LIMFOCITŲ IR JŲ POTIPIŲ BEI LĄSTELINIŲ UŽDEGIMO ŽYMENŲ VERTINIMAS SERGANTIESIEMS SPONDILOARTROPATINĖMIS LIGOMIS IR OSTEOARTROZE

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS

Živilė Dalmantaitė

LIMFOCITŲ IR JŲ POTIPIŲ BEI LĄSTELINIŲ UŽDEGIMO

ŽYMENŲ VERTINIMAS SERGANTIESIEMS

SPONDILOARTROPATINĖMIS LIGOMIS IR OSTEOARTROZE

Darbo vadovė Doc. dr. Daiva Urbonienė

TURINYS

SANTRAUKA ... 4

SUMMARY ... 5

INTERESŲ KONFLIKTAS ... 6

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 6

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 9

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1 Limfocitai ir jų potipiai ... 12

1.1.1 T limfocitai ... 12

1.1.2 B limfocitai ... 16

1.1.3 NK ląstelės ... 18

1.2 Spondiloartropatinės ligos, epidemiologija, ekonominiai aspektai ... 20

1.3 Spondiloartropatijų etiopatogenezė ... 21

1.3.1 Genetiniai rizikos faktoriai ... 21

1.3.2 Ląstelinis imuninis atsakas ... 23

1.3.3 Aplinkos veiksniai ... 23

1.4. Laboratorinė spondiloartropatijų diagnostika ... 24

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 26

2.1 Tyrimo eiga ir tiriamųjų kontingentas ... 26

2.2 Tyrimo metodai ... 26

2.2.1 Bendras kraujo tyrimas automatizuotu būdu ... 26

2.2.2 Periferinio kraujo limfocitų potipių nustatymas ... 27

2.2.4 C-reaktyviojo baltymo nustatymas kraujo plazmoje ... 31

2.2.5 Eritrocitų nusėdimo greičio nustatymas ... 31

2.3 Statistinė duomenų analizė ... 32

3. REZULTATAI ... 33

3.1 Tiriamųjų kontingentas ... 33

3.2 Limfocitų ir jų potipių kiekio periferiniame kraujyje vertinimas sergantiesiems spondiloartropatinėmis ligomis ir osteoartroze ... 34

3.3 Periferinio kraujo limfocitų potipių aktyvacijos rodiklių vertinimas sergantiesiems spondiloartropatinėmis ligomis ir osteoartroze ... 35

3.4 Uždegiminių rodiklių pokyčiai sergantiesiems spondiloartropatinėmis ligomis ir osteoartroze ... 35

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 37

IŠVADOS ... 40

SANTRAUKA

Magistro darbo pavadinimas. Limfocitų ir jų potipių bei ląstelinių uždegimo žymenų vertinimas sergantiesiems spondiloartropatinėmis ligomis ir osteoartroze.

Tyrimo tikslas: įvertinti ląstelinio imuninio atsako ypatumus asmenims, sergantiems spondiloartropatinėmis ligomis ir osteoartroze.

Tyrimo uždaviniai. Nustatyti ir įvertinti periferinio kraujo limfocitų ir jų potipių (B, T ir NK limfocitų) kiekius asmenims, sergantiems spondiloartropatija ir osteoartroze; Palyginti limfocitų potipių (B, T, NK limfocitų) ir aktyvuotų T limfocitų kiekius asmenims, sergantiems spondiloartropatija ir osteoartroze; Nustatyti ir palyginti uždegiminių rodiklių (C-reaktyviojo baltymo (CRB), eritrocitų nusėdimo greičio (ENG), vidutinio trombocitų tūrio (MPV) ir trombocitų/limfocitų (T/L), neutrofilų/limfocitų (N/L) santykių) pokyčius pacientams, sergantiems spondiloartropatija ir osteoartroze.

Tyrimo objektas ir metodai. Tyrimui atrinkti pacientai sergantys spondiloartropatija (SpA) ir osteoartroze (OA). Į sveikųjų kontrolinę grupę įtraukti pacientai be sisteminių ir uždegiminių ligų, taip pat nesergantys jokia kita sąnarių liga. Limfocitų ir jų potipių kiekiai, aktyvuotų T limfocitų kiekiai periferiniame kraujyje nustatyti tėkmės citometrijos metodu (FACS Canto, Becton Dickinson, JAV). Leukocitų, eritrocitų ir trombocitų kiekiai bei jų rodikliai nustatyti hematologiniu analizatoriumi XE-5000 (ROCHE Diagnostics, Šveicarija), o uždegiminiai rodikliai, CRB ir ENG, atitinkamai nustatyti klinikinės chemijos automatine sistema SYNCHRON UniCel® DxC 800 (Beckman Coulter, JAV) ir Sedi-15 (Becton Dickinson, JAV) automatiniu analizatoriumi.

Rezultatai. Nustatytas statistiškai reikšmingas B ir T limfocitų kiekio sumažėjimas ir NK ląstelių kiekio padidėjimas tiek SpA, tiek OA pacientų periferiniame kraujyje, lyginant su kontroline grupe. Aktyvuotų T limfocitų kiekio skirtumų SpA ir OA grupėse nustatyta nebuvo. Taipogi, nustatytas statistiškai reikšmingas MPV rodiklio padidėjimas SpA ir OA pacientams lyginant su kontroline grupe bei teigiama MPV ir ENG rodiklių koreliacija. Tačiau reikšmingų T/L ir N/L santykių pokyčių grupėse nenustatyta. Išvados. Gauti rezultatai parodė, kad limfocitų potipių pokyčiai nėra specifiniai SpA, o labiau atspindintys vykstantį uždegiminį procesą. Nustatyta, teigiama MPV ir ENG rodiklių koreliacija, leidžia manyti, kad MPV rodiklis galėtų būti naudojamas uždegiminiam procesui įvertinti pacientams, sergantiems SpA ir OA.

SUMMARY

Full title of Master Thesis. Evaluation of lymphocyte subsets and cellular inflammatory markers in patients with spondyloarthropathy and osteoarthrosis.

Aim: to evaluate cellular immune response features in patients with spondyloarthropathy and osteoarthrosis.

Objectives. To determine and evaluate peripheral blood lymphocytes and their subsets (B, T and NK cells) count in patients with spondyloarthropathy and osteoarthrosis; To compare lymphocyte subsets (B, T, NK cells) and activated T cells count in patients with spondyloarthropathy and osteoarthrosis; To determine and compare inflammatory markers (C-reactive protein (CRP), erythrocyte sedimentation rate (ESR), mean platelet volume (MPV) and platelet/lymphocyte (P/L), neutrophil/lymphocyte (N/L) ratio) changes in patients with spondyloarthropathy and osteoarthrosis.

Patients and methods. Patients with spondyloarthropathy (SpA) and osteoarthrosis (OA) were enrolled. Healthy individuals without systemic inflammatory diseases and joint diseases were included in healthy control group. Peripheral lymphocyte and their subsets counts were analyzed by flow cytometry (FACS Canto, BD, USA). Leucocyte differential count, erythrocyte, platelet count and their indices were determined using XE-5000 automated hematology analyzer (ROCHE Diagnostics, Switzerland). Inflammatory markers CRP and ESR were measured with SYNCHRON UniCel® DxC 800 (Beckman Coulter, USA) and Sedi-15 (Beckman Coulter, USA) automated analyzers, respectively.

Results. B and T cell counts were significantly lower and NK cells count was significantly higher in the peripheral blood of patients with SpA and OA compared with healthy control subjects, but there were no significant differences between activated T cells count in the SpA and OA groups. MPV was significantly higher in patients with SpA and OA than in the control group. Moreover, a significant positive correlation was found between MPV and ESR. The P/L and N/L ratios were not significantly different between the groups.

Conclusions. It was shown that lymphocyte subsets alterations were not specific for SpA. However, it may indicate ongoing inflammatory process. Positive correlation between MPV and ESR suggests that MPV also could be used to assess inflammatory process in patients with SpA and OA.

INTERESŲ KONFLIKTAS

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

Tyrimui atlikti ir archyviniams duomenims naudoti gautas LSMU Bioetikos centro pritarimas 2016-01-06 Nr. BEC-LMB(M)-182.

SANTRUMPOS

APC - alofikocianinas (angl. allophycocyanin) APL - antigeną pateikianti ląstelė

AS - ankilozuojantis spondilitas

ASAS - tarptautinė spondiloartrito vertinimo draugija (angl. The assessment of spondyloarthritis international society)

BCR - B ląstelių receptorius (angl. B cell receptor)

CD - diferenciacijos grupė (angl. cluster of differentiation) CRB - C-reaktyvusis baltymas

CTL - citotoksiniai T limfocitai ENG - eritrocitų nusėdimo greitis

FITC - fluoresceino izotiocianatas (angl. fluorescein isothiocyanate)

GM-CSF - granuliocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius (angl. granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)

HLA - žmogaus leukocitų antigenai (angl. human leukocyte antigen) IFN-γ - γ interferonas

IL - interleukinas

K3EDTA - tribazis kalio etilendiamintetraacetatas (angl. ethylene diamine tetra acetic acid tribasic potassium

salt)

MHC - pagrindinis audinių suderinamumo kompleksas (angl. major histocompatibility complex) MPV - vidutinis trombocitų tūris (angl. mean platelet volume)

N/L - neutrofilų/limfocitų santykis NK - NK ląstelės (angl. natural killer) OA - osteoartrozė

PE - fikoeritrinas (angl. phycoerythrin)

PerCP - peridinchlorofilo proteinas (angl. peridinchlorophyll protein) PLT - trombocitai (angl. platelets)

PsA - psoriazinis artritas PŠS - priekinė šviesos sklaida RA - reumatoidinis artritas RBC - eritrocitai

SpA - spondiloartropatija

ŠŠS - šoninė šviesos sklaida T/L - trombocitų/limfocitų santykis

TCR - T ląstelių receptorius (angl. T cell receptor)

TD - nuo T priklausomi antigenai (angl. T-cell dependent) TH - T limfocitai pagalbininkai (angl. helper T cells)

TI - nuo T nepriklausomi antigenai (angl. T-cell independent) TNF - tumoro nekrozės faktorius

Treg - reguliacinės TH ląstelės

ĮVADAS

Spondiloartropatijos (dar kitaip spondiloartrozės (SpA)) - tai grupė glaudžiai susijusių ligų, pasižyminčių bendrais klinikiniais požymiais ir artimu ryšiu su HLA-B27 antigenu. SpA ligų grupei priklauso ankilozuojantis spondilitas (AS), psoriazinis artritas (PsA), reaktyvusis artritas, enteropatinis spondilitas ir artritas bei nediferencijuotos SpA. SpA paplitimas pasaulyje siekia 1 proc. populiacijos, bet įvairiose šalyse/etninėse grupėse žymiai varijuoja: nuo 0,01 proc. Japonijoje iki 2,5 proc. Šiaurės Arktyje gyvenančiose tautose (68). Nustatyta, kad paplitimas Lietuvoje yra 0,84 proc. gyventojų (1). SpA ligų grupė charakterizuojama lėtiniu uždegimu sausgyslių prisitvirtinimo prie kaulų ir kitose vietose, kuris lemia pagrindinius klinikinius ligų požymius: sakroileitą, entezitą ir periferinį artritą. Ekstraartikulinės apraiškos, tokios kaip psoriazė, uveitas, uždegiminė žarnyno liga, taip pat skiriamasis SpA ligų požymis. SpA patogenezė nėra iki galo aiški, manoma, kad tai sąveikos tarp genetinių rizikos faktorių ir aplinkos veiksnių rezultatas, lemiantis uždegimo ir autoimuniteto aktyvaciją (2).

