LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
Rima Ramonaitė
EPITELIO LĄSTELIŲ
NADPH OKSIDAZĖS VAIDMUO ŽARNŲ
UŽDEGIMO PATOGENEZĖJE
Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,
biologija (01B)
Disertacija rengta 2009–2014 metais Lietuvos sveikatos mokslų univer-sitete.
Mokslinis vadovas
Prof. habil. dr. Limas Kupčinskas (Lietuvos sveikatos mokslų univer-sitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)
Konsultantė
Prof. Dr. Vilmantė Borutaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
ĮVADAS ... 7
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Opinis kolitas ... 10
1.2. Opinio kolito patogenezė ... 12
1.2.1. Uždegimo procesus reguliuojančių mechanizmų pakitimai žarnų epitelio ląstelėse ... 12
1.2.2. Imuninio atsako sutrikimai... 14
1.2.3. Žarnų mikroflora ... 15
1.2.4. Genetiniai veiksniai ... 16
1.2.5. Aplinkos veiksliai ... 17
1.3. Eksperimentiniai gyvūnų žarnų uždegimo modeliai ... 18
1.4. Natrio dekstano sulfato sukeltas kolitas ... 19
1.5. Reaktyvios deguonies formos ... 21
1.6. Išoriniai veiksniai, sąlygojantys reaktyvių deguonies formų susidarymą ... 21
1.7. Vidiniai veiksniai, sąlygojantys reaktyvių deguonies formų susidarymą ... 22
1.8. Reaktyvių deguonies formų biologinės funkcijos ... 23
1.9. NADPH oksidazių baltymų šeima ... 24
1.10. Nox baltymų funkcijos ir pasiskirstymas audiniuose ... 26
1.11. NOX raiškos reguliavimas audiniuose ... 29
1.12. NOX1 genas ir jo raiška žarnų epitelio ląstelėse ... 31
1.13. Nox1 vaidmuo opinio kolito patogenezėje ... 32
2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI ... 36
2.1. Tiriamasis kontingentas ... 36
2.1.1. Pacientai ... 36
2.1.2. Gyvūnai ... 36
2.2. Tyrimo metodai ... 37
2.2.1. Natrio dekstano sulfato sukeltas kolitas ... 37
2.2.1.1. Kolito sukėlimas BALB/c linijos pelėms ... 37
2.2.1.2. Klinikinių ir morfologinių kriterijų įvertinimas ... 38
2.2.1.3. Histologinių kriterijų įvertinimas ... 38
2.2.2. Žmogaus žarnų epitelio ląstelių skyrimas ir kultivavimas ... 38
2.2.3. Pelių žarnų epitelio ląstelių skyrimas ir kultivavimas ... 41
2.2.4. Žarnų epitelio ląstelių gyvybingumo įvertinimas ... 43
2.2.5. Reaktyvių deguonies formų kiekio nustatymas žarnų epitelio ląstelių kultūrose ... 43
2.2.7. Genų raiškos vertinimas pelių žarnų epitelio ląstelėse ... 46
2.2.7.1. Mėginio paruošimas ... 46
2.2.7.2. Ribonukleino rūgščių skyrimas ... 46
2.2.7.3. Ribonukleino rūgščių kiekio ir grynumo įvertinimas. ... 48
2.2.7.4. Kopijinės deoksiribonukleorūgšties (cDNR) ruošimas ... 49
2.2.7.5. Genų raiškos tyrimas... 50
2.3. Statistinė analizė ... 53
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 54
3.1. Natrio dekstano sulfato sukeltas kolitas ... 54
3.1.1. Klinikinių ir morfologinių kriterijų įvertinimas ... 54
3.1.2. Histologinių kriterijų įvertinimas ... 55
3.2. Ląstelių gyvybingumo įvertinimas ... 57
3.2.1. Pelių storosios žarnos epitelio ląstelių gyvybingumo įvertinimas ... 57
3.2.2. Pelių storosios žarnos epitelio ląstelių kultūros grynumo įvertinimas ... 59
3.2.3. Žmogaus gaubtinės žarnos epitelio ląstelių gyvybingumo įvertinimas ... 60
3.3. Reaktyvių deguonies formų kiekio įvertinimas žarnų epitelio ląstelių kultūrose ... 62
3.3.1. Reaktyvių deguonies formų kiekio įvertinimas pelių storosios žarnos epitelio ląstelių kultūroje ... 62
3.3.2. Reaktyvių deguonies formų kiekio įvertinimas žmogaus gaubtinės žarnos epitelio ląstelių kultūroje ... 64
3.4. TNF-α kiekio įvertinimas žarnų epitelio ląstelių kultūrose ... 66
3.4.1. TNF-α kiekio įvertinimas pelių žarnų epitelio ląstelių kultūroje ... 66
3.4.2. TNF-α kiekio įvertinimas žmogaus žarnų epitelio ląstelių kultūroje ... 67
3.5. Nox1 raiškos įvertinimas pelių žarnų epitelio ląstelių kultūroje ... 69
4. TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS ... 70
IŠVADOS ... 75
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 76
PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 90
SANTRUMPOS
BMP4 Kaulų morfogenetinis baltymas 4
CD14 Diferenciacijos klasteris 14 Cd3e T limfocitų žymuo
Cd68 Makrofagų/ monocitų žymuo
cDNR Kopijinė deoksiribonukleorūgštis
CDX1 Homeodomeną turintis transkripcijos veiksnys 1 DMEM „Dulbeko pakeista Eagle“ terpė
DMSO Dimetilsulfoksidas
DNR Deoksiribonukleorūgštis
DPI Difenilenojodonio chloridas
DSS Natrio dekstano sulfatas
EDTA Etilendiamino-tetraacetatas EGTA Etilenglikolio tetraacto rūgštis
ELISA Imunofermentinis tyrimų metodas
FCS Fetalinis galvijų serumas
GATA Globino transkripcijos veiksnys gp91phox NADPH oksidazės subvienetas HNF-1α Kepenų branduolio veiksnys-1 alfa IFN-γ Interferonas-gama
IL Interleukinas
IRAK Interleukino receptorių jungianti kinazė
IRF Interferoną reguliuojantis transkripcijos veiksnys
LPS Lipopolisacharidas
MD-2 Limfocitų baltymas 96
MyD88 Mieloidinis pirminės diferenciacijos baltymas 88 NF-κB Branduolio veiksnys-kappa B
NOD Nukleotido oligomerizacijos domenas
Nox NADPH oksidazė
Noxa1 NADPH oksidazės aktyvatorius 1
Noxo1 NADPH oksidazės organizatorius 1
Nrf2 Eritroidinės kilmės transkripcijos veiksnys 2
OK Opinis kolitas
p22phox NADPH oksidazės subvienetas p40phox NADPH oksidazės subvienetas p47phox NADPH oksidazės subvienetas p67phox NADPH oksidazės subvienetas
PAF Trombocitų aktyvinimo veiksnys
Ptprc Hemopoetinių ląstelių žymuo
Rac Mažos molekulinės masės G baltymas
RNR Ribonukleino rūgštis
ROS Reaktyvios deguonies formos
RT-PCR Tikralaikė polimerazės grandininė reakcija
STAT Signalus perduodantis ir transkripciją aktyvuojantis baltymas TGF-β Transformuojantis augimo veiksnys-beta
TIR-1 „Varpelio“ tipo /interleukino 1 receptoriaus domenas TLR „Varpelio“ tipo receptoriai
TNF-α Navikų nekrozės veiksnys-alfa Tollip TLR slopinantis baltymas
TRAF6 Navikų nekrozės veiksnio receptorius jungiantis baltymas
UŽL Uždegiminės žarnų ligos
ĮVADAS
Opinis kolitas (OK) – tai lėtinė daugiaveiksmė uždegiminė žarnų liga (UŽL), pasireiškianti storosios žarnos gleivinės ir pogleivio pažeidimais [9, 31, 130]. OK atsiradimą lemia sudėtinga genetinių, imunologinių ir aplinkos veiksnių sąveika, sąlygojusi pakitimus bakterijų atpažinimo bei sunaikinimo procesuose, vykstančiuose žarnų epitelio ląstelėse [4, 9]. Tačiau tikslūs etiologiniai ir patogeniniai mechanizmai, sukeliantys OK vystymąsi, nėra aiškūs.
Moksliniai tyrimai parodė, kad oksidacinį stresą sukeliančios reaktyvios deguonies formos (angl. reactive oxygen species, ROS) yra svarbios UŽL patogenezėje. NADPH oksidazės šeimos fermentai (Nox1, Nox2, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1 ir Duox2) – svarbus ROS šaltinis organizme [24, 50, 91]. Šių fermentų gaminamos ROS molekulės veikia kaip antriniai signalų nešikliai, kurie aktyvina bei reguliuoja įvairius biologinius procesus, tokius kaip augimas, ląstelių diferenciacija, uždegimas ar apoptozė. Nox2 pirmiau-siai buvo nustatytas fagocituose. Vėliau atrastos naujos Nox izoformos (Nox1, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1 ir Duox2), esančios kituose audiniuose [6, 24, 91]. Nox1, savo struktūra artimas Nox2, jis randasi gaubtinės žarnos ir virškinamojo trakto barjeriniuose audiniuose, turinčiuose tiesioginį kon-taktą su žarnų simbiotinėmis bei patogeninėmis bakterijomis. Todėl mano-ma, kad Nox1 biologinės funkcijos gali būti susijusios su įgimtais apsaugi-niais, gynybiniais mechanizmais, ląstelės signaliniais keliais bei virškina-mojo trakto uždegiminių ligų patogeneze [24, 91]. Kurį laiką buvo nežino-ma, kokie saviti mikroorganizmų regionai, sąveikaudami su enterocitais, lemia Nox fermentinės sistemos aktyvaciją. Kol 2005 metais Kavahara su kolegomis nustatė, jog lipopolisacharidas (LPS), išskirtas iš Helicobacter pylori bakterijų, aktyvuoja nuo Nox1 priklausomą ROS sintezę per „varpe-lio“ tipo receptoriaus 4 (TLR4) signalinį kelią jūrų kiaulyčių skrandžio epitelio ląstelėse. Atlikti bandymai su T84 ląstelių linijomis atskleidė, kad uždegiminiai citokinai interferonas gama (IFN-γ), interleukinas 18 (IL-18) ir navikų nekrozės veiksnys-alfa (TNF-α), kurie sintetinami aktyvinus branduolio veiksnį-kapa B (angl. nuclear factor-kappa B, NF-κB), gali skatinti žmogaus NOX1 geno transkripciją. Priešingą poveikį NOX1 raiškai žarnų epitelio ląstelėse turi priešuždegiminiai citokinai, t.y. transformuo-jantis augimo veiksnys-beta (TGF-β) ir IL-10 efektyviai slopinantys inter-ferono-gama (IFN-γ) sintezę [24, 60, 83, 169]. Taigi uždegiminių ir prieš-uždegiminių citokinų gebėjimas reguliuoti NOX1 raišką žarnų epitelio ląs-telėse leidžia manyti, kad šis fermentas yra svarbus uždegiminių ligų patogenezei.
