai. Aklosios ir klubinės žarnų kolonoskopija – vienas dažniausiai naudojamų metodų išskirti opinį kolitą nuo Krono ligos [128].

Histologiniai OK metu vykstantys pokyčiai:

1. Ūminis uždegimo atvejis: gleives gaminančių gleivinės ląstelių skaičius sumažėja, atsiranda edemiška laminia propia mucosae, gleivinės ir pogleivio hiperemija ir kriptų mikroabcesai.

2.

TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo organizavimas

Prieš atliekant tyrimą susipažinta su Romos universiteto „La Sapienza“ žmogaus fiziologijos ir farmakologijos departamento "V.Erspamer" laboratorijos įranga, vidaus taisyklėmis, tyrimo eigoje analizuota mokslinė literatūra opinio kolito tematika, didelis dėmesys skirtas OK metu kraujyje ir gaubtinėje žarnoje išsiskiriantiems uždegimo žymenims, jų sukeliamiems fiziologiniams veiksniams uždegimo metu, jų nustatymo ir kiekybinio nustatymo audiniuose galimybėms. Tyrimo pradžioje sudarytas planas – nustatytas tyrimo tikslas, iškelti uždaviniai, suderinti tyrimo metodai bei eksperimento protokolai.

2.2. Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – laukinio tipo pelės, kurios buvo atsitiktinai padalytos į dvi grupes po 16 (kontrolinė ir sergančioji). Tyrimo metu įvertinta uždegimo žymenų (iNOS, COX−2, NO ir PGE2) raiška kraujo plazmoje ir gaubtinės žarnos audinių mėginiuose.

2.3. Tiriamųjų kontingentas

Eksperimentams buvo naudojamos šešių savaičių amžiaus laukinio tipo vyriškos lyties CD – 1 linijos pelės gautos iš Harlan laboratorijos (Undine, Italija). Pelės šertos sausu pašaru ir girdytos švariu geriamu vandentiekio vandeniu. Visos procedūros buvo patvirtintos „La Sapienza“ universiteto (Roma, Italija) etikos komiteto. Gyvūnų laikymas buvo suderintas su tarptautine skausmo studijų asociacija (TSSA) bei Europos Bendrijos (EB L358/ 1 18/12/86) gairėmis dėl gyvulių naudojimo ir apsaugos eksperimentinių tyrimų metu.

2.4. Tyrimo metodai ir naudotos medžiagos

tirpalu geriamajame vandenyje šešias dienas iš eilės. Septintą dieną tiek kontrolinės, tiek eksperimentinės grupės pelės buvo eutanizuotos stiprios anestezijos pagalba. Plakančios širdies punkcijos metu paimti kraujo mėginiai ir surinkti į buteliukus su antikoaguliantu (5% etilendiamintetra acto rūgštimi (EDTA)) ir COX−2 inhibitoriumi (indometacinas, Sigma−Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Vokietija). Norint nustatyti prostaglandino E2 (PGE2) ir azoto monoksido (NO) kiekius, širdies punktūros metu surinktas kraujas buvo centrifūguojamas 15 minučių 1000 aps./min. greičiu ir atskirta kraujo plazma buvo nedelsiant užšaldyta bei saugoma – 80 ° C temperatūroje iki analizės. Taip pat buvo imami keturi gleivinės mėginiai iš riestinės žarnos distalinės, tiesiosios žarnos proksimalinės – rektosigmoidinės žarnos dalies ir patalpinti „Dulbeko modifikuotoje Eagle“ mitybinėje terpėje (DMEM) papildytoje jaučio vaisiaus serumu (JVS) esant 37 ° C temperatūrai ir 5% CO2/ 95% oro koncentracijai. Audinių mėginiai buvo auginami 24 valandas, tuomet homogenizuoti ir analizuoti Western analizės metodu.

2.4.1. Baltymų ekstrakcija ir „Wester blot“ analizė

2.4.2. Kiekybinis NO kiekio nustatymas

Azoto monoksido (NO) koncentracija buvo matuojama kaip nitrito jonų (NO2–) kaupimasis pelių kraujo plazmoje ir tiriama spektrofotometrijos metodu, pagrįstu Griess reakcija. Griess reagentas (1% sulfanilamido ir 0,1% naftiletilendiamino ortofosfato rūgštyje (H3PO4)) jautrus šviesai, todėl reakcija buvo atliekama saugantis nuo šviesos. Pasiruošti etaloniniai žinomų NaNO2 koncentracijų (100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56μM) tirpalai kalibracinei kreivei. Lygūs tiriamųjų plazmų ir kontrolės tūriai buvo dedami į šulinėlių optinę mikroplokštelę, į visus šulinėlius pridedant Griess reagento ir uždengus 10 min. inkubuojama kambario temperatūroje. Absorbcija buvo matuojama mikroplokštelių skaitytuvu 30 min. esant 550 nm bangos ilgiui. Nitrito koncentracija (nM) buvo nustatyta naudojant gautą kalibracinę NaNO2 kreivę.

2.4.3. Imunofermentinė PGE2 analizė

PGE2 koncentracijai tiriamųjų pelių plazmoje nustatyti buvo atlikta imunofermentinė (angl.: ELISA) analizė. Tyrimas atliktas, naudojant komercinį ELISA rinkinį pagal gamintojo pateiktą

2.5. Duomenų analizės metodai

3.

REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Uždegiminių procesų žymenys, jų pokyčiai OK metu bei įvertinimo metodai

3.1.1 Uždegiminių procesų žymenys opinio kolito metu

1998 m. JAV Nacionalinio sveikatos instituto žymemis apibrėžianti grupė (angl.: National Institutes of Health Biomarkers Definitions Working Group) biologinį žymenį apibrėžė kaip charakteristiką, kuri gali būti objektyviai nustatyta ir įvertinta kaip indikatorius įprastų biologinių procesų, patogeninių procesų ar farmakologinių organizmo atsakų [75], kuris naudojamas ligų diagnostikai, ligos eigos, vystymosi stebėjimui, recidyvo prognozavimui ir kuriant naujas terapines priemones [109]. Analizė atlikta atrinkus straipsnius iš PubMed prieigos naudojant šiuos raktinius žodžius anglų kalba: uždegiminė žarnų liga, uždegimo žymenys, uždegimas, ligos aktyvumas, recidyvas, ūminės uždegimo fazės rodikliai: citokinai, interleukinai, adhezijos molekulės ir kt. Analizės tikslas buvo nustayti bei atrinkti žymenis svarbius OK patogenezei siekiant papildomai, išsamiau ir tikslingiau įvertinti OK be ir taip jau žinomų bei nustatomų OK metu žymenų (pvz.: TNF [121]. Nustatyti pagrindiniai uždegiminiai žymenys buvo suskirstyti į tris grupes pagal jų išskyrimo vietą organizme: serologiniai, išmatų bei mišrūs testai žymenims.