Ankilozuojantis spondilitas (AS) – dažniausia ir sunkiausia spondiloartropatinė liga. AS dažniausiai paveikia jaunus žmones antrame ar trečiame gyvenimo dešimtmetyje (amžiaus vidurkis 26 metai) (3). Skausmas, ribotas fizinis aktyvumas ir pasireiškianti depresija apriboja socialinį pacientų gyvenimą, mokymąsi (4). Blogėja ir AS sergančių asmenų darbo produktyvumas, kadangi dėl pasireiškiančio skausmo ar kitų apribojimų, ligoniams prireikia daugiau laisvų dienų, dirbama mažiau valandų, dažniau prašoma kolegų pagalbos. Pacientai patiriantys didelį skausmą yra linkę keisti darbo pobūdį (5,6). Nedarbingumas ženkliai paveikia tiek individą, tiek visuomenę. Tyrimai Prancūzijoje rodo, kad SpA metinė gydymo ir darbo produktyvumo nuostolių suminė kaina gali siekti iki 13 635 € (7). Vidutinė metinė gydymo paslaugų ir vaistų kaina sergantiems AS JAV siekia apie 17 728 JAV dolerių, daugiau nei 50  kainos sudaro vaistai (8).

Siekiant pristabdyti ligos progresavimą, sumažinti ligos sukeliamą socialinę ir ekonominę naštą bei išvengti nereikalingų diagnostinių ir terapinių procedūrų, labai svarbi ankstyva diagnozė ir gydymas. Visgi, AS viena iš vėliausiai diagnozuojamų reumatinių ligų. Galimi faktoriai, lemiantys uždelstą AS diagnozę (nuo simptomų pasireiškimo dažniausiai praieina daugiau nei vieneri metai), daugumai pacientų yra nepilnas klinikinis vaizdas, kai kuriems – normalus radiografinis sakroileinių sąnarių vaizdas simptomų pradžioje. Taip pat įtakos turi ir patognominių požymių, laboratorinių diagnostinių testų ar validuotų diagnostinių kriterijų nebuvimas (9).

Laboratorinių tyrimų visiškai specifinių SpA nėra. Pacientams dažnai nustatomi nespecifiniai uždegimo žymenis (CRB, ENG), atlikus bendrą kraujo tyrimą stebima normochrominė, normocitinė anemija. Pacientams taip pat nustatomas HLA-B27 antigenas (2). Nors HLA-B27 antigenas nustatomas 90

proc. AS pacientų, tik 5 proc. HLA-B27 teigiamų individų bendrojoje populiacijoje išsivysto AS, todėl vien tik HLA-B27 buvimas nenurodo SpA (10). Ūmios fazės reaktantų (CRB ir ENG) tyrimai pasižymi mažu jautrumu ir specifiškumu ir neatspindi ligos proceso ar aktyvumo AS ir SpA pacientams. Padidėjęs CRB ar ENG yra nustatomas tik 40-50 proc. pacientų, sergančių AS. Taigi, ENG ar CRB rodikliais atmesti aktyvios ligos ar AS diagnozės negalima (2).

Dėl šių priežasčių vis ieškoma naujų rodiklių, kurie ne tik atspindėtų vykstantį uždegiminį procesą, bet ir būtų specifiniai SpA. Kadangi SpA ligos laikomos autoimuninėmis ir yra stipriai susijusios su HLA-B27 antigenu, pateikiančiu antigeninius peptidus CD8+ T limfocitams, manoma, kad jų patogenezėje svarbų vaidmenį atlieka įgytas ląstelinis imuninis atsakas. Todėl šio tyrimo metu pasirinkta tyrinėti SpA pacientų periferinio kraujo limfocitus ir jų potipius, o siekiant nusatatyti, ar pacientams, sergantiems SpA būdingi tam tikri specifiniai limfocitų potipių kiekio ir aktyvacijos pokyčiai, nuspręsta juos palyginti su osteoartroze sergančiais pacientais (OA). Darbo metu taipogi tyrinėti nauji ląsteliniai uždegiminiai rodikliai – vidutinis trombocitų tūris (MPV), trombocitų/limfocitų (T/L) ir neutrofilų/limfocitų (N/L) santykiai. Pastaraisiais metais buvo parodyta, kad padidėjęs trombocitų dydis, T/L, N/L yra susiję su daugeliu uždegiminių ligų, tokių kaip RA, AS, šeimine Viduržemio jūros karštine, juveniline SRV, sistemine skleroze ir uždegimine žarnyno liga (11-15). Duomenys reikalingi apskaičiuoti N/L, T/L bei MPV rodiklis gaunami atlikus bendrą kraujo tyrimą, kuris rutiniškai atliekamas diagnozuojant uždegimines ligas ir stebint jų eigą. Todėl šių rodiklių nustatymas būtų patogus ir lengvas, greitai prieinamas būdas įvertinti vykstantį uždegiminį procesą SpA pacientams.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tyrimo tikslas – įvertinti ląstelinio imuninio atsako ypatumus asmenims, sergantiems spondiloartropatinėmis ligomis ir osteoartroze.

Tyrimo uždaviniai:

1. Nustatyti ir įvertinti periferinio kraujo limfocitų ir jų potipių (B, T ir NK limfocitų) kiekius, asmenims, sergantiems spondiloartropatinėmis ligomis ir osteoartroze.

2. Palyginti limfocitų potipių (B, T, NK limfocitų) ir aktyvuotų T limfocitų kiekius asmenims, sergantiems spondiloartropatinėmis ligomis ir osteoartroze.

3. Nustatyti ir palyginti uždegiminių rodiklių (C-reaktyviojo baltymo, eritrocitų nusėdimo greičio, vidutinio trombocitų tūrio ir trombocitų/limfocitų, neutrofilų/limfocitų santykių) pokyčius pacientams, sergantiems spondiloartropatinėmis ligomis ir osteoartroze.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Limfocitai ir jų potipiai

Limfocitai – leukocitų rūšis, pagrindinės ląstelinio ir humoralinio imuniteto ląstelės. Visi limfocitai yra kilę iš kraujodaros kamieninių ląstelių kaulų čiulpuose (16) ir pagal ląstelių paviršiaus molekules (angl. CD - cluster of differentiation) yra skirstomi į atskiras grupes: T limfocitus, B limfocitus ir natūraliuosius kilerius (NK ląsteles). Šios ląstelės labai judrios, po jų vystymosi pirminiuose limfiniuose organuose (čiobrialiaukėje ir kaulų čiulpuose), jos keliauja į antrinius limfinius organus (limfmazgius, blužnį), kur iš limfos ir kraujo pateikiami cirkuliuojantys antigenai (17). Sveiko suaugusio žmogaus periferiniame kraujyje limfocitai sudaro 20-40 proc. visų leukocitų.

T ir B limfocitai svarbiausios įgyto imuninio atsako ląstelės. Įgytas (specifinis) imunitetas pasižymi specifiškumu antigenui, geba keisti ir sustiprinti šį specifiškumą (afiniškumo subrendimas) bei imunine atmintimi (18). Kadangi NK ląstelės neturi antigenui specifinių ląstelės paviršiaus receptorių, paprastai jos yra laikomos įgimto (nespecifinio) imuniteto dalimi, tačiau nauji tyrimai rodo, jog NK ląstelės taipogi gali pasižymėti savybėmis būdingomis įgytam imunitetui (19).

Limfocitai atlieka pagrindinį vaidmenį šalinant mikroorganizmus, infekuotas ir piktybines ląsteles. Atpažinusios giminingus antigenus, ląstelės aktyvuojamos, proliferuoja ir diferencijuojasi. Vėliau dalis aktyvuotų limfocitų populiacijos keliauja į infekcijos vietą, kur šios ląstelės atlieka efektorines funkcijas, tokias kaip citokinų ar antikūnų gamyba ir ląstelių taikinių lizė. Po patogeno eliminacijos dauguma aktyvuotų ląstelių žūva apoptozės būdu ir išlieka tik maža dalis ląstelių – atminties ląstelės, kurios užtikrina greitą apsaugą reinfekcijos atveju (20).

1.1.1 T limfocitai

T ląstelės vystosi iš kraujodaros kamieninių ląstelių kaulų čiulpuose ar embriono kepenyse ir po migracijos subręsta čiobrialiaukėje. Pasiekusios čiobrialiaukę T ląstelių pirmtakės greitai dauginasi, veikiant interleukinui-7 (IL-7) (17). Ankstyviausioji (jauniausioji) T ląstelė neekspresuoja T ląstelių receptoriaus (TCR), CD4 ir CD8 molekulių ir yra vadinama dvigubai neigiamu (DN) timocitu (21). Ankstyva timocitų ekspansija yra lydima Notch-1 ir kitų transkripcijos faktorių indukcijos. Transkripcijos faktoriai lemia tolesnį ląstelių pirmtakių vystymąsi T ląstelių linijos kryptimi ir skatina genų, svarbių T ląstelių receptoriaus (TCR) surinkimui, raišką. Funkcionalūs genai, koduojantys TCR α ir β ar γ ir δ

grandines, susidaro TCR genų pertvarkos metu (17). Pilnai surinkto TCR komplekso ekspresija ląstelės paviršiuje žymi DN timocito perėjimą į dvigubai teigiamą (DT) timocitą (CD4+, CD8+) (22).

