LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
ANDRIUS DAUKŠYS
Gelifikuotų propolio mikroemulsijų modeliavimas ir
biofarmacinis vertinimas
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Lekt. dr. Modestas Žilius
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. Dr. Ramunė Morkūnienė
Data
Gelifikuotų propolio mikroemulsijų modeliavimas ir
biofarmacinis vertinimas
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Lekt. dr. Modestas Žilius
Data
Recenzentas Darbą atliko
Doc. A. Dagilytė Magistrantas
Andrius Daukšys
Data Data
TURINYS
TURINYS ... 3 SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 PADĖKA ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 8
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Mikroemulsijos ir jų pritaikymas ... 10
1.2. Farmacijoje naudojami polimerai ... 11
1.3. Polimerinių mikroemulsijų charakteristikos ... 14
1.4. Propolio pritaikymas ... 17
2. TYRIMO METODIKA ... 18
2.1. Tyrimo objektas ... 18
2.2. Tyrimų medžiagos ir įranga ... 19
2.2.1. Naudotos medžiagos ... 19
2.2.2. Naudota įranga ... 19
2.3. Tyrimų metodai ... 19
2.3.1. Propolio junginių analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 19
2.3.2. Propolio fenolinių junginių tirpumas ... 20
2.3.3. Aliejus–vanduo tipo mikroemulsijų gamyba ir sudėtys ... 20
2.3.4. Pagamintų aliejus–vanduo tipo mikroemulsijų fizikinių ir cheminių savybių nustatymas ... 21
2.3.5. Propolio fenolinių junginių atpalaidavimo iš pagamintų mikroemulsijų in vitro tyrimai ... 21
2.3.6. Statistinė duomenų analizė ... 22
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 22
3.1. Propolio fenolinių junginių tirpumas ... 23
3.2. Eksperimentinių aliejus–vanduo tipo mikroemulsijų fizikinių–cheminių savybių vertinimas ... 24
3.3. Eksperimentinių aliejus–vanduo tipo mikroemulsijų dalelių dydžio pokyčio vertinimas ... 30
3.4. Propolio fenolinių junginių atpalaidavimas in vitro iš eksperimentinių aliejus–vanduo tipo mikroemulsijų ... 35
IŠVADOS ... 37
A. Daukšio magistro baigiamasis darbas: „Gelifikuotų propolio mikroemulsijų modeliavimas ir biofarmacinis vertinimas“ / mokslinis vadovas Lekt. dr. Modestas Žilius; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Klinikinės farmacijos katedra. – Kaunas.
Darbo tikslas: įvertinti gelifikuotų aliejus–vanduo tipo mikroemulsijų dalelių dydžių pokyčius ir
propolio fenolinių junginių (vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo rūgščių ir vanilino) atpalaidavimą iš sumodeliuotų mikroemulsijų.
Darbo uždaviniai: Įvertinti aliejus–vanduo tipo propolio mikroemulsijų fizikines chemines
savybes; nustatyti galimus aliejus–vanduo tipo propolio mikroemulsijų dalelių dydžio pokyčius laikymo metu; stabilizuoti propolio mikroemulsijų daleles, gelifikuojant sistemas ir įvertinant dalelių dydžius; įvertinti propolio fenolinių rūgščių ir vanilino atpalaidavimą iš gelifikuotų aliejus– vanduo tipo mikroemulsijų.
Metodai: mikroemulsijų dalelių dydžiai ir polidispersiškumo indeksai buvo nustatyti dinaminės
šviesos sklaidos metodu. Įvertinti propolio fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtis, buvo naudotas validuotas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Nustatyti mikroemulsijų pH buvo naudojamas pH–metras, nustatyti klampai buvo naudojamas reometras ir nustatyti elektrinį laidį buvo naudojamas konduktometras. Biofarmaciniai atpalaidavimo in vitro tyrimai buvo atlikti naudojant modifikuotas Franz tipo difuzines celes.
Rezultatai: tirtų mikroemulsijų vidutinis dalelių dydis buvo 47,55 – 184,2 nm, polidispersiškumo
indeksas buvo 0,277 – 0,839 ribose, pH buvo nuo 3,8 iki 7,2, klampa buvo nuo 18,6 mPa·S iki 178 mPa·S, elektrinis laidis buvo 11,6 – 30,7 µS/cm ribose. Aliejus–vanduo mikroemulsijoje su propolio fenoliniais junginiais VDD po 4 savaičių padidėjo 63,2 proc., o mikroemulsijose turinčiose 1 proc. ar 5 proc. polimero, dalelių dydžio pokyčiai buvo sumažinti iki 1,36 – 8,6 proc.. Atlikus atpalaidavimo tyrimus su gelifikuotomis ir negelifikuotomis mikroemulsijomis, didžiausias atpalaiduotas suminis fenolinių junginių kiekis buvo 1,2 ± 0,1 proc., o srautas 7,0 ± 0,3 µg/cm2.
Išvados: įvertinus fizikines–chemines savybes aliejus–vanduo mikroemulsija atitiko kokybės
reikalavimus. Aliejus–vanduo mikroemulsijoje po 4 savaičių susidarė 19,9 proc. naujų, didesnių dalelių, o tai parodo sistemos nestabilumą. Poloksameras 407 stabdo mikroemulsijų dalelių pokyčius, tačiau keičia sistemų mikrostruktūrą. Efektyviam propolio fenolinių junginių atpalaidavimui tinkama poloksamero 407 koncentracija yra 1 proc..
Final master‘s thesis of A. Daukšys: „Modeling and biopharmaceutical evaluation of gelified propolis microemulsions“ / scientific supervisor lect. dr. Modestas Žilius; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, department of Clinical Pharmacy. – Kaunas.
The aim of work: to evaluate gelified oil-in-water type microemulsion changes in particle size and
propolis phenolic compounds (vanillic, caffeic, p-coumaric, ferulic acids and vanillin) release in vitro from modelled microemulsions.
Main tasks: to evaluate physicochemical properties of oil–water propolis microemulsions; to determine
possible changes in the size of oil–in–water propolis microemulsion particles during storage; to stabilize propolis microemulsion particles by gelling the system and evaluating their particle sizes; to evaluate the release of propolis phenolic acids and vanillin from gelified oil–in–water type microemulsions.
Methods: microemulsion particle sizes and polydispersity index were determined by dynamic light
scattering. The qualitative and quantitative composition of the phenolic compounds of propolis was evaluated by validated HPLC method. The pH meter was used to determine the pH of the microemulsion, a rheometer was used to determine the viscosity and a conductometer was used to determine the electrolytic conductivity. Biopharmaceutical in vitro release studies were performed by modified Franz type diffusion cells system.
Results: The average particle size of tested microemulsions was between 47,55 – 184,2 nm,
polidispersity index was 0,277 – 0,839, the pH was between 3,8 and 7,2, the viscosity was between 18,6 mPa·S and 178 mPa·S, the electrolytic conductivity was between 11,6 µS/cm and 30,7 µS/cm. The average particle size of oil–in–water microemulsion with phenolic compounds of propolis, after 4 weeks increased by 63,2 percent, but gelified microemulsions with 1 or 5 percent polymer content reduced the particle changes to 1,36 – 8,6 percent. After 6 hours, highest released amount of phenolic compounds was 1,2 ± 0,1 percent and the flux was 7,0 ± 0,3 µg/cm2.
Conclusions: after evaluation of quality parameters, oil–in–water microemulsion with propolis
compounds met the quality requirements. Oil–water type microemulsion after 4 weeks formed 19,9 percent of new, larger particles, which shows the instability of the system. Poloxamer 407 slows down the particle changes, but changes the systems microstructure. For effective release of propolis phenolic compounds, a suitable poloxamer 407 concentration is 1 percent.
PADĖKA
Už suteiktas puikias darbo sąlygas, materialinius išteklius, ir pagalbą rengiant mokslinį tiriamąjį darbą „Gelifikuotų propolio mikroemulsijų modeliavimas ir biofarmacinis vertinimas“ dėkoju darbo vadovui lekt. dr. Modestui Žiliui ir visam Klinikinės farmacijos katedros kolektyvui.
SANTRUMPOS
A–v – aliejus vandenyje mikroemulsijos sistema VDD – vidutinis dalelių dydis
ĮVADAS
Mikroemulsijos – tai patrauklios išvaizdos, daugiakomponentės ir dinamiškos sistemos. Jos dėl savo vidinės struktūros geba ištirpinti didelį kiekį tiek hidrofilinių tiek lipofilinių vaistinių medžiagų, o dėl mažo dalelių dydžio jos geba pagerinti vaistinių medžiagų skvarbą per odą, todėl jos yra tinkamos naudoti transdermaliai [1-3]. Tačiau dėl dinaminės prigimties, mikroemulsijų dalelės nuolat juda ir sąveikauja tarpusavyje [4, 5]. Dėl šių sąveikų dalelės gali agreguotis ar susilieti, o tai gali turėti neigiamą poveikį mikroemulsijai kaip transdermalinei vaisto formai – padidėjusių ar susiagregavusių dalelių paviršiaus plotas mažėja, todėl gali prastėti vaisto pernaša per odą [4, 6, 7]. Sumažinti dalelių sąveikas gali padėti polimero pridėjimas į sistemą. Amfifiliniai polimerai geba jungtis tiek su hidrofobinėmis tiek su hidrofilinėmis medžiagomis, tad gali išsidėstyti tarp aliejinės ir vandeninės fazių. Polimerai be amfifilinių savybių gali sąveikauti su surfaktanto plėvele [8]. Polimerai geba sujungti disperguotas daleles tarpusavyje, arba sudaryti polimerinį tinklą ir taip mažinti dalelių sąveikas. Polimerai mikroemulsijose taip pat naudojami kaip papildomi kosurfaktantai, norint dar labiau sumažinti paviršiaus įtemptį, jie didina sunkiai tirpių vaistų tirpumą ir gerina vaistų skvarbą transdermaliai [9, 10]. Propolis – tai bičių iš įvairių augalų surinkta dervinga ir kvapni medžiaga, kurioje yra daugiau nei 300 skirtingų junginių [11]. Dėl savo antioksidacinių, antiradikalinių, priešbakterinių, priešvirusinių, antiparazitinių, priešuždeginimių, anestetinių bei imunomoduliacinių savybių, jis puikiai tinka naudoti transdermaliai [12, 13]. Propolis padeda gyti žaizdoms, o ypač nudegimams, nes padeda odai regeneruotis ir turi antimikrobinių savybių [11].
