Diffusione di fragranze sintetiche nel sistema acquatico lagunare veneziano

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Corso di Laurea Magistrale

in Scienze Ambientali

Tesi di Laurea

Diffusione di fragranze sintetiche

nel sistema acquatico lagunare

veneziano

Relatore

Prof. Andrea Gambaro

Correlatore

Dott. Marco Vecchiato

Laureando

Simone Cremonese

Matricola 820803

Anno Accademico

2014 / 2015

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A nonna Antonietta

“Vivere la vocazione dell’essere custodi dell’opera di Dio

è parte essenziale di un’esistenza virtuosa.”

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Indice

Premessa e Scopo ... 1

1. Introduzione ... 2

1.1. Personal Care Products (PCPs) ... 3

1.1.1. Fragranze Sintetiche ... 4

1.2. Analiti ... 6

1.3. Area d’indagine ... 12

1.4. Consumo pro capite ... 17

2. Materiali e metodi ... 19

2.1. Strumentazione e materiali utilizzati ... 19

2.1.1. Estrazione in fase solida SPE ... 19

2.1.2. Turbovap®_{... 20}

2.1.3. Gascromatografia accoppiata a spettrometria di massa (HRGC-LRMS) ... 20

2.2. Messa a punto di una metodologia sperimentale per la determinazione di fragranze sintetiche ... 23

2.2.1. Campionamento ... 23

2.2.2. Preparazione campioni ... 32

2.2.3. Quantificazione ... 33

3. Risultati e discussione ... 35

3.1. Validazione della metodica analitica ... 35

3.1.1. Resa ... 35

3.1.2. Accuratezza ... 36

3.1.3. Limiti strumentali ... 38

3.1.4. Test preliminari su matrice reale ... 40

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3.2. Struttura finale della metodica ... 45

3.3. Prima campagna: campioni preliminari ... 46

3.4. Seconda campagna: distribuzione spaziale ... 49

3.5. Terza campagna: evoluzione temporale e influenza della marea .. 56

3.6. Quarta campagna: evoluzione su scala temporale breve ... 60

3.7. Considerazioni generali ... 62

Conclusioni ... 66

Appendice ... 68

Bibliografia ... 71

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Premessa e Scopo

I Prodotti per la Cura Personale (PCPs) sono un insieme di prodotti di uso quotidiano, come saponi, profumi, creme solari ecc. e sono classificati come inquinanti emergenti a causa del loro enorme impiego.

Le fragranze sintetiche sono molecole utilizzate per il loro profumo come ingredienti nei Prodotti per la Cura Personale.

Per capire il rischio associato all’utilizzo e allo scarico di fragranze sintetiche è necessario studiare il loro destino ambientale e qual è la loro distribuzione nei diversi comparti ambientali: una volta rilasciate in acqua, le fragranze sufficientemente persistenti possono distribuirsi nei sedimenti, evaporare nell’atmosfera oppure accumularsi nel comparto biotico.

La città di Venezia si trova al centro della laguna veneta, inserita dall’UNESCO tra i patrimoni mondiali dell’umanità. Il centro storico della città è mancante di un sistema adeguato di raccolta delle acque reflue e per tale motivo è presumile che le fragranze vengano scaricate direttamente nell’acqua dei canali.

Il primo passo per valutare il destino ambientale di queste fragranze è di capire quali siano le vie di immissione principali in ambiente, identificare quali tra gli analiti selezionati risultano essere emessi in maggiore quantità e qual è la loro concentrazione ambientale.

Si è ipotizzato che la via preferenziale di ingresso di queste sostanze in ambiente siano le acque di scarico, pertanto in questo lavoro ci si è focalizzati sulla diffusione delle fragranze sintetiche nell’acqua superficiale della laguna di Venezia data l’elevata probabilità che questo sia il primo comparto in cui essi vengono immessi in ambiente.

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1. Introduzione

La storia dei profumi iniziò quando l’uomo scoprì che componenti caratteristiche dell’aroma di alcuni prodotti naturali potevano essere aumentate mediante metodi relativamente semplici.

Lo sviluppo sistematico di tecniche per l’estrazione e la distillazione ebbe inizio nel XIII secolo quando le farmacie iniziarono a preparare oli medicinali e più tardi cominciarono a registrare le loro proprietà e gli effetti fisiologici nella farmacopea1

(Bauer e Garbe 1985).

Molti degli oli essenziali usati oggi dai profumieri venivano originariamente preparati attraverso distillazione nelle farmacie tra il XVI e il XVII secolo.

Un altro importante passo in avanti nella storia della fragranze ebbe luogo nella prima metà del XIX secolo quando la produzione degli oli essenziali venne industrializzata per far fronte alla crescente richiesta di tali oli che venivano utilizzati come ingredienti per profumi.

La prima fragranza sintetica a base di oli essenziali venne introdotta tra il 1845 e il 1850; questa consisteva in esteri di acidi grassi provenienti da diversi alcool e venne prodotta sinteticamente dall’industria chimica per il suo odore fruttato. I segnali chimici sono indispensabili per la sopravvivenza di molti organismi che usano dei chemiorecettori per svolgere molte attività come la caccia delle prede, l’identificazione di un compagno o di un nemico nei paraggi, ecc. Per l’uomo queste funzioni non sono più di vitale importanza, come si evince dall’esiguo numero di recettori rispetto ad altri mammiferi, ciononostante non ha perso la capacità di captare gli odori.

Le fragranze possono essere classificate come naturali, se ottenute tramite processi fisici da piante e talvolta da fonti animali, identiche-alle-naturali, se prodotte mediante sintesi ma chimicamente identiche alle loro controparti naturali ed infine sintetiche o artificiali, se prodotte artificialmente e non sono presenti analoghi chimici in natura (Bauer e Garbe 1985).

1_{La farmacopea definisce i requisiti per la composizione qualitativa e quantitativa dei farmaci e} le prove da effettuare sui farmaci, sulla sostanza e sui materiali usati nella loro produzione (https://www.edqm.eu).

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1.1. Personal Care Products (PCPs)

I prodotti per la cura personale (PCPs) sono considerati degli inquinanti emergenti, ovvero sostanze chimiche che non sono comunemente monitorate nell’ambiente ma che hanno le potenzialità di entrarvi e causare effetti avversi all’ecosistema e alla saluta umana (Geissen et al. 2015); a questa categoria appartiene ogni prodotto usato per la salute personale o per la cosmesi (Daughton & Ternes 1999).

I PCPs sono un gruppo di composti usati in saponi, lozioni, profumi e creme solari, a differenza dei farmaci, appartenenti alla categoria dei PPCPs (Pharmaceuticals and Personal Care Products) che sono sottoposti al metabolismo del soggetto che ne fa uso, i prodotti per la cura personale hanno un uso esterno e pertanto non sono soggetti ad alterazioni metaboliche. Per questo motivo i PCPs entrano inalterati nell’ambiente (Brausch & Rand 2011). Molti di questi composti sono usati in grande quantità: studi recenti hanno indicato che molti sono persistenti, sono attivi biologicamente e possono bioaccumulare (Peck 2006; Daughton & Ternes 1999). Oltre a questo alcuni studi hanno evidenziato che tali sostanze possono essere allergeni e possono provocare alterazioni al sistema endocrino (Villa et al. 2007; de Oliveira e Sá et al. 2014). Sono presenti relativamente pochi studi riguardanti tali sostanze rispetto al loro largo impiego e poche sono le informazioni disponibili riguardo alla loro sicurezza (Bridges 2002; Lamas et al. 2010).

La Commissione Europea ha espresso le sue perplessità riguardo la sicurezza di alcune fragranze che sembrano essere colpevoli di causare sensibilizzazione dermica. La Commissione Scientifica sui Prodotti Cosmetici e i Prodotti Non Alimentari (SCCNFP), ha raccomandato che le sostanze colpevoli di causare sensibilizzazione debbano essere inserite in una lista in modo da garantire l’informazione al consumatore. Questa raccomandazione arriva in risposta al continuo aumento di allergie dermatologiche riconducibili all’uso di fragranze (Bridges 2002).