Serologiniai (serume ar kituose organizmo skysčiuose) aptinkami žymenys:

Ūminės fazės rodikliai: hemoglobino, trombocitų kiekis, vidutinis trombocitų tūris, eritrocitų

nusėdimo greitis (ENG), prostaglandinai, NO, serumo trombopoetinas, serumo eritropoetinas, fibrinogenas, laktoferinas, transferinas, serumo amiloidas A, α1−antitrypsinas, anti–neutrofilų citoplazmos antikūnis (pANCA), C reaktyvus baltymas ir orosomukoidas (α1−rūgšties glikoproteinas). Jie buvo naudojami vertinant OK ligos aktyvumą atskirai arba kartu. ENG ir C−reaktyvusis baltymas buvo dažniausiai naudojami žymenys klinikinėje OK diagnostikoje. [76−82]

Citokinai: uždegiminiai interleukinai (IL−1, IL−2, IL−6, IL−8, IL−10, IL−15), interleukinų

receptoriai (IL−1 ir IL−2), interleukino receptorių antagonistai (IL−1ra), TNF− α, TNF− α receptoriaus koncentracija [83 − 84].

Kiti: elastazė, mieloperoksidazė, leukocitų esterazė, tenascino C serumas, B2 mikroglobulinas, neutrofilų elastazė, tirpios adhezijos molekulės ir antiangiogeniniai baltymai [85−86].

Žymenys išmatose

Su išmatomis išsiskiria 111Indium žymėti leukocitai ar leukocitų produktai, kraujo serumo baltymai (α1−antitripsinas, lizocimas, kalprotektinas, laktoferinas) [87 – 88].

Žarnyno pralaidumo testas bei testas plaunant žarnyną skysčiais siekiant nustatyti imunoglobulinus ir albuminą [75].

Žymenų skirstymas pagal jų išsiskyrimo vietą yra naudingas moduliuojant naujas ligos terapines priemones. Pagal uždegimo metu atsiradusius fiziologinius sutrikimus žinome žymenų lokalizaciją bei galime atlikti pageidaujamų žymenų analizę norint juos nustatyti bei kiekybiškai nustatyti, taip idenfitikuojant ligas. Pavyzdžiui, nustatant uždegimo žymenis išmatose gali būti diagnozuojamas OK (išmatose normaliomis fiziologinėmis sąlygomis neaptinkami kraujo baltymai, OK metu, dėl atsiradusio rektalinio kraujavimo šie baltymai nustatomi) ar stebimas ligos paūmėjimas, nes sunkėjant ligos formai rektalinis kraujavimas ir viduriavimas dažnėja [96].

3.1.2 Uždegiminių procesų žymenų pokyčiai opinio kolito metu

Uždegimo žymenų tyrimas yra neinvazinis būdas objektyviai įvertinti uždegimą ir gali vaidinti papildomą ar pagrindinį vaidmenį ligos aktyvumo įvertinime. Pagal sukeliamus fiziologinius kitimus OK uždegiminio proceso metu atrinkome šiuos OK patogenezei svarbius uždegimo žymenys, kurie padėtų išsamiau ištirti OK etiopatogenezę bei kontroliuoti ligos eigą kuriant naujas terapines priemones OK.

3.1.2.1.

COX−2 ir PGE2 vaidmuo opinio kolito patogenezėje

arba nesteroidiniais priešuždegiminiais vaistais (NVNU), kurie slopina ciklooksigenazę [50]. Prostaglandino 2 (PGE2), produkuojamo per COX−2, funkcijos ir reikšmė virškinamajam traktui: [51] Didelėmis dozėmis sukelia skrandžio sulčių sekreciją, mažomis – inhibuoja; gerina ar mažina virškinamojo trakto peristaltikos judesius; sukuria gleivių barjero funkciją: bikarbonato sekreciją, gleivių sekreciją ir epitelio ląstelių citoapsaugą.

PGE2 produkciją organizme vykdo: bronchiolės, virškinimo trakto ląstelės, kraujagyslių, gimdos ir šlapimo pūslės lygieji raumenys, placenta, inkstų „macula densa“ tankiosios ląstelės, sėklidžių Leidigo ląstelės, mezenchiminės kamieninės ląstelės, monocitai ir makrofagai [52]. Endogeniniai pirogenai patekę į bendrąją kraujotaką indukuoja PGE2 sintezę kraujagyslinių endotelyje ir periferiniuose audiniuose. PGE2 perėjęs hematoencefalinį barjerą, dirgina prostaglandinų receptorius (EP – 3 receptorius) ir sukelia karščiavimą. PGE2 sukelia ūmų vietinį uždegimą ir fagocitų tarpininkaujamą imuninę reakciją patogeno patekimo vietoje, taip pat turi specializuotą vaidmenį kontroliuojant žalingą citotoksiškų T limfocitų, Th1 ir natūralių ląstelių žudikių (NK) (citotoksinį) imuninį aktyvavimą, ypač vėlesniuose imuninio atsako etapuose, todėl tai tinkamas uždegimo žymuo vertinant ir moduliuojant ūminio opinio kolito modelį. Uždegimo metu PGE2 moduliuoja chemokino gamybą, slopina uždegimą skatinančių ląstelių trauką, tuo pačiu didina T ląstelių kaupimąsi, B ląstelių diferenciaciją [53]. Didelėmis dozėmis PGE2 skatina dendritinių ląstelių Th17 sekreciją, kuris, jau aptarėme, yra siejamas su UŽL etiopatogenezę [54].