Formuluojant gelifikuotas mikroemulsijas su propolio fenoliniais junginiais, siekiama sumažinti dalelių sąveikas ir taip padidinti sistemos stabilumą. Norint sumodeliuoti efektyvias ir stabilias mikroemulsijas, bus vertinamas jų vidutinis dalelių dydis, dalelių pokyčiai, polidispersiškumo indeksas ir bus atliekamas biofarmacinis in vitro atpalaidavimo tyrimas, siekiant nustatyti atpalaiduotus propolio fenolinius junginius.
Šio darbo tikslas yra įvertinti gelifikuotų aliejus–vanduo tipo mikroemulsijų dalelių dydžių pokyčius ir propolio fenolinių junginių (vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo rūgščių ir vanilino) atpalaidavimą iš sumodeliuotų mikroemulsijų.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: įvertinti gelifikuotų aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų dalelių dydžių pokyčius
ir propolio fenolinių junginių (vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo rūgščių ir vanilino) atpalaidavimą iš sumodeliuotų mikroemulsijų.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti aliejus–vanduo tipo propolio mikroemulsijų fizikines chemines savybes.
2. Nustatyti galimus aliejus–vanduo tipo propolio mikroemulsijų dalelių dydžio pokyčius laikymo metu.
3. Stabilizuoti propolio mikroemulsijų daleles, gelifikuojant sistemas ir įvertinant dalelių dydžius. 4. Įvertinti propolio fenolinių rūgščių ir vanilino atpalaidavimą iš gelifikuotų aliejus–vanduo tipo
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Mikroemulsijos ir jų pritaikymas
Pirmasis mikroemulsijos apibrėžimą suformulavo profesorius Jack H. Shulman 1959 metais Kolumbijos universitete [14], tačiau bėgant laikui apibrėžimas kito ir buvo tobulinamas. Vieną iš tiksliausių mikroemulsijos apibrėžimų suformulavo I. Danielsson ir B. Lindman [15] – „tai sistema iš vandens, aliejaus ir amfifilo, kuri yra vienalytis, optiškai izotropiškas ir termodinamiškai stabilus skystis“. Mikroemulsijos tai skaidrios, daugiakomponentės sistemos, kurių vidutinis dalelių dydis (VDD) yra nuo 10 nm iki 100 nm [2, 16]. Polidispersiškumo indeksas nurodo mikroemulsijos homogeniškumą – kuomet PDI yra mažesnis nei 0,5, sistemos yra skaitomos homogeniškos, o didesnis PDI nurodo platesnį dalelių dydžio pasiskirstymą [17, 18]. Mikroemulsijos sulaukia vis daugiau dėmesio, kaip transdermalinės vaisto formos – jos geba tirpinti tiek hidrofobines, tiek hidrofilines medžiagas, o dėl savo vidinės struktūros, gali ištirpinti didelius vaistinių medžiagų kiekius [1]. Dėl nedidelio vidutinio dalelių dydžio ir labai mažos paviršiaus įtempties, šios dalelės pasižymi didele skvarba per odą [1-3]. Norint, kad nanodalelės galėtų prasiskverbti į odą, jų diametras turėtų būti mažesnis nei 300 nm. Jei dalelių, diametras yra nuo 10 nm iki 210 nm, jos gali prasiskverbti pro plaukelių folikulus, tačiau didžiausia skvarba į odą pastebima, kai dalelių dydis yra mažesnis nei 70 nm [19]. Tad mikroemulsijas sudarančios dalelės puikiai tinka vaistinių medžiagų pernašai per odą, tačiau kai kurie reiškiniai skvarbą gali ir apsunkinti. Yra žinoma, kad dalelių dydis, bei dalelių sąveikos yra labai svarbūs veiksniai, vertinant mikroemulsijos stabilumą bei gebėjimą prasiskverbti pro odą [4]. Pavyzdžiui dalelių didėjimas ar agregacija gali neigiamai paveikti mikroemulsijos kaip farmacinės formos kokybę.
Mikroemulsijos yra dinaminės sistemos, kurių dalelės juda spontaniškai bei sąveikauja tarpusavyje [4, 5]. Viena iš šio dalelių judėjimo priežasčių yra Brauno judėjimas. Dalelės, veikiamos kinetinės energijos, juda atsitiktine tvarka, todėl mikroemulsija išlieka dinamiška ir tai neleidžia dalelėms nusėsti [20]. Dėl šio spontaniško judėjimo, dalelės susiduria ne tik su tirpiklio molekulėmis, bet ir su kitomis dalelėmis, o tai gali sąlygoti dalelių pokyčius [21]. Nors paprastai aliejus–vanduo tipo (a–v) mikroemulsijose daleles veikia atstumiančios jėgos, neleidžiančios joms laisvai susijungti ir maišytis tarpusavyje, atlikti tyrimai parodė, kad tam tikrais atvejais šios jėgos yra nepakankamos sustabdyti dalelių sąveikas [4]. Atstumiamą poveikį tarp dalelių lemia hidratuoto surfaktanto sluoksnis, kuris neleidžia kitoms dalelėmis prisiartinti pakankamai arti kad įvyktų sąveikos. Tačiau dalelių susidūrimai vyksta dažnai ir kartais šie susidūrimai baigiasi jų sąveikomis [4, 7]. Atlikti tyrimai parodė, kad susidurdamos dalelės gali atstumti viena kitą, agreguoti ar net susilieti į vieną dalelę [6]. Šios sąveikos galėtų paaiškinti ir reiškinius, kai mikroemulsijose aptinkama ne tik pavienių dalelių bet ir jų
agregatų [22]. Susidarius dalelių agregatams taip pat prastėja vaisto pernaša per odą, nes mažėja dalelių paviršiaus plotas. Nuolatinius dalelių pokyčius parodo ir polidispersiškumo indeksas (PDI). Yra žinoma, kad PDI mikroemulsijose yra dinamiškas, o tai įrodo, kad dalelių dydis mikroemulsijose visuomet kinta [4].
Mikroemulsijos yra perspektyvi vaisto forma, gebanti ištirpinti didelius tiek hidrofobinių tiek hidrofilinių vaistų kiekius, o mažas dalelių dydis užtikrina puikią skvarbą per odą. Kadangi mikroemulsijos yra dinamiškos sistemos, dalelių dydis bėgant laikui gali kisti, jos gali agreguotis ar susilieti. Polimero pridėjimas į sistemą gali pristabdyti dalelių sąveikas ir taip padaryti mikroemulsijas pastovesnes, o tai leistų tolygiai atpalaiduoti vaistines medžiagas ir pasiekti stabilų farmakologinį poveikį.
1.2. Farmacijoje naudojami polimerai
Pagal IUPAC, polimerai – tai „molekulės, turinčios didelę santykinę molekulinę masę, kurių struktūra susideda iš pasikartojančių, tiesiogiai ar konceptualiai, mažų santykinės molekulinės masės molekulių“. Polimerai jau nuo seno buvo naudojami farmacinėms formoms kurti, tačiau pastaruoju metu jų vaidmuo farmacijoje labai išaugo. Medicinoje, jie yra naudojami tvarsčių, chirurginių siūlų, sąnarių protezų gamybai [23]. Farmacinėse formuluotėse, polimerai atlieka daug skirtingų vaidmenų: įvairių kietų vaistinių formų gamyboje jie naudojami organoleptinių savybių gerinimui, kaip rišikliai, dezintegrantai, skiedikliai ar slidikliai. Polimerai plačiai naudojami vaistinių medžiagų atpalaidavimo kontrolei [24-26]. Kadangi polimerai yra labai įvairūs, jų klasifikacijų yra kelios, priklausomai nuo kilmės, struktūros, bioskaidumo ar sąveikos su vandeniu [23, 27]. Atsižvelgiant į tai, polimerus galima skirstyti į šias klasifikacijas [27]:
Pagal kilmę:
Natūralūs (polisacharidai, baltymai) – jie yra gaunami iš natūralių šaltinių (augalai, gyvūnai). Šie polimerai yra biologiškai suskaidomi ir netoksiški, todėl puikiai tinka naudojimui į vidų. Pavyzdžiui chitinas efektyviai skatina hidrofilinių makromolekulių (heparinas) absorbciją per gleivines ar peroraliai [28].
Pusiau sintetiniai (celiuliozės acetatas, celiuliozės nitratas) – tai natūralūs polimerai, kurie turi būti chemiškai arba fiziškai apdoroti, kad įgautų savo galutinę formą.
Sintetiniai- tai žmogaus sukurti polimerai (polietilenas, poliakrilamidas, teflonas). Pagal skaidomumą:
Biologiškai skaidomi (polilaktinė rūgštis, polikaprolaktonas).
Biologiškai neskaidomi (etilceliuliozė, poliglikolio rūgštis). Pagal sąveiką su vandeniu:
Hidrofobiniai ir vandenyje tirpūs polimerai (etilceliuliozė, polidimetilsiloksanas).
Hidrofiliniai polimerai (hipromeliozė, natrio alginatas).
Hidrogelius sudarantys polimerai (polietileno oksidas, poliakrilamidas).
Polimerai tarpusavyje yra labai skirtingi ne tik struktūra, bet ir savybėmis, o nuo to priklauso jų panaudojimas skirtingose srityse. Kai kurie polimerai, dėl savo unikalios struktūros, pasižymi specifinėmis savybėmis, tokiomis kaip jautrumas šviesai, pH ar temperatūrai, o tai praplečia jų pritaikymą medicinoje. Kai kurie polimerai gali turėti ir baktericidinį ar antivirusinį poveikį [23].