Pastaraisiais dešimtmečiais vis plačiau pradedami naudoti gyvūnų eksperimentiniai modeliai, atliekant daugiaveiksmių ligų tyrinėjimus. 1990 metais Okayasu ir kt. pirmą kartą aprašė eksperimentinį pelių natrio dekstrano sulfato (angl. Dextran sodium sulfate, DSS) kolito modelį [120]. DSS vartojimas per os, priklausomai nuo dozės ir girdymo laikotarpio, sukelia ūminį arba lėtinį žarnų uždegimą, kurio klinikiniai simptomai bei histopatologiniai pokyčiai artimi žmogui. DSS veikia kaip antigenas, sąlygodamas uždegimines reakcijas storosios žarnos audiniuose, kurių metu pažeidžiamas gleivinės vientisumas, aktyvuojama uždegiminių mediatorių sintezė ir stimuliuojama imunimių ląstelių migracija žarnų gleivinėje [15, 103, 127]. Taigi šis eksperimentinis gyvūnų modelis gali būti sėkmingai naudojamas, siekiant išsiaiškinti žarnų uždegimo molekulinius mechaniz-mus, ištirti su uždegimo progresavimu susijusius veiksnius bei vystyti nau-jas OK terapijos priemones.
Darbo tikslas ir uždaviniai
Darbo tikslas – ištirti epitelio ląstelių NADPH oksidazės reikšmę žarnų
uždegimo patogenezei, sergant opiniu kolitu ir DSS sukeltu kolitu.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti NADPH oksidazės slopiklio apocianino poveikį žmogaus ir pelių žarnų epitelio ląstelių kultūros gyvybingumui.
2. Palyginti reaktyvių deguonies formų (tarpląstelinio vandenilio per-oksido) gamybą bei jos kitimus DSS sukeltu kolitu sergančių ir kontrolinės grupės pelių žarnų audiniuose ir epitelio ląstelių kul-tūroje.
3. Palyginti reaktyvių deguonies formų (tarpląstelinio vandenilio per-oksido) gamybą bei jos kitimus opiniu kolitu sergančių ligonių ir kontrolinės grupės asmenų žarnų gleivinės audiniuose ir epitelio ląstelių kultūroje.
4. Ištirti TNF-α kiekį žmogaus ir pelių žarnų epitelio ląstelių kultūroje bei įvertinti šio uždegiminio citokino kiekio pokyčius, esant žarnų uždegimui bei lipopolisacharido ir NADPH oksidazės slopiklio apocianino poveikyje.
5. Ištirti Nox1 geno raišką pelių žarnų epitelio ląstelėse ir įvertinti raiškos pokyčius esant žarnų uždegimui.
Darbo aktualumas ir naujumas
Lietuvos sveikatos mokslų universitete Gastroenterologijos klinikoje jau nuo 2001 metų atliekami epidemiologiniai [88, 186] genetiniai [8, 159], imunologiniai [168] UŽL moksliniai tyrimai. Gastroenterologijos klinikos mokslininkų grupė kartu su užsienio bendradarbiais vykdė išsamius gene-tinius tyrimus, nustačiusius genų polimorfizmus, lemiančius polinkį susirgti OK bei parodžiusius sudėtingą OK patogenezę, kai kelių genų tarpusavio sąveika sąlygoja OK vystymąsi [8, 159, 167]. Atlikta unikali sveikų ir OK sergančių dvynių studija atskleidė, kad tarp žmogaus genomo ir mikrobiomo yra glaudi sąveika (žarnų mikroorganizmai veikia genų raišką žarnų gleivi-nės ląstelėse), kuri pažeidžiama, sergant OK [93]. Pradėti darbai, nagrinė-jantys mikrobiomą, ir toliau sėkmingai tęsiami kartu su Christian-Albrecht universiteto mokslininkais, (Kylis, Vokietija). 2008 metais atliktas pirmasis tyrimas, nagrinėjantis TLR4 svarbą UŽL etiopatogenezei („Molekulinis mikroorganizmų atpažinimo mechanizmas žarnyno epitelinio ląstelėse ir jo sąsaja su uždegiminių žarnų ligų etiopatogeneze“) [138]. Šis darbas paskatino tolimesnius UŽL signalinių kelių tyrimus.
Šiuo metu yra ištirti genai, koduojantys Nox fermentus, ir jų lokali-zacijos vietos, tačiau trūksta žinių apie Nox raiškos ypatumus audiniuose, aktyvinimo būdus bei galimas biologines funkcijas. Daugelis mokslinių tyrimų, nagrinėjančių Nox biologines funkcijas, atlikti naudojant vėžines ląstelių linijas, o ne pirmines ląstelių kultūras. Iki šiol nėra pilnai išaiškinti Nox valdomi signaliniai keliai bei šių fermentų aktyvinimo mechanizmai žarnų epitelio ląstelėse. Nors mokslinių darbų, rodančių galimą Nox įtaką UŽL etiopatogenezei, daugėja, tikslus Nox veikimo mechanizmas enteroci-tuose uždegimo metu vis dar nenustatytas.
Mūsų darbas atskleidė Nox svarbą žarnų uždegimo patogenezei. Mes pirmieji parodėme, jog Nox fermentų slopinimas pasižymi uždegimą malši-nančiu poveikiu pirminėms žmogaus ir pelių žarnų epitelio ląstelėms in vitro. Gautos žinios leis praplėsti jau turimas teorines žinias apie uždegimo molekulinius mechanizmus bei prisidės, kuriant naujas OK terapijos prie-mones. Tyrimo rezultatai yra svarbūs tolimesnių biomedicinų mokslinių tyrimų plėtrai.
1.
LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Opinis kolitas
Opinis kolitas (OK) – lėtinė daugiaveiksmė uždegiminė žarnų liga (UŽL), pasireiškianti storosios žarnos gleivinės ir pogleivio pažeidimais (OMIM 191390) [31, 76, 92, 130, 158]. OK būdingi tokie klinikiniai simp-tomai kaip kraujavimas iš tiesiosios žarnos, pilvo srities skausmai, viduria-vimas, apetito praradimas ir kūno masės sumažėjimas [31, 82, 130]. Sergant OK, stebimi šie histologiniai žarnų audinių pokyčiai: gleivinės opos ir ero-zijos, kriptų struktūros pakitimai (kriptos šakotos, netolygaus pločio, nely-giagrečios), sumažėjęs taurinių ląstelių skaičius, mikroabscesai, edema, paviršinio epitelio regeneracija ir imuninių ląstelių (limfocitų, granulioctų, plazminių ląstelių) migracija į epitelį [87]. Paprastai žarnų gleivinės pažeidi-mai nėra gilūs ar labai dideli, tačiau retais atvejais jie gali apimti visus žar-nos sienelės sluoksnius (gleivinę, pogleivinę ar raumeninį sluoksnį) ir lemti mirtinas komplikacijas (storosios žarnos perforaciją, peritonitą ir kt.) [22, 44] Sergant OK gali būti randami ir ekstraintestinaliniai kitų organų sistemų pakitimai, t. y. artropatijos, pirminis sklerozuojantis cholangitas, mazginė eritema, gangreninė pioderma, episkleritas, uveitas, osteoporozė [40, 179]. Pacientams OK diagnozė patvirtinama, įvertinus klinikinius, radiologinius, endoskopinius bei histologinius kriterijus [45, 59, 64, 140, 141]. Šia liga dažniausiai serga jauni, darbingo amžiaus žmonės. Prognozė pacientams, sergantiems OK, dažniausiai yra gera, su maža kolektomijos tikimybe per pirmąjį dešimtmetį po ligos diagnozavimo [42, 44]. Nepaisant to, OK tęsiasi visą gyvenimą, periodiškai paūmėja, sąlygoja pacientų gyvenimo kokybę, mirštamumą bei hospitalizacijų skaičių [31, 40, 44]. Ligos sunkumas gali priklausyti ir nuo paciento amžiaus diagnozės metu: vaikams būdinga daug sunkesnė OK eiga su dažnais paūmėjimais ar gydymo netoleravimu [180].
2005 metais Monrealyje patvirtinta nauja OK klasifikacija. Ja remiantis, ligos fenotipas, įvertinus ligos sunkumą ir anatominį uždegimo išplitimą, buvo suskirstytas į proktitą, kai uždegimas apima tik tiesiąją žarną (E1, angl. proctitis), kairės pusės kolitą, kai uždegimas apima kairiąją storosios žarnos pusę iki blužnies linkio (E2, angl. left side colitis), ir pankolitą, kai užde-gimas apima visą storąją žarną (E3, angl. pancolitis) [93]. Šiuo metu sukurta nemažai histologinius pokyčius vertinančių sistemų (angl. Riley, Keren, Odze, and, Danielsson scoring systems), leidžiančių diagnozuoti OK ir padedančių nustatyti ligos aktyvumą. Vis dėlto galutinė OK diagnozė patvirtinama tik įvertinus visus klinikinius, radiologinius, endoskopinius bei histologinius kriterijus [45, 59, 64, 140].
Nors mirtingumas nuo OK žemas, sergamumas šia liga pasaulio išsi-vysčiusiose šalyse yra didelis. Didžiausias naujų atvejų skaičius nustatomas išsivysčiusiose Vakarų šalyse. Sergamumas OK Šiaurės Amerikoje ir Euro-poje 100 000 gyventojų yra nuo 21 iki 246 žmonių. Europos regione OK paplitęs tarp Didžiosios Britanijos, Skandinavijos, Olandijos, Airijos, Vo-kietijos, Islandijos gyventojų. Aukštas sergamumo dažnis randamas ir ki-tuose pasaulio regionuose, t. y. JAV, Kanadoje bei Australijoje (OK papli-timo dažnis pavaizduotas 1.1.1 pav.) [27, 105, 115].