TCR yra transmembraninis receptorius, atsakingas už svetimų antigenų, pateiktų kartu su šeimininko (savomis) pagrindinio audinių suderinamumo komplekso (angl. MHC – major histocompatibility complex) molekulėmis, atpažinimą ir dalyvaujantis T ląstelių aktyvinimo procese. Visgi, dauguma timocitų ekspresuoja TCR, kurie negeba jugtis prie savų MHC molekulių, todėl tokios ląstelės nėra naudingos šeimininko imuninei sistemai (22). Šios ląstelės pašalinamos teigiamos selekcijos metu: išgyvena tik ląstelės, kurių TCR žemu avidiškumu jungiasi prie čiobrialiaukės epitelio MHC molekulių, tos, kurių TCR nesijungia su savomis MHC, žūva apoptozės būdu (21). Per stipriai besijungiančios ląstelės taip pat pašalinamos (neigiama selekcija), taip užtikrinama, jog autoreaktyvios ląstelės nesubręs (centrinė tolerancija) (17). Pastarasis procesas dažniausiai vyksta čiobrialiaukės meduliarinėje dalyje dalyvaujant dendritinėms ląstelėms (21).

Timocitai, kurie pereina tiek teigiamos, tiek neigiamos selekcijos procesus, bręsta iki CD4+ ar CD8+ T ląstelių. Ląstelės ekspresuojančios TCR, kuris jungiasi prie savo peptido:MHC I klasės molekulių komplekso, tampa CD8+ T ląstelėmis, kuomet savo TCR besijungiančios prie peptido:MHC II klasės molekulių komplekso – CD4+ T ląstelėmis. Šios pilnai diferencijuotos, tačiau naiviosios (nesusidūrusios su svetimu antigenu), T ląstelės palieka čiobrialiaukę ir keliauja į antrinius limfinius organus (17).

Aktyvacija. Subrendę T limfocitai yra aktyvuojami, kai jų TCR sąveikauja su antigeniniais peptidais komplekse su MHC molekulėmis. CD8+_{T limfocitai gali sąveikauti su peptidais (9-11 aminorūgščių ilgio)}

pateiktais su I klasės MHC molekulėmis (HLA-A, HLA-B, HLA-C). Šias MHC molekules savo paviršiuje ekspresuoja visos branduolį turinčios ląstelės. Antigeniniai peptidai paprastai yra generuojami iš virusais ar kitai patogenais, besidauginančiais intraceliuliariai, infekuotų ląstelių citoplazmoje esančių baltymų (endogeniniai antigenai). Priešingai, CD4+_{T limfocitų TCR prisijungia peptidus peteiktus kartu su II}

klasės MHC molekulėmis (HLA-DR, HLA-DQ ir HLA-DP). II klasės MHC molekulės yra ekspresuojamos antigeną pateikiančių ląstelių (APL) paviršiuje ir jų sintezė yra indukuojama įgimto imuniteto stimulais (17).

T limfocitų aktyvacija inicijuojama, kai TCR atpažįsta peptido-MHC kompleksą APL paviršiuje. Šiame procese labai svarbus koreceptorių, tokių kaip CD4 ir CD8, dalyvavimas. CD4 ir CD8 koreceptoriai – transmembraniniai baltymai, kurių išoriniai domenai padeda TCR prisijungimui prie MHC molekulių, o citoplazminiai domenai – sustiprina TCR signalo perdavimą. Išoriniai CD4, CD8 domenai specifiškai jungiasi prie pastoviųjų II ir I klasės MHC molekulių determinančių (CD4 prie II klasės, CD8 – I klasės MHC), tokiu būdu stabilizuodami TCR/peptido-MHC komplekso sąveiką (22).

Optimaliam T limfocitų atsakui į antigeną pasiekti be peptido-MHC komplekso atpažinimo TCR reikalingas ir antrasis signalas: kostimuliuojančių molekulių sąveika su receptoriais, esančiais APL paviršiuje. CD28 geriausiai ištyrinėta T limfocitų kloninę ekspansiją, diferenciaciją ir efektorines funkcijas kostismuliuojanti molekulė. CD28 jungiasi prie B7.1 (CD80) ir/ar B7.2 (CD86) receptorių, ekspresuojamų aktyvuotų APL paviršiuje (pvz., makrofagų, dendritinių ląstelių, B limfocitų). Jei negaunamas CD28 signalas, naivieji T limfocitai nėra aktyvuojami ir tampa nereaktyvūs. Ši visiško nejautrumo būsena vadinama anergija ir yra apibūdinama nesugebėjimu sintetinti IL-2 ir/ar proliferuoti. Taigi, T ląstelėse optimalus ląstelės proliferacijos sužadinimas po susidūrimo su antigenu taip pat priklauso nuo IL-2/IL-2 receptoriaus sistemos. CD28 signalai stiprina IL-2 sintezę ir sekreciją tiek transkripciniame, tiek potranskripciniame lygmenyje (23).

Atminties T ląstelės aktyvuojamos esant mažesniems antigeno kiekiams, aktyvacijai taip pat reikalinga mažiau kostimuliuojančių signalų. Nors atminties ląstelės proliferuoja silpniau nei naiviosios, tačiau sukelia stipresnį efektorinį atsaką (24).

T limfocitų efektorių potipiai. Selekcijos čiobrialiaukėje metu susidaro T limfocitai, turintys dviejų tipų TCR. Didžioji dauguma ekspresuoja antigeną jungiančias αβ TCR grandines – imunoglobulinų šeimos baltymus, sujungtus disulfidine jungtimi. Šios grandinės suformuoja unikalią struktūrą kiekvieno T limfocito paviršiuje. αβTCR T limfocitų receptoriai pasižymi labai dideliu antigeno atpažinimo repertuaru, tai limfocitai, kurie cirkuliuoja antriniuose limfiniuose organuose ir dalyvauja specifinėse imuninio atsako reakcijose. Maža dalis T limfocitų ekspresuoja γδ TCR grandines, šie limfocitai daug mažiau heterogeniški nei αβTCR T ląstelės, aptinkami odoje ir tam tikruose gleivinės paviršiuose ir galimai vaidina svarbų vaidmenį pirminiame atsake mikrobinės invazijos atveju (17, 25).

Pagal ląstelių linijos žymenis ir funkcinį aktyvumą išskiriamos kelios αβTCR T limfocitų grupės. Du pagrindiniai paviršiaus koreceptoriai, CD4 ir CD8, atskiria dvi pagrindines T limfocitų linijas, atliekančias skirtingas funkcijas. CD4+ _{limfocitai atpažįsta antigeną, pateiktą kartu su II klasės MHC}

molekulėmis ir kaip efektorinės ląstelės – T pagalbininkės (angl. TH – helper T cells) – produkuoja citokinus. CD8+ limfocitai aktyvuojami antigeninių peptidų, pateiktų su I klasės MHC molekulėmis, jų efektoriai – citotoksiniai T limfocitai (CTL) (25).

Aktyvuoti CD4+ _{limfocitai padeda B limfocitams ir citotoksinėms T ląstelėms sintetindami}

citokinus. T pagalbininkai taip pat dalyvauja įgimto imuniteto ląstelių, makrofagų, neutrofilų, putliųjų ląstelių ir monocitų, reguliavimo, stiprinimo ir telkimo procesuose (25). TH ląstelės charakterizuojamos

pagal jų išskiriamus citokinus, išskiriami šie T pagalbininkų potipiai: TH1, TH2, TH17, reguliacinės TH

Anksčiausiai atrasti T pagalbininkųpotipiai: TH1 ir TH2. TH1 ląstelės dažniausiai apibūdinamos

IL-2 ir γ interferono (IFN-γ) sinteze, tačiau įvairių tyrimų metu buvo parodyta, jog šios ląstelės gali produkuoti eilę kitų citokinų: tumoro nekrozės faktorių (TNF), limfotoksiną ir granuliocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantį faktorių (angl. GM-CSF – granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) (26). TH1 ląstelės dalyvauja imuniniame atsake prieš intraląstelinius patogenus (parazitus, virusus ir

viduląstelines bakterijas) ir tarpininkauja ląstelinio imuniteto ir lėto tipo padidinto jautrumo reakcijose. TH1 ląstelių vystymasis yra reguliuojamas IL-12. Kitas T pagalbininkų potipis, TH2, produkuoja 4,

IL-5, IL-13, taip pat IL-9 ir IL-10. Šios ląstelės skatina humoralinį imuninį atsaką ir padeda pašalinti ekstraląstelinius mikroorganizmus ir žarnyno helmintus (28).

Ilgą laiką T pagalbininkų atsakas buvo skirstomas į TH1, kaip atsaką į virusinę infekciją

(ląstelinis imunitetas), ir TH2 atsaką, pasižymintį antikūnų sekrecija (humoralinis imunitetas). Tačiau buvo

atrasta daug papildomų TH potipių, kurių kiekvienas pasižymi unikaliu citokinų profiliu ir funkcinėmis

savybėmis. TH17, apibūdinamas IL-17 sinteze, apsaugo nuo bakterijų ir grybų gleivinės paviršiuose bei

nuo kai kurių mikrorganizmų, kurie nėra TH1 ir TH2 atsako taikiniai. Gleivinių imunitetą taip pat palaiko

TH9, TH22 ląstelės (sintetina IL-9 ir IL-22 atitinkamai). T folikuliniai pagalbininkai TFH labai svarbūs B

limfocitų gemalinio centro formavimosi, klasės perjungimo ir afiniškumo brendimo procesuose. Imuninio atsako supresijos ir periferinės tolerancijos palaikymo funkciją atlieka reguliaciniai T limfocitai (Treg)

(28).

Kita didelė T limfocitų grupė – CD8+ _{T limfocitai, jų efektoriai vadinami citotoksiniais T}

limfocitai (CTL). CTL ir ląstelės taikino paviršiuje, atpažinus svetimus citozolinius peptidus, pateiktus kartu su I klasės MHC molekulėmis, susiformuoja imunologinė sinapsė. Per šią sinapsę į ląstelę taikinį patenka CTL granulės: granzimai, perforinas. Granzimai tai serino proteazės, kurios aktyuoja ląstelės apoptozę, perforinas – perforuoja ląstelės membraną (17). CTL taip pat išskiria citokinus: INF-γ, TNF-α (29). Citotoksiniai T limfocitai pašalina viduląstelinių patogenų infekuotas ir piktybines ląsteles.