Amfifiliniai polimerai pastaruoju metu sulaukia vis daugiau dėmesio. Dėl savo struktūros, jie gali sąveikauti tiek su vandenine tiek su aliejine fazėmis. Amfifilinių polimerų pavyzdžiai – telecheliniai polimerai, bloko kopolimerai ar „šepečio“ formos polimerai. Telecheliniai polimerai susideda iš pagrindinės grandinės, kuri galuose turi mažos molekulinės masės grupes, turinčias atvirkštinį poliškumą. Bloko kopolimerai, yra sudaryti iš skirtingų polimerinių blokų, iš kurių vienas yra hidrofobinis, o kitas hidrofilinis. „Šepečio“ formos polimerai turi prie pagrindinės grandinės prisitvirtinusias priešingo poliškumo grandines [8]. Dėl savybės įsitvirtinti tiek vandeninėje tiek aliejinėje fazėje, kai kurie amfifiliniai polimerai gali būti naudojami kaip surfaktantai ar kaip kosurfaktantai [8]. Skirtingų amfifilinių polimerų struktūros nurodytos 1 paveiksle.
Puikus amfifilinio polimero pavyzdys yra poloksameras – tai nejoninis, vandenyje tirpus bloko kopolimeras, sudarytas iš hidrofobinio polietilenoksido (PEO) ir hidrofilinio polipropilenoksido (PPO) blokų (PEO–PPO–PEO). Bendroji cheminė struktūra pavaizduota 2 paveiksle.
2 pav. Bendroji poloksamerų struktūra, a – etilenoksido blokas, b – propilenoksido blokas [29]
Poloksamerai skiriasi monomerų blokuose kiekiu ir santykiu. Šiuo metu dažniausiai naudojami poloksamerai yra 188, 237, 338 ir 407 [29]. Dažniausiai poloksamerai yra žymimi raide P ir 3 skaičiais. Pirmus du skaičius reikia padauginti iš 100 – taip gaunama polipropilenoksido molekulinė masė. Trečią skaičių reikia padauginti iš 10 – taip gaunamas etilenoksido kiekis procentais [30]. Šie polimerai yra lengvai tirpūs vandenyje ir gali suformuoti hidrogelius. Paprastai, vandeniniai poloksamero tirpalai yra stabilūs, tačiau jautrūs temperatūros pokyčiams. Kylant temperatūrai, yra skatinamos susidaryti micelės. Jei temperatūra kyla ir toliau, esant pakankamai koncentracijai, micelės pradeda jungtis tarpusavyje ir susidaro gelis [30]. Tačiau tai yra grįžtamas procesas, tad temperatūrai nukritus, poloksameras vėl grįžta į skystą formą. Poloksamero gelifikacijos procesas pavaizduotas 3 paveiksle.
3 pav. Poloksamero gelifikacijos procesas [31]
Poloksameras vis dažniau patraukia dėmesį kaip komponentas mikroemulsijų gamyboje. Atliktų tyrimų metu buvo pastebėta, kad poloksameras žmonėms yra labai mažai toksiškas – jis nesukėlė jokių uždegiminių procesų ar imuninių reakcijų [29-31]. Kadangi poloksameras yra amfifilinis polimeras, jis gali sąveikauti tiek su aliejine tiek su vandenine mikroemulsijos fazėmis, dėl to mikroemulsijose jis geba dar labiau sumažinti ir taip nedidelę paviršiaus įtemptį [8, 30]. Žinoma, kad kylant temperatūrai poloksameras greičiau sudaro miceles. Šių micelių centre yra hidrofobinis propilenoksido blokas, kurį
supa hidrofilinis pilietilenoksido blokas. Į šias miceles, gali būti įtraukiami ir sunkiai vandenyje tirpstančios vaistinės medžiagos, tad sistemose su poloksameru padidėja hidrofobinių medžiagų tirpumas. Atlikus tyrimus, buvo pastebėta, kad įdėjus poloksamero kaip stabilizuojančios medžiagos, tokių vaistų kaip ibuprofeno, ciklosporino, felodipino, mikonazolo nitrato ar metotreksato, tirpumas sistemoje ženkliai padidėjo, lyginant su ta pačia formuluote be poloksamero [9, 30]. Taip pat buvo pastebėta, kad mikroemulsijų formuluotės su poloksameru pagerina vaistinių medžiagų skvarbą į odą [9].
Apibendrinant, polimerai yra labai įvairūs ir yra naudojami tiek medicininių prekių, tiek vaistinių preparatų gamyboje. Jie gali būti naudojami kaip rišikliai, organoleptinių savybių maskuotojai, dezintegrantai, skiedikliai, slidikliai, taip pat puikiai tinka kontroliuojamo atpalaidavimo sistemų gamybai ir nepakeičiami reologinių savybių modifikuotojai. Nauji polimerai taip pat pasižymi ir kitomis svarbiomis savybėmis, kaip jautrumas pH, temperatūrai ar šviesai, o kai kurie netgi turi baktericidinį ar priešvirusinį poveikį. Taip pat pastebima, kad polimerų pridėjimas į jau esamas formuluotes gali stipriai padidinti vaistinių medžiagų tirpumą ar vaistinės medžiagos skvarbą per odą.
1.3. Polimerinių mikroemulsijų charakteristikos
Mikroemulsijos turi daug privalumų lyginant su kitomis vaistų formomis. Jas yra nesunku pagaminti, jos pagerina vaistinių medžiagų biologinį pasisavinimą, geba ištirpinti didelius kiekius vaistinių medžiagų bei gerai tirpina sunkiai tirpias vaistines medžiagas. Mikroemulsijų mažas disperguotų dalelių dydis turi didelį paviršiaus plotą, o tai padidina vaistų tirpumą sistemoje, dalelės geriau adsorbuojasi prie gleivinių ir vaistinės medžiagos yra lengviau pasisavinamos [2]. Tačiau mikroemulsijos turi trūkumų – joms suformuluoti reikia didelio kiekio surfaktanto ar surfaktanto/kosurfaktanto mišinio, o šie komponentai gali turėti dirginantį ar net toksinį poveikį ir tai gali apsunkinti mikroemulsijų pritaikymo galimybes [2, 32]. Mikroemulsijų klampa paprastai taip pat nėra didelė, kas apsunkina jų panaudojimą transdermaliai [33]. Taip pat dėl savo dinamiškos prigimties, dalelės bėgant laikui gali sąveikauti ir didėti, o tai ne tik sumažina sistemos stabilumą, bet ir apsunkina mikroemulsijos skvarbą per odą [4]. Gelifikuojant mikroemulsijas, šių problemų būtų galima išvengti.
Mikroemulsijų savybių gerinimui yra naudojami įvairūs polimerai. Dažnai yra naudojami amfifiliniai polimerai, dėl savo savybės sąveikauti tiek su vandenine tiek su aliejine fazėmis, ar dėl jų savybių dar labiau sumažinti ir taip nedidelę paviršiaus įtemptį [9, 10, 34]. Tačiau polimerai be amfifilinių savybių taip pat gali patobulinti mikroemulsijų charakteristikas. Dažniausiai tai yra homopolimerai arba kopolimerai, kurie nors ir negali sujungti aliejinės bei vandeninės fazių, tačiau gali
paveikti surfaktanto plėveles. Tai gali turėti didelę įtaką mikroemulsijų dinamikai, ypač jei surfaktanto poliškumas skiriasi nuo homopolimero arba jei vienas komponentas yra joninis o kitas nejoninis. Polimerai geba jungtis su surfaktantu ar tiesiog tarpusavyje, taip sudarydami tinklus vandeninėje arba aliejinėje terpėse [8].
Kuriant transdermalines mikroemulsijas yra svarbu atkreipti dėmesį į sistemos reologines savybes. Nors mikroemulsijos pasižymi puikia skvarba per odą paprastai jos būna nedidelės klampos, todėl dozavimas ir pats vartojimas tampa sudėtingas [33]. Pridėjus polimero, būtų galima padidinti mikroemulsijos klampą ar pagaminti mikroemulsija paremtą gelį [33, 35]. Mikroemulsijų gelius būtų patogu naudoti, tačiau atlikti tyrimai parodė, kad gaminant mikroemulsijų gelius, gali sumažėti vaistinių medžiagų skvarba per odą [36]. Romano Lapasin ir kt. (2001) tyrė carbopol 940 poveikį a–v tipo mikroemulsijų reologinėms savybėms. Carbopol 940 – tai didelės molekulinės masės homopolimeras, sudarytas iš poliakrilo rūgšties susietos su alilo sacharoze. Šis polimeras net mažais kiekiais gali stipriai padidinti mikroemulsijos klampą. Kadangi carbopol 940 yra mažai toksiškas, jis puikiai tinka transdermalinių sistemų formuluotėms. Buvo tirtos mikroemulsijos su keturiomis skirtingomis polimero koncentracijomis – 0,25 proc., 0,5 proc., 1 proc. ir 2 proc.. Kuomet polimero koncentracija siekė iki 1 proc., mikroemulsija demonstravo silpnas gelio savybes ir tiko naudoti transdermaliai. Tačiau jei polimero koncentracija siekė 1 – 2 proc., mikroemulsijos reologinės savybės tapo beveik identiškos gelinėms carbopol 940 sistemoms. Tuomet mikroemulsijos dalelės įstringa polimero tinkle ir taip suprastėja vaistinių medžiagų atpalaidavimas [33]. Kenneth Chibuzor Ofokansi ir kt. (2013) atliktas tyrimas parodė, kad polimerai gali ne tik padidinti, bet ir sumažinti mikroemulsijos sistemos klampą, taip pagerindami vaistinių medžiagų biologinį pasisavinimą. Mikroemulsijos stabilumui pagerinti, buvo pasirinktas poloksameras 407 – trijų blokų kopolimeras. Lyginant su kontrole, poloksameru 407 stabilizuoti mėginiai demonstravo sumažėjusią klampą – poloksameras 407 veikė kaip papildomas kosurfaktantas ir taip padėjo mažinti paviršiaus įtemptį. Polimeru stabilizuotos sistemos sugebėjo geriau inkorporuoti sunkiai tirpų mikonazolo nitratą į mikroemulsiją ir pagerino jo atpalaidavimą iš sistemos [9]. Babette Biruss ir Claudia Valenta (2008) atliko tyrimą su nejoninėmis a–v tipo progesterono mikroemulsijomis. Tačiau pagamintos mikroemulsijos buvo per mažos klampos, o disperguota vaistinė medžiaga mėginyje nebuvo pakankamai stabili. Padidinti stabilumui ir padidinti mikroemulsijos klampą buvo nuspręsta į sistemą įvesti polimerinį emulsiklį (akrilo rūgšties kopolimeras, modifikuotas su C10– 30 alkil akrilatu ir susietas su alilpentaeritritoliu (Pemulen™ TR–1)) arba silikono dioksidą (aerosil). Įdėjus polimerinio emulsikio, klampa padidėjo apie 50 kartų, o įdėjus silikono dioksido, klampa padidėjo 20 kartų. Atlikus skvarbos tyrimus buvo pastebėta, kad mikroemulsijos su silikono dioksidu 1,24 karto, o mikroemulsijos su polimeriniu emulsikliu 1,63 karto padidino vaistinės medžiagos difuziją į odą [35].