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1.1.1. Fragranze Sintetiche

Le fragranze sintetiche sono prodotte artificialmente per essere usate come ingredienti nella preparazione di profumi e altri prodotti. In accordo con l’International Fragrance Association (IFRA) una fragranza viene definita ingrediente (fragrance ingredient), quando è usata nella preparazione di un prodotto per il suo odore, per aumentarne il profumo o per le sue proprietà fissative (IFRA 2005). In generale, qualsiasi sostanza che sia sufficientemente volatile e che reagisca con i recettori olfattivi può essere usata come ingrediente. Si conoscono circa 30.000 preparazioni profumate e queste possono essere oli essenziali, estratti, composti identici-ai-naturali, composti sintetici o solventi inoltre, molti contengono isomeri, contaminanti e residui di produzione.

Le fragranze possono essere alcool, aldeidi, chetoni, acidi carbossilici, amine, esteri, lattoni, idrocarburi, solfuri e mercaptani; molti di questi sono piccole molecole con meno di 20 atomi di carbonio (Klaschka & Kolossa-gehring 2007). Le fragranze vengono usate in percentuali diverse a seconda dei prodotti e queste possono variare da una media pari allo 0,5% fino ad un massimo del 40% nel caso dei profumi (Tabella 1).

Tabella 1 - Livelli massimi (M) e medi (m) della percentuale di utilizzo di fragranze in una selezione di prodotti (Klaschka & Kolossa-gehring 2007; P. a. Cadby et al. 2002).

Prodotto Livello %

Shampoo 0,5 - 1,5 (m)

Prodotti per il bagno e la doccia 6 (M)

Olio da bagno 10 (M)

Sapone 5 (M), 0,5 – 2,5 (m)

Profumo 40 (M), 5 – 25 (m)

Eau de toilette 40 (M), 5 – 15 (m)

Creme per la pelle e lozioni 5 (M)

Deodorante 1 (M)

Spray per capelli 0,50 (M)

Lozioni per il corpo 0,40 (M)

Detersivo in polvere < 1 (m)

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Le acque di scarico rappresentano il mezzo principale attraverso il quale le fragranze raggiungono l’ambiente, queste, infatti vengono ritenute in quantità esigua dal mezzo sulle quali vengono applicate (pelle, capelli, vestiti, ecc..), mentre la maggior parte viene rilasciata. Come si vede nella Tabella 2 il 99% delle fragranze contenute nei prodotti elencati finisce tal quale nell’ambiente ad eccezione delle lozioni per il corpo che per le loro caratteristiche e modalità di utilizzo vengono assorbite e rilasciate in quantità minore (P. A. Cadby et al. 2002).

Tabella 2 - Percentuale di fragranze rilasciate in ambiente. Il fattore di ritenzione indica la quantità massima che rimane sulla pelle, sui capelli, sui vestiti o su altre superfici solide (P. A. Cadby et al.

2002). Prodotto Fattore di ritenzione stimato Percentuale rilasciata in ambiente Via di ingresso principale Lozioni per il corpo 1,00 0% - Shampoo 0,01 99% Acqua Prodotti per il bagno 0,001 99,9% Acqua Detersivo in polvere < 0,01 > 99% Acqua

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1.2. Analiti

Alcune stime indicano che esistano almeno 10.500 fragranze utilizzate come ingredienti in prodotti profumati (Klaschka & Kolossa-gehring 2007) e tali valutazioni suggeriscono che in ambiente vengano riversati un’enorme quantità di composti diversi.

Tra le moltissime fragranze in commercio, sono state selezionate 17 sostanze tra le più stabili e persistenti. Le fragranze selezionate hanno un ampio range di applicabilità in prodotti con caratteristiche anche molto differenti, dalla candeggina ai detergenti acidi. Questa stabilità chimica associata alla loro persistenza come profumi sono indicatori di una possibile persistenza ambientale.

Le fragranze utilizzate per preparare le soluzioni standard sono state fornite da Givaudan©_{, un’azienda fondata in Svizzera leader nel mercato delle fragranze}

sintetiche. Nella tabella che segue in grassetto sono riportati i nomi commerciali degli analiti, ad esempio Oranger Crystals, accompagnati dai nomi secondo la nomenclatura IUPAC2_{: 2-Acetonaphthone. La tenacia (“Tenacity on blotter”)}

indica la persistenza delle fragranze sulla carta. Questa voce può dare indicazioni sulla persistenza della fragranza una volta rilasciata in ambiente. Con “livello di utilizzo” si intende la percentuale massima con la quale la fragranza viene impiegata all’interno di una preparazione. Il valore massimo si evidenzia nel caso del Benzil salicilato che può raggiungere una percentuale di circa il 40%.

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Tabella 3 – Nome comune e nome IUPAC delle fragranze oggetto dell’indagine, peso molecolare, tenacia, percentuale di utilizzo, costante di ripartizione, pressione di vapore e origine della fragranza (www.thegoodscentscompany.com). Nome commerciale Nome IUPAC Peso Molecolare Tenacia Livello di utilizzo LogPow Pressione di vapore hPa (20°C) Prodotto in natura Ultravanil 2-Ethoxy-4-methylphenol (80% solution in dipropylene glycol) 152 Alcune settimane Tracce 0,2% 2,2 - No Lemonile 3,7-Dimethyl-2(3),6-nonadienonitrile 163,2 3 settimane Trace 5% 3,9 0,0133 No Pelargene Tetrahydro-2-methyl-4- methylene-6-phenyl-2H-pyran & 3,6-Dihydro-2,4-dimethyl-6-phenyl-2H-pyran & 3,6-Dihydro-4,6-dimethyl-2-phenyl-2H-pyran 188 Alcune settimane Fino al 2% 3,3 - No Mefranal 3-Methyl-5-phenylpentanal 176,2 Alcune settimane Fino al 2% 3,3 1,1998 No Bourgeonal 3-(4-tert-Butylphenyl)propanal 190 Alcune settimane Fino al 5% 3,7 0,0053 No Myraldene 4(3)-(4-Methylpent-3- enyl)cyclohex-3-enecarbaldehyde 192,3 Alcune settimane Tracce 0,5% 4,4 0,0067 No Tridecene-2-Nitrile 2-Tridecenenitrile 193,3 Alcune settimane Tracce 0,5% 5,5 0,0027 No Amil salicilato Pentyl 2-hydroxybenzoate &

3-Methylbutyl 2-hydroxybenzoate 208,3 Alcune settimane Fino al 10% 4,4 0,0040 Si Oranger Crystals 2-Acetonaphthone 170,2 Un mese e più 0,1 – 3% 2,8 0,0013 No Dupical 4 -(Octahydro-4,7-methano-5H-inden-5-ylidene)butanal 204 Alcune settimane 0,1 – 0,5% 4,1 0,0013 No Isobutavan/ Vanillin isobutyrate 4-Formyl-2-methoxyphenyl 2-methylpropanoate 222,2 Alcuni mesi Fino al 2% 2,0 >0,0013 No Esil salicilato Hexyl 2-hydroxybenzoate 222,2 Alcune settimane 2 – 5% 4,9 0,0013 Si Ambrofix/Ambroxide Dodecahydro-3a,6,6,9a-tetramethylnaphto[2,1b]furan 236,4 Un mese Tracce 2% > 6,0 0,0013 Si Peonile 2-Cyclohexylidene-2-phenylacetonitrile 197 Un mese e più 1 – 10% 4 0,0004 No Okoumal 2,4-Dimethyl-2-(1,1,4,4-

tetramethyltetralin-6-yl)-1,3-dioxolane (trans & cis isomers) 288,4 Un mese e più 0,5 – 4% 5,7 0,0006 No Benzil salicilato Benzyl 2-hydroxybenzoate 228,2 Alcune settimane Fino al 40% 4 < 0,0013 Si Amberketal IPM 3,8,8,11a- Tetramethyldodecahydro- 5H-3,5a-epoxy-napht[2,1-C]oxepin and isomers (8,5%

solution in isopropyl myristate) 278,4 Un mese e più Tracce 1% 5,7 0,0011 No

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La costante di ripartizione ottanolo/acqua (LogPow) indica l’affinità del composto

alla fase lipofilica o idrofilica. All’aumentare del valore del logaritmo aumenta il carattere lipofilico della molecola. Questo parametro fornisce un’indicazione molto importante sotto il profilo ecotossicologico, infatti, all’aumentare del valore del logaritmo aumenta la lipofilicità e questo indica che potenzialmente queste sostanze possono bioaccumulare nei tessuti una volta rilasciate in ambiente. Tali proprietà indicano che questi composti possono distribuirsi ed essere rinvenuti nel comparto acquatico, in quello aereo, nei sedimenti e in quello biotico (Klaschka & Kolossa-gehring 2007). La costante di ripartizione di queste sostanze varia da 2 a 6 ed è comparabile a quella di inquinanti in grado di bioaccumulare come ad esempio gli Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA) e i Policlorobifenili (PCB) (NIST).