Dauguma efektorinių T ląstelių išnyksta, kai antigenas eliminuojamas, tačiau dalis jų išlieka ir susiformuoja atminties T ląstelės. Priešingai nei naiviosios T ląstelės, kurios gyvuoja keletą mėnesių, ar efektorinės ląstelės, kurios žūva imuninio atsako pabaigoje, atminties T ląstelės limfiniuose organuose ir periferiniuose audiniuose gali išgyventi metų metus (29). Atminties ląstelės gali būti skiriamos į tris subpopuliacijas: centrinės atminties ląstelės (TCM), efektorinės atminties ląstelės (TEM) ir audinių atminties

ląstelės (angl. TRM – tissue-resident cells). TCM ekspresuoja CCR7 ir CD62L (L-selektinas) molekules, taip

pat sekretuoja IL-2, tačiau negeba sitetinti INF-γ ir IL-4. Priešingai, TEM neekspresuoja CCR7 ar CD62L,

pasižymi silpnesne proliferacija, tačiau sintetina didelius kiekius INF-γ ir IL-4. CD4+ _{ir CD8}+ _T CM

atminties T ląstelių populiacija gali likti periferiniuose audiniuose, šios ląstelės vadinamos audinių atminties ląstelėmis. TRM savo paviršiuje ekspresuoja CD103 ir CD69 molekules (27). Kaip minėta,

daugelis antigenui specifiškų atminties ląstelių gali išgyventi metus ar dešimtmečius, taigi atminties ląstelės yra esminė įgyto imuniteto dalis.

1.1.2 B limfocitai

Vystymasis. B limfocitų vystymasis yra daugiastadijinis procesas, prasidedantis pirminiuose limfiniuose organuose (žmogaus embriono kepenyse ir embriono/suaugusiojo kaulų čiulpuose) ir pasibaigiantis antriniuose limfiniuose organuose (limfmazgiuose ir blužnyje), kur vyksta funkcinis ląstelių brendimas (30).

B limfocitai išsivysto iš kraujodaros kamieninės ląstelės kaulų čiulpuose ar embriono kepenyse. Vystymasis priklauso nuo kaulų čiulpų stromos ląstelių, kurios daugiausia sekretuoja IL-7, taipogi augimo faktorių – Flt3-L, taip pat nuo transkripcijos faktorių veikimo, tokių kaip E2A, EBF, Pax5 ir kt. Veikiant šiems veiksniams kraujodaros kamieninė ląstelė virsta B limfocitų ląstelėmis pirmtakėmis (Pro-B), kurios neturi nei B ląstelių receptoriaus (BCR), nei paviršiaus imunoglobulinų (30).

B ląstelių receptorių (BCR) sudaro membraniniai imunoglobulinai (mIgM ir mIgD), sujungti su Igα/Igβ (CD79a/CD79b) heterodimerais (α/β). mIg subvienetai prisijungia antigeną, o α/β suvienetai perduoda signalus į ląstelės vidų (31). Imunoglobulinus koduojantys genai yra surenkami iš segmentų tokiu pat būdu kaip T limfocitų receptoriaus genai (32). Kai pro-B ląstelėse įvyksta imunoglobulino sunkiosios (IgH) grandinės genų persitvakymas, ląstelės diferencijuojasi į B ląsteles pirmtakes (pre-B), kurios sintetina citoplazmines μΗ grandines ir savo paviršiuje laikinai ekspresuoja pre-B ląstelių receptorių (pre-BCR). Po lengvosios imunoglobulino (IgL) grandinės persitvarkymo pre-B ląstelėse, susiformuoja nebrandūs B limfocitai, paviršiuje ekspresuojantys BCR, sudarytą iš IgM. Vėliau vyksta selekcijos procesai, kurių metu pašalinamos autoreaktyvios ląstelės, likę limfocitai migruoja į kraują, kur lastelės paviršiuje įgyjamas IgD. Galutinai B limfocitai subręsta blužnyje (33).

B limfocitų aktyvacija. B limfocitų aktyvaciją ir diferencijaciją lemia dvi plačios antigenų kategorijos – nuo T nepriklausomi (angl. TI – T-cell independent) ir nuo T priklausomi (angl. TD – T-cell dependent) antigenai. B ląstelių atsakas į TD antigenus priklauso nuo B ląstelių ir CD4+ T pagalbininkų sąveikos, šie antigenai paprastai būna baltyminės kilmės. TI antigenai geba sukelti atsaką be T limfocitų pagalbos, tai bakterijų sienelės komponentai, polisacharidai (34).

B limfocitų specifiškumą lemia BCR kintamasis (variabilusis) domenas. Šiuo domenu B limfocitai specifiškai atpažįsta antigeną. Priešingai nei TCR, kuris atpažįsta antigeną tik pateiktą su MHC molekulėmis, BCR gali aptikti ir tirpius, ir prie membranų prisijungusius (pvz., dendritinių ląstelių pateikiamus) antigenus. BCR prisijungus prie jam specifinio antigeno gaunamas pirmasis aktyvacijos signalas. Signalą sustiprina CD19 kompleksas, kurį sudaro CD19, CD21, CD81 ir CD225 molekulės (35).

Kad B limfocitai būtų aktyvuojami, reikalingas ir antrasis signalas. Jį suteikia aktyvuotos TFH

ląstelės gemaliniame centre. Čia folikulinės dendritinės ląstelės pateikia antigeną B limfocitams C3-komplemento receptorių ar antikūnų-Fc receptorių būdu. Gaunamas aktyvacijos signalas, be to, antigenas B limfocitų paruošiamas ir kartu su II klasės MHC molekulėmis pateikiamas TFH ląstelėms (35).

Aktyvuoti T limfocitai savo paviršiuje sintetina CD40 ligandą (CD40L), kuris jungiasi prie CD40 B limfocitų paviršiuje – taip gaunamas antrasis aktyvacijos signalas. CD40 svarbi kostimuliuojanti molekulė, kuri palengvina nuo T priklausomą B limfocitų aktyvaciją, nuo T priklausomą B limfocitų proliferaciją, gemalinio centro formavimąsi ir imunoglobulino izotipo perjungimą (35-37).

Nuo T priklausomai B limfocitų aktyvacijai taip pat svarbūs citokinai: IL-6, IL-21. IL-6 padeda subręsti TFH ląstelėms, IL-21 veikia ne tik TFH, bet ir B limfocitus, skatina jų proliferaciją, plazmoblastų

diferenciaciją ir antikūnų sekreciją (35).

B limfocitus aktyvuoti be T limfocitų pagalbos gali vadinamieji nuo T nepriklausomi antigenai. TI antigenai skiriami į dvi grupes: 1 tipo TI antigenus (TI-1) ir 2 tipo TI antigenus (TI-2). TI-1 antigenai, tokie kaip lipopolisacharidai, yra B limfocitų mitogenai, jie nespecifiškai ar polikloniškai aktyvuoja daugumą B limfocitų. TI-2 antigenai, pavyzdžiui, polisacharidai, yra didelės molekulės, turinčios daugybę pasikartojančių epitopų, kurie geba vienu metu jungtis prie keleto BCR. (35). Paprastai atsako į TI antigenus metu nesusidaro ilgai gyvuojančių plazminių ląstelių, nes jo metu nesiformuoja gemaliniai centrai bei imunologinė atmintis. Priešingai, atsako į TD antigenus metu susidaro gemaliniai centrai, kuriuose vyksta antikūnų klasės perjungimas, somatinės hipermutacijos, generuojami atminties B limfocitai ir ilgai gyvuojančios plazminės ląstelės (34).

B limfocitų potipiai. Paprastai naivieji B limfocitai yra skirstomi į tris potipius: B-1 B limfocitus, folikulinius (FO) B limfocitus ir marginalinės zonos (MZ) B limfocitus (30, 38, 39).

B-1 B limfocitų potipis geriausiai buvo ištyrinėtas pelėse, o klausimas ar šios ląstelės egzistuoja žmogaus organizme ilgą laiką buvo ginčytinas. Visgi, Griffin ir kt. 2011 metais apibūdino žmogaus B-1 B limfocitus. Kaip ir pelės B-1 B ląstelės, žmogaus B-1 B ląstelės produkuoja IgM antikūnus prieš TI antigenus (40). Šie antikūnai pasižymi polireaktyvumu ar polispecifiškumu, gali jungtis tiek prie nuosavų antigenų, tiek prie mikrobinių antigenų. Tipinis pavyzdys, B-1 B ląstelės generuojančios antikūnus prieš

ABO kraujo grupes. Šie antikūnai atsiranda natūraliai per primuosius kelis gyvenimo mėnesius dėl strūkturinių panašumų tarp ABO sistemos ir bakterinių antigenų, kuriuos atpažįsta B-1 B limfocitai. Taipogi, manoma, kad B-1 B limfocitai yra polireaktyvių IgA antikūnų, kurie svarbūs gleivinės imunitetui, šaltinis (38).

MZ B limfocitai randami marginalinėje blužnies zonoje, taip pat ekspresuoja polireaktyvų BCR. Šie B limfocitai produkuoja polireaktyvius IgM antikūnus, kurie palengvina mikroorganizmų ir apoptotinių ląstelių pašalinimą iš kraujo. Panašiai kaip B-1 B ląstelės, MZ B ląstelės atpažįstą nuo T nepriklausomus antigenus. Taigi, tiek B-1, tiek MZ B limfocitų atsakas panašus į greitą įgimto imuniteto ląstelių atsaką: greitai gaminami IgM antikūnai (maždaug per 1-3 dienas), kurie apsaugo organizmą nuo infekcijos iki kol FO B limfocitai diferencijuojasi į plazmines ląsteles ir pradeda gaminti didesnio afiniškumo IgG antikūnus (užtrunka apie 7 dienas) (41). Visgi, priešingai nei B-1 B limfocitai, MZ B limfocitai taip pat dalyvauja imuniniame atsake į nuo T priklausomus baltyminius antigenus ir gali generuoti didelio afiniškumo perjungtos klasės antikūnus bei pateikti antigenus folikulų dendritinėms ląstelėms blužnyje, taip padėdami gemalinio centro reakcijos formavimuisi (38).

FO B limfocitai, randami blužnyje ir limfmazgiuose, yra tradiciniai (įprastiniai) įgyto imuniteto limfocitai ir sudaro didžiają dalį visų B limfocitų. Nors FO B limfocitai dalyvauja nuo T priklausomame IgM atsake, visų pirma jie atsakingi už ilgai gyvuojančių, didelio afiniškumo IgG antikūnų generaciją, kurie labai svarbūs humoraliniui imunitetui, suteikiančiam apsaugą po infekcijų ar vakcinacijos (38).