1.1.1 pav. Opinio kolito paplitimo dažnis pasaulyje [115]
Šiuo metu trūksta duomenų apie OK epidemiologiją besivystančiose šalyse. Kai kuriose Rytų ir Centrinės Europos šalyse (Vengrijoje, Kroatijoje ir kt.) stebimas smarkiai augantis OK dažnis tarp gyventojų, kuris tampa panašus į Vakarų Europos šalių dažnį. Tuo tarpu kitose Rytų ir Centrinės Europos šalyse, tokiose kaip Lenkija ir Rumunija, sergamumas OK išlieka žemas [105, 115]. Lietuvos populiacijoje, 2010 metų Kauno regiono registro duomenimis, 100 000 gyventojų tenka devyni nauji OK atvejai per metus.
Rasinių ir etninių pogrupių tyrimai atskleidė, jog OK dažniau serga Kaukazo bei Rytų Europos žydų kilmės individai [105, 115].
1.2. Opinio kolito patogenezė
Tikslūs patologiniai mechanizmai, atsakingi už OK patogenezę, nėra aiškūs. Manoma, kad šios ligos atsiradimą lemia sudėtinga genetinių, imu-nologinių ir aplinkos veiksnių sąveika, sąlygojusi bakterijų atpažinimo bei sunaikinimo procesų pakitimus, vykstančius žarnų epitelio ląstelėse [4, 9, 41, 122, 150].
Pagrindiniai veiksniai, susiję su OK patogeneze, yra šie:
1. Uždegimo procesus reguliuojančių sistemų pakitimai OK sergančių ligonių žarnų epitelio ląstelėse.
2. Imuninio atsako sutrikimai. 3. Žarnų mikrofloros pasikeitimas. 4. Genetiniai veiksniai.
5. Aplinkos veiksniai.
1.2.1. Uždegimo procesus reguliuojančių mechanizmų pakitimai žarnų epitelio ląstelėse
Žmogaus virškinamajame trakte randama daugybė – net apie 10–100 trilijonų mikroorganizmų (skrandyje – 103 bakterijų viename grame išmatų
masės, tuščiojoje žarnoje – 104
; klubinėje žarnoje – 105–108; gaubtinėje žarnoje – 1010
–1014 bakterijų), šis skaičius viršija mūsų kūno ląstelių skaičių daugiau nei dešimt kartų [18, 39, 55]. Taigi žarnų gleivinės paviršius, suda-rytas iš epitelio ląstelių, nuolat kontaktuoja su mikroorganizmais ir atlieka svarbią „barjero“ funkciją. Sveikų asmenų žarnų epitelio ląstelėse esančios struktūros atpažįsta bei atskiria patogeninius mikroorganizmus nuo simbio-tinių bakterijų, reguliuoja imuninės sistemos aktyvumą, dalyvauja bakterijas naikinančiuose procesuose [18, 175]. Tačiau sutrikus organizmo imuninės sistemos aktyvumo reguliacijai, net į normalią organizmo mikroflorą reaguo-jama aktyvuojant uždegiminius procesus, dėl to išsivysto sudėtingos imuno-loginės ir autoimuninės kilmės ligos, tokios kaip OK [39, 151, 175]. Nusta-tyta, kad OK metu uždegimo kontrolė sutrinka visuose žarnų homeostazę palaikančių sistemų reguliacijos lygiuose [9]. Epitelio ląstelėse pakinta apsauginių baltymų (mucinų, defencinų ir kt.), chemokinų, citokinų sintezė bei sumažėja epitelio jungtis formuojančių kompleksų kiekis (kateninai, kadherinai) [144, 151, 162, 176]. Tačiau svarbiausi pokyčiai randami bakte-rijų atpažinimą lemiančiuose mechanizmuose. Žarnų bakterijas, patogenus ir kitus antigenus atpažįsta molekulės, įsitvirtinusios ląstelių membranose, esančios ląstelės citoplazmoje, ar laisvos molekulės. „Varpelio“ tipo recep-toriai (angl. Toll-like receptors, TLR) – pagrindiniai įgimtos imuninės siste-mos elementai, kurie atpažįsta bakterinės, virusinės ir grybelinės kilmės
patogenines molekules [3, 75]. Sveikų asmenų epitelio plazminėje membra-noje galima aptikti tik labai nedidelius TLR (TLR2, TLR4) bei jų korecep-torių kiekius. Tokį TLR pasiskirstymą lipidų mikrodomenuose (angl. lipid rafts) nulemia simbiotinių bakterijų struktūrose randami uždegimo mediato-riai (bakterijų lipoproteinai, lipopolisacharidai (LPS) ir kt. medžiagos). Esant normaliomis fiziologinėmis sąlygomis, TLR, sąveikaudami su žarnų mikro-flora, sukelia signalų kaskadas, kurių metu gaminami apsauginiai baltymai. Tuo tarpu OK sergančių ligonių epitelio membranoje padidėjęs šių receptorių kiekis sąlygoja uždegiminių procesų aktyvaciją bei citokinų sintezės pusiausvyros sutrikimą [2, 144, 156, 160]. Kiti svarbūs receptoriai, dalyvau-jantys antigenų atpažinimo mechanizmuose, yra viduląsteliniai receptoriai – nukleotido oligomerizacijos domenai (angl. nucleotide oligomerization do-main, NOD). 2001 metais NOD2 genas aprašytas kaip vienas pirmų UŽL žymenų. Manoma, kad dėl NOD2 genų mutacijų Krono liga sergantiems pacientams sumažėja antimikrobinių peptidų išskyrimas bei sutrinka bakterijų sienelės komponentų „atpažinimas“, ir net į normalią organizmo mikroflorą reaguojama aktyvuojant uždegiminius signalus, kurių metu stimuliuojama branduolio veiksnio-kapa B (angl. nuclear factor-kappa B, NF-κB) raiška bei uždegiminių citokinų gamyba (patogenų atpažinimas žarnų epitelio ląstelėse pavaizduotas 1.2.1.1 pav.) [144, 178].
1.2.1.1 pav. Patogenų atpažinimas žarnų epitelio ląstelėse
Pastaba: A – sveikų asmenų epitelis (signalų kaskados, kurių metu gaminami apsauginiai baltymai). B – uždegiminėmis žarnų ligomis sergančių asmenų epitelis (signalų kaskados, kurių metu prarandama komensalinių bakterijų tolerancija, aktyvuojami uždegiminiai pro-cesai bei uždegiminių citokinų sintezė). NOD – nukleotido oligomerizacijos domenas TLR – „varpelio“ tipo receptoriai. NF-κB – branduolio veiksnys-kapa B. Paveikslas su-kurtas pagal [144].
1.2.2. Imuninio atsako sutrikimai
Normaliomis fiziologinėmis sąlygomis žarnų audiniuose palaikoma už-degiminių ir priešužuž-degiminių citokinų gamybos pusiausvyra. Citokinų sin-tezės pokyčiai siejami su UŽL patogeneze bei uždegimo aktyvumu audinuo-se. Uždegiminiai citokinai (IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, IL-17, IL-23, IFNγ, arba TNFα), dalyvaujantys UŽL patogenezėje, lemia uždegi -minių procesų vystymąsi žarnų gleivinėje bei turi įtakos šių susirgimų prog-resavimui. Priešingu poveikiu pasižymi priešuždegiminiai citokinai (IL-4, IL-10, IL-13), kurie, mažindami uždegiminių citokinų sintezę, slopina užde-gimą žarnų audiniuose. Moksliniai tyrimai parodė, kad Krono liga sergan-tiems pacientams būdingas Th1 limfocitų aktyvumo padidėjimas. Tuo tarpu Th2 limfocitų sąlygotas imuninis atsakas labiau siejamas su OK [43, 63, 96, 109, 185]. Citokinų sintezės pokyčiai, sergant UŽL, pavaizduoti 1.2.2.1 pav.
1.2.2.1 pav. Citokinų sintezės pokyčiai, sergant uždegiminėmis žarnų ligomis [109]
Pastaba: IL-1 – interleukinas 1, IL-4 – interleukinas 4, IL-5 – interleukinas 5, IL-6 – interleukinas 6, IL-8 – interleukinas 8, IL-10 – interleukinas 10, IL-12 – interleukinas 12, IL-13 – interleukinas 13, IL-17 – interleukinas 17, IL-18 – interleukinas 18, IL-19 – inter-leukinas 19, IL-21 – interinter-leukinas 21, IL-23 – interinter-leukinas 23, IL-25 – interinter-leukinas 25, IL-27 – interleukinas 27, IL-33 – interleukinas 33, IL-35 – interleukinas 35, TNF-α – navikų nekrozės veiksnys-alfa, TGF-β – transformuojantis augimo veiksnys-beta, TL1A – navikų nekrozės veiksnio ligandas 1A.
1.2.3. Žarnų mikroflora
Didžiausias mikroorganizmų skaičius randamas viškinamajame trakte, kur jų skaičius siekia 1014 ir viršija mūsų kūno ląstelių skaičių daugiau nei
dešimt kartų [18, 137]. Žmogaus žarnyne aptinkami simbiotiniai mikroorga-nizmai sąveikaudami su gleivinės struktūromis, palaiko žarnų homeostazę bei nulemia individualų imuninės sistemos aktyvumą [22]. Moksliniai tyrimai parodė, kad žmogaus žarnyną kolonizavusios anaerobinės bakterijos priklauso keturiems tipams (Bacteroides, Firmicutes, Actinobacteria, Pro-teobacteria), o susiformavusi mikrobiota yra pastovi [21, 39, 137]. Mikro-biota turi prisitaikantį ir atsinaujinantį metabolinį aktyvumą. Simbiotinių bakterijų gaminamos trumpos grandinės riebalų rūgštys teigiamai veikia žarnų epitelio ląstelių diferenciaciją, proliferaciją bei reguliuoja kitus meta-bolinius kelius [118, 148]. Tačiau mikrobiotos sudėtis gali greitai pasikeisti, veikiant žalingiems aplinkos veiksniams, tokiems kaip chirurginės proce-dūros, cheminės medžiagos, antibiotikai, antiseptikai, antihistaminiai prepa-ratai, pramoniniai teršalai, pesticidai, radiacija ar stresas [115, 137]. Bada-vimas, mitybos raciono kaita, hormonų veiklos sutrikimai taip pat turi įtakos mikrofloros pokyčiams žarnyne. Baterijų ekosistemos pakitimai sąlygoja
žarnų barjerinės funkcijos sutrikimus, kurie skatina patologinio uždegimo pradžią [115, 157]. Neseniai atlikti darbai atskleidė, jog OK sergantiems ligoniams būdingas simbiotinų bakterijų rūšių įvairovės ir kiekio sumažė-jimas, ypač Bifidobacteria, Lactobacilli, Bacteroides ir Firmicutes rūšių, ir sąlyginai patogeninių ir patogeninių bakterijų padidėjimas (Escherichia coli, Mycobacteria) [115].