Labai svarbus yra amfifilinių polimerų poveikis surfaktantų emulgavimo savybėms. Buvo atliktas tyrimas su polialkano–polietileno oksido (PA–PEO) dibloko kopolimeru – mikroemulsijoms be
polimero, reikėjo, kad bent 13 proc. bendros masės sudarytų surfaktantas, norint kad susidarytų mikroemulsija. Tačiau keičiant surfaktanto dalį polimeru, mikroemulsija susidaro panaudojus tik 3 proc. surfaktanto. Polimeras šiame tyrime, pakeitė tik iki 12 proc. surfaktanto masės, tad galime teigti, kad surfaktanto ir polimero mišinys yra daug efektyvesnis formuluojant mikroemulsijas, lyginant su mikroemulsija be polimero [10]. Gerhard Gompper ir kt. (2001) atlikti tyrimai parodė, kad polietilenpropileno – polietilenoksido blokų kopolimero (PEPx–PEOy) pridėjimas į trinarę mikroemulsijos sistemą stipriai pagerina sistemos emulgavimo efektyvumą, nepriklausomai nuo aliejinės fazės ar surfaktanto grandinių ilgio. Naudojant dviejų surfaktantų mišinį pasiekiamas tik labai nežymus sinergistinis efektas, o naudojant polimerą, net ir mažas jo kiekis stipriai padidina mikroemulsijos stabilumą [37].
Stabilizuoti mikroemulsijai, reikia didelio kiekio surfaktanto arba surfaktanto/kosurfaktanto mišinio, tačiau didesnės surfaktantų ar kosurfaktantų koncentracijos gali pasižymėti toksinėmis ar dirginančiomis savybėmis [2, 38]. Sumažinti naudojamo surfaktanto kiekį, būtų galima pasitelkiant polimerus. Surfaktanto ir polimero mišinys daug efektyviau stabilizuoja mikroemulsijų sistemas – taip gali būti išvengiamas surfaktantų ir kosurfaktantų kiekiui būdingas toksiškumas ar dirginamasis poveikis.
Mikroemulsijų stabilumui taip pat įtakos turi ir dinamiškas sistemos pobūdis. Dėl Brauno judėjimo, dalelės mikroemulsijoje nuolat juda, dėl to yra neišvengiama jų susidūrimų. Dažnai susidūrusios dalelės viena kitą atstumia, dėl egzistuojančių atstumiančių jėgų, tačiau kartais jų neužtenka ir dalelės susilieja ar sulimpa, o tai gali turėti įtakos mikroemulsijų kokybei [4]. Polimero pridėjimas į sistemą galėtų suteikti dalelėms papildomų atstumiančių jėgų arba sujungus miceles tarpusavyje polimeru, kas sumažintų dalelių sąveikas. Maria Jose Suarez ir kt. (1993) atliko tyrimą su vanduo–aliejus tipo mikroemulsijomis su skirtingais polimerais [39]. Buvo naudojami trijų tipų polimerai: vandenyje tirpūs (polioksietileno glikolis, poliakrilamidas, polivinilo alkoholis), aliejuje tirpūs (polibutadienas) ir polimerai tirpūs tiek vandeninėje tiek aliejinėje fazėse (polipropileno glikolis). Į sistemą pridėjus vandenyje tirpių polimerų, buvo pastebėta, kad sumažėjo dalelių tarpusavio traukos jėgos. Šios traukos jėgos mažėjo dar labiau, didėjant polioksietilenglikolio molekulinei masei. Priešingas poveikis pastebėtas su aliejinėje fazėje tirpiu polibutadienu – daleles traukiančios jėgos padidėjo. Panašus dalelių traukos padidėjimas buvo pastebėtas ir su polipropileno glikoliu. R. Ahfir (2014) atliktame tyrime su a– v tipo mikroemulsijomis buvo stebimos disperguotų dalelių sąveikos pridėjus telechelinių polimerų. Tirti polimerai buvo polietileno oksido grandinės, su viena arba dviejom C12H25 hidrofobinėmis galinėmis
grupėmis. Į sistemą pridėjus polimero su vienu hidrofobiniu galu, padidėjo daleles viena nuo kitos atstumiančios jėgos. Du hidrofobinius galus turintis polimeras sujungė daleles tarsi tiltu, tad tai galima būtų pavadinti papildomos dalelių traukos atsiradimu. A. Holmberg ir kt. (2002) atliko tyrimą su „šepečio“ formos polimeru ir v–a tipo mikroemulsijomis. Dalis disperguotų dalelių buvo sujungta šiuo
polimeru tarsi tiltu. Kai kurias daleles jungė net kelios skirtingų polimerų grandinės, tad susidarė tinklas. Tai padidino mikroemulsijos klampa apie 2000 kartų. Didinant polimero kiekį mikroemulsijoje grandinių skaičius vienoje dalelėje didėjo, tačiau sistemoje visuomet likdavo nemažiau kaip 30 proc. laisvų, nesujungtų dalelių. Taip pat buvo pastebėta, kad disperguotų dalelių difuzija buvo daug greitesnė nei polimero difuzija, tad šis polimeras negali imobilizuoti mikroemulsijos dalelių [40].
Taigi, polimero poveikis mikroemulsijai labai priklauso nuo panaudoto polimero. Panaudojus polimerą, mikroemulsijose disperguotoms dalelėms galima suteikti atstumiantį poveikį ir taip slopinti dalelių sąveikas. Tačiau galimas ir dalelių sujungimas tarpusavyje ar net sudėtingų tinklų su polimeru ir disperguotomis dalelėmis sudarymas. „Šepečio“ formos polimero pridėjimas į mikroemulsiją tik nežymiai paveikė disperguotų dalelių sąveikas, tad norint pasiekti optimalių rezultatų reikia įvertinti skirtingų polimerų savybes skirtingų sudėčių mikroemulsijoms.
1.4. Propolio pritaikymas
Propolis (bičių pikis) – tai tamsios spalvos, lipni, lipofilinė, malonaus kvapo, dervinga medžiaga, bičių surinkta iš įvairių augalų ar medžių, kurioje taip pat yra ir bičių seilių bei fermentų [41, 42]. Bitės naudoja propolį apsaugoti avilius nuo infekcijų sukėlėjų, avilių taisymui bei statybai. Dėl savo įvairių gydomųjų savybių, jis jau nuo seno buvo naudojamas liaudies medicinoje [41, 43, 44].
Bičių pikis yra sudėtingas biologiškai aktyvių medžiagų mišinys, kuriame galima aptinkti daugiau nei 300 cheminių junginių [11]. Žinoma, skirtingi propolio mėginiai gali labai skirtis savo chemine sudėtimi, kuri priklauso nuo sezono, geografinės padėties, klimato sąlygų, dirvožemio ar augmenijos [45]. Paprastai propolis susideda iš 50 proc. sakų bei augalinių balzamų, 30 proc. vaško, 10 proc. eterinių bei aromatinių aliejų, 5 proc. žiedadulkių ir apie 5 proc. kitų medžiagų, tokių kaip alifatinių rūgščių, esterių, aromatinių rūgščių, sočiųjų rūgščių, įvairių angliavandenių, aldehidų, amino rūgščių, ketonų, chalkonų, dihidrochalkonų, terpenoidų, vitaminų (B1, B2, B6, C, ir E) ir mineralų [42]. Pagrindinį propolio biologinį aktyvumą sąlygoja fenoliniai junginiai, tokie kaip fenolinės rūgštys, aldehidai ir flavanoidai [46]. Lietuvoje surinktame propolyje iš fenolinių junginių daugiausiai buvo aptikta ferulo, kumaro, vanilino, kofeino, galo, chlorogeninės, cinamono, protokatecho, rozmarino, rūgščių, pinokembrino, pinostrobino, chrisino ir vanilino [13, 47-49].
Propolis gali būti plačiai panaudojamas medicinoje, nes pasižymi antioksidaciniu, antiradikaliniu, priešbakteriniu, priešvirusiniu, antiparazitiniu, priešuždeginimiu, priešnavikiniu, anestetiniu bei imunomoduliaciniu aktyvumu [12, 13]. Propolis ir jo produktai gali būti naudojami kremuose, tepaluose, tabletėse, kapsulėse, pastilėse, ampulėse, sirupuose ar purškaluose (į nosies ertmę ar oraliniam naudojimui) [50]. Daug dėmesio patraukia ir mikroemulsijos, dėl gebėjimo inkorporuoti
didelį kiekį lipofilinės medžiagos ir pagerinti vaistinių medžiagų skvarbą per odą [51].
Naudojant transdermaliai, propolio produktai gali mažinti randų susidarymo tikimybę, skatinti bei greitinti žaizdų gyjimą [11]. Dėl antimikrobinių savybių propolis puikiai tinka gydyti ir nudegimams, kuomet didėja infekcijos tikimybė [52]. Atlikti tyrimai parodė, kad propolis stipriai veikia Helicobacter pylori, gramteigiamus stafilokokus ir streptokokus, gramneigiamus Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris ir Pseudomonas aeruginosa. Taip pat pastebėtas ir priešgybėlinis poveikis Candida albicans grybeliui [53]. Nudegimams gyti padėtų ir propolio junginių antioksidacinis poveikis, kuris padėtų mažinti oksidacinį stresą [11].
Propolio produktai taip pat gali būti panaudojami ir odontologijoje. Atlikti tyrimai parodė, kad propolis dėl savo priešgrybėlinių savybių galėtų padėti kovoti su burnos kandidoze ar protezų stomatitu, o dėl priešvirusinio poveikio galėtų padėti prieš Herpes simplex virusą. Propolis, kaip papildoma terapija, gali padėti burnos plokščiųjų ląstelių karcinomos gydyme – bičių pikyje aptinkamas kofeino rūgšties fenetilo esteris slopina karcinomos proliferaciją ir kolonijų susidarymą. Taip pat propolio produktai naudojami dantų pastose ar skalavimo skysčiuose, gali padėti mažinti apnašų susidarymą, kariesų atsiradimą ar dantų jautrumą [54].