3.1.2.2.

iNOS ir NO vaidmuo opinio kolito patogenezėje

Azoto monoksido NO sintezę organizme katalizuoja viena iš trijų NO sintazės izoformų: NOS1 (neuronų arba nNOS), NOS2 (endotelio arba eNOS), ir NOS3 (indukuojamo arba iNOS) [55]. Sintetinant NO, visos izoformos priklauso nuo L−arginino substrato, taip pat nuo kofaktorių/kofermentų nikotinamidadenindinukleotido fosfato (NADPH), tetrahidrobiopterino (BH4), flavinadenindinukleotido (FAD), flavinmononukleotido (FMN), deguonies (O2) ir protoporfirino IX [56]. Iki 1987 m. azoto monoksidas buvo žinomas kaip atmosferos teršalas tiekiamas pramoninių procesų, audrų elektros iškrovų metu, randamas automobilių išmetamosiose dujose ir kt. Furchgott, Ignarro ir Murads, nepriklausomai vienas nuo kito, 1977 m. ir 1987 m. pristatė savo darbus, kuriuose NO apibrėžia kaip endotelio išlaisvinamą vasodilatacijos koeficientą [57 – 59], šiuo metu tyrimai tęsiami ištirti NO poveikį kraujagyslių homeostazei, neuronams ir imunologiniams procesams organizme.

Terapijos skirstomos į dvi grupes: 1) vaistai keičiantys organizmo fermentinę NO gamybą; 2) medžiagos produkuojančios NO arba vieną iš redokso analogų.

Didelė NO koncentracija (mikromolių) sukelia reaktyviųjų azoto rūšių formavimąsi (pvz.: peroksinitrito (ONOO−)) [112], kurios, kartu su reaktyviuoju deguonimi, sukelia oksidacinį stresą ir nitrosativų stresą lydimą DNR bazių deamininimo, sutrikdo ląstelines funkcijas, sustiprina uždegimines reakcijas, slopina adhezijos molekulių ekspresiją ant leukocitų paviršiaus, inhibuoja mitochondrijų kvėpavimą ir ląstelių apoptozę [63]. Maža NO koncentracija (pikomolių) sukelia anti−apoptotinį poveikį ir skatina angiogenezę, taip palengvindamos naviko apsirūpinimą maistinėmis medžiagomis ir augimą [64], taigi NO bei fermento iNOS diagnostika uždegiminiuose procesuose (tokiuose kaip OK) bei raiškų modeliavimas yra naudingas vertinant ligos aktyvumą bei kuriant naujas terapines priemones.

Prostglandinai bei azoto monoksidas sukelia fiziologinius žarnyno epitelio pokyčius, sutrikdo ląstelines funkcijas, sustiprina uždegimines reakcijas, inhibuoja ląstelių apoptozę. Šie pokyčiai histologiniai uždegimo požymiai stebimi OK metu, todėl žymenys yra tinkami OK diagnostikai, naudingi moduliuojant naujas terapines priemones OK atveju. NO žymuo tinkamas ligos progresavimui tirti (navikų, žarnos vėžio diagnostikoje).

3.1.3 Kiekybinis žymenų pokyčių vertinimas ex vivo mėginiuose

Medžiagos nustatymui ir kiekybiniam nustatymui yra svarbi jos cheminė struktūra bei fizikiniai parametrai (agregatinė būsena, kietumas, klampumas, tankis, elektrinis, šiluminis laidumas bei kita). Mūsų parinkti svarbūs OK patogenezės žymenys (COX−2, iNOS, PGE2 ir NO) skiriasi tiek savo cheminėmis, tiek fizikinėmis savybėmis (COX−2 ir iNOS – fermentai, globuliniai baltymai, PGE2 − fiziologiškai aktyvus lipidas [107], o NO − dujos [108]), todėl negalime taikyti vieno kiekybinės analizės metodo jiems nustatyti bei kiekybiškai ištirti. Atsižvelgdami ne tik į jų struktūros ypatumus, bet ir organizme atliekamas fiziologines funkcijas rinkome ir lyginome metodus, skirtus jų analizei. Baltyminių žymenų studijų metu dažniausi naudojami metodai yra imunohistocheminis dažymas, imunocitocheminis, Western Blot. Imunofermentinė analizė (ELISA) šiuo metu yra nepakeičiamiausias aktyvių lipidų kiekybinės analizės metodas. NO koncentracijai nustatyti naudojami šie pagrindiniai metodai: Griess analizė, chemiliuminescencinis ir elektrohistocheminis tyrimai. Greita NO difuzija, aukštas reaktyvumas ir trumpas pusinis gyvavimo laikas sukelia sunkumus tiksliam ir kruopščiam NO matavimui [74]. Lentelėje pateikiami atrinkti analizės metodai uždegimo žymenų ex

vivo biologiniams mėginiams tirti.

Medžiaga Metodai Tikslas Privalumai Trūkumai B al ty m in ės m edž iago s: C O X –2 i r i N O S Imunohisto– cheminis metodas [110]

Naudojamas ieškant ląstelinių arba audinių antigenų, kurių intervalas yra nuo amino rūgščių ir baltymų iki infekcinių agentų ir specifinių ląstelinių populiacijų

Platus tiriamųjų spektras, įgalina procesų stebėjimą nepaliesto audinio kontekste, ypač naudingas vertinant ligos progresavimo procesus, pavyzdžiui, vėžiniuose susirgimuose Mažiau jautrus kiekybiškai nei imunologiškai. Imunocito– cheminis metodas [111]

Nustatyti baltymus ar kitas makromolekules kultivuotuose ląstelių audinių mėgininiuose.

Įgalina nustatyti, ar ląstelės gamina tam tikrą baltymą, teikia informaciją apie viduląstelinių baltymų lokalizaciją

Sudėtingas atlikti, mažiau jautrus kiekybiškai nei imunologiškai.