1.2.4. Genetiniai veiksniai
Moksliniai tyrimai atskleidė, jog genetiniai veiksniai atlieka svarbų vaidmenį OK patogenezėje [8, 41, 150, 185]. Viso genomo analizės (angl. Genome-wide scanning studies) dėka išaiškinti UŽL vystymąsi lemiantys genų lokusiai (IBD1-9). IBD3, IBD6, IBD7, esantys 6, 19, 1 chromosomose (6p, 19p, 1p), įvardinti kaip atsakingi už abiejų šių susirgimų, t. y. Krono ligos ir OK atsiradimą. IBD1, IBD4, IBD5, randami 16, 14 ir 5 chromoso-mose (16q, 14q, 5q31), buvo susiję su Krono ligos, o 12 chromosomoje (12q) esantis IBD2 – su OK patogeneze. 2001 metais nustatytas vienas pirmųjų UŽL žymenų NOD2. Tolimesni meta-analizės darbai (angl. Geno-me-Wide Association Studies, GWAS) parodė, kad net 118 genų polimor-fizmų sąlygoja polinkį susirgti UŽL, iš kurių net 71 prisidėjo prie Krono ligos ir 47 – prie OK vystymosi [8, 77, 166, 185]. Nemaža dalis OK lemian-čių genų polimorfizmų yra genuose, atsakinguose už ląstelių struktūras, kurios reguliuoja žarnyno mikroorganizmų atpažinimo, bakterijų naikinimo, citokinų sintezės molekulinius mechanizmus [77, 166, 173, 185]. Pagrin-diniai genai, atsakingi už UŽL atsiradimą bei ligų progresavimą, pavaiz-duoti 1.2.4.1 lentelėje.
1.2.4.1 lentelė. Genai dalyvaujantys uždegiminių žarnų ligų patogenezėje [173]
Su opiniu kolitu
susiję genai Su Krono liga susiję genai Su uždegiminėmis žarnų ligomis susiję genai
ECM1, ARPC2 IL10, HNF4 IFN, CDH1 IL22, IL26 FCGR2A 13q12, 1p36 IL2/IL21, 13q13 IL17REL/PIM3 CARD9 CAPN10/GPR35 CEP72/TPPP LAMB1/SCL26A3 OTUD3/PLA2G2E SMURF1/KPNA7 NOD2, GCKR, LRRK2 ATG16L1, SLC22A23 NLRP3, ZNF365 PTPN22, CCR6 1q24, 1q32 6q21, 6q25 7p12, 8q24 13q14, 18q11 ICOSLG, ITLN1 GPX4, ORMDL3 CCL2/CCL7/CCL11/CCL8 IL23R, JAK2 IL12/p40, LYRMA4 CDKAL1, STAT3 TNFRSF6B(DCR3) NKX23, PSMG1 3p21/MST1 CCNY, IL27 REL/PUS10 ZMIZ1, IBD5 MTMR3, PUS10 IRGM, PTGER4 TNFSF15(TL1A) ORMDL3 19q13, 21q21 HORMAD2/MTMR3
Tyrimai, nagrinėjantys su OK susijusius genetinius veiksnius, toliau tęsiami. Pastaruoju metu pasirodo vis daugiau darbų, atskleidžiančių sudė-tingą OK patogenezę, kai kelių genų tarpusavio sąveika sąlygoja OK vysty-mąsi ar šios ligos progresavimą [159].
1.2.5. Aplinkos veiksliai
UŽL paplitimas įvairiuose pasaulio regionuose siejamas su socialine bei ekonomine pažanga. Epidemiologiniai tyrimai parodė, kad UŽL sergamumo dažnis pirmiausiai pradėjo augti išsivysčiusiose pasaulio šalyse, esančiose Šiaurės Amerikoje bei Šiaurės Europoje, vėliau sergamumas UŽL didėjo ir likusioje Europos dalyje bei Pietų Amerikoje. Dabartiniu metu stebimas OK ligos atvejų skaičiaus augimas Azijos regione (Japonijoje, Korėjoje, Hon-konge), tačiau sergamumas Krono liga šiame regione vis dar išlieka nedi-delis ir stabilus [41, 115]. Taigi UŽL plitimo ypatumai sutapo su socialine bei ekonomine pažanga šiose šalyse. Norint paaiškinti OK ir Krono ligos plitimo ypatumus, buvo iškelta „higienos hipotezė“, teigianti jog didėjantį sergamumą UŽL galėjo lemti žmonių higienos sąlygų gerėjimas, platus vakcinų ir antibiotikų naudojimas, griežta maisto kontrolė bei sumažėjęs sergamumas infekcinėmis bei parazitinėmis ligomis. Laipsniškas sergamu-mo infekcijomis mažėjimas vaikystėje prisideda prie autoimuninių, alergi-nių, lėtinių ar uždegiminių susirgimų, tokių kaip OK ar Krono liga, atsira-dimo. Imuninės sistemos aktyvumo reguliacijos mechanizmų sutrikimai
sąlygoja ilgai besitęsiantį uždegiminį atsaką, kurio metu ligos sukėlėjai nėra sunaikinami arba sutrikdomas bakterijų struktūrų „atpažinimas“, kai net į normalią mikroflorą reaguojama aktyvuojant uždegiminius procesus žarnų audiniuose [41, 114, 115]. Su padidėjusia rizika sirgti UŽL ar šių ligų pa-ūmėjimu siejami ir kiti aplinkos veiksniai, tokie kaip mityba, rūkymas, vaistai (antibiotikai, oraliniai kontraceptikai, nesteroidiniai priešuždegimi-niai vaistai), gyvenamoji vieta bei stresas. Nustatytos galimos sąsajos tarp gyvenamosios vietos ir UŽL sergamumo dažnio, t. y. miesto gyventojai daž-niau serga UŽL nei kaimo vietovėse gyvenantys asmenys. Moksliniai darbai parodė, jog mitybos įpročiai taip pat turi įtakos UŽL atsiradimui, kaip rizikos veiksniai įvardinti „greitą maistą“ teikiančių užkandinių siūlomi gaminiai, vaisvandeniai („cola“ gėrimai), gyvulinės kilmės baltymai ir rie-balai, omega-6 polinesočios riebalų rūgštys, margarinas, raudona mėsa. Šių produktų per didelis kiekis racione sąlygoja žarnyno barjero pažeidimus bei mikrobiotos pokyčius. Tuo tarpu vaisių, daržovių, žuvies, omega-3 poline-sočiųjų riebalų rūgščių vartojimas bei kūdikių žindymas motinos pienu sumažina riziką sirgti UŽL. Europos ir Azijos regionų atvejo – kontrolės (angl. Case-control studies) tyrimai atskleidė, kad apendektomija apsaugoja nuo OK vystymosi, ypač jei diagnozuojamas apendicitas ar limfadenitas, ir jei operacija atliekama pacientams iki 20 metų amžiaus. Tačiau panašių sąsajų tarp apendektomijos ir Krono ligos nustatyta nebuvo [114, 115, 157]. Apibendrinant galima teigti, jog pagrindiniai aplinkos veiksniai, lemiantys UŽL vystymąsi bei atsiradimą, yra nustatyti, tačiau vis dar trūksta žinių apie aplinkos bei genetinių veiksnių tarpusavio sąveiką.
1.3. Eksperimentiniai gyvūnų žarnų uždegimo modeliai
Gyvūnų eksperimentiniai modeliai plačiai taikomi, atliekant daugia-veiksmių ligų (epilepsijos, autoimuninio encefalomielito, vėžio, nutukimo, cukrinio diabeto, infarkto) tyrimus, nagrinėjančius šių susirgimų patogenezę bei etiologiją. Šiuo metu aprašyti net 66 eksperimentiniai gyvūnų modeliai, tiriantys UŽL [72, 103, 104, 183]. Visi jie pagal uždegimo sukėlimo pobūdį yra skirstomi į penkias grupes:
1. Žarnų uždegimo modeliai, kai uždegimas gyvūnams sukeliamas naudojant bakterijų antigenus ar bakterijas (LPS, Clostridium buty-ricum, Enterococcus faecalis, Klebsiella spp kolito modeliai ir kt.) [72, 103, 104, 183].
2. Žarnų uždegimo modeliai, kai uždegimas gyvūnams sukeliamas naudojant imunologines, fizines ar chemines priemones (trinitro-benzeno sulfoninės rūgšties, oksazolino, natrio dekstano sulfato
(angl. Dextran sodium sulfate, DSS) kolito modeliai ir kt.) [72, 103, 183].
3. Genetiniai žarnų uždegimo modeliai, kai uždegimo atsiradimą sąlygoja gyvūno genotipas (tyrimams naudojami transgeniniai ar „knock-out“ gyvūnai) [72,103,183].
4. Žarnų uždegimo modeliai (angl. adoptive transfer models), kai uždegimas sukeliamas įvedant į pilvo ertmę imunines ląsteles, t.y. T ar B limfocitus [123].
5. Savaime kylančio žarnų uždegimo modeliai (angl. spontaneous co-litis models), kai uždegimas atsiranda spontaniškai dėl neurologinių ar neuroendokrininių mechanizmų sutrikimų (stresas ir kt.) [139]. Pradžioje UŽL tyrimams naudoti paprastesni eksperimentiniai gyvūnų modeliai, žarnų uždegimą sukeliančios medžiagos (Clostridium butyricum, Enterococcus faecali, LPS, trinitrobenzeno sulfoninė rūgštis, oksazolinas, DSS), tiesiogiai sąveikaudamos su žarnų gleivine, lemdavo uždegimo atsi-radimą [72, 103, 183]. Vėliau, vystantis technologijoms, pradėti taikyti su-dėtingi genetiniai žarnų uždegimo modeliai, kurie leido pagilinti ir praplėsti jau turimas žinais apie UŽL molekulinius mechanizmus [103, 183]. Gyvūnų modeliai ir dabar sėkmingai naudojami vystant UŽL signalinių kelių tyrimus bei kuriant naujas UŽL terapijos priemones.