1.1.3 NK ląstelės

Natūralieji kileriai (NK) – dideli grunuliuoti limfocitai, vaidinantys svarbų vaidmenį įgimto imuniteto atsake prieš tam tikrus mikrobinius patogenus ir piktybines ląsteles. NK ląstelės išsivysto ir, manoma, subręsta kaulų čiulpuose iš bendro limfoidinio pirmtako (42). Skirtingai nei T ar B limfocitai, NK ląstelės savo paviršiuje neturi receptorių, kurie susidaro somatinės rekombinacijos būdu, ir daugiausiai randami periferiniame kraujyje, kaulų čiulpuose ir blužnyje, tačiau gali būti aptinkami ir limfmazgiuoze bei kituose nelimfiniuose organuose, pvz., kepenyse, plaučiuose, kasoje ir gimdoje (43). Virusinių infekcijų, uždegimo, navikų augimo ir invazijos metu natūralieji kileriai iš kraujo greitai sutelkiami pažeisto organo parenchimoje, kur aktyvuotos NK ląstelės tiesiogiai nužudo ląsteles taikinius bei sekretuoja prouždegiminius citokinus (pvz., INF-γ) ir chemokinus (CCL3 ir CCL5), kurie skatina uždegiminę reakciją, stimuliuoja kraujodarą, indukuoja granuliocitų aktyvaciją ir proliferaciją, taip toliau stiprindami uždegiminį atsaką (42, 44).

NK ląstelės pašalina infekuotas, piktybines ląsteles tokiu pat būdu kaip citotoksiniai T limfocitai (CTL): į ląsteles taikinius jie išskiria citotoksines granules – perforiną, kuris perforuoją membraną, ir granzimus – serino proteazes, kurios aktyvuoja ląstelės taikinio apoptozę (42). Taipogi, natūralieji kileriai savo paviršiuje turi mirties receptorių ligandus (TRAIL, FasL (CD95L)), kuriems prisijungus prie šių receptorių ląstelės taikinio paviršiuje, inicijuojama ląstelės apoptozė (45).

NK ląstelių aktyvaciją lemia aktyvuojančių ir slopinančių signalų visuma, kuriuos jos gauna po susidurimo su ląstele taikiniu (45).

Per pastaruosius 20 metų buvo identifikuota daugybė NK ląsteles aktyvuojančių receptorių. Geriausiai charakterizuotas NKG2D aktyvuojantis receptorius. NKG2D atpažįsta molekules, kurios daugumoje normalių ląstelių nėra ekspresuojamos ar yra ekspresuojamos silpnai, tačiau nesveikose ląstelėse (pyktybinėse, infekuotose ar streso paveiktose) jų kiekis paviršiuje būna padidėjęs. Šio receptoriaus ligandai žmogaus organizme – MICA/MICB, ULBP1-6. NKG2D pagrindinis atpažinimo receptorius, detektuojant ir eliminuojant transformuotas ir infekuotas ląsteles, taip pat dalyvaujantis kai kurių uždegiminių ligų vystymosi procese (46, 47). Kitas svarbus NK ląsteles stimuliuojantis receptorius – Fc receptorius FcγR, kuris sukelia nuo antikūnų priklausomą ląstelės citotoksiškumą, jungdamasis prie kitų ląstelių paviršiaus prisijungusių IgG. Identifikuota ir daugiau kitų aktyvuojančių (pvz., NKp46, NKR-P1C) receptorių, tačiau atitinkami jų ligandai dar lieka neaiškūs (45).

NK ląstelės taipogi reguliuojamos slopinančiais receptoriais, dauguma iš jų jungiasi prie I klasės MHC molekulių, ekspresuojamų daugumos branduolį turinčių ląstelių. Žmogaus ląstelių žudikių imunoglobulino tipo receptoriai (angl. KIR – killer cell immunoglobulin-like receptors; dar žinomi kaip CD158) – grupė transmembraninių glikoproteinų, kuriuos sintetina NK ląstelės ir kai kurie T limfocitai. KIR svarbiausi NK ląstelių vystymąsi, toleranciją ir aktyvaciją reguliuojantys receptoriai. Pagrindiniai KIR ligandai yra I klasės MHC (HLA-A, -B ar -C) molekulės. NK ląstelės pirmiausiai atakuoja nenormalias ląsteles, kurių paviršiuje sumažėja ar išnyksta MHC-I molekulės. MHC-I molekulių praradimas retas atvejis, dažniausiai pasitaikantis kai kuriose vėžinėse ir virusų infekuotose ląstelėse, kurios taip siekia išvengti citotoksinių T limfocitų atpažinimo. NK ląstelių reguliacija KIR receptoriais turi labai didelę reikšmę jų atsakui virusinės infekcijos, vėžio, kraujodaros kamieninių ląstelių transplantacijos ir nėštumo atvejais (48).

Taigi, NK ląstelių aktyvacija priklauso nuo to, kurie iš signalų, aktyvuojantys ar slopinantys, bus dominuojantys.

1.2 Spondiloartropatinės ligos, epidemiologija, ekonominiai aspektai

Seronegatyvios spondiloartropatijos (dar kitaip spondiloartrozės (SpA)) sąvoka pradėta vartoti maždaug prieš 40 metų. Spondiloatropatijos – tai grupė glaudžiai susijusių ligų, pasižyminčių bendrais klinikiniais požymiais ir artimu ryšiu su HLA-B27 antigenu. SpA ligoms priskiriama ankilozuojantis spondilitas (AS), psoriazinis artritas (PsA), reaktyvusis artritas, enteropatinis spondilitas ir artritas bei nediferencijuotos PsA. Klinikiniai SpA požymai heterogeniški ir apima nugaros skausmą (dažniausiai uždegiminės kilmės), oligoartritą (dažniausiai apatinių galūnių), daktilitą, kulno ar kitų vietų entezitą ir ekstraartikulines ligos apraiškas – uveitą, uždegimines žarnyno ligas ir psoriazę. Visi šie požymiai gali pasireikšti kiekvienai SpA grupei (1 pav.) (49).

1 pav. Spondiloartropatinės ligos

Šios ligos pasižymi bendrais klinikiniais požymiais, bendra patogeneze. AS- ankilozuojantis spondilitas; PsA – psoriazinis artritas; EA – enteropatinis artritas; ReA – reaktyvinis artritas; NspA – nediferencijuota

spondiloartropatija (50).

Apskaičiuota, jog SpA paplitimas pasaulyje siekia 1 proc. populiacijos, bet įvairiose šalyse/etninėse grupėse žymiai varijuoja: nuo 0,01 proc. Japonijoje iki 2,5 proc. Šiaurės Arktyje gyvenančiose tautose. SpA dažnumas skirtingose šalyse taip pat gerokai svyruoja ir esti nuo 0,48 atvejo 100000 individų per metus Japonijoje iki 62,5 atvejo 100000 individų per metus Ispanijoje (51). Adomavičiūtės ir bendraautorių studijos metu nustatyta, kad SpA paplitimas Lietuvoje siekia 0,84 proc. populiacijos (1).

Prototipinė spondiloartropatinė liga – ankilozuojantis spondilitas (AS). Tai dažniausia ir sunkiausia SpA. AS – jaunų vyrų liga, paveikia vyrus dažniau nei moterys santykiu 2:1, dažniausiai trečiame gyvenimo dešimtmetyje (52). Yra nustatyta, kad sergantys AS patiria tris kartus didesnę pastovaus nedarbingumo riziką (53). Blogėja ir AS sergančių asmenų darbo produktyvumas, kadangi dėl

AS

PsA

ReA

EA

pasireiškiančio skausmo ar kitų apribojimų, ligoniams prireikia daugiau laisvų dienų, dirbama mažiau valandų, dažniau prašoma kolegų pagalbos. Pacientai patiriantys didelį skausmą yra linkę keisti darbo pobūdį (5,6). Atlikti tyrimai Prancūzijoje parodė, kad ankstyvo SpA metinė gydymo ir darbo produktyvumo nuostolių suminės kainos vidurkis gali siekti iki 13 635 €, apie 60 proc. šios sumos sudaro biologiniai vaistiniai preparatai (7). Vidutinė metinė gydymo paslaugų ir vaistų kaina sergantiems AS JAV siekia apie 17728 JAV dolerių, kuomet daugiau nei 50  kainos taipogi sudaro vaistai (8). AS ir gretutinės ligos (pvz., uždegiminės sąnarių ligos) yra glaudžiai susiję su sergančių gyvenimo kokybe (54). Skausmas, ribotas fizinis aktyvumas ir pasireiškianti depresija apriboja socialinį gyvenimą, mokymąsį. Sergantieji AS kartais privalo iškeisti laisvalaikį ir hobius į simptomų slopinimą ir poilsį tam, kad galėtų kokybiškai dirbti (4).

1.3 Spondiloartropatijų etiopatogenezė

SpA patogenezė nėra iki galo išaiškinta. Tai sudėtingos genetinių ir aplinkos faktorių sąveikos rezultatas, lemiantis autoimuniteto ir uždegimo aktyvaciją (2).

1.3.1 Genetiniai rizikos faktoriai

SpA paveldimumas yra poligeninis ir susijęs su keletu genetinių faktorių. AS pacientų pirmo, antro ir trečio laipsnio artimieji atitinkamai turi 94 proc., 25 proc. ir 4 proc. santykinę ligos išsivystymo riziką. Nustatyta, kad AS išsivystymui gali būti svarbūs ne mažiau kaip 9 lokusai. Šiuo metu septyni lokusai yra indentifikuoti ir validuoti viso genomo asociacijos (angl. GWAS – genome-wide association) tyrimų metu. Šie lokusai koduoja molekules: HLA-B27, endoplazminio tinklo aminopeptidazę 1 (angl. ERAP1 - endoplasmic reticulum aminopeptidase 1), interliaukino-23 receptorių (IL-23R), interliaukino-1 2 tipo receptorių (IL-1R2), juodligės toksino receptorių 2 (angl. ANTXR2 – anthrax toxin receptor 2). Likę du lokusai yra nekoduojančios genų sekos. Veiksninė populiacijos rizika, susijusi su HLA-B27, ERAP1, IL-23R, atitinkamai yra maždaug 90 proc., 26 proc. ir 1 proc.. ANTXR2 funcija nėra aiški. ERAP1 turi dvi biologines funkcijas, kurios abi svarbios AS patogenezėje: pirma, ERAP1 yra susijusi su HLA-B27 pateikimu. Antra, ERAP1 dalyvauja TNF, IL-1 ir IL-6 receptorių „nuėmime“ nuo ląstelių paviršiaus. Laisvi receptoriai tuomet tampa „spąstais“ atitinkamiems citokinams, taip reguliuojamas jų aktyvumas. Teoriškai, defektyvi ERAP1 gali lemti padidėjusį aktyvumą. Trečio AS geno, IL-23R, produktas yra ekspresuojamas T pagalbininkų, sekretuojančių IL-17, paviršiuje. IL-17, pasižymi didelėmis

prouždegiminėmis savybėmis, ir manoma, yra pagrindinis mediatorius daugelyje uždegiminių sąnarių ligų, taipogi ir spondiloartropatinėse (55).