Western analizė [105]

Nustatyti specifinius baltymus, kurie atskiriami vienas nuo kito atsižvelgiant į jų dydį elektroforeze gelyje po perkėlimo ant membranos

Labai jautrus metodas, gali aptikti labai mažus (nuo nano iki piko molių) baltymų kiekius, išsamus, teikiantis daug informacijos metodas kuriuo galima tirti kelis mėginius vienu metu

Daug atlikimo žingsnių – klaidų tikimybė, sunku perkelti labai didelius ar stipriai hidrofobinius baltymus ant membranos, ilgas, brangus metodas, kuriam reikalingi specialūs reagentai. L ipidi nės m edž iago s: PGE2 Imunofer– mentinės analizės metodas (ELISA) [89]

Randamas specialus antigenas mėginyje, nustatomos santykinė ir absoliuti koncentracijos naudojant standartines kreives

Greitas, gana lengvas, saugus metodas, tinkantis atsikartojantiems

mėginiams, deramas ir kitų medžiagų kiekybinei analizei. Brangus, reikalaujantis specialių reagentų metodas. Tiesioginėje ELISA: minimalus signalo stiprinimas, netiesioginėje ELISA: kryžminės reakcijos galimybė su antriniais antikūnais. D uji nės m edži agos : N O Griess analizė [90 – 91]

Apskaičiuojamas NO kiekis kaip nitrito jonų (NO2

–

) kaupimasis plazmoje.

Greita, paprasta, pigi, galima tirti daug mėginių vienu metu.

Šviesos poveikis gali iškreipti rezultatus, riboto spektro. Chemiliumi– nescencinis [92, 95]. iliustracinis pvz. pateiktas 1 priede 11 pav. Tiesioginis NO matavimas.

Reakcijos kameroje NO reaguoja su ozonu (O3), susidaro azoto

dioksidas jo sužadinimo būsenoje (NO2*), po NO2* skilimo gaunami

fotono emisijos rezultatai kurie matuojami naudojant nuotraukų multiplikatoriaus vamzdį.

Selektyvesnis lyginant su Griess reakcija (galima išmatuoti NO, NO2 − ir NO3 − koncentracijas), jautrus Brangus, reikalaujantis specialių sąlygų, pasiruošimo Elektrohis– tocheminis [93−94] iliustracinis pvz. pateiktas 1 priede 9 pav.

Aptikti NO sudėtingose biologinėse terpėse, tokiose kaip audiniai ar organai. NO elektrocheminis aptikimas gali būti atliktas vykstant NO oksidacijai iki N2O2

2−

, arba, dažniau naudojamas, trijų žingsnių trijų elektronų redukcija iki NO3−.

Įvertinus privalumus ir trūkumus baltymų analizei ex vivo mėginiuose pasirinktas metodas yra Western analizė kaip išsamus, tikslus, jautrus, teikiantis daug informacijos metodas, kuriuo galima tirti kelis mėginius vienu metu. Imunohistocheminis bei imunocitocheminis metodai yra platesni nei Western analizė, jų metu galima baltymus tirti ne tik kiekybiškai, bet ir nustatyti tam tikrų viduląstelinių baltymų vietą, jie ypač naudingi vertinant ligos progresavimo procesus, tačiau yra mažiau jautrūs kiekybiškai nei imunologiškai. ELISA metodas yra šiuo metu plačiausiai taikomas ir nepakeičiamas metodas PGE2 analizei– greitas, gana lengvas ir saugus, tinkantis atsikartojantiems mėginiams, nėra specifinis, todėl turint kitus tiriamųjų medžiagų protokolus bei reagentus deramas ir kitų medžiagų kiekybinei analizei.

Parenkant tinkamiausią jautrų, tikslų bei atsikartojantį metodą NO kiekybinei analizei atlikti, iš pateiktų trijų dažniausiai naudojamų metodų nusprendėme rinktis Griess analizę. Lyginant šiuos tris metodus Griess analizė išsiskiria savo paprastumu bei ekonomiškumu, jai atlikti nereikalinga sudėtinga technika, o mikroplokštelių skaitytuvas (densitometras) spektrofotometrinei NO analizei naudojamas ir kitoms analizėms (pavyzdziui ELISA metode). Tuo tarpu chemiliuminescenciniui metodui reikalinga ne tik speciali laboratorijos įranga ir įrengimai (reakcijos kamera, multiplikatoriaus vamzdis ir kt.) bet ir reagentai (ozonas) tirti NO koncentraciją mėginiuose. Griess metodas nėra toks išsamus kaip chemiliuminescencinis (kuriuo galima išmatuoti NO, NO2− ir NO3− koncentracijas), tačiau tyrimo tikslas buvo nustatyti tik NO kiekį, kuris išskiriamas uždegimo metu Nors elektrohistocheminiui metodui naudojama įranga gali būti pritaikoma ir kitiems oksidacijos/redukcijos reakcijų produktams, tačiau Griess reakcija yra paprasta, bei jos metu galima tirti daug mėginių vienu metu bei yra pakankamai greita (susideda vos iš poros žingsnių). Greitas ir tikslus metodas buvo tyrimo siekiamybė.

3.1.3.1.

Western analizė

Western blot – analizės metodas, naudojamas ląstelinėje ir molekulinėje biologijoje [105], pasitelkus Western analizę galima nustatyti ir kiekybiškai ištirti konkretų baltymą mišinyje, išgautame iš ląstelių. Western analizė (taip pat vadinama imunopernaša) yra technika, naudojama individualių baltymų analizei baltymų mišinyje (pvz. ląstelių lizate). Western analizės metu baltymų mišiniui taikoma gelio elektroforezė pernešant mišinį ant membranos (SDS–PAGE, gamtinė PAGE, izoelektrinis fokusavimas, 2D gelio elektroforezės ir kt.) ir rūšiuojant baltymus pagal dydį, krūvį, ar pagal kitus individualių baltymų skirtumus. Vienu metu galima aptikti ir analizuoti kelis baltymus mišinyje, tai vienas iš Western blot privalumų palyginus su kitais imunofermentiniais metodais (pvz.: ELISA).

1) Denatūruoja baltymą suardydamas nekovalentinius ryšius, baltymo molekulės „išvyniojamos“, panaikinama baltymo molekulės forma (kaip galimo kofaktoriaus poveikis), atliekama baltymų elektroforezė [66].

2) Prie dviejų baltymo molekulės aminorūgščių liekanų jungiasi vienas NDS anijonas, turintis hidrofobinę grupę – kuo daugiau baltyme amino rūgščių, tuo daugiau NDS molekulių prisijungs, taip neigiamai įkrautos baltymų molekulės migruoja link teigiamo elektrodo [46]. PAGE atskiria baltymo molekules pagal dydį jų migracijos link anodo metu. Vėliau baltymai fiksuojami gelyje ir išlaikomi denatūruoti, tuomet perkeliami, dažomi ir ryškinami [66].