Come si vede nella Tabella 3 le fragranze sintetiche sono presenti in piccole quantità nei prodotti per la cura personale, nonostante questo, non va sottovalutato il loro potenziale inquinante dato l’enorme impiego.

Secondo la Scientific Committee on Consumer Safety (SCCS), un organo della Commissione Europea preposto a fornire opinioni su rischi alla salute e sulla sicurezza (chimica, biologica e fisica) di prodotti di consumo non alimentari, la frequenza di allergie alle fragranze sintetiche nella popolazione europea è pari all’1-3 % (Committee & Sccs 2012).

I salicilati sono tra gli ingredienti di maggior interesse perché, come vedremo nel capitolo 3, sono tra i più abbondanti e i prodotti per i quali è presente una maggiore bibliografia.

Questi vengono utilizzati nei cosmetici, nei profumi, negli shampoo, nei saponi, e in altri prodotti non cosmetici come i detergenti per la casa (Belsito et al. 2012). Negli Stati Uniti è stato approvato da parte del FAD (Food and Drugs Administration3) l’uso dell’Amil salicilato e del Benzil salicilato e di altri 3 salicilati

non inseriti in questo studio, come aromi nei cibi.

3_{Ente governativo statunitense che si occupa della regolazione dei prodotti alimentari e} farmaceutici (http://www.fda.gov/).

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Tabella 4 - Impiego mondiale annuo dei salicilati espresso in tonnellate: a_{(Belsito et al. 2012),}b

riferito all’anno 2000 (Gaudin 2014) e c_{riferito all’anno 2010 (Gaudin 2014), esposizione sistemica e}

esposizione dermica giornaliera massima (Belsito et al. 2012).

Analita Impiego mondiale annuo (tonnellate) Esposizione sistemica4 (mg/kg/d) Livello massimo sulla pelle (%) Amil salicilato 100-1000a 3000b 6800c 0,1042 2,19 Esil salicilato > 1000a 2800b 7000c 0,1108 2,86 Benzil salicilato > 1000a 5700b 8500d 0,4023 6,71

I salicilati e i loro derivati sono presenti in molti oli essenziali vegetali (Bauer e Garbe 1985) e la loro tossicità acuta è distribuita in un range che varia da 0,7 a 10 mg/L (Belsito et al. 2012).

Queste sostanze sembrano essere facilmente biodegradabili, in particolare uno studio ha evidenziato che a distanza di tre mesi dall’aggiunta di una quantità nota di Esil salicilato in fanghi di un impianto di trattamento usati poi come ammendanti per il suolo, l’analita non veniva più determinato sia nel suolo che nel percolato (Difrancesco et al. 2004).

L’analita di maggior interesse e quello per il quale è presente una maggiore bibliografia è il Benzil salicilato, presente in una vasta gamma di prodotti che vanno dai cosmetici, ai profumi, agli shampoo, alle creme solari fino ai saponi. Si stima che l’uso mondiale di questa sostanza sia superiore alle 1000 tonnellate per anno e per tale motivo è inserita tra le sostanze chimiche HPV (High Production Volume5_{) (Lapczynski et al. 2007; Belsito et al. 2012).}

4_{Dose assorbita attraverso la pelle e resa disponibile per il sistema circolatorio.}

5_{Sostanze prodotte o importate negli USA in quantità superiori a 1.000 tonnellate per anno} (http://www.epa.gov/HPV/).

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Questa fragranza è inserita nella lista delle fragranze che più frequentemente causano allergie. Il livello cutaneo massimo di Benzil salicilato risultante da profumi è stimato essere pari al 6,71% o quello derivante da cosmetici in generale è pari al 15.79% portando ad un’esposizione giornaliera pari a 0,40 mg/kg (Lapczynski et al. 2007). Il Benzil salicilato possiede, inoltre, capacità estrogeniche in grado di aumentare le probabilità di insorgenza e proliferazione di cellule tumorali del seno (Charles & Darbre 2009; Zhang et al. 2012).

È noto che la diffusione delle fragranze nei diversi comparti ambientali, acqua, suolo e aria è molto ampia però poco è conosciuto ed esistono relativamente pochi studi che attestino il destino e gli effetti delle fragranze sintetiche nei maggiori comparti ambientali (Bridges 2002; Zhang et al. 2013), di seguito verranno esposti i risultati di alcuni lavori riguardanti queste sostanze da cui sono state tratte molte informazioni utili alla redazione di questo elaborato.

Livelli di Benzil salicilato pari a circa 9 µg/L e di Esil salicilato pari a circa 5 µg/L sono stati misurati in ingresso ad un impianto di trattamento delle acque reflue vicino a Cincinnati, Ohio, USA (Simonich et al. 2000).

Da un altro studio risulta che per 12 campioni raccolti negli USA in affluenti ad impianti di trattamento delle acque reflue, la concentrazione del Benzil salicilato risultano essere pari a circa 10 µg/L mentre quella dell’Esil salicilato si attesta attorno ai 6 µg/L. Lo stesso studio riporta anche i risultati di 5 campioni raccolti in Europa mostrando che le concentrazioni sono simili a quelle per gli affluenti americani: 11 µg/L per il Benzil salicilato e circa 7 µg/L per l’Esil (Simonich et al. 2002).

In uno studio pubblicato nel 2011 (Kameda et al. 2011) condotto in alcuni fiumi della prefettura giapponese di Saitama, sono riportati livelli medi di Benzil salicilato pari a 145 ng/L.

Oltre che nell’acqua superficiale il Benzil salicilato è stato ritrovato anche in campioni di aria provenienti da ambienti domestici (indoor air) a concentrazioni pari a circa 0,16 µg/m3_{(Lamas et al. 2010).}

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Tabella 5 - Formule di struttura degli analiti.

Nome Formula Nome Formula

Ultravanil Dupical Lemonile Isobutavan Pelargene Esil salicilato Mefranal Ambrofix Bourgeonal Peonile Myraldene Okoumal Tridecene-2-Nitrile Benzil Salicilato Amil Salicilato Amberketal Oranger Crystals

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1.3. Area d’indagine

La laguna veneta è situata nella zona settentrionale del mar Adriatico e le sue acque salmastre bagnano buona parte delle coste del Veneto.

Il paesaggio lagunare si è formato nel corso di migliaia di anni, tutto ebbe inizio dopo l’ultima glaciazione, la würmiana, circa 20.000 anni fa e la conformazione che osserviamo oggi è il risultato dell’azione di fattori naturali e antropici.

Una laguna si forma dall’opposizione di due elementi: quelli continentali, rappresentati dai fiumi che con il loro fluire dai molti al mare, trasportano sedimenti che man mano che si avvicinano al bacino marino diminuiscono di granulometria; e quelli marini ovvero le correnti, generate dai venti preponderanti che, nell’alto Adriatico sono la bora da nord/est e lo scirocco da sud/ovest (Scortegagna 2009).

La laguna è un sistema complesso e si trova in una zona di transizione che subisce l’influsso del bacino scolante dell’entroterra veneziano e lo scambio di marea con il mare Adriatico attraverso le tre bocche di porto.

Figura 1 - Immagine da satellite della laguna veneta (Google Earth). Venezia

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Il bacino scolante rappresenta il territorio la cui rete idrica superficiale, in condizioni di deflusso ordinario, scarica nella laguna. Il bacino scolante della laguna di Venezia ha superficie di circa 2.000 km2_{, approssimativamente un nono}

della superficie della regione Veneto.