HLA-B27 vienas svarbiausių genetinių faktorių AS patogenezėje. Jis nustatomas 85-95 proc. baltųjų asmenų, sergančių AS, tačiau bendroje populiacijoje tik 7-8 proc. HLA-B27 teigiamų asmenų išsivysto AS. Nors silpniau, bet HLA-B27 taip pat susijęs ir su kitomis SpA ligomis. HLA-B27 yra koduojamas I klasės MHC regiono alelio ir visos šios grupės molekulės pasižymi bendra kanonine struktūra, kuri leidžia pateikti antigeninius peptidus CD8+ T limfocitų receptoriams. Pasiūlyta keletas skirtingų hipotezių, siekiant paaiškinti HLA-B27 vaidmenį SpA patogenezėje (2).

Artritogeninio peptido hipotezėje (dar žinoma kaip molekulinės mimikrijos hipotezė) teigiama, kad tam tikri mikrobiologiniai peptidai, struktūra labai panašūs į nuosavus peptidus, gali imituoti juos ir lemti T limfocitų reaktyvumą, lydintį į autoreaktyvumą ir autoimuninės ligos išsivystymą. Tačiau šios hipotezės pagrįstumas kvestionuojamas dėl to, jog HLA-B27 pelėms vis tiek gali išsivystyti artritas, nesant CD8+ T limfocitų (2, 55).

Subrendusi HLA-B27 molekulė susideda ir trijų komponentų: polimorfinės HLA sunkiosios grandinės, kuri nekovalentiškai susijungusi su monomorfine lengvąja grandine, vadinama β2-mikroglobulinu, ir trumpo antigeninio peptido. Ląstelės paviršiuje, β2M gali disocijuoti nuo HLA sunkiosios grandinės, kuri tuomet vadinama laisva sunkiaja grandine. Yra žinoma, kad šios laisvos sunkiosios grandinės viena su kita sąveikauja ir suformuoja homodimerus. Laisvos sunkiosios grandinės hipotezė pagrįsta atradimu, kad šio tipo HLA dimerai prisijungia prie kai kurių receptorių T limfocitų ir NK ląstelių paviršiuje (LILRA1, LILRB2, KIR3DL1 ir KIR3DL2). Hipotezė postuliuoja, jog HLA-B27 lemia artritą, nes HLA-B27 laisvos sunkiosios grandinės gali aktyvuoti prouždegimines NK ląsteles ir T limfocitus (2, 55).

Paskutinioji hipotezė, kuria bandoma paaiškinti HLA-B27 vaidmenį SpA patogenezėje, vadinama nesusilanksčiusio baltymo atsako hipoteze. HLA-B27 paprastai lankstosi lėčiau nei kitos HLA molekulės. Tai gali generuoti blogai susilanksčiusius baltymus, kurie kaupiasi endoplazminiame tinkle ir lemia autofagijos ir IL23/17 signalinio kelio aktyvaciją (2, 55).

Charakterizuoti daugiau nei 100 HLA-B27 subtipų, tačiau ne visi iš jų vienodai susiję su SpA/AS. Su AS išsivystymu stipriai susijusios B27:02, 04 ir 05 molekulės. Taip pat nustatyta, kad kiti HLA-B aleliai, tokie kaip HLA-B60, B39, B38 ir B40, irgi susiję su AS (2).

1.3.2 Ląstelinis imuninis atsakas

Dar nėra iki galo išsiaiškinta, kurios imuninio atsako ląstelės palaiko SpA ligų aktyvumą, bet pacientų, sergančių SpA, periferiniame kraujyje stebima nemažai limfocitų potipų pokyčių. Nustatyta, kad sergantiesiems AS padidėja Th2 pagalbininkų, taip pat Th17 limfocitų skaičius (56-59). IL-17 yra prouždegiminis citokinas, kuris dalyvauja ne vienos uždegiminės ligos patogenezėje. Vienas pagrindinių IL-17 šaltinių yra Th17 ląstelės, bet T limfocitai, NK ląstelės, putliosios ląstelės bei neutrofilai gali būti taip pat susijusios su šio citokino gamyba. Gerai žinoma, kad IL-17 įvairiais aspektais prisideda prie ūmaus uždegimo, kadangi skatina IL-6 ir IL-8 išskyrimą. IL-17 vaidmuo reumatinėse ligose buvo išsiaiškintas nustačius, kad šis citokinas skatina kremzlės pažeidimą pelėse (52).

Tyrimai rodo, kad AS pacientams periferiniame kraujyje (56, 60, 61) ir sinoviniame skystyje (62) sumažėja reguliacinių T limfocitų (Treg). Treg palaiko periferinę toleranciją, slopindami efektorinius T

limfocitus, taip inhibuodami su imuniniais procesais susijusį audinių pažeidimą. AS pacientams, kurie buvo gydyti anti-TNF terapija, nustatomas panašus Treg kiekis kaip ir sveikiems asmenims. Taigi, tyrimų

duomenys leidžia manyti, kad Treg vaidina svarbų vaidmenį AS patogenezėje (60).

B limfocitai greičiausiai turi minimalų vaidmenį SpA patogenezėje, kadangi AS buvo nustatyta ir pacientams su B limfocitų stoka. Taipogi tyrimai rodo, kad gydymas rituksimabu nėra efektyvus pacientams, sergantiems SpA (55).

NK ląstelės, dalyvaujančios įgimto imuninio atsako reakcijose, taip yra siejamos su autoimunitetu. Žinoma, kad NK ląstelių skaičius periferiniame kraujyje sergantiesiems autoimuninėmis ligomis, tokiomis kaip sisteminė raudonoji vilkligė, būna sumažėjęs. Tačiau tiriant AS pacientus, nustatytas NK ląstelių skaičiaus padidėjimas (63-65). Teiginį, kad NK ląstelės užima svarbų vaidmenį AS patogenezėje, sustiprina faktai, jog HLA-B27 homodimerus specifiškai atpažįsta NK ląstelių receptoriai KIR3DL1 ir KIR3DL2 (2, 55).

1.3.3 Aplinkos veiksniai

Manoma, kad prie AS išsivystymo galimai prisideda du aplinkos faktoriai. Pirmasis labiausiai tikėtinas ir greitai pripažintas faktorius yra mechaninis stresas vietose, kur sausgyslės prisitvirtina prie kaulų (angl. enthesis). Normaliai tose vietose mechaninis stresas yra išsklaidomas. Buvo pasiūlyta, kad AS atveju, stresas gali aktyvuoti procesus, kurie lemia uždegimą, kaulo eroziją ir ataugų formavimąsi (66).

Kitas plačiai siūlomas aplinkos faktorius yra infekcija specifiniais patogenais, pvz., Klebsiella spp. Iš tikro keletas intraląstelinių patogenų gali sukelti reaktyvųjį artritą, vieną iš SpA grupės ligų. Šie patogenai gali būti Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp. ir Yersinia spp, infekuojantys virškinimo traktą, ir Chlamydia trachomatis, kuri infekuoja lyties ir šlapimo takų sistemą. Kai kuriems individams šios bakterijos nukeliauja į sąnarius ir gali indukuoti patogenui specifišką, taip pat ir HLA-B27 antigenui specifišką T limfocitų reaktyvumą. Visgi, ar šios T limfocitų reakcijos sukelia artritą, nėra visiškai aišku. Nėra įtikinamų įrodymų, kad dauguma AS atvejų yra sąlygoti patogenų (50, 55).

1.4. Laboratorinė spondiloartropatijų diagnostika

SpA ligos diagnozuojamos remiantis klinikiniais simptomais, fiziniu ligonio ištyrimu, instrumentiniais tyrimais ir laboratoriniais tyrimais. Visgi, nėra laboratorinių tyrimų visiškai specifinių SpA. Pacientams dažnai nustatomi nespecifiniai uždegimo žymenis, CRB, ENG, ir normochrominė, normocitinė anemija, taip pat HLA-B27 antigenas (2).

HLA-B27 antigenas nustatomas 90 proc. AS pacientų, 60 proc. sergančiųjų PsA, 70 proc. ReA pacientų ir 70 proc. pacientų, kuriems pasireiškia su uždegimine žarnyno liga susijęs spondilitas. Tačiau tik 5 proc. HLA-B27 teigiamų individų bendrojoje populiacijoje išsivysto AS, todėl vien tik HLA-B27 buvimas nenurodo SpA. Rezultatas interpretuojamas kartu su magnetinio rezonanso, klinikiniais duomenimis (10).

CRB ir ENG rodikliai pasižymi mažu jautrumu ir specifiškumu ir neatspindi ligos proceso ar aktyvumo AS ir SpA pacientams. Nors CRB rodiklio padidėjimas yra įtrauktas į tarptautinės spondiloartrito vertinimo draugijos (angl. ASAS - The assessment of spondyloarthritis international society) SpA klasifikacijos kriterijus, padidėjęs CRB ar ENG yra nustatomas tik 40-50 proc. pacientų, sergančių AS. Šis procentas gali būti didesnis sergantiesiems periferinėmis SpA formomis, pvz., PsA. Taigi, gavus ENG ar CRB rodiklius normos ribose, atmesti aktyvios ligos ar AS diagnozės negalima (2).