Bičių pikyje esantys kofeino rūgšties fenetilo esteris ir artepilinas C, taip pat pasižymi ir imunomoduliaciniu poveikiu. Šie junginiai turi imunosupresinį poveikį T limfocitų subvienetams, tačiau taip pat gali aktyvuoti ir makrofagus [55].
Taigi, dėl gausios sudėties, propolis pasižymi labai plačiu farmakologiniu poveikiu. Bičių pikį galima inkorporuoti į daug skirtingų vaistų formų, o atliekami nauji tyrimai atranda vis daugiau propolio pritaikymo būdų.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Gelifikuotos aliejus–vanduo tipo mikroemulsijos, turinčios propolio junginių (vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo rūgščių ir vanilino).
2.2. Tyrimų medžiagos ir įranga
2.2.1. Naudotos medžiagos
Propolio žaliava – UAB „Medicata Filia“, Vilnius, Lietuva Izopropilo miristatas – Scharlab S. L., Ispanija
Etanolis, 96 proc. – AB „Vilniaus degtinė“, Vilnius, Lietuva Išgrynintas vanduo
Kaprilo–kaproilo makrogolio gliceratas (Labrasol®) – Gattefosse Saint-Priest, Prancūzija Poloksameras 407 (Kolliphor® P 407) – Sigma–Aldrich, Steinheim, Vokietija
2.2.2. Naudota įranga
Svarstyklės (Scaltec SBC 31, Scaltec Instruments GmbH, Vokietija)
pH–metras (pH–meter 766 su elektrodu Knick SE 104 N, (Knick Elektronische Messgerate GmbH and Co, Vokietija))
Vibracinis viskozimetras (Vibro viscometer SV–10, A&D Company Ltd., Japonija) ZetaSizer Nano ZS aparatas (Malvern Instruments, Ltd., Jungtinė Karalystė)
Magnetinė maišyklė su kaitinamuoju paviršiumi (IKA® C–MAG HS 7, IKA® – Werke GmbH & Co. KG, Vokietija)
Konduktometras (Cond 3110 SET 1, Vokietija) Termostatinė purtyklė (GFM, Vokietija)
2.3. Tyrimų metodai
2.3.1. Propolio junginių analizė efektyviosios skysčių chromatografijos
metodu
Tirta propolio fenolinių rūgščių (vanilo, kavos, p–kumaro, ferulo rūgščių) ir vanilino kokybinė ir kiekybinė sudėtis. Tyrimas atliktas kapiliariniu skysčių chromatografu su diodų matricos
detektoriumi „Agilent 1260 Infinity“, taikant laboratorijoje įdiegtą ir validuotą metodiką [56]. Chromatografinei analizei taikytos sąlygos:
Kolonėlė – C18 kolonėlė (150 × 0,5 mm, 5 μm dydžio dalelėmis).
Judri fazė – eliuentas A: 0,5 proc. acto rūgšties vandeninis tirpalas, eliuentas B: acetonitrilas. Linijinio gradiento kitimas – nuo 1 iki 21 proc. B 25 min..
Injekcijos tūris – 0,2 µl. Tėkmės greitis – 20 µl/min.. Kolonėlės temperatūra – 25 ºC.
Fenolinių junginių detekcija – 290 nm.
2.3.2. Propolio fenolinių junginių tirpumas
Vertintas propolio žaliavos tirpumas 96 proc. etanolyje, kuomet propolio žaliava tirpinta santykiu 1:20. Fenoliniai junginiai ekstrahuojami 48 valandas termostatuojamoje purtyklėje, esant 25 ºC temperatūrai ir 100 apsisukimų per minutę purtymo greičiui. Gautas tirpalas buvo filtruojamas pro popierinį filtrą, o po to pro nailoninį membraninį filtrą (0.22 µm) ir analizuojamas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
2.3.3. Aliejus–vanduo tipo mikroemulsijų gamyba ir sudėtys
Aliejus–vanduo mikroemulsijų sudėtys yra pasirinktos iš anksčiau atliktų tyrimų pseudotrinarių diagramų [57]. Mikroemulsijų gamybai buvo naudojamas išgrynintas vanduo kaip vandeninė terpė, izopropilo miristatas kaip aliejinė terpė, kaprilo-kaproilo makrogolio gliceridas (Labrasol®) naudotas kaip surfaktantas ir etanolis (96 proc.) naudotas kaip kosurfaktantas. Mikroemulsijų sudėtys nurodytos 1 lentelėje. Izopropilo miristatas proc. Išgrynintas vanduo proc. Surfaktantas ir kosurfaktantas (5:1) proc. Poloksameras 407 proc. ME_kontrolė 1,0 35,0 64,0 0 ME_1%_pr 1,0 34,0 64,0 1,0 ME_1%_po 1,0 34,0 64,0 1,0 ME_5%_pr 1,0 30,0 64,0 5,0 ME_5%_po 1,0 30,0 64,0 5,0
1 lentelė. Mikroemulsijų sudėtys
Mikroemulsijų gelifikacijai buvo pasirinktas poloksameras 407 (Kolliphor® P 407). Surfaktanto ir kosurfaktanto santykis yra 5:1. Negelifikuota mikroemulsija buvo gaminama ant magnetinės maišyklės maišant išgrynintą vandenį, surfaktanto/kosurfaktanto mišinį ir aliejinę fazę. Gelifikuotos mikroemulsijos buvo gaminamos dviem būdais: polimerą tirpdant išgrynintame vandenyje prieš mikroemulsijų gamybą ir polimerą įvedant į jau pagamintas mikroemulsijas. Naudotos polimero koncentracijos buvo 0 proc., 1 proc., 5 proc., 10 proc. ir 15 proc. bendros mikroemulsijos masės. Ištirpinti 10 proc. ir 15 proc. polimero vandenyje prieš mikroemulsijų gamybą technologiškai nepavyko, nes dėl didelės poloksamero 407 koncentracijos susidarė geliai, todėl buvo nuspręsta dalį polimero (5 proc.) ištirpinti vandenyje prieš mikroemulsijų gamybą, o likusią dalį tirpinti po gamybos.
2.3.4. Pagamintų aliejus–vanduo tipo mikroemulsijų fizikinių ir cheminių
savybių nustatymas
Pagamintų mikroemulsijų vidutinis dalelių dydis (VDD) ir polidispersiškumo indeksas (PDI) buvo tiriami dinaminės šviesos sklaidos metodu, naudojant ZetaSizer Nano ZS aparatą.
Mikroemulsijų klampa buvo tiriama vibraciniu viskozimetru, pH nustatomas pH–metru, o elektrinis laidumas tirtas konduktometru. Visi matavimai buvo atlikti kambario temperatūroje.
2.3.5. Propolio fenolinių junginių atpalaidavimo iš pagamintų mikroemulsijų
in vitro tyrimai
ME_10%_po 1,0 25,0 64,0 10,0
ME_5%_pr_5%_po 1,0 25,0 64,0 10,0
ME_15%_po 1,0 20,0 64,0 15,0
Propolio junginių atpalaidavimo tyrimai buvo atlikti in vitro, naudojant modifikuotas Franz–tipo difuzines celes ir regeneruotas celiuliozės dializės membranas. Akceptorinė terpė buvo 20 proc. etanolis, ji buvo maišoma naudojant magnetinę maišyklę, o terpės temperatūra buvo 32 ºC. Difuzijos plotas – 1,13 cm2. Donorinės fazės begalinė dozė difuzinėje celėje 5,00 ± 0.029 g. Mėginiai buvo imami po 1, 2, 3, 4 ir 6 valandų nuo difuzijos pradžios ir toks pat kiekis akceptorinės terpės buvo grąžinamas atgal. Mėginiai analizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos būdu.
2.3.6. Statistinė duomenų analizė
Atliktų tyrimų rezultatų statistinė analizė atlikta naudojant „Microsoft Office Excel 2013“ ir „IBM SPSS statistics subscribtion“ duomenų analizės paketus. Šie paketai buvo naudojami skaičiuoti vidurkius, standartinius nuokrypius, nustatyti statistiniam reikšmingumui buvo naudojama vieno faktoriaus dispersinės analizės modelis (angl. One–Way ANOVA), naudojant LSD (angl. Least Significant Difference) kriterijų ir blokuotų duomenų vienfaktorinės dispersinės analizės metodas, naudojant LSD kriterijų.
3.1. Propolio fenolinių junginių tirpumas
Fenolinių junginių ekstrakcijai buvo pasirinktas 96 proc. etanolis, nes jis geba išekstrahuoti didelį kiekį fenolinių junginių iš propolio žaliavos [42, 48]. Etanolis taip pat buvo naudojamas mikroemulsijų gamyboje kaip kosurfaktantas. Atlikti tyrimai parodė, kad etanolis puikiai tinka transdermalinėms formuluotėms, dėl gebėjimo įvairiais mechanizmais pagerinti vaistinių medžiagų skvarbą per odą, pavyzdžiui etanoliu paveikus odą kinta membranų struktūra ir gerėja difuzija [58, 59]. Ištirpintų propolio fenolinių junginių kiekiai yra pateikiami 4 paveiksle.