Il bacino scolante interessa 108 comuni, per un totale di circa un milione di abitanti e la zona di ricarica copre una superficie di 86 km2_(ARPAV).

La laguna ha un’estensione di circa 550 km2_{e una profondità media di 1,5 metri.}

Il profilo batimetrico è molto variabile ed è possibile trovare zone di acqua molto profonda, come ad esempio le bocche di porto e i canali per le grandi navi e zone sottoposte ad emersione e sommersione giornaliera dovuta alla marea, le zone delle barene.

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Nel 1987 la laguna è stata inserita nella lista dei siti patrimonio dell’umanità dell’Unesco.

Al suo interno troviamo la città di Venezia, che assieme alle altre isole e terre emerse, rappresenta l’8% della superficie della laguna. Nel centro storico veneziano abitano stabilmente circa 56.000 persone, dato in continua diminuzione, visto che negli anni ’70 il numero di abitanti era più del triplo del numero attuale (Servizio Statistica e Ricerca - Comune di Venezia).

Venezia è stata scelta come sito d’indagine perché, oltre ad essere inserita in un sito naturale protetto, è mancante di un sistema fognario adeguato alla raccolta delle acque di scarico. Questo significa che quasi tutto quello che viene trasportato attraverso le acque grigie e quelle nere, si ritrova nell’acqua dei canali. È doveroso precisare che, mentre un tempo le acque nere finivano per mezzo di

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condotte, dette gatoli, direttamente nei canali, oggi, in molti casi, sono adoperati sistemi a vasche biologiche al fine di attenuare il carico dei reflui.

Un ruolo importante nella dinamica di smaltimento delle acque reflue è giocato dalla marea: questa due volte al giorno entra dalle bocche di porto e fuoriesce 6 ore più tardi portando con se buona parte del carico accumulatosi durante le ore di marea crescente.

Tale dinamica è maggiormente efficace per i canali più ampi e situati nelle zone più esterne della città, ovvero sottoposti in maggior misura al flusso di marea. Diverso è il caso per i canali più piccoli e interni dato che sono caratterizzati da una minore portata e sono influenzati dal flusso di marea in quantità minore.

Figura 4 - Venezia e Burano in una vista da satellite, con dettaglio della città di Burano in basso a destra (Google Earth).

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Un altro sito su cui si è concentrata l’attenzione di questo lavoro è l’isola di Burano, situata nella parte settentrionale della laguna l’isola è composta a sua volta da 4 isole più piccole separate tra loro da 3 canali interni. Ha una superficie di circa 21 ettari e una popolazione di 2700 abitanti.

La scelta di raccogliere alcuni campioni anche in questo sito è nata dal fatto che l’isola recentemente è stata sottoposta ad un intervento di implementazione parziale della rete fognaria.

Secondo Insula, società pubblica incaricata di realizzare opere di manutenzione urbana ed edilizia per il comune di Venezia e addetta alla realizzazione del servizio fognario per la città di Burano, al momento della redazione di questo documento, sono stati portati a termine la metà dei lotti, ovvero 5 dei 10 previsti. Questo significa che sono stati messi a dimora 12,3 km di tubazioni rispetto ai 25,4 totali.

Come si vede nella Figura 5, in verde sono evidenziate le zone in cui è stato implementato il sistema fognario di raccolta dei reflui, che attraverso una condotta sublagunare vengono trasportati al depuratore di Sant’Erasmo. In rosso, invece, sono rappresentate le zone che ancora non sono state sottoposte all’intervento.

- Venezia e Burano da satellite, con dettaglio di Burano in basso a destra (Google Earth).

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Alla luce di questi dati, sarà interessante confrontare i dati ottenuti dai campioni raccolti nei canali adiacenti alle zone servite da fognatura rispetto a quelli ottenuti da campioni raccolti nelle zone non ancora servite e vedere se l’implementazione di tale infrastruttura permette un abbattimento del carico sversato nell’ambiente acquatico lagunare.

Anche in questa località sarà importante capire il ruolo giocato dalla marea nello smaltimento del carico di reflui.

1.4. Consumo pro capite

Il consumo di detergenti e cosmetici è distribuito in maniera differente tra le varie regioni europee, il maggior utilizzatore è l’Italia con un consumo pro capite pari a 12,6 Kg per anno mentre la media europea si attesta a 10,1 Kg/y (HERA 2004). Sulla base di questi dati è possibile fare una stima della concentrazione di fragranze sintetiche scaricata ogni giorno nei canali di Venezia.

Ad un abitante equivalente (AE) corrisponde un volume di scarico pari a 250 L/d di refluo. Il fattore moltiplicativo per il dimensionamento di una fossa settica per acque nere è pari a 0,4 m3_{/AE (Comune di Venezia).}

Considerando uno scarico pari a 250 L/d e un consumo di detergenti pari a 12,6 Kg/y, che corrispondono a 34,5 g/d, è possibile dedurre che nel refluo prodotto in un giorno da un abitante equivalente la concentrazione di cosmetici e detergenti sia approssimativamente pari a 0,1 g/L.

Come visto nei paragrafi precedenti, le fragranze sintetiche vengono impiegate nei prodotti finali in percentuali relativamente basse; fissando queste percentuali in un range tra 0,25 e 5 % (Costa et al. 2015) è plausibile pensare che la concentrazione di tali sostanze allo scarico sia dell’ordine di grandezza attorno a 1 mg/L.

Assumendo che per abitazioni civili gli abitanti equivalenti corrispondono ai residenti (tralasciando quindi uffici, ristoranti e alberghi che hanno coefficienti particolari di maggiorazione o minorazione) è possibile stimare la quantità di fragranze sintetiche scaricate ogni giorno.

Il centro storico di Venezia è abitato da circa 60.000 persone, ognuna delle quali si stima possa produrre ogni giorno 250 L di reflui (acque nere e miste), dividendo il valore corrispondente al consumo giornaliero di detergenti per il volume di

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liquami prodotti si ottiene una concentrazione allo scarico pari a circa 0,14 g/L, applicando le percentuali relative alle fragranze sintetiche queste concentrazioni si traducono in un range compreso tra circa 0,35 e 7 mg/L al giorno. Moltiplicando il numero di abitanti per il consumo annuo di detergenti e applicando le percentuali viste in precedenza si stima che la quantità di fragranze scaricate nel solo centro storico di Venezia sia compreso approssimativamente tra le 2 e le 40 tonnellate annue.

Nella migliore delle ipotesi questo carico viene sottoposto solamente ad un trattamento primario prima di essere rilasciato nelle acque superficiali dell’ambiente lagunare. Secondo uno studio (Simonich et al. 2000) questo trattamento garantisce una percentuale di rimozione attorno al 60 %6_.

Già da questi primi dati, si nota che le sostanze all’oggetto di tale studio possono avere un impatto significativo sull’ambiente in cui è inserita la città di Venezia.

(25)

2. Materiali e metodi

2.1. Strumentazione e materiali utilizzati

Tutti i solventi utilizzati: acetone, diclorometano e toluene, sono di grado purezza pesticidi (Romil Ltd. Cambridge, GB), il Fenantrene 13_{C (CLM-2451) usato come}

standard interno marcato è prodotto da Cambridge Isotope Laboratories, Inc., (Andover, Massachusetts, USA) e gli standard dei profumi sono stati forniti da Givaudan©_{(Vernier, Svizzera).}

2.1.1. Estrazione in fase solida SPE

L’estrazione in fase solida è una tecnica di preparazione del campione che sfrutta diverse proprietà del campione al fine di separarlo dalla matrice di partenza. Questa tecnica di preparazione permette l’estrazione, la purificazione e una prima concentrazione dei campioni prima della loro quantificazione.

L’SPE utilizza la differenza di affinità tra analita ed interferente presenti nella matrice acquosa, tale affinità permette la separazione della sostanza target dalle impurità indesiderate.

In questo studio sono state impiegate cartucce Oasis da 6 cc HLB (Hydrophilic Lipophilic Balanced) prodotte dalla Waters©_{contenenti 200 mg di fase stazionaria}

che sfruttano l’estrazione a fase inversa ottenuta grazie all’impiego di due monomeri: uno idrofilico l’N-vinilpirrolidone e l’altro lipofilico il divinilbenzene (http://www.waters.com/).