NDS – PAGE gali būti pritaikyta [67, 68]: baltymo dydžiui nustatyti, baltymui nustatyti, mėginio grynumui vertinti, disulfidinių ryšių aptikimui, baltymų kiekybiniam vertinimui, Western analizės (blotting) paruošimui.

Western analizės eiga susideda iš šių žingsnių:

Pirmiausia atliekamas baltymų išskyrimas pagal dydį naudojant natrio dodecil lauril sulfato poliakrilamido gelio elektroforezę (NDS – PAGE). Baltymų perkėlimui naudojama membrana (paprastai nitroceliuliozės arba polivinilideno difluorido (PVDF), baltymai ant jos perkeliami naudojant elektroforezę – neigiamai įkrauti baltymai migruoja ant membranos. Atsargumo sąlygos, kurių reikia laikytis: tinkamas pH, tarp nitroceliuliozės ir gelio neturi susidaryti oro burbuliukų. Membrana pildoma neriebiu pienu (nespecifinių baltymų adhezijai) bei pirminiu antikūniu (susidaro baltymo – antikūno kompleksas). Membrana plaunama fosfatiniu buferiu ir užpildoma antriniu (pirminiam) antikūniu. Šis antikūnas turi būti prisijungęs fermentą, kuris padeda išryškinti visą kompleksą reakcijoje su substratu metu. Galimi substratų tipai: a) chromogeninis substratas b) chemiliuminescencinis substratas c) chemifluorescencinis substratas. Membrana vėl plaunama buferiu. Rentgenografiškai išryškinama reakcija. Atliekama nuotraukos densitometrija [65].

3.1.3.2.

ELISA

Kiekybiniai analizės metodai, kurie rodo antigeno – antikūno reakciją naudojant fermentinį konjugatą ir fermentų substratus (spalvos pokyčiui) bei padeda tirti molekulių biologinių skysčių buvimą ir jų koncentraciją, paprastai vadinami imunofermentiniai testai (fermentų imuno tyrimas ar imunofermentinė analizė (ELISA)) [69]. ELISA yra heterogeninis imunologinis tyrimo metodas naudojamas aptikti specifinius antikūnus ar tirpius antigenus. Dėl skirtingų medžiagų charakteristikų ir struktūrų buvo sukurti keli ELISA metodo tipai, kurie didina matavimo specifiškumą, iliustracinis pavyzdys pateiktas pirmame priede 9 pav. [70]:

 Netiesioginis ELISA metodas

 „Sumuštinio“ tipo ELISA (antikūnų analizės) metodas

 Konkurencinis ELISA (antigeno / antikūno analizės) metodas

Tiesioginio analizės metodo žingsniai [71]: tikslūs imunofermentinės analizės buferio kiekiai dedami į šulinėlius. Atitinkami etaloninių tirpalų kiekiai dedami į šulinėlius. Visi šulinėliai, išskyrus tušti, pildomi pirminiu antikūniu, plokštelė uždengiama ir paliekama inkubacijai kambario temperatūroje 2 valandas arba, jei patogiau, per naktį 4°C. Po inkubacijos visi šulinėliai plaunami fosfatiniu buferiu (PBS) du kartus, likusios baltymų jungimosi vietos blokuojamos neriebiu pienu (nespecifinių baltymų adhezijai). Plokštelė uždengiama ir paliekama inkubacijai kambario temperatūroje 2 valandas arba, jei patogiau, per naktį 4°C. Po inkubacijos visi šulinėliai plaunami PBS buferiu du kartus. Pridedama antrinio antikūno ir inkubuojama 2 valandas kambario temperatūroje. Plokštelė plaunama keturis kartus su PBS, pridedama substrato. Po spalvinės reakcijos pridedama reakciją stabdantis tirpalas, pavyzdžiui natrio hidroksidas (NaOH), vandenilio chlorido rūgštis (HCl) arba sieros rūgštis (H2SO4) [69]. Absorbcija (optinis tankis) matuojama densitometru (plokštelių skaitytuvu).

3.1.3.3.

Griess analizė

Sukurtas 1879 metais, Griess tyrimas šiuo metu yra populiariausias metodas NO analizei atlikti. Metodas turi nemažai privalumų: pigus analizės metodas, paprastas vykdyti ir nesudėtingas analizuoti [72]. Griess tyrimas NO koncentraciją nustato netiesiogiai− kaip NO auto−oksidacijos produktą (nitrito jonus (NO2−)) [73]. NO2 − reaguojant su sulfanilamidu susidaro diazonio druska, kuri vėliau reaguoja su N− (1−naftil) etilendiaminu ir suformuoja azo dažiklius. Absorbcija matuojama spektrofotometriškai bent 540 nm bangos ilgiui, iliustracinis pavyzdys pateiktas pirmame priede 10 pav. Griess reagentas jautrus šviesai, todėl analizė atliekama apsaugojus nuo šviesos [74].

3.2.

COX−2 ir iNOS raiškos pokyčių įvertinimas pelių žarnų gleivinės

audiniuose

Pradiniame tyrimo etape Western blot metodu buvo vertinami visų tyrime dalyvavusių CD–1 linijos pelių tiriamų COX−2 ir iNOS žymenų pokyčiai. Tyrime pelės buvo suskirstytos atsitiktinai į ūminiu opiniu kolitu nesergančias (kontrolinė grupė) ir opiniu kolitu sirgsiančias peles (sergančioji grupė). Vienas iš plačiausiai naudojamų opinio kolito modelių, kuomet opinis (ūmus arba lėtinis) kolitas sukeliamas graužikams, yra naudojant DSS [116]. Pelės šešias dienas iš eilės buvo girdomos 4% DSS tirpalu geriamajame vandenyje opiniam kolitui sukelti. Septintą dieną pelės eutanizuotos, žymenų tyrimams atlikti imti keturi gleivinės mėginiai iš rektosigmoidinės žarnos dalies.