4 pav. Propolio fenolinių junginių tirpumas
Nustatyta, kad didžiausia koncentracija etanolinėje propolio ištraukoje buvo p–kumaro rūgšties (490,8 ± 68,3 µg/g). Šiek tiek mažiau buvo aptikta ferulo rūgšies (329,6 ± 38,3 µg/g) ir vanilino (265,2 ± 41,6 µg/g). Mažiausiai buvo aptikta vanilo rūgšties (148,5 ± 19,7 µg/g) ir kavos rūgšties (33,6 ± 5,3 µg/g). Suminis išekstrahuotų fenolinių junginių kiekis buvo 1267,64 µg/g. Loreta Kubilienė ir kt. (2018) atliktame tyrime buvo nustatomas propolio fenolinių junginių tirpumas vandenyje, 20 proc. propilenglikolyje ir 70 proc. etanolyje. Lyginant fenolinių rūgščių ir vanilino kiekius, daugiausiai junginių buvo išekstrahuota naudojant 70 proc. etanolį (3404,7 ± 124,8 µg/ml), o mažiausiai – vandenį (514,7 ± 40,6 µg/ml) [60]. Kavos rūgštis Vanilo rūgštis Vanilinas Ferulo rūgštis p-kumaro rūgštis 0.0 100.0 200.0 300.0 400.0 500.0 600.0 Fenol ini ų jung ini ų ki ek is µg /g Fenoliniai junginiai
3.2. Eksperimentinių aliejus–vanduo tipo mikroemulsijų fizikinių–cheminių
savybių vertinimas
Pagamintų mikroemulsijų fizikinės–cheminės savybės buvo tiriamos po pagaminimo, po 2 savaičių ir po 4 savaičių. Mikroemulsijos ME_kontrolė fizikinės–cheminės savybės yra pateikiamos 2 lentelėje.
2 lentelė. ME_kontrolė fizikinės–cheminės savybės
Tirtos ME_kontrolė mikroemulsijos pH, po 4 savaičių sumažėjo 5 proc.. Klampa po 4 savaičių padidėjo 7,5 proc., tačiau po 2 savaičių buvo pastebėta 3,5 proc. didesnė klampa, lyginant su rezultatais po 4 savaičių. Elektrinis laidis po 2 savaičių padidėjo 22,5 proc., o po 4 savaičių dar padidėjo iki 32,9 proc. lyginant su pradiniu tašku.
Vidutinis dalelių dydis po 4 savaičių statistiškai nereikšmingai (p<0,05) padidėjo 63,2 proc., o PDI sumažėjo 22,9 proc., tačiau statistiškai nereikšmingai (p<0,05).
Mikremulsijų ME_1%_pr ir ME_1%_po fizikinės–cheminės savybės yra pateikiamos 3 lentelėje. Mikroemulsijos ME_1%_pr pH po 4 savaičių sumažėjo 7,1 proc.. Klampa po 2 savaičių padidėjo 5,72 % ir po 4 savaičių nepakito. Elektrinis laidis po 4 savaičių padidėjo 28,9 proc..
Mikroemulsijos ME_1%_po pH po 4 savaičių sumažėjo 7,1 proc.. Klampa po 4 savaičių sumažėjo 14,3 proc.. Elektrinis laidis po 4 savaičių padidėjo 32,5 proc.
Abiejų 1 proc. gelifikuotų mikroemulsijų pH kito identiškai, o klampa kito atvirkščiai, ME_1%_pr ji didėjo, o ME_1%_po ji mažėjo. Elektrinis laidis kito panašiai, abiejose mikroemulsijose matomas apie 30 proc. padidėjimas.
ME_kontrolė
Po pagaminimo Po 2 savaičių Po 4 savaičių
pH 4 3,8 3,8
Klampa (mPa·s, 21-23 ºC) 18,6 20,7 20
Elektrinis laidis (µS/cm) 23,1 28,3 30,7
Vidutinis dalelių dydis (nm)
55.17 ± 1.735 64.22±14.96 90.04±55.74
Polidispersiškumo indeksas 0.459 ± 0.036 0.294±0.088 0.354±0.054
3 lentelė. ME_1%_pr ir ME_1%_po fizikinės–cheminės savybės
Vidutinis dalelių dydis mikroemulsijoje ME_1%_pr po 4 savaičių statistiškai reikšmingai (p<0,05) padidėjo 6,3 proc., o ME_1%_po mikroemulsijoje po 4 savaičių dalelių dydis statistiškai reikšmingai (p<0,05) sumažėjo 3,2 proc..
Mikroemulsijos ME_1%_pr PDI po 4 savaičių sumažėjo 4,4 proc., tačiau statistiškai nereikšmingai, o ME_1%_po PDI po 4 savaičių statistiškai nereikšmingai (p>0,05) sumažėjo 11 proc..
Lyginant mikroemulsijų ME_1%_pr ir ME_1%_po VDD ir PDI, skirtumai yra statistiškai reikšmingi (p<0,05).
Mikroemulsijų ME_5%_pr ir ME_5%_po fizikinės–cheminės savybės yra pateikiamos 4 lentelėje.
Mikroemulsijos ME_5%_pr pH po 4 savaičių sumažėjo 4,2 proc.. Klampa po 2 savaičių padidėjo 5,8 proc., tačiau po 4 savaičių pastebėtas tik 0,5 proc. padidėjimas lyginant su pradiniu tašku. Elektrinis laidis po 4 savaičių padidėjo 6,5 proc..
Mikroemulsijos ME_5%_po pH po 4 savaičių sumažėjo 4,17 proc.. Klampa po 4 savaičių sumažėjo 11,7 proc.. Elektrinis laidis po 4 savaičių padidėjo 10,6 proc..
Po pagamini mo Po 2 savaičių Po 4 savaičių Po 1 dienos Po 2 savaičių Po 4 savaičių pH 4,2 4 3,9 4,2 4 3,9 Klampa (mPa·s, 21-23 ºC) 22,7 24 24 26,6 24,4 22,8 Elektrinis laidis (µS/cm) 20,1 23,3 25,9 19,4 23,1 25,7 Vidutinis dalelių dydis (nm) 52.35 ± 1.036 53 ± 0.8847 55.68 ± 0.7739 64.32 ± 7.02 55.42 ± 3.562 62.21 ± 1.967 Polidispersiškumo indeksas 0.451 ± 0.028 0.451 ± 0.035 0.431 ± 0.008 0.553 ± 0.129 0.481 ± 0.023 0.492 ± 0.027 ME_5%_pr ME_5%_po Po pagaminimo Po 2 savaičių Po 4 savaičių Po 1 dienos Po 2 savaičių Po 4 savaičių pH 4,8 4,7 4,6 4,8 4,7 4,6
4 lentelė. ME_5%_pr ir ME_5%_po fizikinės–cheminės savybės
Abiejų mikroemulsijų pH kito identiškai. Mikroemulsijos ME_5%_pr klampa po dviejų savaičių padidėjo, tačiau po 4 savaičių sumažėjo, o mikroemulsijos ME_5%_po klampa tiek po 2 tiek po 4 savaičių mažėjo, tačiau abiejų mikroemulsijų klampa po 4 savaičių tapo panaši. Elektrinis laidis abiejose mikroemulsijose tiek po 2 tiek po 4 savaičių buvo padidėjęs.
Mikroemulsijos ME_5%_pr VDD po 4 savaičių statistiškai nereikšmingai (p>0,05) sumažėjo 1,36 proc., o ME_5%_po VDD po 4 savaičių statistiškai nereikšmingai (p>0,05) sumažėjo 8,6 proc..
ME_5%_pr PDI po 4 savaičių statistiškai nereikšmingai (p>0,05) sumažėjo 8,8 proc., o ME_5%_po PDI po 4 savaičių statistiškai nereikšmingai sumažėjo 0,8 proc..
Lyginant mikroemulsijų ME_5%_pr ir ME_5%_po VDD, skirtumai yra statistiškai reikšmingi (p>0,05), o lyginant PDI, skirtumai buvo statistiškai nereikšmingi (p>0,05).
Mikroemulsijų ME_10%_po ir ME_5%_pr_5%_po fizikinės–cheminės savybės yra pateikiamos 5 lentelėje.
Mikroemulsijos ME_5%_pr_5%_po pH po 4 savaičių sumažėjo 2,9 proc., klampa sumažėjo 23,4 proc., o elektrinis laidis padidėjo 9,4 proc..
Mikroemulsijos ME_10%_po pH sumažėjo 4,4 proc, klampa sumažėjo 24,9 proc., o elektrinis laidis padidėjo 9,3 proc..
Klampa (mPa·s, 21-23 ºC) 39,4 41,7 39,6 44,4 40,9 39,2 Elektrinis laidis (µS/cm) 16,8 17 17,9 17 17,7 18,8 Vidutinis dalelių dydis (nm) 91.89 ± 8.408 92.83 ± 12.92 90.64 ± 7.985 93.4 ± 11.04 74.95 ± 7.709 85.36 ± 6.001 Polidispersiškumo indeksas 0.719 ± 0.132 0.872 ± 0.157 0.656 ± 0.148 0.656 ± 0.129 0.829 ± 0.186 0.651 ± 0.059 ME_5%_pr_5%_po ME_10%_po Po pagaminimo Po 2 savaičių Po 4 savaičių Po 1 dienos Po 2 savaičių Po 4 savaičių pH 6,8 6,7 6,6 6,9 6,7 6,6
5 lentelė. ME_10%_po ir ME_5%_pr_5%_po fizikinės–cheminės savybės
Abiejų mikroemulsijų pH mažėjo ir po 4 savaičių susilygino. Klampa po 1 dienos buvo identiška, tačiau po 4 savaičių mikroemulsijos ME_10%_po klampos sumažėjimas buvo didesnis. Abiejų mikroemulsijų elektrinis laidis per 4 savaites didėjo.
Mikroemulsijos ME_5%_pr_5%_po VDD po 4 savaičių statistiškai nereikšmingai (p>0,05) sumažėjo 34,5 proc., o ME_10%_po VDD po 4 savaičių statistiškai reikšmingai (p<0,05) sumažėjo 30,2 proc..
Mikroemulsijos ME_5%_pr_5%_po PDI po 4 savaičių statistiškai reikšmingai (p<0,05) padidėjo 89,4 proc., o ME_10%_po PDI po 4 savaičių statistiškai nereikšmingai (p>0,05) padidėjo 46,6 proc..
Lyginant mikroemulsijų ME_5%_pr_5%_po ir ME_10%_po VDD ir PDI, skirtumai yra statistiškai reikšmingi (p<0,05).
Mikroemulsijų ME_15%_po ir ME_5%_pr_10%_po fizikinės–cheminės savybės yra pateikiamos 6 lentelėje.
Mikroemulsijos ME_5%_pr_10%_po pH po 4 savaičių sumažėjo 2,8 proc., klampa po 4 savaičių sumažėjo 27,3 proc., o elektrinis laidis po 4 savaičių padidėjo 11,2 proc..