La separazione a fase inversa viene condotta in genere su una matrice polare, generalmente acquosa, e una fase stazionaria non polare.

(26)

2.1.2. Turbovap®

Il Turbovap®_{è uno strumento che consente la riduzione, attraverso}

evaporazione, del volume di un campione sotto leggero flusso di azoto.

Lo strumento è formato da una console nella quale è possibile impostare le modalità di funzionamento e la temperatura del bagno d’acqua, da una camera in cui si possono alloggiare sei ditali che sono immersi per alcuni centimetri in un bagno d’acqua termostatato. Sul coperchio, in corrispondenza della sommità dei ditali, sono posizionati sei ugelli che erogano un flusso d’azoto.

L’evaporazione è favorita dal flusso del gas inerte erogato all’interno del ditale fino al raggiungimento del volume finale segnalato da un sensore ottico.

2.1.3. Gascromatografia accoppiata a spettrometria di massa (HRGC-LRMS)

L’analisi dei campioni è stata svolta attraverso un gascromatografo (Agilent Technologies 7890A GC System) accoppiato ad un analizzatore di massa al quadrupolo (Agilent Technologies 5975C inert MSD) utilizzato in modalità SIM (Single Ion Monitoring).

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Un volume di 2 µL di campione viene iniettato mediante un’apposita siringa, la soluzione viene vaporizzata e fatta passare, grazie ad un flusso di elio (fase mobile), attraverso una colonna capillare. In uscita dalla colonna il campione viene ionizzato mediante un fascio di elettroni prodotto dalla sorgente ad impatto elettronico (EI).

Per l’analisi degli analiti in questione è stata utilizzata una colonna capillare in silice fusa con fase stazionaria in (5% -fenil)-metilpolisilossano della lunghezza di 60 m (Agilent Technologies HP-5ms).

Il dettaglio di tutte le condizioni strumentali è riportato nella Tabella A 2 in appendice.

Per ogni analita sono stati monitorati due rapporti carica/massa (m/z). Lo ione principale è stato scelto come il più abbondante e/o meno interferito nello spettro di massa di ciascun analita.

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Tabella 6 - Ioni principali e di conferma degli analiti oggetto d'indagine. Analita Ione Principale Di conferma Ultravanil 124.1 152.1 Lemonile 148.1 162.1 Pelargene 129.1 188.1 Mefranal 91.1 176.1 Bourgeonal 175.1 190.1 Myraldene 192.1 149.1 Tridecene-2-nitrile 164.1 192.1 Amil salicilato 120.1 208.1 Oranger Crystals 155.1 170.1 Dupical 135.1 120.1 Isobutavan 152.1 222.1 Esil salicilato 120.1 222.1 Ambrofix 221.1 236.4 Peonile 197.1 130.1 Fenantrene13_C _184.1 Okoumal 273.1 215.2 Benzil salicilato 91.1 228.1 Amberketal 190.2 218.2

(29)

2.2. Messa a punto di una metodologia sperimentale per la determinazione di fragranze sintetiche

La mancanza di studi riguardanti le fragranze sintetiche prese in esame ha fatto nascere la necessità di sviluppare un metodo analitico che permettesse la determinazione ambientale di tali sostanze.

La struttura generale della metodica analitica era stata precedentemente sviluppata all’interno del gruppo di ricerca mentre le attività riportate nel presente lavoro di tesi hanno riguardato la validazione della metodica stessa, l’applicazione ai campioni esplorativi ed infine l’analisi dei campioni reali.

Tutta la vetreria e gli strumenti utilizzati sono stati trattati prima di ogni utilizzo con acqua e detergente Contrad®_{e successivamente decontaminati tramite}

lavaggi con due aliquote di acetone e due di diclorometano.

2.2.1. Campionamento

I campioni d’acqua sono stati raccolti in bottiglie di vetro da 500 mL preventivamente lavate e decontaminate. In fase di raccolta dei campioni le bottiglie sono state dapprima avvinate con un’aliquota di acqua e poi riempite completamente.

I campioni raccolti sono stati conservati in frigorifero ad una temperatura di 4°C fino al momento della loro preparazione per l’analisi.

Le stazioni di campionamento sono state selezionate in modo tale che coprissero diversi punti del centro storico della città di Venezia e fosse quindi possibile avere una visione più dettagliata della distribuzione spaziale degli analiti. Oltre alla copertura spaziale, è stata presa in considerazione la dinamica idrologica dei canali, cercando di scegliere canali relativamente piccoli e con scarsa circolazione d’acqua.

Oltre alle caratteristiche geografiche e fisiche dei siti si è valutata anche la qualità chimica dell’acqua e del sedimento. Questo è stato fatto consultando l’Atlante della Laguna di Venezia accostando alle caratteristiche esposte in precedenza i valori di inquinamento da Idrocarburi Policiclici Aromatici, PAH (Figura 9) e dei Policlorobifenili, PCB (Figura 10).

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Nelle due figure, i colori più chiari rappresentano concentrazioni minori, mentre quelli più scuri concentrazioni maggiori.

In conclusione, considerando tutte le variabili prese in esame si è giunti a selezionare 14 punti di campionamento nel centro storico veneziano e al fine di confrontare i dati ottenuti dai campioni in questi punti con una situazione a minore impatto antropico si è scelto di raccogliere due campioni in due zone di laguna aperta a nord dell’isola di Burano (Figura 11).

Figura 9 – Concentrazione di PAH espressa in mg/kg presente nei sedimenti (http://www.atlantedellalaguna.it).

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Per Burano, invece, i punti di campionamento sono stati scelti sulla base della conformazione geografica dell’isola. Come visto nell’introduzione, questa è formata da 4 isole separate da tre canali. I campioni sono stati prelevati in 6 punti distribuiti tra i canali in modo da coprire buona parte della città e tenendo in considerazione l’avanzamento dei lavori di implementazione della fognatura. Pertanto, due punti risultano essere inseriti in canali adiacenti a fondamenta mancanti di sistema fognario, tre si trovano nella situazione opposta e uno in una situazione intermedia.

Nelle figure che seguono sono rappresentati i punti di campionamento selezionati per la città di Venezia, per Burano e i due in laguna aperta andando così a delineare la zona d’indagine di questo studio.

Figura 10 - Concentrazione di PCB espressa in mg/kg presente nei sedimenti (http://www.atlantedellalaguna.it).

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Figura 11 - Punti di campionamento Venezia e laguna aperta a destra.

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I dati esposti in questo lavoro sono stati ottenuti da diverse campagne di campionamento

1. Prima campagna: campioni esplorativi; 2. Seconda campagna: distribuzione spaziale;

3. Terza campagna: evoluzione temporale ed influenza della marea; 4. Quarta campagna: evoluzione su scala temporale breve.

La prima campagna è stata effettuata a carattere esplorativo, in modo da avere dei campioni reali su cui testare il metodo analitico sviluppato.

Tabella 7 - Dati relativi ai campioni esplorativi raccolti in data 16 aprile 2015. Vengono indicate la stazione, il luogo di raccolta, le coordinate geografiche, la data di campionamento e il codice univoco associato ad ogni campione.

Prima Campagna

Stazione Luogo Coordinate Data Codice

C1 Venezia Centro storico 45°26'19.83"N 12°19'34.64"E 16/04/2015 Ve1S1 C2 Venezia Centro storico 45°26'19.20"N 12°19'46.21"E 16/04/2015 Ve2S1 C3 Venezia Centro storico 45°26'11.64"N 12°20'27.87"E 16/04/2015 Ve3S1 C4 Venezia Centro storico 45°26'0.18"N 12°20'3.06"E 16/04/2015 Ve4S1

La seconda è stata la campagna più ampia e diffusa poiché sono stati raccolti 22 campioni da altrettante stazioni, di cui 14 nel centro storico di Venezia, 6 nella città di Burano e 2 in laguna aperta. Questo campionamento è stato effettuato il 5 ottobre (centro storico di Venezia) e il 6 ottobre (Burano e laguna aperta) 2015.

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Tabella 8 - Campioni reali raccolti nei giorni 5 e 6 ottobre 2015. Vengono indicate la stazione, il luogo di raccolta, le coordinate geografiche, la data di campionamento e il codice univoco associato ad ogni campione.