1.4. Natrio dekstano sulfato sukeltas kolitas
1990 metais Okayasu ir kt. pirmą kartą aprašė eksperimentinį pelių DSS sukeltą kolito modelį [120]. Pastaraisiais dešimtmečiais šis eksperimentinis gyvūnų modelis pradėtas plačiai naudoti, siekiant išsiaiškinti žarnų užde-gimo molekulinius mechanizmus, nustatyti su uždegimo progresavimu susi-jusius veiksnius bei vystyti naujas OK terapijos priemones [15, 103, 104, 116]. DSS vartojimas per os, priklausomai nuo dozės ir girdymo trukmės, sukelia ūminį arba lėtinį žarnų uždegimą, kurio klinikiniai simptomai (vidu-riavimas, kūno masės netikimas, kraujavimas iš tiesiosios žarnos) bei histo-patologiniai pokyčiai yra artimi žmogui [103, 104, 127]. DSS veikia kaip antigenas, sąlygodamas uždegimines reakcijas storosios žarnos audiniuose, kurių metu yra pažeidžiamas gleivinės vientisumas, aktyvuojama uždegi-minių medžiagų sintezė (citokinų, chemokinų) ir stimuliuojama imuninių ląstelių (neutrofilų, makrofagų, limfocitų, eozinofilų) migracija žarnų gleivi-nėje [7, 14, 103, 104, 127]. Moksliniai tyrimai parodė, kad žymūs žarnų audinių pakitimai aptinkami jau penktą–septintą DSS girdymo dieną. Šiuo atveju gyvūnams nustatomi ūminiam žarnų uždegimui būdingi histologiniai pokyčiai, t. y. kriptų ar/ir taurinių ląstelių netekimas dideliuose gleivinės
plotuose, židininis gleivinės išopėjimais, mikroabscesai, edema, paviršinio epitelio regeneracija, imuninių ląstelių migraciją gleivinėje. Tolimesnis DSS girdymas, besitęsiantis kelias savaites, lemia lėtinio žarnų uždegimo vysty-mąsi, dėl to randami lėtiniam žarnų uždegimui būdingi audinių pokyčiai, tokie kaip kriptų struktūros pakitimai (kriptos šakotos, netolygaus pločio, nelygiagrečios), sumažėjęs taurinių ląstelių skaičius, mikroabscesai, edema, paviršinio epitelio regeneracija ir uždegiminių ląstelių migracija gleivinėje [103, 104, 127]. DSS poveikis storosios žarnos audiniams pavaizduotas 1.4.1 pav.
1.4.1 pav. Natrio dekstano sulfato poveikis storosios žarnos audiniams
Pastaba: A, B, C, D pavaizduoti pelių žarnų gleivinės pokyčiai, praėjus 0 d., 7 d., 12 d. ir 21 d. po DSS girdymo. E, F, G, H pelių žarnų gleivinės histologiniai pokyčiai, praėjus 0 d., 7 d., 12 d. ir 21 d po DSS girdymo. Paveikslas sukurtas pagal [42,68].
DSS sąlygoja žarnų homeostazės praradimą bei patologinių procesų aktyvinimą. DSS lemia apsauginių baltymų-mucinų sumažėjimą. Mucinus gamina taurinės epitelio ląstelės, jis yra būtinas žarnų gleivinės homeostazei palaikyti. Šie baltymai formuoja apsauginį gleivių barjerą, patikimai sau-gantį žarnų gleivinę nuo tiesioginio kontakto su antigenais. Virškinamajame trakte esantys komensaliniai mikroorganizmai reguliuoja mucinų sintezę epitelio ląstelėse ir palaiko apsauginio barjero stabilumą, todėl uždegiminis signalas žarnų audiniuose yra slopinamas [69, 70, 86]. Tuo tarpu patogeni-niai mikroorganizmai gali prasiskverbti pro gleivių barjerą ir aktyvinti imu-ninį atsaką, sukeldami mucinų sintezės pokyčius. OK sergančių pacientų taurinėse ląstelėse mucinų sintezė yra sumažėjusi. Tokį baltymų kiekio su-mažėjimą sąlygoja pakitusi enterocitų sąveika su komensaliniais mikroorga-nizmais [48, 69, 86].
DSS sužadina uždegiminius signalus pelių storosios žarnos audiniuose. Uždegiminių kaskadų aktyvavimas sutrikdo citokinų, chemokinių ir augimo veiksnių sintezės pusiausvyrą. Moksliniai tyrimai parodė, kad panašūs užde-giminių mediatorių sintezės pakitimai nustatomi ir OK sergančių ligonių audiniuose [7, 26, 99, 155, 174].
1.5. Reaktyvios deguonies formos
Reaktyvios deguonies formos (angl. reactive oxygen species, ROS) – tai mažos deguonį (O) turinčios molekulės, joms priklauso deguonies radikalai (superoksido radikalas (O2•-), hidroksilo radikalas (OH•), alkoksilo radikalas
(RO•) peroksido radikalas (RO
2•)) bei „neradikalinės“ deguonies formos
(vandenilio peroksidas (H2O2), hipochlorito rūgštis (HOCl), ozonas (O3),
singletinis deguonis (1O2)), kurios organizme greitai paverčiamos į radikalus
[6, 50, 67]. ROS atrastos daugiau kaip prieš 50 metų. Šios molekulės aptin-kamos visose biologinėse sistemose, kur susidaro įvairių fermentinių ir nefermentinių reakcijų metu ar yra gaunamos iš aplinkos. Pradžioje manyta, jog ROS organizme gaminami fermentinių redukcijos-oksidacijos reakcijų metu, kaip šalutiniai produktai. Kol nebuvo nustatyta, kad tam tikros fer-mentinės sistemos ROS gamina kaip antrinius signalų nešiklius, kurie akty-vina bei reguliuoja įvairius biologinius procesus [6, 50]. Pagrindinės ROS molekulės ir jų susidarymo būdai pavaizduoti 1.5.1 pav.
1.5.1 pav. Reaktyvios deguonies formos ir jų susidarymo būdai [10]
1.6. Išoriniai veiksniai, sąlygojantys reaktyvių deguonies formų susidarymą
Jei biologinėse sistemose susidariusios ROS gali dalyvauti biologinių procesų reguliacijoje kaip signalų nešikliai, tai išorinių veiksnių sąlygota ROS gamyba siejama su žalingu šių molekulių poveikiu [10, 79]. ROS sin-tezę organizme lemia įvairūs aplinkos veiksniai, tokie kaip teršalai,
netin-kama mityba, tabako dūmai, narkotikai, ksenobiotikai ar radiacija [13, 50]. Išoriniai veiksniai gali tiesiogiai ar per tarpines-vidines sistemas skatinti ROS molekulių sintezę [50]. Ultravioletiniai spinduliai ir kita didelės ener-gijos (α, β, γ) spinduliuotė sukelia ROS sintezę odoje. Ozonas, oksiduo -damas biologines molekules, sąlygoja ROS formavimąsi audiniuose. Atmos-feros teršalai skatina ROS susidarymą ir mažina antioksidantų poveikį bronchų alveolėse. Toksinams priskiriami didelius ROS kiekius turintys ci-garečių dūmai. Įkvėpus cigarečių dūmų, įvyksta kraujotaką reguliuojančių mechanizmų pokyčiai, lemiantys homeostazės praradimą, t. y. sutrinka nuo endotelio priklausoma vazorelaksacija, trombocitų agragacija, pasireiškia endotelio ląstelių disfunkcija. Ksenobiotikai (antibiotikai, paracetamolis) bei netinkama mityba taip pat gali turėti įtakos ROS sintezei organizme [10, 33, 50, 53]. ROS pusiausvyrai palaikyti ypač svarbu tinkamai maitintis. Netin-kama mityba, kai su maisto medžiagomis gaunamas mažas kiekis poline-sočiųjų riebalų rūgščių ir antioksidantais praturtintų maisto produktų, o su-vartojamas didelis kiekis sočiųjų riebalų, angliavandenių ar maisto pramo-nėje naudojamų maistinių priedų, prisideda prie ROS kiekio didėjimo organizme ir sumažina antioksidacinių sistemų pajėgumą. Todėl manome, kad ypač svarbu su maisto produktais gauti pakankamą kiekį polinesočiųjų riebalų rūgščių bei antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčių maisto pro-duktų, turinčių vitaminų C, E ir A, katechinų ar antocianidų. Šių produktų naudojimas ne tik sumažina ROS kiekį audiniuose, bet ir apsaugoja orga-nizmą nuo lėtinių ligų vystymosi [33, 38, 135].
1.7. Vidiniai veiksniai, sąlygojantys reaktyvių deguonies formų susidarymą
Biologinėse sistemose ROS susidaro nuolat oksidacijos-redukcijos reakcijų metu veikiant fermentams bei Fentono (angl. Fenton) ir Haberio-Veiso (angl. Haber-Weiss) reakcijų metu – nefermentiniu būdu [50, 79]. Pagrindiniai fermentai, kanalizuojantys ROS molekulių sintezę ląstelėse, yra oksidazės, oksigenazės bei mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksai [12, 50, 54, 97]. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksai (I ir III kompleksai), dalyvaujantys ATP biosintezės mechanizme, gamina ROS mo-lekules kaip šalutinius biocheminių procesų produktus. Vykstant kvėpavimo grandinės elektronų pernašos reakcijoms, elektronams „nukrypus“ nuo gran-dinės tarpinių elementų link deguonies, susidaro O2•– radikalai [19, 50, 107].
Oksigenazės katalizuoja organinių junginių oksidaciją ląstelėse. Oksidacijos metu O2 atomai yra įtraukiami į organinių junginių struktūras. Taip
akty-vumu. Kaip šalutiniai reakcijų produktai dažniausiai susidaro O2•– arba H2O2 [12, 36, 50]. Oksidazės katalizuoja elektronų mainų reakcijas, kurių
metu, dalyvaujant tarpiniams elektronų nešikliams-kofermentams bei O2
kaip elektronų akceptoriui, sintetinamos ROS molekulės ar kiti O atomą turintys junginiai (O2 nėra įtraukiamas į organinio substrato struktūrą).
Oksidazėms priskirama NADPH oksidazė gamina O2•–, ksantino oksidazės – H2O2, citochromo C oksidazės – H2O ir kt. [50, 79, 97]. ROS ląstelėse
susidaro ir nefermentinių reakcijų metu. Šios reakcijos vadinamos Fentono ir Haberio-Veiso reakcijomis. Tai svarbiausias HO šaltinis in vivo. Jei ma-žiau aktyvūs ROS gali būti fiziologiškai naudingi, tai HO radikalai lemia tik žalingą poveikį organizmui. Dėl šios priežasties labai svarbu, kad laisvi Cu2+ ir Fe 2+jonai būtų sujungti su baltymais [50, 79].
Fe2+
(Cu2+) + H2O2→ Fe3+ + •OH + •OH (Fentono reakcija)
O2•–+ H2O2→(Fe, Cu)→ •OH + OH-+ O2 (Haberio-Veiso reakcija)
Įprastinėmis sąlygomis ROS kiekis ląstelėse yra nedidelis. O kenksmin-gas šių molekulių poveikis organizme slopinamas daugiaveiksmių-antioksi-dacinių sistemų, t. y. antioksidantinių fermentų, antioksidantų, junginių stabdančių ROS įsijungimą į reakcijas ar atstatančių ROS pažeistas ląstelių struktūras. Taip organizme išlaikoma ROS sintezės pusiausvyra [50, 135].