Mikroemulsijos ME_15%_po pH po 4 savaičių sumažėjo 2,8 proc., klampa po 4 savaičių sumažėjo 25 proc., o elektrinis laidis po 4 savaičių padidėjo 10,3 proc..
Klampa (mPa·s, 21-23 ºC) 102 80,4 78,1 102 81,5 76,6 Elektrinis laidis (µS/cm) 13,8 14,9 15,1 14 15 15,3 Vidutinis dalelių dydis (nm) 115.8 ± 30.66 88.76 ± 15.31 75.88 ± 23.98 141.7 ± 44.48 70.83 ± 11.41 98.85 ± 12.34 Polidispersiškumo indeksas 0.443 ± 0.174 0.683 ± 0.182 0.839 ± 0.221 0.446 ± 0.286 0.741 ± 0.159 0.654 ± 0.109 ME_5%_pr_10%_po ME_15%_po Po pagaminimo Po 2 savaičių Po 4 savaičių Po 1 dienos Po 2 savaičių Po 4 savaičių pH 7,2 7,1 7 7,2 7 7 Klampa (mPa·s, 21-23 ºC) 178 138 125 172 135 129
6 lentelė. ME_15%_po ir ME_5%_pr_10%_po fizikinės–cheminės savybės
Abiejų mikroemulsijų pH mažėjo ir po 4 savaičių susilygino. Klampa abiejose mikroemulsijose mažėjo, o elektrinis laidis didėjo.
Mikroemulsijos ME_5%_pr_10%_po VDD po 4 savaičių statistiškai nereikšmingai (p>0,05) sumažėjo 5,5 proc., o ME_15%_po VDD po 4 savaičių statistiškai nereikšmingai (p>0,05) sumažėjo 58,6 proc..
Mikroemulsijos ME_5%_pr_10%_po PDI po 4 savaičių statistiškai nereikšmingai (p>0,05) sumažėjo 21 proc., o ME_15%_po PDI po 4 savaičių statistiškai nereikšmingai (p>0,05) sumažėjo 20,4 proc..
Lyginant ME_5%_pr_10%_po ir ME_15%_po mikroemulsijų VDD ir PDI, skirtumai yra statistiškai reikšmingi (p<0,05).
Ištyrus pagamintas a–v tipo mikroemulsijas būvo pastebėta, kad mažiausias pH buvo ME_kontrolė mikroemulsijoje (3,8), o iš gelifikuotų mikroemulsijų – sistemose su 1 proc. polimero (3,9). Mažiausiai pH kito sistemose su 15 proc. polimero (2,8 proc. sumažėjimas). Didžiausias pH pastebėtas mikroemulsijose su 15 proc. polimero (7,2). Didžiausias pH pokytis pastebimas mikroemulsijose su 1 proc. polimero sistemoje (7,1 % sumažėjimas). Lyginant su ME_kontrolė, mažesni pH pokyčiai pastebėti mikroemulsijose su 5 proc., 10 proc. ir 15 proc. polimero koncentracijomis. Kenneth Chibuzor Ofokansi ir kt. (2013) atliktame tyrime mikroemulsijų su poloksameru 407 formuluočių pH taip pat buvo panašus – jis siekė nuo 3.20 ± 0.09 iki 5.91 ± 0.03 [9]. Pagal mokslinės literatūros duomenis, žmogaus odos pH yra 4–6 [61, 62]. Pagamintų mikroemulsijų pH buvo nuo 3,8 iki 7,2, todėl galima teigti, kad pagamintos mikroemulsijos yra tinkamos vartoti ant odos.
Pagal mokslinę literatūrą, elektrinis laidis gali nurodyti mikroemulsijos tipą. Kai elektrinis laidis yra aukštas (10–100 µS/cm), mikroemulsijos yra laikomos a–v tipo, o jei žemesnis nei 10 µS/cm – v–a tipo [63-65]. Tirtų mikroemulsijų elektrinis laidis buvo nuo 11,6 µS/cm iki 30,7 µS/cm, todėl galima teigti, kad tirtos mikroemulsijos buvo a–v tipo.
Didėjant ištirpinto polimero kiekiui, didėja ir mikroemulsijų klampa. Lyginant su ME_kontrolė, ME_1%_pr klampa po pagaminimo padidėjo 22 proc. ir po 4 savaičių, padidėjo 20 proc., o ME_1%_po
Elektrinis laidis (µS/cm) 11,6 12,7 12,9 11,6 12,5 12,8 Vidutinis dalelių dydis (nm) 128.5 ± 39.11 162.2 ± 34.32 121.5 ± 33.59 184.2 ± 67.04 106.2 ± 23.14 108 ± 22.75 Polidispersiškumo indeksas 0.46 ± 0.126 0.386 ± 0.067 0.363 ± 0.067 0.583 ± 0.116 0.277 ± 0.035 0.464 ± 0.127
klampa po pagaminimo padidėjo 28,5 proc. ir po 4 savaičių padidėjo 14 proc.. ME_kontrolė palyginus su ME_5%_pr, po pagaminimo klampa padidėjo 111,8 proc. ir po 4 savaičių padidėjo 98 proc., o ME_5%_po, po pagaminimo klampa padidėjo 138,7 proc. ir po 4 savaičių padidėjo 96 proc.. Lyginant ME_kontrolė su ME_5%_pr_5%_po, po pagaminimo klampa padidėjo 448,4 proc. ir po 4 savaičių padidėjo 290,5 proc., o ME_10%_po po pagaminimo klampa padidėjo 448,4 proc. ir po 4 savaičių padidėjo 283 proc.. Lyginant ME_kontrolė su ME_5%_pr_10%_po, po pagaminimo klampa padidėjo 857 proc. ir po 4 savaičių padidėjo 525 proc., o ME_15%_po po pagaminimo padidėjo 824,7 proc. ir po 4 savaičių padidėjo 545 proc.. Gauti rezultatai atitinka mokslinės literatūros duomenis – didėjant poloksamero 407 koncentracijai sistemoje, didėja ir klampa [66]. Poloksameras 407 vandeninėje terpėje geba sudaryti miceles, kurios gali jungtis tarpusavyje [29]. Šis klampos didėjimas gali būti paaiškinamas polimero micelių kiekio didėjimu – kuo didesnė poloksamero 407 koncentracija, tuo daugiau micelių gali susidaryti, o susidariusios micelės gali jungtis ir tarpusavyje ir su disperguotomis dalelėmis, taip sudarydami agregatus, todėl didėja sistemos klampą.
Didėjant polimero koncentracijai matomas VDD bei PDI pokytis mikroemulsijose. Lyginant ME_kontrolė su 5 proc., 10 proc. ir 15 proc. gelifikuotomis sistemomis, didėja tiek VDD tiek PDI. Šį padidėjimą galima sieti su poloksamero 407 micelių kiekio didėjimu. Susidarę micelių ir disperguotų dalelių agregatai gali paveikti šviesos sklaidos tyrimų rezultatus. Kuomet polimero koncentracija yra 1 proc. bendros mikroemulsijos masės, pastebima, kad dalelių dydis po pagaminimo yra panašus į ME_kontrolė mikroemulsiją – dėl mažesnės poloksamero 407 koncentracijos susidaro mažiau micelių, todėl mažiau ir agregatų.
Lyginant ME_kontrolė ir gelifikuotas mikroemulsijas, pastebima, kad didėjant polimero koncentracijai sistemoje didėja ir PDI. Daugėjant poloksamero 407 micelių, gali susidaryti įvarių dydžių agregatai. Polimero koncentracijai esant 5 proc., 10 proc. ir 15 proc. bendros mikroemulsijos masės, matomi ir padidėję PDI pokyčiai po 2 ir po 4 savaičių. Atlikti tyrimai parodė, kad disperguotos dalelės su polimeru gali sudaryti agregatus ir vėl iširti [40]. Dėl didėjančio micelių kiekio, disperguotos dalelės su polimeru gali sudaryti įvairaus dydžio struktūras, kurios bėgant laikui gali iširti, taip nuolat keisdamos PDI reikšmę.
Gelifikuotose mikroemulsijose yra matomas VDD padidėjimas, lyginant su ME_kontrolė, tačiau taip pat pastebimas ir VDD pokyčio sumažėjimas bėgant laikui, sistemose, su 1 proc. ir 5 proc. polimero koncentracija. ME_kontrolė VDD po 4 savaičių pakito 63,2 proc., tačiau gelifikuotos mikroemulsijos šį kitimą pristabdo – ME_1%_pr ir ME_1%_po VDD pokytis po 4 savaičių yra atitinkamai 6,4 proc. ir 3,3 proc., ME_5%_pr ir ME_5%_po VDD po 4 savaičių pakinta 1,4 proc. ir 8,6 proc.. Polimero padidėjus iki 10 proc. ir 15 proc., vėl išryškėja VDD pokyčiai – ME_5%_pr_5%_po ir ME_10%_po VDD po 4 savaičių pakinta atitinkamai 34,5 proc. ir 30,2 proc., o mikroemulsijų ME_5%_pr_10%_po ir ME_15%_po VDD po 4 savaičių pakinta 5,5 proc. ir 58,6 proc.. Li Na ir kt. (2009) atliktame tyrime taip
pat buvo pastebėtas mikroemulsijų dalelių didėjimas, didėjant polimero koncentracijai (polietilenglikolis). Mikroemulsijų be PEG–400 dalelių diametras siekė 15 nm, o pridėjus 2,3 proc. polimero, diametras siekė 43 nm [67].
3.3. Eksperimentinių aliejus–vanduo tipo mikroemulsijų dalelių dydžio pokyčio
vertinimas
Pagamintų mikroemulsijų vidutinis dalelių dydis buvo matuojamas 1 diena po pagaminimo, 2 savaitės po pagaminimo ir 4 savaitės po pagaminimo. Mikroemulsijos ME_kontrolė VDD pokyčiai pavaizduoti 5 paveiksle.