Seconda campagna

Stazione Luogo Coordinate Data Codice

C1 Venezia

Centro storico 45°26'19.83"N 12°19'34.64"E 05/10/2015 Ve1S2

C2 Venezia

C3 Venezia

C4 Venezia

C5 Venezia

C6 Venezia

C7 Venezia

C8 Venezia

C9 Venezia

C10 Venezia

C11 Venezia

C12 Venezia

C13 Venezia

C14 Venezia

C15 Laguna aperta 45°29'18.26"N 12°25'2.32"E 06/10/2015 La1S2

C16 Laguna aperta 45°30'12.50"N 12°24'42.47"E 06/10/2015 La2S2

BUR.1 Burano 45°29'12.46"N 12°25'4.57"E 06/10/2015 Bu1S2

BUR.2 Burano 45°29'8.89"N 12°25'2.66"E 06/10/2015 Bu2S2

BUR.3 Burano 45°29'6.23"N 12°24'57.83"E 06/10/2015 Bu3S2

BUR.4 Burano 45°29'3.29"N 12°25'1.44"E 06/10/2015 Bu4S2

BUR.5 Burano 45°29'4.27"N 12°25'11.27"E 06/10/2015 Bu5S2

BUR.6 Burano 45°29'8.26"N 12°25'13.25"E 06/10/2015 Bu6S2

Allo scopo di valutare la distribuzione spaziale degli analiti, questo campionamento è stato effettuato in una situazione di quadratura di marea (Figura 13, http://www.comune.venezia.it/). Questa situazione si verifica quando

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la Luna si trova nella fase di primo o ultimo quarto e il risultato è un’attenuazione dell’escursione di marea permettendo così di raccogliere i campioni in condizioni confrontabili tra i diversi siti e pressoché costanti durante l’intero arco della giornata di campionamento.

La terza campagna di campionamento è stata effettuata nei giorni 10, 11 e 12 dicembre 2015 ed è stata svolta per valutare l’evoluzione temporale giornaliera e l’influenza delle maree sulla concentrazione degli analiti. Durante questa fase ci si è focalizzati sui punti di campionamento più interessanti secondo i risultati emersi dalla precedente campagna, ovvero le stazioni C1, C2 e BUR.2.

Più precisamente, il 10 e l’11 dicembre sono stati raccolti un totale di 12 campioni nelle stazioni C1 e C2, seguendo l’ordine esposto nella Tabella 9. Il 12 dicembre sono stati raccolti 3 campioni a Burano, nel punto 2 (BUR.2), nelle stesse condizioni dei campioni raccolti nel centro storico di Venezia: alta, media e bassa marea.

Figura 14 - Andamento della marea dal 10 al 13 dicembre (http://www.comune.venezia.it/). Figura 13 - Quadratura di marea del 5 ottobre 2015 (http://www.comune.venezia.it/).

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Tabella 9 - Campioni raccolti per testare l'influenza della marea sulla concentrazione degli analiti all'interno dei campioni. Vengono indicate la stazione, il luogo di raccolta, le coordinate

geografiche, la data e l’ora di campionamento e il codice univoco associato ad ogni campione.

Terza campagna

Stazione Luogo Coordinate Data Ora Codice C1A Venezia

Centro storico 45°26'19.83"N 12°19'34.64"E 10/12/2015 09:06 Ve1S3A

C1B Venezia

Centro storico 45°26'19.83"N 12°19'34.64"E 10/12/2015 12:42 Ve1S3B

C1C Venezia

Centro storico 45°26'19.83"N 12°19'34.64"E 10/12/2015 16:17 Ve1S3C

C2A Venezia

C2B Venezia

C2C Venezia

Centro storico 45°26'19.20"N 12°19'46.21"E 10/12/2015 16:05 Ve2S3C

C1A1 Venezia

Centro storico 45°26'19.83"N 12°19'34.64"E 11/12/2015 09:51 Ve1S3D

C1B1 Venezia

Centro storico 45°26'19.83"N 12°19'34.64"E 11/12/2015 13:16 Ve1S3E

C1C1 Venezia

Centro storico 45°26'19.83"N 12°19'34.64"E 11/12/2015 16:10 Ve1S3F

C2A1 Venezia

Centro storico 45°26'19.20"N 12°19'46.21"E 11/12/2015 09:43 Ve2S3D

C2B1 Venezia

Centro storico 45°26'19.20"N 12°19'46.21"E 11/12/2015 13:10 Ve2S3E

C2C1 Venezia

Centro storico 45°26'19.20"N 12°19'46.21"E 11/12/2015 16:00 Ve2S3F

BUR.2A Burano 45°29'8.89"N 12°25'2.66"E 12/12/2015 11:00 Bu2S3A

BUR.2B Burano 45°29'8.89"N 12°25'2.66"E 12/12/2015 14:00 Bu2S3B

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La quarta ed ultima campagna di campionamento è stata effettuata l’11 gennaio 2016 ed è stata condotta per valutare l’evoluzione delle concentrazioni su scala temporale breve.

Sono stati raccolti tre campioni nella stessa stazione, C1, a distanza di pochi minuti l’uno dall’altro.

Tabella 10 - Quarta campagna di campionamento effettuata in data 11 gennaio 2016. Vengono indicate la stazione, il luogo di raccolta, le coordinate geografiche, la data e l’ora di

campionamento e il codice univoco associato ad ogni campione.

Quarta campagna

Stazione Luogo Coordinate Data Ora Codice

C1A Venezia

C1B Venezia

C1C Venezia

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2.2.2. Preparazione campioni

Il primo step prevede l’aggiunta di una quantità nota di uno standard interno in modo tale da rendere possibile la determinazione della concentrazione degli analiti presenti nei campioni. Tale tecnica si basa sul confronto del segnale di risposta dell’analita rispetto al segnale fornito dallo standard. Questi due segnali sono confrontabili poiché lo standard aggiunto al campione subisce i medesimi step procedurali degli analiti. Affinché gli errori vengano minimizzati è necessario che il composto utilizzato come standard abbia caratteristiche chimiche e fisiche simili agli analiti di interesse e che non sia presente naturalmente nei campioni. In questo lavoro si è scelto di utilizzare come standard interno il Fenantrene marcato 13_{C e a ogni campione sono stati aggiunti 50 µL di standard interno ad}

una concentrazione di 1 ng/µL.

In fase di messa a punto del metodo sono stati testati come standard interni anche altri composti, ovvero la Vanillina 13_{C, l’Acenaftilene} 13_{C e il}

Benzo(a)Pirene 13_{C, tuttavia il Fenantrene si è dimostrato il più idoneo in termini}

di resa e accuratezza.

Dopo l’aggiunta dello standard interno si è proceduto al condizionamento della cartuccia Oasis®_{HLB da 6 cc per SPE (Solid Phase Extraction) dotata di 200 mg}

di una fase adsorbente polimerica. Il condizionamento, attuato attraverso l’eluizione di 10 mL di diclorometano e successivamente di 10 mL di acqua ultrapura (ELGA), prepara la fase solida presente nella cartuccia all’estrazione. Una volta completato il condizionamento della cartuccia, si è proceduto con l’estrazione del campione: questo viene fatto fluire attraverso la cartuccia SPE che è stata collegata ad una beuta ed è stato creato il vuoto attraverso una pompa apposita.

Una volta completata l’estrazione dei 500 mL di campione si è proceduto all’eluizione con solvente per riportare in soluzione gli analiti che sono stati trattenuti dalla fase adsorbente presente nella cartuccia. In questo caso sono stati utilizzati dapprima 1 mL di toluene e successivamente 15 mL di diclorometano.

L’eluato è stato raccolto in una vial e vi è stato aggiunto del solfato di sodio anidro, Na2SO4, in maniera tale da rimuovere qualsiasi traccia di umidità eventualmente

(39)

presente. La rimozione dell’umidità non è stata effettuata mediante essicazione all’aria della cartuccia a causa della volatilità degli analiti che avrebbe potuto portare ad un abbassamento delle rese del metodo.

L’eluato privato dell’acqua residua è stato trasferito in un ditale da Turbovap®_{, il}

sale rimasto nella vial è stato lavato con un’aliquota di 5 mL di diclorometano e trasferito anch’esso nel ditale.