1.8. Reaktyvių deguonies formų biologinės funkcijos
Biologinėse sistemose susidarę nedideli ROS kiekiai yra būtini gyvy-binėms funkcijoms palaikyti. Šios molekulės, sąveikaudamos su baltymų, transkripcijos veiksnių ar kitomis genų struktūromis, keičia organinių jun-ginių funkciją ir veikia kaip antriniai signalų nešikliai, kurie aktyvina bei reguliuoja įvairius biologinius procesus, tokius kaip augimas, dalijimasis, ląstelių diferenciacija, uždegimas ar apoptozė [111, 136, 181]. Normaliomis fiziologinėmis sąlygomis organizme palaikoma ROS homeostazė [5, 129, 136]. Tačiau padidėjus ROS gaminančių fermentų aktyvumui ar šių mole-kulių patekimui iš aplinkos, sąlygojami organinių junginių (nukleorūgščių, baltymų, lipidų) struktūros pažeidimai bei aktyvuojami patologiniai procesai ląstelėse. Taigi padidėjęs ROS kiekis dalyvauja įvairių lėtinių bei vėžinių susirgimų vystymesi (gastrointestinaliniai navikai, aterosklerozė, miokardo infarktas, cukrinis diabetas, uždegiminės žarnų ligos ir kt.) [32, 85].
1.9. NADPH oksidazių baltymų šeima
NADPH oksidazės (Nox) randamos visuose eukariotiniuose organiz-muose: NoxA, NoxB, NoxC izoformos – grybuose; NoxA, NoxB- amebose; NoxM – uodose, NoxD – dumbliuose, bei Rboh – augaluose (angl. respira-tory burst oxidase homologues, Rboh) [84]. Žinduolių organizme aptinkami septyni Nox šeimos baltymai (Nox2, Nox1, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1 ir Duox2). Visi šios šeimos baltymai, esantys žinduolių ląstelėse, katalizuoja nuo kofermento NADPH priklausomą deguonies redukciją, kurios galutinis produktas yra O2•–. O2•– savaime arba veikiant superoksido dismutazei, virsta H2O2 radikalu ar kitais antriniais ROS [16, 17, 112, 113].
NADPH + 2O2→ NADP+ + H+ + 2O2–
2O2-+ 2H+ → O2+ H2O2
Nox1, Nox3, Nox4 molekulių dydis, domenų struktūra yra artima Nox2. Tuo tarpu Nox5 bei Duox grupės izoformos pasižymi didesniais dydžio bei struktūros skirtumais [24, 89, 90, 91]. Nox1, Nox2, Nox3, Nox4 fermentų redukcijos-oksidacijos reakcijų centras – tai silpno potencialo b tipo flavocitochromas, sudarytas iš dviejų integralinių membraninių baltymų: giukolizuoto gliukoproteino gp91phox ir negiukolizuoto p22phox baltymo. Pagrindinis Nox1–Nox4 sistemų subvienetas, atliekantis elektronų pernešimą per ląstelės membraną yra, gp91phox. Gp91phox turi domenus, skirtus hemo, FAD (flavino adenino dinukleotido) ir NADPH (nikotinami-dadenindinukleotido fosfato) molekulių prijungimui. Be membraninių sub-vienetų Nox1, Nox2, Nox3 turi skirtingą kiekį ląstelės citoplazmoje esančių baltymų (p47phox, p67phox, p40phox ir kt.), kurie būtini fermentų akyvumui. Duox1, Duox2, Nox5 fermentai turi tik vieną, tačiau daug sudė-tingesnės struktūros transmembraninį subvienetą gp91phox. Šiuo atveju gp91phox aktyvumas reguluojamas prijungiant ar atpalaiduojant Ca2+
jonus (Nox šeimos sruktūra pavaizduota 1.9.1 pav.) [56, 164, 165].
1.9.1 pav. NADPH oksidazės baltymų šeimos sruktūra
Pastaba: Rac1, Rac2 – mažos molekulinės masės G baltymai, gp91phox, p22phox, p40phox, p47phox, p67phox – NADPH oksidazės subvienetai, NOXO1 – NADPH oksi-dazės organizatorius 1, NOXA1 – NADPH oksioksi-dazės aktyvintojas 1. Paveikslas sukurtas pagal [24].
Nox baltymų sandaros ypatumai:
• Nox1 susideda iš penkių subvienetų, sudarančių aktyvų elektronus pernešantį kompleksą. Du Nox1 subvienetai (p22phox ir gp91phox) visada yra įsiterpę į ląstelės membraną, nepriklausomai ar fermen-tas yra aktyvus ar ne, o du citoplazmoje esantys subvienetai (NADPH oksidazės organizatorius 1, angl. NADPH oxidase orga-nizer 1, NOXO1) ir NADPH oksidazės aktyvintojas 1 (angl. NADPH oxidase activator 1, NOXA1) bei mažos molekulinės ma-sės G baltymas (angl. Rac-binding TPR domain, Rac) prisijungia prie membraninių subvienetų tik po Nox1 aktyvacijos [24, 89, 90, 91, 165].
• Nox2 struktūra artima Nox1, tačiau Nox2 aktyvuoja kiti ląstelės citoplazmoje esantys subvienetai, t. y. p47phox, p67phox, p40phox [24, 56, 165].
• Nox3 struktūra artima Nox2. Pagrindinis skirtumas tarp šių balty-mų tas, kad Nox3 vietoje citoplazminio subvieneto p40phox turi NOXO1 [24, 89, 91, 165].
• Nox4 aktyvumui nebūtini ciploplazmoje randami baltymai. Akty-vus fermentas sudarytas tik iš dviejų membraninių subvienetų (p22phox ir gp91phox) [24, 165].
• Nox5 sudarytas iš vieno transmebraninio subvieneto gp91phox. Nox5 aktyvumas reguliuojamas prijungiant ar atpalaiduojant Ca2+
jonus [24, 56, 165].
• Duox1 ir Duox2 struktūra atrtima Nox5. Tačiau Duox fermentų membraninis subvienetas (gp91phox) N gale turi papildomą dome-ną, kuris yra homologiškas peroksidazėmis. Manoma, kad šis do-menas randasi membranos išorėje ir sintetina H2O2[24, 164, 165].
1.10. Nox baltymų funkcijos ir pasiskirstymas audiniuose
Šiuo metu ištirti genai, koduojantys Nox fermentus, ir jų lokalizacijos vieta, tačiau trūksta žinių apie NOX raiškos ypatumus audiniuose, aktyvi-nimo būdus bei galimas biologines funkcijas. Moksliniai tyrimai nustatė, jog Nox funkcijos skirtinguose audiniuose ar ląstelėse yra skirtingos, nes šių izoformų pasiskirstymas audiniuose yra griežtai apribotas. NOX genų loka-lizacija, raiškos ypatumai bei Nox baltymų savybės pavaizduoti 1.10.1 len-telėje [24, 29, 165].
1.10.1 lentelė. Žmogaus NOX genų lokalizacija, raiškos ypatumai bei Nox baltymų savybės [24, 62, 165] Kiti p avadi-nimai Vieta chro-mosomoje Amino rūgš-tys Balty-mo masė (kDa) Aukšta
raiška Vidutinė raiška
Nox1 NOH-1 MOX1 GP91-2 Xq22 564 55–60 Gaubtinė žarna, žarnų epitelis Lygieji raumenys, endotelis, gimda, placenta, prostata, osteoklastai, neuronai. Nox2 CYBB gp91phox
Xp21.1 570 70–90 Fagocitai B limfocitai neuronai kardiomiocitai, hepatocitai, endotelis, lygieji raumenys. Nox3 GP91-3 6q25.3 568 ≈ 65 Vidinė ausis Vaisiaus inkstai, vaisiaus blužnis, kaukolės kaulai, smegenys. Nox4 RENOX KOX-1 KOX 11q14.2-q21 578 75–80 Inkstai, krauja-gyslės Osteoklastai, endotelis, fibroblastai, keratonocita, neuronai Nox5 15q23 747 ≈ 85 Limfoidinis audinys, sėklidės Endotelis, lygieji raumenys, kasa, placenta, kiaušidės, gimda, skrandis, įvairūs vaisiaus audiniai. Duox1 Thox1 LNOX1 NOXEF1
15q15.3 1551 ≈ 190 Skydliaukė Kvėpavimo takų
epitelis, liežuvio epitelis, virškinimo trakto epitelis, smegenėlės, sėklidės. Duox2 Thox2 LNOX2 NOXEF2 p138lox
15q15.3 1548 ≈ 190 Skydliaukė Seilių ir tiesiosios
žarnos liaukos, virškinimo trakto epitelis, kvėpavimo takų epitelis, tulžies pūslė, kasos salelės.
NOX1 geno raiška didžiausia storojoje žarnoje, tačiau jis aptinkamas ir kituose audiniuose (kraujagyslių lygiuosiuose raumenyse, endotelyje, gim-doje, placentoje, prostatoje, osteoklastuose, tinklainėje) bei ląstelių linijose (Caco2, DLD-1, HT-29, A549). Kraujagyslių lygiuosiuose raumenyse Nox1 dalyvauja kraujo spaudimo reguliacijoje, t. y. didina kraujo spaudimą. Nox1 biologinės funkcijos gaubtinės žarnos ir virškinamojo trakto barjeriniuose audiniuose susijusios su įgimtais apsauginiais, gynybiniais mechanizmais, ląstelės signaliniais keliais ir uždegimo molekuliniais mechanizmais [29, 60, 61, 133].
Nox2 atrastas pirmiausiai, jis aptinkamas imuninei sistemai priklausan-čiose ląstelėse, tokiose kaip neutrofilai, eozinofilai, monocitai bei makro-fagai. Normaliomis fiziologinėmis sąlygomis Nox2 yra neaktyvus, du šio baltymo subvienetai randasi ląstelės membranoje (p22phox ir gp91phox) ir trys (p47phox, p67phox, p40phox) – citoplazmoje. Uždegiminių ląstelių stimuliacija bakterijų produktais sąlygoja signalų kaskadas, kurių metu visi Nox2 subvienetai susijungia, suformuodami aktyvų baltymą. Aktyvus Nox2 gamina didelius ROS kiekius, lyginant su kitais Nox. Susidariusios ROS molekulės tiesiogiai dalyvauja, naikinant patogenines baterijas fagocitozės metu [50, 52, 61, 73]. Moksliniai tyrimai parodė, kad pacientai sergantys, lėtinėmis granuliomatozinėmis ligomis, turi NOX2 genų mutacijas, lėmusias koduojamų baltymų struktūros bei funkcijos pakitimus. Imuninės sistemos ląstelės nesugeba tinkamai naikinti patogenų, todėl lėtinėmis granuliomato-zinėmis ligomis sergantys pacientai nuolat kenčia nuo infekcinių ligų [61, 73, 132].