Šiuo metu, intensyviai tyrinėjami nauji ląsteliniai uždegiminiai žymenys – vidutinis trombocitų tūris (angl. MPV – mean platelet volume), trombocitų/limfocitų santykis (T/L) ir neutrofilų/limfocitų santykis (N/L). MPV atspindi trombocitų dydį ir trombocitų produkciją kaulų čiulpuose. Šis rodiklis gali būti naudojamas vertinant trombocitų aktyvaciją ir uždegimo sunkumą. Pastaraisiais metais buvo parodyta, kad padidėjęs trombocitų dydis, sąlygotas trombocitų aktyvacijos, yra susijęs su daugeliu uždegiminių ligų, tokių kaip RA, AS, šeimine Viduržemio jūros karštine, juveniline SRV, sistemine

skleroze ir uždegimine žarnyno liga (11). Trombocitai atlieka labai svarbų vaidmenį uždegimo ir imuninio atsako koordinavimo procese. Jie veikia kaip uždegiminės ląstelės, tarpininkaudami tarp stromos ir imuninių ląstelių, kas lemia pastarųjų aktyvaciją, kuri reikalinga uždegiminio proceso progresavimui. Trombocitų α granulėse yra daug įvairių citokinų, kurie daugiausia pasižymi prouždegiminiu veikimu (67). Trombocitų/limfocitų santykis taip pat buvo pasiūlytas kaip kaip naujas uždegimo žymuo. Įvairios studijos rodo, kad tiek trombocitų, tiek neutrofilų santykis su limfocitais yra naudingas žymuo vertinant uždegimo procesą pacientams, sergantiems RA, AS (12-15). Duomenys reikalingi apskaičiuoti N/L, T/L bei MPV rodiklis gaunami atlikus bendrą kraujo tyrimą, kuris rutiniškai atliekamas diagnozuojant uždegimines ligas ir stebint jų eigą. Todėl rodiklių nustatymas patogus ir lengvas, tyrimas greitai prieinamas ir nepridedantys jokios papildomos ištyrimo kainos.

Visgi, siekiant išsiaiškinti autoimuninių ligų etiologiją, patogenezę, nustatyti ankstyvą diagnozę bei pradėti gydymą, būtinas imuninių mechanizmų, juose dalyvaujančių komponentų, lemiančių lėtinį uždegimą, supratimas ir identifikacija. T ir B limfocitų bei prouždegiminių citokinų sąveika vaidina labai svarbų vaidmenį sisteminių autoimuninių ligų patofiziologijoje. T limfocitai – svarbus proužegiminių citokinų šaltinis, jie palaiko uždegimą, audinių pažeidimą. Antigenai T ląstelėms yra pateikiami aktyvuotų B limfocitų, makrofagų, dendritinių ląstelių. Aktyvinti T limfocitai savo ruožtu aktyvuoja įgimto imuniteto ląsteles, padeda aktyvuoti B limfocitus, sekretuoja įvairius citokinus (68). B limfocitai dalyvauja ligos patogenezėje pateikdami antigenus, taipogi sekretuodami citokinus, antikūnus, autoantikūnus (69). Limfocitų, dalyvaujančių įgimto imuninio atsako reakcijose, NK ląstelių svarba autoimuninių ligų vystymuisi iki šiol nėra aiški.

Periferinio kraujo ląstelių kiekio pokyčiai gali būti tyrinėjami ne tik siekiant suprasti autoimuninių ligų etiologiją, patogenezę, bet ir siekiant išsiaiškinti, ar limfocitų ir tam tikrų jų potipių absoliutaus kiekio pokyčiai gali nurodyti tam tikras autoimunines ligas (pvz., AS), kadangi tai būtų patogus ir greitas būdas gauti reikiamą informaciją apie ligą. Šiuo tikslu atlikta nemažai mokslinių studijų, kuriose tirti periferinio kraujo limfocitų kiekio ir aktyvacijos pokyčiai (63, 64, 70-73), tačiau gauti rezultatai gana prieštaringi ir specifinių pokyčių iki šiol nėra nustatyta, greičiausiai dėl to, kad SpA pacientai labai heterogeniški - skiriasi ligomis, jų aktyvumu, ligos trukme bei paprastai būna gydomi vaistais.

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI

2.1 Tyrimo eiga ir tiriamųjų kontingentas

Darbas atliktas LSMU Laboratorinės medicinos klinikoje. Tyrimui atlikti ir archyviniams duomenims naudoti gautas LSMU Bioetikos centro pritarimas 2016-01-06 Nr. BEC-LMB(M)-182.

Į tyrimą buvo įtraukti LSMU ligoninės Kauno klinikų pacientai iš konsultacinės poliklinikos ar stacionaro skyrių su SpA ar kitomis sąnarių ligomis (pagal siuntime laboratoriniam tyrimui nurodytą diagnozę) bei tirti Laboratorinės medicinos klinikoje 2015–2016 metais. Į sveikųjų kontrolinę grupę įtraukti pacientai be sisteminių ir uždegiminių ligų, taip pat nesergantys jokia kita sąnarių liga bei tirti Laboratorinės medicinos klinikoje 2015 m. kovo – 2016 m. gruodžio mėnesiais. Dalis sveikųjų buvo tirti specialiai, kita dalis atrinkta iš besilankiusių pacientų.

2.2 Tyrimo metodai

2.2.1 Bendras kraujo tyrimas automatizuotu būdu

Ėminio paėmimas ir laikymas:

Periferinis kraujas tyrimui buvo imamas standartinėmis sąlygomis periferinės venos punkcijos metu į vakuuminius mėgintuvėlius K3EDTA druska (Vacutainer ®, BD, JAV). Ėminys iki tyrimo laikytas

15–25 °C temperatūroje, ištirtas per 4 val. nuo paėmimo. Tyrimo eiga:

Prieš tyrimą kraujas gerai išmaišytas ir tirtas automatiniu hematologiniu analizatoriumi XE-5000 (ROCHE Diagnostics, Šveicarija). Nustatytas absoliutus eritrocitų, leukocitų ir jų atskirų populiacijų bei trombocitų skaičius, trombocitų vidutinis tūris (MPV).

Leukocitų populiacijos hematologiniu analizatoriumi atskiriamos naudojantis fluorescencinės tėkmės citometrijos principais. Tyrimo metu naudojamas fluorescencinis žymuo, kuris specifiškai jungiasi prie ląstelių nukleorūgščių. Sukuriamas ląstelių suspencijos srautas, kuriame ląstelės išsirikiuoja eile ir po vieną teka į tiriamąjį tašką, kuriame apšviečiamos lazerio spinduliu. Fiksuojama priekinė ir šoninė lazerio šviesos sklaida (PŠS, ŠŠS), pagal kurią ląstelės atskiriamos dėl skirtingų morfologinių savybių, ir fluorescencinė sklaida. PŠS atspindi ląstelių dydį, ŠŠS – ląstelių vidaus struktūrų sudėtingumą, grūdėtumą, fluorescencinis signalas – DNR, RNR kiekį ląstelėse. Pagal šiuos parametrus leukogramoje

išskiriamos limfocitų, monocitų, neutrofilų, eozinofilų ir bazofilų populiacijos. Nustatytas bendras leukocitų skaičius (x109_{/l) ir atskirų populiacijų santykinis ir absoliutus skaičius (proc., x10}9_/l).

Eritrocitų ir trombocitų absoliutų skaičių analizatorius nustato naudojant tiesioginės srovės (su hidrodinaminiu fokusavimu) metodą (matavimo vienetai: RBC x1012_{/l, PLT x10}9_{/l). Ląstelės yra}

leidžiamos pro mažą plyšį, vadinama apertūra. Abejose apertūros pusėse yra elektrodai, kuriais teka tiesioginė srovė. Kraujo ląstelėms pereinant pro apertūrą, tarp elektrodų keičiasi srovės varža. Varža lemia elektrinio impulso pokytį, kuris yra proporcingas kraujo ląstelės dydžiui. Tuo pačiu principu nustatomas ir apskaičiuojamas vidutinis trombocitų tūris, nurodomas fl matavimo vienetais.

2.2.2 Periferinio kraujo limfocitų potipių nustatymas

Periferinio kraujo limfocitų potipiai buvo tirti tėkmės citometrijos metodu naudojant BD Simultest™ IMK-Lymphocyte reagentų rinkinį, į kurio sudėtį įėjo šie monokloniniai antikūnai: CD19+, CD4+, CD8+, CD16+/CD56+ (Becton Dickinson, JAV). Papildomai buvo pridėti monokloniniai antikūnai prieš HLA-DR ir prieš CD25 (Becton Dickinson, Pharmingen, JAV), siekiant nustatyti aktyvuotų T limfocitų dalį. Naudotų antikūnų detali charakteristika pateikiama 1 lentelėje. Ląstelių surinkimas ir analizė atlikta BD FACS Canto tėkmės citometru (Becton Dickinson, JAV). Dviejų ir/ar trijų spalvų tiesioginės imunofluorescencijos reagentų rinkiniu nustatytas procentinis subrendusių ir diferencijuotų limfocitų potipių kiekis.

1 lentelė. Tyrimams naudoti monokloniniai antikūnai

Eil. Nr.

mAk (CD

numeris) Izotipas Klonas Fluorochromas

1. CD45 Ms IgG1, κ 2D1 FITC 2. CD14 Ms IgG2b, κ MφP9 PE 3.* IgG1/ IgG2a Ms IgG1, κ Ms IgG2a, κ X40 X39 FITC PE 4. CD3 Ms IgG1, κ SK7 FITC 5. CD19 Ms IgG1, κ 4G7 PE 6. CD4 Ms IgG1, κ SK3 PE 7. CD8 Ms IgG1, κ SK1 PE 8. CD16 Ms IgG1, κ B73.1 PE 9. CD56 Ms IgG1, κ MY31 PE

10. CD25 Ms IgG1, κ M-A251 APC

11. HLA-DR Ms IgG1, κ L243 PerCP

Ms – pelės antikūnai (angl. mouse); IgG1, κ – imunoglobulino sunkiosios G1 ir lengvosios κ

grandinės; * kontroliniai antikūnai prieš žmogaus ląstelių neekspresuojamus antigenus.

Ėminio paėmimas ir laikymas: Žr. 2.2.1 skyrelį.

Tyrimo eiga:

1. Kiekvienam pacientui buvo paruošti ir sužymėti šeši mėgintuvėliai (A–F), į kuriuos atitinkamai pridėta 20 µl reagentų A–F (2 lentelė).

2 lentelė. Tyrimams naudoti reagentai

Reagentas Komponentas A CD45/CD14 B IgG1/ IgG2a C CD3/CD19 D CD3/CD4/CD25 E CD3/CD8/HLA-DR F CD3/CD16/CD56

2. Vėliau į kiekvieną mėgintuvėlį buvo įpilta 100 µl gerai sumaišyto tiriamojo kraujo. Mėgintuvėliai 3s atsargiai maišyti purtykle (Vortex Genie 2, Scientific Industries, JAV) ir inkubuoti 30 min. kambario temperatūroje (20–25°C), mėginius saugant nuo tiesioginės šviesos.