Įvertinus COX−2 ir iNOS kiekius kontrolinių pelių ir DSS sukeltu ūminiu opiniu kolitu sergančių pelių gaubtinių žarnų gleivinės audiniuose nustatyta, jog tiek COX–2, tiek iNOS fermentų kiekiai padidėjo palyginus su kontrolinėmis grupėmis (kontrolinėse ir sergančiosiose grupėse nustatytų žymenų vidurkių reikšmės pateiktos 4 pav. ir 5 pav., kuomet kiekvienas eksperimentas kartotas tris kartus).

4 pav. COX–2 kiekis pelių gaubtinės žarnos audiniuose

* Statistiškai reikšmingas skirtumas tarp OK sergančių pelių grupės ir kontrolinės grupės. Statistiškai reikšminga, kai p<0,05.

Tyrimo rezultatai atskleidė, kad šių žymenų raiškos kitimo dinamika esti panaši: COX−2 fermento kiekis žarnų gleivinės audiniuose padidėjo 9,6 karto, o iNOS – 9,7 karto lyginant su jų kitimu kontrolinės grupės audiniuose. Fiksuojant kiekybinius žymenų pokyčius statistinei duomenų analizei buvo naudota „SPSS version 22.0“ programinė įranga, statistiniam reikšmingumui tarp tiriamų grupių vidurkių buvo naudota ANOVA analizė. Statistinė analizė atskleidė, kad šių baltymų raiškos pokyčiai yra statistiškai reikšmingi.

0 2 4 6 8 10 OD =m m 2 Kontrolinė Sergančioji OK

COX-2 koncentracijų vidurkiai

COX-2

*

5 pav. iNOS kiekis pelių gaubtinės žarnos audiniuose

* Statistiškai reikšmingas skirtumas tarp OK sergančių pelių grupės ir kontrolinės grupės. Statistiškai reikšminga, kai p<0,05.

Mūsų parinkto OK žymenų tyrimo tinkamumą rodo kiti moksliniai tyrimai. Jae–Young Um bei kt. mokslininkai žymenų raiškos tyrimui [115] ūminį kolitą pelėms taip pat sukėlė girdydami DSS geriamuoju vandeniu, COX– 2 bei PGE2 žymenų koncentracijos taip pat ženkliai išaugo lyginant su žymenų koncentracijomis kontrolinėse grupėse. Raiškų tyrimams jie taikė tuos pačius analizės metodus– Western blot metodą COX–2 fermento kiekybinei analizei, ELISA – PGE2 kiekybinei analizei.

Moksliniuose OK žymenų tyrimuose dažnai atliekamos tiek iNOS raiškos, tiek NO produkcijos kiekybinės analizės kompleksiniame tyrime. J. Westwick bei kt. mokslininkų atliktame tyrime [114] buvo nustatyta, jog pagrindinis iNOS šaltinis – epitelinės ląstelės. iNOS koncentracija buvo nustatyta naudojant Western blot analize, tiriant tiek ląstelių kultūras, tiek žmonių audinių biopsijas, taigi pasirinktas kiekybinės analizės metodas yra tinkamas ne tik ex vivo mėginiams, bet ir in

vitro tyrimams. Moksliniai iNOS ir NO tyrimai opinio kolito metu padeda siekiant detaliau išsiaiškinti

OK eiopatogenezę bei kontroliuoti ligos progresavimą. Nustatyta [113], jog žarnyno gleivinėje padidėjusi azoto monoksido gamyba iš dalies sukeliama dėl entero glijų išskiriamo S100B baltymo. Mokslininkai taikė tuos pačius analizės metodus (iNOS koncentracija buvo nustatyta Western blot metodu, o NO Griess analize) kaip ir mūsų atrinkti, todėl kompleksiniam šių žymenų (COX–2, iNOS, PGE2 bei NO) nustatymui atrinkti metodai yra tinkami, o jų kiekybinis nustatymas padeda diagnozuoti OK bei tirti naujas OK terapines priemones.

Ankstyvosios gaubtinės žarnos vėžio stadijos yra susijusios su uždegiminių fermentų ciklooksigenazės–2 (COX–2) ir indukuojamos NO sintazės (iNOS) padidėjimu [117], jų raiškos pokyčių stebėjimas padėtų prognozuojant ligos komplikacijas.

0 2 4 6 8 10 12 OD =m m 2 Kontrolinė Sergančioji OK

iNOS koncentracijų vidurkiai

iNOS

*

3.3.

PGE

ir NO gamybos pokyčiai pelių kraujo plazmoje

Taip pat pradiniame tyrimo etape ELISA metodu buvo vertinamas visų tyrime dalyvavusių CD–1 linijos pelių tiriamo PGE2 žymens gamybos pokytis, o Griess analize – NO pokytis. Po eutanazijos širdies punkcijos metu paimti kraujo mėginiai surinkti į mėgintuvėlius su antikoaguliantu bei COX−2 inhibitoriumi, centrifūguojami, atskirta analizei naudota kraujo plazma.

Įvertintus PGE2 ir NO žymenų gamybą bei jų kitimus DSS sukeltu ūminiu opiniu kolitu sergančių pelių kraujo plazmoje nustatyta, jog tiek azoto monoksido, tiek prostaglandino E2 kiekiai padidėjo palyginus su kontrolinėmis grupėmis (kontrolinėse ir sergančiosiose grupėse nustatytų žymenų vidurkių reikšmės pateiktos 6 pav. ir 7 pav., kuomet kiekvienas eksperimentas kartotas tris kartus).

6 pav. PGE2 kiekis pelių kraujo plazmos mėginiuose

* Statistiškai reikšmingas skirtumas tarp OK sergančių pelių grupės ir kontrolinės grupės. Statistiškai reikšminga, kai p<0,05.

7 pav. NO kiekis pelių kraujo plazmos mėginiuose

* Statistiškai reikšmingas skirtumas tarp OK sergančių pelių grupės ir kontrolinės grupės. Statistiškai reikšminga, kai p<0,05. 0 2 4 6 8 10 p g /mL Kontrolinė Sergančioji OK

PGE2 koncentracijų vidurkiai

Tyrimo rezultatai atskleidė, jog šių žymenų kitimo dinamika yra panaši: NO fermento kiekis žarnų gleivinės audiniuose padidėjo PGE2 – 11,73, NO − 10,5 karto lyginant su jų kitimu kontrolinės grupės audiniuose. Fiksuojant kiekybinius žymenų pokyčius statistinei duomenų analizei buvo naudota„SPSS version 22.0“ programinė įranga, statistiniam reikšmingumui tarp tiriamų grupių vidurkių buvo naudota ANOVA analizė. Statistinė analizė atskleidė, kad šių žymenų raiškos pokyčiai yra statistiškai reikšmingi.