Nox3 nustatytas vidinės ausies (sraigėje, jutimo epitelyje, spiralinių ganglijų neuronuose) audiniuose. Šis baltymas yra būtinas mažų kalcio karbonato kristalų, vadinamų otolitais, susidarymui bei normaliai vestibulia-rinės sistemos funkcijai palaikyti. Darbai su „knock - out“ gyvūnų modeliais atskleidė, jog NOX3 genų mutacijos, sąlygojusios baltymo trūkumą, fenoti-piškai pasireiškė koordinacijos ir pusiausvyros sutrikimais [20, 61].
Nox4 ir Nox5 gaminamos ROS molekulės audiniuose veikia, kaip antri-niai signalų nešikliai, kurie aktyvina bei reguliuoja įvairius biologinius procesus (augimą, embriogenezę, apoptozę, angiogenezę, ląstelių prolife-raciją bei migprolife-raciją). Manoma, kad Nox4 palaiko eritropoetino pusiausvyrą inkstuose. Tačiau tikslios Nox4 ir Nox5 funkcijos audiniuose nėra nusta-tytos. Ypač trūksta žinių apie Nox5, nes šis baltymas laboratorinių pelių ir žiurkių audiniuose neaptinkamas [23, 35, 95, 106, 152].
Duox1 ir Duox2 dominuoja skydliaukės audinyje, ypač skydliaukės folikulų ląstelėse tirocituose. Abi Duox izoformos dalyvauja skydliaukės hormonų, t. y. tiroksino ir trijodtironino, sintezės procesuose. Duox izo-formų gaminamas H2O2 yra būtinas jodo molekulės įjungimui į
tiroglobu-lino sudėtį. Taigi sumažėjęs Duox aktyvumas siejamas su skydliaukės hor-monų sumažėjimu – hipotiroze [65, 119, 143, 152, 161].
Padidėjęs ar sumažėjęs Nox aktyvumas siejamas su įvairiomis, skir-tingų organų sistemų, lėtinėmis ligomis bei navikiniais susirgimais. Šių bal-tymų biologinės funkcijos bei su Nox susijos ligos pateiktos 1.10.2 lentelėje [24, 60, 81, 133].
1.10.2 lentelė. Nox biologinės funkcijos bei su Nox susijusios ligos [81].
Funkcija Su Nox siejamos ligos
Nox1 Uždegimas Kraujospūdžio reguliavimas Signalinė funkcija
Uždegiminės žarnų ligos
Virškinamojo trakto navikiniai susirgimai Hipertenzija
Aterosklerozė Pankreatitas Osteoporozė Nox2 Uždegimas
Signalinė funkcija Alzheimerio liga, Parkinsono liga
Lėtinės granuliomatozinės ligos Nox3 Pusiausvyros reguliacija Pusiausvyros ir
koordinacijos sutrikimai Nox4 Sigalinė funkcija
Hormonų sintezė Inkstų navikai Hipertenzija Aterosklerozė
Plaučių ir širdies fibrozė Širdies nepakankamumas Insultas
Cukrinis diabetas Diabetinė nefropatija Nox5 Sigalinė funkcija
Angiogenezė Embriogenezė
Prostatos vėžys Kraujagyslių ligos
Bareto stemplės adenokarcinoma Duox1
Duox2 Hormonų sintezė Uždegimas Signalinė funkcija
Hipotirozė
1.11. NOX raiškos reguliavimas audiniuose
Nox izoformų aktyvumą bei pasiskirstymą organizme reguliuoja įvairūs transkripcijos veiksniai bei mediatoriai, kurie aktyvina arba slopina jų raišką audiniuose. NOX1 transkripciją aortos lygiųjų raumenų ląstelėse skatina angiotensinas II, urokinazės, plasminogeno aktyvatorius, trombocitų augimo veiksnys, kaulų morfogenetinis baltymas 4 (angl. bone morphogenic protein 4 (BMP4)), prostaglandinas 2, keratinocitų augimo veiksnys-alfa, forbolio
esteris. Tuo tarpu NOX1 raišką šiose ląstelėse mažina angiotenziną konver-tuojančių fermentų, renino slopikiai ir angiotenzino II receptoriaus antago-nistai [30, 95, 152]. NOX1 raiška žarnų epitelio ląstelėse aptarta 1.12 sky-riuje.
NOX2 raiškos pusiausvyrą imuninėse ląstelėse valdo skirtingi transkrip-cijos veiksniai, kurie slopina arba aktyvina šio geno raišką, jungdamiesi prie NOX2 geno promotoriaus regionų. NOX2 transkripciją slopina CCAAT pakeitimo baltymas (angl. CCAAT displacement protein, CDP), kuris prisi-jungęs prie promotoriaus nutraukia NOX2 raišką imuninėse ląstelėse. Tuo tarpu transkripcijos veiksniai – PU.1 ir YY1 yra pagrindiniai NOX2 raiškos aktyvikliai fagocituose. Moksliniai tyrimai parodė, kad Nox2 raiška fagoci-tuose kinta uždegimo metu, kai uždegiminiai mediatoriai IFN-γ ar LPS padidina šio geno transkripciją per interferoną reguliuojantį transkripcijos veiksnį (angl. interferon regulatory transcription factor, IRF) bei signalus perduodantį ir transkripciją aktyvuojantį baltymą 1 (angl. signal transducer and activator of transcription protein 1, STAT1) [52, 89, 112, 113].
NOX3 raišką valdantys molekuliniai mechanizmai vidinės ausies audi-niuose iki šiol nėra ištirti. Moksliniai tyrimai, nagrinėjantys Nox fermentų evoliuciją, atskleidė, jog NOX3 genas atsirado gana vėlai pereinamame laikotarpyje, kai stuburiniai gyvūnai prisitaikė gyventi nuolat sausumoje. Nors žuvys ir amfibijos turi otolitus, jie neturi NOX3. Visiems kitiems sau-sumos stuburiniams gyvūnams vidinės ausies audiniuose esančių otolitų susidarymui bei pusiausvyros funkcijai palaikyti būtini Nox3 fermentai [60, 61, 81].
Lygiųjų raumenų ląstelėse NOX4 transkripciją skatina urokinazė, audi-nių plazminogeno aktyvatorius, angiotensinas II, TGF-β ir TNF-α. Priešingu poveikiu pasižymi BMP4, kuris mažina NOX4 raišką žmogaus endotelinėse ląstelėse. Eritroidinės kilmės veiksnys 2 (angl. erythroid related factor 2, Nrf2), jungdamasis prie NOX4 geno promotoriaus ARE sekų, taip pat slopina NOX4 transkripciją plaučių kapiliarų endotelyje [35, 81].
NOX5 raišką žmogaus stemplės adenokarcinomos ląstelėse skatina trom-bocitų aktyvinimo veiksnys (angl. platelet-activating factor, PAF). PAF si-muliuoja kaskadas, kurių metu STAT5 jungiasi prie NOX5 promotoriaus bei aktyvina šio geno raišką. Kiti moksliniai tyrimai atskleidė, jog onkogeninė nereceptorinė tirozino kinazė skatina, o tirozino fosfatazė slopina NOX5 raišką žmogaus leukemijos ląstelių kultūrose. Baltymų kinazės C, trombi-nas, angiotensinas II bei Ca2+ jonai reguliuoja NOX5 transkripciją ar fer-mento aktyvumą kraujagyslių audiniuose [81, 106].
DUOX1 ir DUOX2 raiška didžiausia skydliaukės audiniuose. DUOX1 transkripciją reguliuoja DUOX1 genų promotoriai esantys pirmojo egzono regione – 150 bazių porų pozicijoje, o DUOX2 – 250 bazių porų pozicijoje.
Tačiau kokie transkripcijos veiksniai jungiasi prie šių genų promotorių nenustatyta. Žmogaus DUOX1 – 2 genų raiška yra nepriklausoma nuo skyd-liaukei unikalių transkripcijos veiksnių. Kvėpavimo takų epitelyje DUOX1 - 2 genų raišką didina citokinai (DUOX1 – IL-4 ir IL-13; DUOX2 – IL-1α, IL-1β ir IFN-γ) [81, 161].
1.12. NOX1 genas ir jo raiška žarnų epitelio ląstelėse
NOX1 genas atrastas 1999 metais. Šį geną sudaro 13 egzonų, visas geno ilgis yra 30374 bazių porų. NOX1 randamas žmogaus X chromosomos ilga-jame petyje 22 segmente (Xq22) [24, 62]. NOX1 raiška didžiausia gaubtinės žarnos audiniuose, ypač gaubtinės žarnos epitelio ląstelėse lyginant su kitais organizmo audiniais ar ląstelėmis. Tačiau NOX1 raiška gaubtinės žarnos audiniuose nėra tolygi. Šio geno raiška proksimalinėje gaubtinės žarnos dalyje yra mažiausia ir tolygiai didėja, artėjant link distalinės žarnos dalies, kur NOX1 raiška yra didžiausia [24, 89].
NOX1 raiška koreliuoja su STAT1, globino transkripcijos veiksnio (angl. globin transcription factor, GATA), kepenų branduolio veiksnio-1 alfa (angl. hepatic nuclear factor-1 alpha, HNF-1α) bei homeodomeną tu-rinčio transkripcijos veiksnio (angl. homeodomain transcription factors, CDX) raiška, kurie atlieka pagrindinę funkciją, reguliuojant NOX1 geno transkrip-ciją gaubtinės žarnos epitelio ląstelėse in vivo [24, 60, 89]. Transkripcijos veiksnių (STAT1 ir GATA) prisijungimo vietos prie žmogaus NOX1 pro-motoriaus regionų pavaizduotos 1.12.1 pav.
1.12.1 pav. Transkripcijos veiksnių prisijungimo vietos prie žmogaus NOX1 promotoriaus [89]
Pataba: STAT1 – signalus perduodantis ir transkripcija aktyvuojantis baltymas 1, GATA – globino transkripcijos veiksnys, NOX1 – NADPH oksidazė 1.