3. Po to į kiekvieną mėgintuvėlį įpilta reagento G (1X BD FACS lizavimo tirpalo), mėgintuvėliai atsargiai sumaišyti ir inkubuoti 10–12 min. kambario temperatūroje (20–25°C) tamsoje.

4. Iš karto po inkubacijos mėginiai buvo centrifuguojami 300xg greičiu 5 min. kambario temperatūroje (Eppendorf 5810 centrifuga, Vokietija).

5. Nucentrifugavus, supernatantas nusiurbtas, mėgintuvėlyje paliekant apie 50 µl skysčio. Ląstelės resuspenduotos likusiame skystyje ir į mėgintuvėlius prideta 2 ml BD CellWASH buferio. Mėginiai sumaišyti purtykle, švelniai purtant 3s, ir centrifuguoti 200xg greičiu 5 min. kambario temperatūroje.

6. Vėl nusiurbtas supernatantas, ląstelės resuspenduotos ir pridėta 0,5 ml BD CellFIX tirpalo. Mėginiai kruopščiai sumaišyti ir iki analizės laikyti 2–8°C temperatūroje tamsoje ne ilgiau nei 24 val.

Mėginiai tirti BD FACS Canto tėkmės citometru (Becton Dickinson, JAV). Duomenų rinkimui ir analizei buvo naudojama BD FACSDiva programinė įranga (Becton Dickinson, JAV). Bendras surinktų ląstelių skaičius mėginyje – 10000, minimaliai 2000 limfocitų regione. Fiksuojant monochromatinę lazerio priekinę (PŠS) ir šoninę šviesos sklaidą (ŠŠS), įvertinamos ląstelių morfologinės savybės, pagal kurias periferinio kraujo ląstelės taškinėje diagramoje išsidėsto skirtinguose regionuose. CD45/CD14 mAk naudoti siekiant tiksliau apibrėžti ir įvertinti limfocitų regioną šviesos sklaidos diagramoje, kurioje limfocitai atskiriami nuo granuliocitų, monocitų, ląstelių nuolaužų, nelizuotų eritrocitų ir eritrocitų su branduoliais.

Įvertinus CD45/CD14 diagramą, taškinėje priekinės ir šoninės šviesos sklaidos diagramoje pasirinktas/koreaguotas dominantis limfocitų populiacijos regionas (angl. gate) (2 pav.)

2 pav. Tėkmės citometrijos duomenų analizė

Duomenys pateikti taškinėmis diagramomis. A – limfocitų regiono pasirinkimas taškinėje diagramoje pagal priekinę (angl. FSC – forward scatter) ir šoninę (angl. SSC – side scatter) šviesos sklaidą; B – žymenų ekspresijos

ribų koregavimas pagal izotipinę kontrolę; C – taškinė diagrama atspindinti CD19 (Q1 kvadrate) ir CD3 (Q4 kvadrate) žymenų teigiamą ekspresiją; D – taškinė diagrama atspindinti dvigubą CD4 ir CD3 (Q2 kvadrate) žymenų

teigiamą ekspresiją.

Limfocitų populiacijos potipiai identifikuoti įvertinus potipiui specifinių CD žymenų ekspresiją. Neigiamos ir teigiamos žymenų ekspresijos ribos koreaguotos pagal neigiamą izotipinę kontrolę. Nustatytas skirtingų limfocitų potipių kiekis procentais nuo bendro limfocitų populiacijos skaičiaus,

A B

skaičiuojant ląsteles, kurių žymenų ekspresija pagal neigiamą izotipinę kontrolę viršija nustatytos ekspresijos ribas (2 pav.)

Absoliutus limfocitų potipių kiekis apskaičiuotas naudojantis formule (1):

Limfocitų potipis x 109_{/l = bendras limfocitų kiekis (x10}9_{/l) x limfocitų potipis (proc.) / 100 proc. (1)}

2.2.3 Žmogaus leukocitų antigeno B27 (HLA-B27) nustatymas

Žmogaus leukocitų antigenas B27 buvo nustatytas tėkmės citometrijos metodu, nadojantis BD FACS Canto tėkmės citometru (Becton Dickinson, JAV) ir BD™ HLA-B27 reagentų rinkiniu (Becton Dickinson, JAV).

Ėminio paėmimas ir laikymas: Žr. 2.2.1 skyrelį.

Tyrimo eiga:

Mėginiai ruošti kambario temperatūroje (20–25°C), naudojant kambario temperatūros reagentus. 1. Į pažymėtus mėgintuvėlius pridėta 30 µl reagento A ir 50 µl gerai išmaišyto tiriamojo kraujo.

Mėgintuvėliai atsargiai sumaišyti purtykle (Vortex Genie 2, Scientific Industries, JAV) ir inkubuoti 20 min. tamsoje. Reagentas A – mAk prieš HLA-B27, žymėti FITC, izotipas Ms IgG1,

κ, klonas GS145.2; CD3 mAk, žymėti PE, izotipas Ms IgG1, κ, klonas SK7.

2. Po inkubacijos į mėgintuvėlius įpilta 2 ml 1X BD FACS lizavimo tirpalo, mėginiai vėl gerai išmaišyti ir inkubuoti 10 min. kambario temperatūroje.

3. Vėliau mėginiai centrifuguoti 300xg greičiu 5 min. kambario temperatūroje (Eppendorf 5810 centrifuga, Vokietija), supernatantas nupiltas ir ląstelės resuspenduotos likusiame skystyje.

4. Toliau ląstelės buvo plaunamos BD CellWASH plovimo tirpalu: į kiekvieną mėgintuvėlį pridėta 2 ml plovimo tirpalo, mėginiai gerai išmaišyti ir centrifuguoti 200xg greičiu 5 min. kambario temperatūroje.

5. Po to, supernatantas nupiltas, ląstelės resuspenduotos likusiame skystyje ir pridėta 0,25 ml BD CellFIX tirpalo. Mėginius būtina kruopščiai sumaišyti. Taip paruošti mėginiai iki analizės laikyti 2–8°C temperatūroje tamsoje ne ilgiau nei 24 val.

Prieš HLA-B27 tyrimą tėkmės citometras buvo kalibruojamas. Tam tikslui naudoti HLA-B27 kalibracijos rutuliukai. Į 12 x 75 mm tyrimo mėgintuvėlius buvo pridedama 1 ml BD FACSFlow

skiediklio ir 2 lašai rutuliukų. Rutuliukų suspensija gerai sumaišoma purtykle. Šis mėginys tirtas tėkmės citometru naudojantis BD FACSCanto programine įranga. Programinė įranga nustato tinkamus įrangos nustatymus ŽLA-B27 tyrimui.

Paruošti tiriamieji mėginiai analizuojami po tėkmės citometro kalibracijos. Gauti duomenys analizuoti automatinėse analizės BD FACSCanto programine įranga (Becton Dickinson, JAV). Taškinėje CD3/šoninės šviesos sklaidos diagramoje buvo pasirinktas T limfocitų regionas. T limfocitų populiacija pateikta dažnio histograma, buvo apskaičiuota tiriamojo mėginio LMF (angl. units of log median fluorescence) vertė. Mėginių, kurių mediana buvo mažesnė nei nustatyta HLA-B27 žymens vertė, nurodyta ant kalibracinių rutuliukų pakuotės, rezultatai laikyti HLA-B27 neigiamais. Mėginių, kurių mediana buvo lygi ar didesnė nei nustatyta žymens vertė, rezultatai laikyti HLA-B27 teigiamais.

2.2.4 C-reaktyviojo baltymo nustatymas kraujo plazmoje

Ėminio paėmimas ir laikymas:

Periferinis kraujas tyrimui buvo imamas standartinėmis sąlygomis periferinės venos punkcijos metu į vakuuminius mėgintuvėlius ličio heparinu (Vacutainer ®, BD, JAV). Ėminys iki tyrimo laikytas 15–25 °C temperatūroje, plazma atskirta centrifuguojant 1500xg greičiu 10 min.

Tyrimo eiga:

C-reaktyvusis baltymas (CRB) tiriamujų pacientų kraujo plazmoje buvo nustatytas klinikinės chemijos automatine sistema SYNCHRON UniCel® DxC 800 (Beckman Coulter, JAV). CRB plazmoje nustatytas naudojant turbidimetrinį metodą. Reakcijos mišinyje vykstant CRB ir jam specifinių antikūnų sąveikai, susiformavo netirpūs antigeno-antikūno kompleksai, dėl kurių susidarymo keitėsi mišinio šviesos absorbcija. Absorbcija buvo matuojama naudojant 340 nm bangos ilgio šviesos šaltinį. Šviesos absorbcijos pokytis proporcingas CRB kiekiui tiriamajame mėginyje. Automatinė sistema CRB koncentraciją apskaičiavo pagal kalibracinę kreivę (matavimo vienetai mg/l).

2.2.5 Eritrocitų nusėdimo greičio nustatymas

Kraujas tyrimui imtas į mėgintuvėlį su natrio citratu. Eritrocitų nusėdimo greitis (ENG) buvo tirtas Westergren‘-o metodu naudojant Sedi-15automatinį analizatorių (Becton Dickinson, JAV).

2.3 Statistinė duomenų analizė

Statistinei duomenų analizei buvo naudota IBM SPSS Statistics 21.0 programa (IBM corp., JAV). Duomenų pasiskirstymas pagal Gauss‘-o skirstinį tikrintas naudojant Shapiro-Wilks testą. T-testas buvo naudotas lyginant kiekybinius kintamuosius, kurie tenkino normaliojo pasiskirtymo prielaidą. Kintamiesiems, kurie neatitiko normalumo sąlygos, naudoti neparametriniai statistiniai kriterijai. Dviems grupėms lyginti naudotas Mann Whitney U testas, daugiau nei dviems – Kruskal Walis testas. Ryšiams tarp parametrų įvertinti naudoti Spearman arba Pearson koreliacijos testai (atsižvelgiant į tai ar kintamieji tenkino normalumo prielaidą). Statistiškai reikšmingais laikyti skirtumai, kurių p reikšmė < 0,05. Kiekybiniai kintamieji buvo pateikti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SN), kokybiniai kintamieji – dažniu ir procentais.