Išnagrinėjus gautus tyrimo rezultatus darome išvadą, jog uždegimo metu išauga prostaglandino E2 ir azoto oksido sintezė, katalizuojamų ciklooksigenazės 2 ir indukuojamos azoto oksido sintazės, todėl jie gali būti apibrėžiami kaip opinio kolito uždegimo žymenys.

Siekdami išsiaiškinti duomenų tiesinę priklausomybę vienas nuo kito atlikome koreliaciją naudojant„SPSS version 22.0“ programinė įranga. PGE2 veikla siejama su padidėjusiu metabolinio ciklooksigenazės fermentų aktyvumu, nors tame pačiame tyrime šie parametrai tarpusavyje lyginami retai. Baltimorės Maryland universitete (JAV) atliktuose tyrimuose taip buvo nustatyta tiesinė koreliacija tarp 3 faktorių– COX–2, PGE2 bei metastazinio potencialo tiriant krūties vėžį [101]. Shandonge (Kinija) lėtinio ne bakterinio prostatito tyrimuose pastebėta koreliacija tarp PGE2, COX–2 (r = 0.493, p < 0,05) bei baltųjų kraujo kūnelių, pateiktas siūlymas kuriant naujus preparatus atsižvelgti į COX–2 slopinimą siekiant naudingesnio terapinio poveikio [102].

Eksperimentinių duomenų statistinė analizė atskleidė statistiškai reikšmingą tiesinę koreliaciją tarp PGE2 ir COX–2 tiriamųjų grupių, Pirsono koreliacijos kooficientas r = 0,572, p < 0,05. Darome išvadą, jog uždegimo metu PGE2 sintezė priklauso nuo COX−2, o norint moduliuoti PGE2 sukeliamus fiziologinius kitimus organizme opinio kolito metu turime moduliuoti ir COX − 2 kiekį.

8 pav. Koreliacija tarp sergančiųjų OK COX–2 ir PGE2 grupių rezultatų.

Statistiškai reikšminga, kai p<0,05.

monoksido NO sintezę katalizuoja viena iš trijų NO sintazės izoformų: NOS1 , NOS2 ir NOS3 [55], todėl darome išvadą, jog norint tinkamai įvertinti azoto monoksido (NO) ir indukuojamo azoto monoksido sintazės (iNOS) izoformos tarpusavio priklausomybę reikėtų nustatyti visų trijų izoformų kiekius.

Palmitoiletanolamidas – nauja OK terapinė priemonė

Romos universitete „La Sapienza“ fiziologijos ir farmakologijos katedroje įvertinus šio eksperimentinio modelio tinkamumą kompleksiniams OK uždegiminio proceso tyrimams, jis buvo pritaikytas tiriant naują OK terapinę priemonę – palmitoiletanolamidą (angl.: palmitoylethanolamide). Šiuo metu atliekami priešklinikiniai tyrimai vertinant PEA veiksmingumą uždegiminiams procesams: mažinant ligos aktyvumo indeksą, kuris nustatomas tiriant klinikinius ir morfologinius kriterijus bei uždegimo žymenų raišką girdant sergančias OK peles PEA. Mūsų vykdyti tyrimai rodo, jog PEA yra veiksmingas OK ligos uždegiminio proceso valdymui ir atlikus išsamesnius tyrimus gali būti laikomas kandidatu klinikiniams tyrimams. Deja, tyrimą remiančios farmacinės kompanijos riboja duomenų publikavimą, todėl išsamesnių PEA tyrimų rezultatų nebuvo galimybės pateikti.

Apibendrinus, galime teikti, jog neinvaziškai nustatant OK, tiriant daugiaveiksmės OK ligos patogenezę ar ieškant naujų terapinių OK priemonių galima taikyti minėtų keturių uždegimo žymenų tyrimą paimtiems audinių bei serologiniams mėginiams tirti. Visi šie žymenys skiriasi tiek cheminėmis, tiek fizikinėmis savybėmis, todėl negali būti pritaikytas vienas metodas kiekybinių jų rodiklių įvertinimui. Tinkamiausi jautrūs, tikslūs bei atkartojami metodai yra Western blot analizė (COX–2 bei iNOS fermentams), ELISA metodas PGE2 analizei ir Griess metodas NO kiekybinei analizei.

4.

IŠVADOS

1. PGE2, NO, COX–2 ir iNOS priskiriami uždegimo žymenims ir yra tinkami atliekant OK diagnostiką, raiškos tyrimus (prognostinei reikšmei tikrinti), naudingi moduliuojant naujas terapines priemones OK atveju, dėl prostaglandinų ir azoto monoksido (COX–2 ir iNOS fermentų katalizuojamų reakcijų produktų) sukeliamų fiziologinių pokyčių, kurie stebimi OK metu. NO žymuo tinkamas ir ligos progresavimui tirti.

2. Siekiant patikimai, tiksliai bei atsikartojančiai įvertinti tiriamųjų žymenų (COX–2, iNOS, PGE2 ir NO) rodmenų pokyčius įvairiuose biologiniuose mėginiuose, dėl jų kompleksiškumo pasirinkti metodai: Western analizė COX–2 ir iNOS kiekybiniam vertinimui, ELISA analizė PGE2 kiekybiniam vertinimui ir Griess analizė NO kiekybiniam vertinimui.

3. Nustačius COX–2 ir iNOS baltyminių fermentų kiekius ir jų pokyčius DSS sukeltu ūminiu opiniu kolitu sergančių pelių gaubtinės žarnos audinių mėginiuose tiek COX–2, tiek iNOS fermentų kiekiai statistiškai reikšmingai padidėjo (p< 0,05). Šių žymenų raiškos kitimo dinamika buvo panaši: COX−2 fermento kiekis žarnų gleivinės audiniuose padidėjo 9,6 karto, o iNOS – 9,7 karto lyginant su jų kitimu kontrolinės grupės audiniuose.