Moksliniai tyrimai parodė, kad NOX1 raišką gaubtinės žarnos epitelio ląstelėse gali didinti bakterijų endotoksinai (LPS, flagelinas), uždegiminiai citokinai (IFN-γ, IL-18 ir TNF-α) bei vitaminas D3. Dabartiniu metu mano-ma, kad Nox1 funkcijos yra susijusios su uždegimo molekuliniais mecha-nizmais bei signaliniais keliais [11, 49, 51, 52, 81].
1.13. Nox1 vaidmuo opinio kolito patogenezėje
Virškinamojo trakto epitelis atlieka svarbią „barjero“ funkciją, nes šių ląstelių membranos yra tampriai susijungusios viena su kita ir sudaro vien-tisą apsauginį paviršių apribojantį bakterijų invaziją į žarnų audinius ar vidaus organus. Žarnų epitelio ląstelėse esantys receptoriai sąlygoja signali-nę funkciją, aktyvuodami kaskadas lemiančias imuninį atsaką, genų trans-kripcijos pokyčius bei uždegiminių citokinų gamybą. Esant normalioms fiziologinėms sąlygoms, simbiotinių mikroorganizmų, enterocitų bei imuni-nių ląstelių tarpusavio sąveika užtikrina ir palaiko žarnų gleivinės homeosta-zę [18, 39, 151, 175]. Tuo tarpu sergant autoimuninės kilmės lėtinėmis virškinamojo trakto ligomis (angl. chronic gastrointestinal inflammation), homeostazę palaikančių sistemų veikla pakinta, t. y. sukeliamas imuninės sistemos atsakas į simbiotines žarnų bakterijas, kurio metu aktyvinamas TLR signalinis kelias [144, 162, 176]. Šiose kaskadose dalyvaujantys trans-membraniniai receptoriai TLR sudaryti iš dviejų dalių:
1. Ektodomeno, esančio ląstelės išorėje ir turinčio 19–25 aminorūgš-čių motyvą, vadinamą leucinu praturtintu regionu (angl. leucine rich repeat, LRR), kurio N – amino- ir C – karboksi- galai pasibai-gia cisteino struktūromis. LRR randami hidrofobiniai radikalai atsi-šakoja nuo trumpos β-grandinės, susijungia sudarydami išlenktas šių receptorių struktūras. LRR struktūra ypač svarbi atpažįstant unikalias bakterijų ir virusų molekules [57, 58, 145].
2. Citoplazminio „Varpelio“ tipo/interleukino-1 receptoriaus domeno (angl. Toll/interleukin-1 receptor, TIR-1), sudaryto iš penkių β-lakštų, apsuptų α-spiralių ir tarpusavyje sujungtų lanksčia „BB“ kilpa. TIR domenas užtikrina tolimesnį signalo perdavimą ląstelės citoplazmoje. Ektodomeną su citoplazminiu domenu jungia iš α-spiralės sudaryti transmembraniniai regionai [57, 58, 145].
TLR šeimos receptoriai atpažįsta skirtingas bakterijų ir virusų struk-tūras: TLR1, TLR2 signalinis kelias aktyvuojamas bakterijų lipopeptidų, TLR3 – dvigrandės virusų RNR, TLR4 – gramneigiamų bakterijų LPS (šios bakterijos sudaro net apie 50 proc. visų žarnyne esančių bakterijų), TLR5 – bakterijų flagelinų, TLR7 bei TLR8 – viengrandės virusų RNR, TLR9 – nemetilintų CpG sekų, turinčių DNR [1, 170]. Kai kuriems iš TLR reikia papildomų koreceptorių galinčių sąveikauti su bakterijų baltymais (pvz., TLR4 reikia limfocitų baltymo-96 dar vadinamo MD2 ir diferenciacijos klasterio14 (angl. cluster of differentiation 14, CD14). Žarnų gleivinė yra nuolat veikiama bakterijų ir jų produktų, dėl to enterocitų plazminėje mem-branoje susidaro maži TLR (TLR2, TLR4 ir kt.) bei jų koreceptorių (CD14, MD2 ir kt.) ir dideli TLR slopinančių baltymų (angl. Toll-interacting
protein, Tollip) kiekiai [57, 58, 125]. Kai žarnyne nėra patogeninių mikroorganizmų, TLR4 lokalizuojasi viduląstelinėse struktūrose, tokiose kaip Goldžio aparatas. Tačiau ląsteles paveikus bakterijų endotoksinu, LPS, TLR4 kiekis ląstelių membranoje žymiai padidėja. Moksliniai tyrimai atskleidė, kad ląstelėse vyksta nuolatinė šių receptorių cirkuliacija tarp Goldžio komplekso ir plazminės membranos [58, 125]. Veikiant LPS, TLR4 keliauja į plazminėje membranoje esančius lipidų mikrodomenus, kuriuose vyksta tolimesnis ląstelės signalinių aktyvavimas [57, 58, 110].
Gana ilgą laiką manyta, jog uždegimo metu padidėjusi ROS sintezė žarnų audiniuose yra susijusi su imuninių ląstelių migracija ir jose esančių Nox2 fermentų veikla [24]. Kol 2005 metais mokslininkai nustatė, kad OK sergančių pacientų enterocituose Nox1 raiška yra padidėjusi, o Nox2 – stabili, lyginant su kontroline grupe [24, 169]. Idėja apie TLR4/Nox1 signa-linį kelią virškinamajame trakte buvo pasiūlyta, atlikus tyrimus su jūrų kiaulyčių skrandžio epitelio ląstelėmis, t.y. LPS, išskirtas iš Helicobacter pylori aktyvavo nuo Nox1 priklausomą ROS sintezę per TLR4 signalinį kelią [83, 169]. Vėliau pasirodė pirmieji pranešimai apie TLR4/Nox1 signa-linį kelią žarnų epitelio vėžinių ląstelių linijose [169]. Tačiau pirminėse enterocitų linijose šis kelias vis dar nėra ištirtas. Dabartiniu metu manoma, jog TLR4 aktyvina Nox1, susidariusios ROS molekulės ne tiesiogiai naikina patogenus, o stimuliuoja ir sustiprina imuninį atsaką žarnų audiniuose, taip į uždegimo židinį pritraukiami neutrofilai, makrofagai bei kitos imuninės sistemos ląstelės, žudančios patogenus [60]. Žarnų epitelio ląstelėse ran-dama daug TLR šeimos baltymų, tarp jų ir TLR4. TLR4 transkripatas nuo DNR nuolat sintetinamas enterocituose, tačiau esant nepakankamam LPS, TLR4 ir jo koreceptorių CD14 ir MD2 kiekiui, signalinis kelias ląstelių membranose slopinamas [1, 57, 34]. Tuo tarpu, veikiant LPS, TLR4 keliauja į plazminėje membranoje esančius lipidų mikrodomenus, prie TLR4 jungia-si koreceptoriai CD14 ir MD2, taip sukeliama reakcijų kaskada, kurių metu prijungiami kiti signaliniai baltymai, t. y. mieloidinis pirminės diferencia-cijos baltymas 88 (angl. myeloid differentiation primary response protein-88, MyD88), interleukino 1 receptorių jungianti kinazė (angl. IL-1 receptor-associated kinase, IRAK), navikų nekrozės veiksnio receptorių jungiantis baltymas 6 (angl. TNF receptor associated factor 6, TRAF6), o susidaręs kompleksas aktyvuoja transkripcijos veiksnį NF-κB [1]. Vis dėlto NF-κB aktyvacija ląstelėse po LPS stimuliacijos gali vykti ir nepriklausomai nuo MyD88 signalinio kelio, dalyvaujant baltymų kinazėms B ir C arba fosfoi-nozitido-3-kinazei (PI3K) [145, 171]. NF-κB transkripcijos veiksnys, lemia padidintą genų susijusių su uždegiminiu atsaku, raišką, taip ląstelėse akty-vuojama uždegiminių citokinų sintezė [126, 171]. Keletas mokslinių darbų parodė, kad NF-κB raiška gali būti reguliuojama nuo Nox priklausomų ROS
molekulių. Tačiau tikslus mechanizmas nėra žinomas [145, 171]. Atlikus tyrimus su T84 ląstelių linijomis, nustatyta, jog IFN-γ sintetinamas akty-vinus NF-κB, gali skatinti žmogaus NOX1 geno transkripciją per STAT1 signalo pernešėjus. Kiti uždegiminiai citokinai (IL-1β, IL-18 ir TNF-α) taip pat gali aktyvinti NOX1 raišką [24, 60, 89]. Priešingą poveikį NOX1 raiškai epitelio žarnų ląstelėse turi priešuždegiminiai citokinai TGF-β ir IL-10, kurie efektyviai slopina IFN-γ [146]. Taigi uždegiminių ir priešuždegiminių citokinų gebėjimas reguliuoti NOX1 raišką enterocituose leidžia manyti, kad šis fermentas yra svarbus uždegiminių ligų patogenezei [146]. Galimas TLR4/Nox1 signalinis kelias pavaizduotas 1.13.1 pav.
1.13.1 pav. „Varpelio“ tipo receptoriaus/NADPH oksidazės 1 signalinis kelias
Pastaba: TLR – „varpelio“ tipo receptoriai, MD2 – limfocitų baltymas 96, CD14 – diferenciacijos klasteris 14, IRAK - interleukino 1 receptorių jungianti kinazė, TRAF6 – navikų nekrozės veiksnio receptorių jungiantis baltymas, MyD88 – mieloidinis pirminės diferenciacijos baltymas 88, NF-κB – branduolio veiksnys – kappa B, IFN-γ – interferonas-gama, IL-1β – interleukinas 1 beta, IL-18 – interleukinas 18, TNF-α – navikų nekrozės veiksnys-alfa, Nox1 – NADPH oksidazė 1, ROS – reaktyvios deguonies formos. Paveikslas sukurtas pagal [117, 146].
Ligonių, sergančių OK, žarnų epitelio ląstelėse pakinta TLR raiška bei funkcijos [66, 110, 172]. TLR reikalingi ne tik patogenams atpažinti ar naikinti, bet ir simbiontinių bakterijų populiacijai reguliuoti, todėl sutrikus TLR signalo perdavimui sergant UŽL, žarnų audiniuose prasideda patolo-giniai procesai, t. y. imuninių ląstelių migracija, uždegiminių citokinų, che-mokinų sintezė bei ląstelių proliferacija [39, 110]. Manoma, jog sutrikusios šių signalų kaskados gali turėti įtakos Nox1 fermento raiškai ir ROS kiekiui ląstelėse [146]. Todėl tyrimai, nagrinėjantys TLR/Nox1 signalinį kelią bei jo svarbą UŽL etiopatogenezei, ir toliau tęsami.