Questo è stato posto nello strumento per far evaporare l’eccesso di solvente e concentrare la soluzione ad un volume finale di 250 µL.

Una volta ottenuto il volume desiderato la soluzione da analizzare è stata trasferita in vial da autocampionatore.

2.2.3. Quantificazione

Poiché la sensibilità strumentale non è identica per i diversi analiti, è necessario correggere le concentrazioni trovate attraverso i fattori di risposta strumentali, ottenuti mediante soluzioni che contengono in concentrazioni note i composti nativi e i marcati 13_{C. Queste soluzioni vengono sottoposte ad analisi}

gascromatografica nelle stesse condizioni dei campioni e dal confronto tra le aree dei picchi dei nativi e dello standard marcato e delle loro concentrazioni è possibile calcolare il fattore di risposta:

𝐹𝑅 =[𝐴𝑖∙ 𝐶𝑖𝑠] [𝐴_𝑖𝑠∙ 𝐶_𝑖] In cui

𝐴𝑖 = area del picco del composto nativo;

𝐴_𝑖𝑠 = area del l picco del composto marcato; 𝐶_𝑖 = concentrazione del composto nativo; 𝐶𝑖𝑠 = concentrazione del composto marcato.

La quantificazione degli analiti è poi ottenuta per confronto diretto dell’area dei picchi cromatografici prodotti dagli analiti con l’area dei picchi degli standard marcati che vengono aggiunti all’inizio della metodica sviluppata. Si assume che gli standard interni aggiunti prima dell’estrazione abbiano lo stesso comportamento chimico-fisico degli analiti e pertanto la medesima interazione

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con la matrice, i solventi e tutti i materiali con cui il campione viene a contatto. Ciò significa che le perdite di analita che si verificano durante la preparazione del campione devono verificarsi in misura uguale anche per gli standard aggiunti in concentrazione nota: sarà pertanto possibile risalire in questo modo alla concentrazione di partenza.

È importante sottolineare che le concentrazioni espresse nelle tabelle che seguiranno si riferiscono alla concentrazione della miscela commerciale dato che per molti dei composti non sono disponibili standard puri.

Ad esempio in C1 l’Oranger Crystals ha una concentrazione di 11,2 ng/L (Tabella

17), questa concentrazione non si riferisce alla molecola 2-Acetonaphtone, ma

(41)

3. Risultati e discussione

3.1. Validazione della metodica analitica

Al fine di valutare la qualità dei dati ottenuti applicando la metodica analitica sviluppata si è proceduto analizzando la resa, l’accuratezza e i limiti strumentali su campioni “sintetici”.

3.1.1. Resa

A partire dai prodotti commerciali puri è stata creata una soluzione in diclorometano contenente tutti gli analiti, ciascuno alla concentrazione di 50 ng/µL. Per effettuare le diverse prove, 200 µL di tale soluzione sono stati aggiunti a 500 mL di acqua ultrapura (ELGA).

Allo scopo di valutare la resa lo standard interno è stato aggiunto successivamente alla fase di concentrazione e immediatamente prima dell’iniezione dei campioni nel gascromatografo.

Tabella 11 - Validazione del metodo analitico: resa percentuale, media e deviazione standard (DS).

Analita Resa1 Resa2 Resa3 Media DS

% % % % Ultravanil ₉₇ ₉₁ ₉₇ ₉₅ ₄ Lemonile ₈₆ ₈₂ ₈₆ ₈₅ ₃ Pelargene ₈₃ ₇₉ ₈₄ ₈₂ ₃ Mefranal ₈₄ ₇₉ ₈₄ ₈₂ ₃ Bourgeonal ₈₉ ₈₅ ₉₀ ₈₈ ₃ Myraldene ₈₇ ₈₃ ₈₃ ₈₄ ₂ Tridecene-2-nitrile ₇₂ ₆₈ ₇₅ ₇₂ ₄ Amil salicilato ₈₄ ₇₉ ₈₄ ₈₂ ₄ Oranger Crystals ₉₀ ₈₅ ₉₀ ₈₈ ₃ Dupical ₈₅ ₈₀ ₈₆ ₈₄ ₄ Isobutavan ₈₉ ₈₅ ₈₉ ₈₈ ₂ Esil salicilato ₈₁ ₇₆ ₈₁ ₈₀ ₄ Ambrofix ₈₃ ₇₈ ₈₄ ₈₂ ₄ Peonile ₈₈ ₈₄ ₈₈ ₈₇ ₃ Okoumal ₇₉ ₈₃ ₈₈ ₈₃ ₅ Benzil salicilato ₈₇ ₈₃ ₈₈ ₈₆ ₃ Amberketal ₈₅ ₈₁ ₈₇ ₈₅ ₃

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Come si vede dalla tabella precedente le rese ottenute sono molto buone per le 17 fragranze selezionate, all’interno di un range che si estende dal minimo del Tridecene-2-nitrile pari al 72% fino al massimo dell’Ultravanil corrispondente al 95%.

Le deviazioni standard molto piccole indicano che i risultati tra le repliche sono poco dispersi evidenziando che il metodo è dotato di un altrettanto buona precisione.

3.1.2. Accuratezza

L’accuratezza è stata valutata seguendo la metodica analitica stabilita aggiungendo all’inizio del procedimento, oltre alla miscela contenente gli analiti a concentrazione nota, anche lo standard interno.

Come per le prove relative alla resa, anche in questo caso sono state effettuate tre repliche per poterne valutare la variabilità.

Figura 15 - Resa: confronto tra le medie e le deviazioni standard.

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 % Media

(43)

Tabella 12 - Validazione del metodo analitico: accuratezza percentuale, media e deviazione standard (DS).

Analita Acc.1 Acc.2 Acc.3 Media DS

% % % % Ultravanil ₁₁₀ ₁₀₆ ₁₀₃ ₁₀₆ ₃ Lemonile ₉₄ ₉₆ ₉₃ ₉₄ ₂ Pelargene ₉₄ ₉₁ ₈₉ ₉₁ ₃ Mefranal ₉₅ ₉₁ ₈₉ ₉₂ ₃ Bourgeonal ₁₀₁ ₉₈ ₉₇ ₉₉ ₂ Myraldene ₉₅ ₉₃ ₉₃ ₉₄ ₁ Tridecene-2-nitrile ₇₀ ₆₆ ₇₁ ₆₉ ₄ Amil salicilato ₈₈ ₈₆ ₈₅ ₈₆ ₂ Oranger Crystals ₁₀₂ ₉₈ ₉₇ ₉₉ ₃ Dupical ₉₂ ₈₉ ₉₀ ₉₀ ₂ Isobutavan ₁₀₂ ₉₈ ₉₇ ₉₉ ₂ Esil salicilato ₇₉ ₇₇ ₈₀ ₇₉ ₂ Ambrofix ₈₅ ₈₅ ₈₅ ₈₅ ₀ Peonile ₉₈ ₉₆ ₉₅ ₉₇ ₂ Okoumal ₇₇ ₇₅ ₈₀ ₇₇ ₃ Benzil salicilato ₉₄ ₈₈ ₉₁ ₉₁ ₃ Amberketal ₈₅ ₈₆ ₈₇ ₈₆ ₁

Anche in questo caso i risultati sono soddisfacenti dato che i valori sono caratterizzati da deviazioni standard relativamente ridotte e valori percentuali in media attorno al 90%.

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Come noto, l’accuratezza è una misura della vicinanza tra il valore reale e il dato ottenuto. Nel caso dei dati ottenuti è possibile quindi dire che il metodo è accurato, dato che la differenza tra la concentrazione immessa nei campioni analizzati è pari circa alle concentrazioni misurate in uscita da esse.

3.1.3. Limiti strumentali

Il limite strumentale è stato valutato al fine di misurare la minima concentrazione di ogni analita rilevabile dallo strumento.

Per fare questo, a partire da una soluzione contenente un mix degli analiti a concentrazione nota, si sono effettuate cinque diluizioni.