5.

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Sleisenger and Fordtran's Gastrointestinal and Liver Disease – 2 Volume Set, 9th Edition By Feldman, M, Friedman SL, and Brandt JL. Chapter 112 „Ulcerative colitis“, page 1975 – 2000. Mark T. Osterman, Gary R. Lichtenstein

2. Burisch J, et al. Gut 2014;63:588–597. doi:10.1136/gutjnl−2013−304636

3. Ausėnaitė D. Uždegiminės žarnų ligos. Tęsiasi kova dėl kiekvieno sergančiojo. vlmedicina.lt 2014 m. gegužės 20 d.

4. Žvirblienė A, Kiudelis G, Kupčinskas L. Ligonių, sirgusių opiniu kolitu ir Krono liga, ligos istorijų retrospektyvioji analizė. MEDICINA (2003) 39 tomas, Nr. 8

6. Review article: biological activity markers in inflammatory bowel disease D. Desai, W. A. Faubion Andw. J. Sandborn. Review article: biological activity markers in inflammatory bowel disease. Aliment Pharmacol Ther. 2007 Feb 1;25(3):247−55. Epub 2007 Jan 8.

7. Okayasu I, Hatakeyama S, Yamada M, Ohkusa T, Inagaki Y, Nakaya R.A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology (Impact Factor: 13.93). 04/1990; 98(3):694−702.

8. Podolsky D K, M.D. Inflammatory Bowel Disease. N Engl J Med 2002; 347:417 – 429. August 8, 2002. doi: 10.1056/NEJMra020831.

9. Garside P, Millington O, Smith K M. The Anatomy of Mucosal Immune Responses. Annals of the New York Academy of Sciences. 2004 Dec; 1029: 9 – 15. doi: 10.1196/annals.1309.002

10. Blum S, Schiffrin J E. Intestinal Microflora and Homeostasis of the Mucosal Immune Response: Implications for Probiotic Bacteria? 2003 Sep; 4(2):53 – 60.

11. MacKalski BA, Bernstein CN. New diagnostic imaging tools for inflammatory bowel disease.Gut. 2006;55(5):733 – 741. doi:10.1136/gut.2005.076612.)

12. Corrao G, Tragnone A, Caprilli R, Trallori G, Papi C, Andreoi A, Paolo M, Riegler G, Rigo G−P, Ferraù O, Mansi C, Ingrosso M, Valpiani D, Cooperative Investigators of the Italian Group for the Study of the Colon and the Rectum (GISC). Risk of inflammatory bowel disease attributable to smoking, oral contraception and breastfeeding in Italy: a nationwide case – control study. Int. J. Epidemiol. 1998 27: 397 – 404.

13. Sleisenger and Fordtran's Gastrointestinal and Liver Disease – 2 Volume Set, 9th Edition By Mark Feldman, MD, Lawrence S. Friedman, MD and Lawrence J. Brandt, MD Chapter 112 „Ulcerative colitis“, page 1975 – 2000. Mark T. Osterman, Gary R. Lichtenstein

15. Greenstein AJ, Sachar DB, Gibas A, Schrag D, Heimann T, Janowitz HD, Aufses AH Jr. Outcome of toxic dilatation in ulcerative and Crohn's colitis. J Clin Gastroenterol. 1985 Apr;7(2):137 – 43.

16. Oxford Reference "megacolon.". [online]. 2008 – 01 – 01. [cituota 2015 01 17] Pasiekiamas: http://www.oxfordreference.com/view/10.1093/oi/authority.20110803100147613.

17. Saleh M, Trinchieri G. Innate immune mechanisms of colitis and colitis – associated colorectal cancer. Nat Rev Immunol. 2011 Jan;11(1):9 – 20. doi: 10.1038/nri2891. Epub 2010 Dec 10. 18. Hungin APS, Whorwell PJ, Tack J, Mearin F. The prevalence, patterns and impact of irritable bowel syndrome: an international survey of 40 000 subjects. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. Volume 17, Issue 5, pages 643 – 650, March 2003. DOI: 10.1046/j.1365 – 2036.2003.01456.x.

19. Molodecky NA, Soon IS, Rabi DM, Ghali WA, Ferris M, Chernoff G, Benchimol EI, Panaccione R, Ghosh S, Barkema HW, Kaplan GG. Increasing incidence and prevalence of the inflammatory bowel diseases with time, based on systematic review. Gastroenterology Volume 142, Issue 1, January 2012, Pages 46 – 54.e42. doi:10.1053/j.gastro.2011.10,001. [cituota 2015 01 17

20. Hanauer SB. Inflammatory bowel disease: epidemiology, pathogenesis, and therapeutic opportunities. Inflamm Bowel Dis. 2006 Jan;12 Suppl 1:S3 – 9. PMID: 16378007

21. Itzkowitz SH, Yio X. Inflammation and Cancer IV. Colorectal cancer in inflammatory bowel disease: the role of inflammation. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology Jul 2004, 287 (1) G7 – G17; doi: 10.1152/ajpgi.00079.2004.

22. Khor B, Gardet A, Xavier RJ. Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 2011;474(7351):307 – 317.

23. Round JL, Mazmanian SK. The gut microbiome shapes intestinal immune responses during health and disease. Nature reviews Immunology. 2009;9(5):313 – 323. doi:10.1038/nri2515.

24. Gitter AH, Wullstein F, Fromm M, Schulzke JD. Epithelial barrier defects in ulcerative colitis: Characterization and quantification by electrophysiological imaging Gastroenterology Volume 121, Issue 6, December 2001, Pages 1320 – 1328. doi:10.1053/gast.2001.29694.

25. Schirbel A, Fiocchi C. Inflammatory bowel disease: Established and evolving considerations on its etiopathogenesis and therapy. Journal of Digestive Diseases. 2010; 11: 266 – 276. doi: 10.1111/j.1751 – 2980.2010,00449.x.

26. Mokbel M, Carbonnel F, Beaugerie L, Gendre JP, Cosnes J. Effect of smoking on the long – term course of ulcerative colitis. Gastroenterol Clin Biol. 1998 Nov;22(11):858 – 62.