La soluzione di partenza, denominata 1, ha una concentrazione media per ogni analita di circa 250 pg/µL7_{, da questa si sono ottenute due diluizioni: la 2 a circa}

100 pg/µL e la 3 a 50 pg/µL. Dalla diluizione 2 è stata ottenuta la diluizione 4 a

7_{1 pg corrisponde a 10}-12_g.

Figura 16 – Accuratezza: confronto tra le medie e le deviazioni standard.

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 % Media

(45)

circa 20 pg/µL, mentre, dalla diluizione 3 è stata ottenuta la 5 a 10 pg/µL, da quest’ultima, infine, è stata ottenuta la diluizione 6 a circa 2 pg/µL.

Tutte queste soluzioni sono state iniettate nel gascromatografo e si sono poi analizzati i cromatogrammi corrispondenti, valutando, dalla concentrazione più bassa a quella più elevata, quali analiti fossero via via presenti.

Tabella 13 - Minima Concentrazione Rilevata (pg/µL) e quantità assoluta iniettata (pg).

Analita Minima Concentrazione Rilevata Quantità assoluta

pg/µL (soluzione) pg Ultravanil 9,1 (5) 18 Lemonile 41 (3) 83 Pelargene 1,7 (6) 3 Mefranal 2,5 (6) 5 Bourgeonal 1,8 (6) 4 Myraldene 9,1 (5) 18 Tridecene-2-nitrile 1,7 (6) 3 Amil salicilato 2,0 (6) 4 Oranger Crystals 18 (4) 35 Dupical 19 (4) 38 Isobutavan 1,6 (6) 3 Esil salicilato 2,0 (6) 4 Ambrofix 1,6 (6) 3 Peonile 1,7 (6) 3 Okoumal 1,9 (6) 4 Benzil salicilato 2,7 (6) 5 Amberketal 8,9 (5) 18 Soluzione 0 Mix Profumi 50000 pg/µL Diluizione 1 250 pg/µL Diluizione 2 100 pg/µL Diluizione 4 20 pg/µL Diluizione 3 50 pg/µL Diluizione 5 100 pg/µL Diluizione 6 2 pg/µL

(46)

Come si vede dalla tabella la maggior parte degli analiti sono visibili già dalla concentrazione più bassa (circa 2 pg/µL), per visualizzarli tutti è necessario arrivare alla soluzione numero 3 (circa 50 pg/µL), in cui anche il Lemonile diventa visibile con tutti i suoi 4 isomeri.

Queste concentrazioni si traducono in quantità assolute moltiplicando per il volume effettivamente iniettato nello strumento pari a 2 µL, il risultato è esposto nella colonna di destra ed è espresso in pg assoluti.

3.1.4. Test preliminari su matrice reale

Durante la fase di validazione del metodo si è voluto testare il ruolo giocato dal particolato in sospensione presente comunemente in acqua, dato che questo potrebbe ritenere una parte degli analiti sottraendoli alla quantificazione.

A questo scopo si è operata una filtrazione del campione raccolto nella stazione C1, su filtro di fibre di quarzo Whatman®_{di 47 mm di diametro, analizzando}

separatamente la soluzione filtrata denominata Filtrato, la porzione rimasta intrappolata sul filtro denominata Filtro e confrontando i risultati con valori ottenuti da una prova effettuata su un campione a cui è stata applicata la procedura messa a punto in precedenza.

La porzione filtrata è stata processata mettendo in pratica la metodica standard, aggiunta dello standard interno, estrazione, eluizione, concentrazione e analisi gascromatografica; mentre il filtro è stato posto in una beuta in cui sono stati aggiunti 15 mL di dicloromentano, 1 mL di toluene e 50 µL di standard interno ed operando quindi l’estrazione in bagno a ultrasuoni. L’estratto è stato trasferito in una vial contenente solfato di sodio, concentrato e successivamente posto in vial da autocampionatore per l’analisi strumentale.

I dati esposti nella Tabella 14 evidenziano che le quantità di analita che rimane adesa alla fase solida è una minima parte del totale, confrontando poi i valori relativi al campione non filtrato rispetto alla somma delle altre due voci, Figura 18, si può notare che il bilancio è pressoché nullo il che indica che la metodica di estrazione SPE è efficace anche per la frazione particolata e rende non necessaria una filtrazione preventiva del campione.

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Tabella 14 – Dati relativi alle prove condotte sulla filtrazione, filtro indica la porzione adesa al filtro in seguito a filtrazione, filtrato e la porzione liquida risultante dalla filtrazione (n.d. = non

determinato).

Analita Campione non filtrato Filtro Filtrato

ng/L ng/L ng/L Ultravanil n.d. n.d. n.d. Lemonile n.d. n.d. n.d. Pelargene n.d. n.d. n.d. Mefranal n.d. n.d. n.d. Bourgeonal n.d. n.d. n.d. Myraldene n.d. n.d. n.d. Tridecene-2-nitrile n.d. n.d. n.d. Amil salicilato 53 6,3 51 Oranger Crystals 13 n.d. 4,9 Dupical n.d. n.d. n.d. Isobutavan n.d. n.d. n.d. Esil salicilato 34 5,4 27 Ambrofix 6,0 n.d. 21 Peonile 26 n.d. 32 Okoumal 0,3 n.d. n.d. Benzil salicilato 34 2,7 26 Amberketal n.d. n.d. n.d. Totale 167 15 162 0 10 20 30 40 50 60 Amyl salicylate Oranger Crystals Hexyl salicylate

Ambrofix Peonile Benzyl

salicylate C o n ce n tr azi o n e ( n g/ L)

Campione non filtrato Filtro + Filtrato

Figura 18 - Confronto tra le concentrazione ottenute con la metodica standard e la somma delle concentrazioni ottenute in seguito alla filtrazione.

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Oltre a valutare il ruolo della filtrazione si è effettuata una prova sull’efficacia di estrazione da parte dei solventi utilizzati effettuando, oltre alla prima eluizione ottenuta mediante l’aggiunta di 1 mL di toluene e 15 mL di DCM, altre due eluizioni ottenute applicando lo stesso procedimento.

In base ai dati esposti nella Tabella 15 si può notare che i valori più significativi di concentrazione si riscontrano solo per la prima eluizione, mentre per quanto riguarda le altre due si vede che i valori ottenuti sono paragonabili o leggermente superiori ai valori restituiti dai bianchi.

In base a questo è possibile affermare che le concentrazioni degli analiti estratti mediante la seconda e terza eluizione sono poco significative rispetto alle concentrazioni ottenute attraverso la prima eluizione soprattutto se paragonate ai dati relativi ai bianchi.

Ai fini della rilevanza per il metodo si è scelto di non effettuare una seconda e terza eluizione.

Tabella 15 - Valutazione dell'efficacia dei solventi nell'eluizione per confronto con la raccolta di frazioni successive alla prima (n.d. = non determinato).

Analita Eluizione 1 Eluizione 2 Eluizione 3 Bianco medio

ng/L ng/L ng/L ng/L Ultravanil n.d. n.d. n.d. - Lemonile n.d. n.d. n.d. - Pelargene n.d. n.d. n.d. - Mefranal n.d. n.d. n.d. - Bourgeonal n.d. n.d. n.d. - Myraldene n.d. n.d. n.d. - Tridecene-2-nitrile n.d. n.d. n.d. - Amil salicilato 53 13 8,3 8,1 Oranger Crystals 13 2,4 1,1 0,9 Dupical n.d. n.d. n.d. - Isobutavan n.d. n.d. n.d. - Esil salicilato 34 7,3 5,2 7,3 Ambrofix 6,0 1,6 1,2 1,8 Peonile 26 n.d. n.d. - Okoumal 0,3 n.d. n.d. - Benzil salicilato 34 6,5 2,8 4,1 Amberketal n.d. n.d. n.d. - Totale 167 31 19 21

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Le prove condotte hanno evidenziato che i campioni, prima di essere estratti, non necessitano di una filtrazione, perché il materiale sospeso non ritiene in maniera significativa gli analiti in fase di eluizione e che la raccolta di frazioni successive alla prima non porterebbe ad un miglioramento delle performance del metodo stesso.

Figura 19 - Confronto tra le concentrazioni ottenute analizzando la prima eluizione rispetto alla seconda e alla terza. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Eluizione 1 Eluizione 2 Eluizione 3 Bianco medio