5 pav. ME_kontrolė vidutinio dalelių dydžio pokyčiai
ME_kontrolė mikroemulsijoje po 2 savaičių 9,8 proc. padaugėjo dalelių, kurių dydis buvo nuo 1,74 nm iki 2,69 nm. Dalelių, kurių dydis buvo nuo 3,12 nm iki 5,62 nm kiekis mikroemulsijoje sumažėjo
-5 0 5 10 15 20 25 30 0.6213 0.8332 1.117 1.499 2.01 2.696 3.615 4.849 6.503 8.721 11.7 15 .69 21.04 28.21 37.84 50.75 68.06 91.28 122.4 Proc ent in is dal el ių sk ai či us Dalelių dydis (nm) ME_kontrolė po 0 d. po 2 sav. po 4 sav. -5 0 5 10 15 20 25 30 35 0.6213 0.9649 1.499 2.328 3.615 5.615 8.721 13.54 21.04 32.67 50.75 78.82 122.4 Proc ent ini s dal el ių sk ai či us Dalelių dydis (nm) ME_1%_pr po 1 d. po 2 sav. po 4 sav. -5 0 5 10 15 20 25 30 0.6213 0.8332 1.117 1.499 2.01 2.69 6 3.615 4.849 6.503 8.721 11.7 15.69 21.04 28.21 37.84 50.75 68.06 91.28 122.4 Proc ent ini s dal el ių sk ai či us Dalelių dydis (nm) ME_1%_po po 1 d. po 2 sav. po 4 sav.
9,7 proc., o dalelių, kurių dydis buvo 6,5 nm nebepavyko aptikti. Lyginant dalelių dydžius po 2 savaičių ir po 4 savaičių pastebima, kad 0,1 proc. padaugėjo dalelių, kurių dydis buvo 1,74 nm, tačiau 37,5 proc. sumažėjo dalelių kiekis intervale nuo 2,01 nm iki 3,12 nm. Dalelių, kurių dydis buvo nuo 3,615 nm iki 5,61 nm padaugėjo 16,8 proc. ir atsirado naujų dalelių, kurių dydis buvo 6,5 nm ir 7,53 nm. Taip pat atsirado ir antra smailė, intervale nuo 28,21 nm iki 91,28 nm, kurią sudarė 19,8 proc. dalelių. Iš šių pokyčių matome, kad smailė, po 2 savaičių pasislinko į kairę – buvo pastebimas dalelių sumažėjimas. Po 4 savaičių, smailė pasislinko į dešinę – dalelės didėjo, o taip pat atsirado ir nauja smailė su dalelėmis, kurių dydžiai buvo nuo 28,21 nm iki 91,28 nm.
ME_1%_pr ir ME_1%_po mikroemulsijų vidutinio dalelių dydžio pokyčiai pavaizduoti 6 paveiksle.
6 pav. ME_1%_pr ir ME_1%_po vidutinio dalelių dydžio pokyčiai
Mikroemulsijoje ME_1%_pr po 2 savaičių nebebuvo galima aptikti 1 proc. dalelių, kurių dydis yra 1,499 nm ir sumažėjo dalelių intervale nuo 1,74 nm iki 2,24 nm, tačiau 20,8 proc. padaugėjo dalelių intervale nuo 2,69 nm iki 5,62 nm, tad smailė pasislinko į dešinę. Lyginant dalelių dydžius po 2 savaičių ir po 4 savaičių, pastebima, kad 8,7 proc. sumažėjo dalelių intervale nuo 1,74 nm iki 2,33 nm., tačiau 8,7 proc. padaugėjo dalelių intervale nuo 2,69 nm iki 5,66 nm ir atsirado 0,1 proc. naujų dalelių, kurių dydis buvo 6,5 nm.
Mikroemulsijoje ME_1%_po, po 2 savaičių atsirado naujų dalelių, intervale 1,27 nm – 1,49 nm, kurios sudarė 5,8 proc. visų dalelių ir 35 proc. padaugėjo dalelių intervale nuo 1,74 nm iki 3,12 nm, tačiau 0,8 proc. sumažėjo dalelių intervale nuo 3,62 nm iki 4,85 nm. Dalelių kiekis, kurių dydis buvo 5,62 nm išliko toks pat, o 40 proc. dalelių intervale 15,69 nm – 68,06 nm nebebuvo galima aptikti. Lyginant dalelių dydžius po 2 savaičių ir po 4 savaičių, pastebima, kad 5,8 proc. dalelių intervale nuo 1,29 nm iki 1,49 nm nebeliko ir 20,1 proc. sumažėjo dalelių intervale nuo 1,74 nm iki 2,33 nm, tačiau intervale nuo 2,69 nm iki 5,62 nm dalelių padaugėjo 25,9 proc..
Mikroemulsijų ME_5%_pr ir ME_5%_po vidutinio dalelių dydžio pokyčiai pavaizduoti 7 paveiksle.
7 pav.ME_5%_pr ir ME_5%_po vidutinio dalelių dydžio pokyčiai
Mikroemulsijoje ME_5%_pr, po 2 savaičių pastebimas 7,3 proc. dalelių kiekio sumažėjimas intervale nuo 1,49 nm iki 2,69 nm, tačiau intervale nuo 3,12 nm iki 5,62 nm 7,1 proc. dalelių padaugėjo ir atsirado 0,1 proc. naujų 6,5 nm dalelių. Lyginant dalelių dydžius po 2 savaičių ir po 4 savaičių, pastebima, kad atsirado naujų dalelių intervale nuo 1,12 nm iki 1,29 nm, kurios sudarė 1,6 proc. viso dalelių kiekio. Intervale nuo 1,49 nm iki 1,74 nm 2,4 proc. dalelių padaugėjo, tačiau intervale nuo 2,01 nm iki 3,12 nm dalelių sumažėjo 10,7 proc.. Intervale nuo 3,62 nm iki 5,62 nm padaugėjo dalelių 1,9 proc., o 0,1 proc. dalelių, kurių dydis yra 6,5 nm, kiekis išliko toks pat.
Mikroemulsijoje ME_5%_po, po 2 savaičių nebelieka dalelių, kurių dydis yra 1,49 nm ir 1,5 proc. sumažėja dalelių, kurių dydis yra 1,74 nm, o dalelių, kurių dydis yra 2,01 nm kiekis išlieka toks pat. Intervale nuo 2,33 nm iki 3,12 nm dalelių kiekis padidėja 4,8 proc., o dalelių intervale nuo 3,62 nm iki 5,62 nm sumažėja 2,5 proc. ir nebelieka dalelių, kurių dydis buvo 6,5 nm, kurios sudarė 0,1 proc. visų dalelių. Lyginant rezultatus po 2 savaičių ir po 4 savaičių yra pastebima, kad atsirado naujų dalelių intervale nuo 1,29 nm iki 1,49 nm. Dalelių intervale nuo 1,74 nm iki 2,01 nm padaugėja 12,7 proc., tačiau intervale nuo 2,33 nm iki 5,62 nm dalelių sumažėja 22,4 proc..
Mikroemulsijų ME_5%_pr_5%_po ir ME_10%_po vidutinio dalelių dydžio pokyčiai pavaizduoti 8 paveiksle. -5 0 5 10 15 20 25 0.62 13 0.8332 1.117 1.499 2.01 2.696 3.615 4.849 6.503 8.721 11.7 15.69 21.04 28.21 37.84 50.75 68.06 91.28 122.4 Proc ent ini s dal el ių sk ai či us Dalelių dydis (nm) ME_5%_pr po 1 d. po 2 sav. po 4 sav. -5 0 5 10 15 20 25 30 0.6213 0.9649 1.29 4 1.736 2.328 3.122 4.187 5.615 7.531 10.1 13.54 18.17 24.36 32.67 43.82 58.77 78.82 105.7 Proc ent ini s dal el ių sk ai či us Dalelių dydis (nm) ME_5%_po po 1 d. po 2 sav. po 4 sav.
8 pav. ME_5%_pr_5%_po ir ME_10%_po vidutinio dalelių dydžio pokyčiai
Mikroemulsijoje ME_5%_pr_5%_po, po 2 savaičių 15,4 proc. padaugėja dalelių intervale nuo 1,49 nm iki 2,33 nm, tačiau intervale nuo 2,69 nm iki 6,503 nm, 15,4 proc. dalelių sumažėja, o dalelių, kurių dydis yra 7,53 nm, kiekis išlieka toks pat. Lyginant rezultatus po 2 savaičių ir rezultatus po 4 savaičių, pastebime, kad nebeliko dalelių, kurių dydis buvo 1,499 nm ir pastebimas 17,7 proc. dalelių sumažėjimas intervale nuo 1,74 nm iki 2,33 nm. Intervale nuo 2,69 nm iki 6,5 nm, dalelių padaugėja 18,5 proc., o dalelių kiekis, kurių dydis yra 7,53 nm, išlieka toks pats.
Mikroemulsijoje ME_10%_po, po 2 savaičių pastebima, kad atsirado 1,2 proc. naujų dalelių, kurių dydis buvo 1,29 nm ir 28,9 proc. padaugėjo dalelių, kurių dydis buvo nuo 1,49 nm iki 2,69 nm. Intervale nuo 3,12 nm iki 6,5 nm, 30,2 proc. dalelių sumažėjo. Lyginant rezultatus po 2 savaičių ir po 4 savaičių pastebime, kad atsirado 1,1 proc. naujų dalelių, kurių dydis yra 1,12 nm ir 5,1 proc. padaugėjo dalelių intervale nuo 1,29 nm iki 1,49 nm. Intervale nuo 1,74 nm iki 2,69 nm, 33,1 proc. sumažėjo dalelių kiekis, o intervale nuo 3,12 nm iki 6,5 nm, dalelių kiekis padidėjo 27,2 proc..
Mikroemulsijų ME_5%_pr_10%_po ir ME_15%_po vidutinio dalelių dydžio pokyčiai pavaizduoti 9 paveiksle.
Mikroemulsijoje ME_5%_pr_10%_po, po 2 savaičių nebeliko dalelių intervale nuo 0,97 nm iki 1,49 nm ir 28,8 proc. sumažėjo dalelių intervale nuo 1,74 nm iki 2,69 nm. Intervale nuo 3,12 nm iki 6,503 nm, dalelių padaugėjo 39,5 proc. ir atsirado naujų dalelių, kurių dydis buvo 7,53 nm. Lyginant rezultatus po 2 savaičių ir po 4 savaičių, pastebima, kad atsirado naujų dalelių intervale nuo 1,12 nm iki 1,49 nm, kurios sudarė 8,9 proc. visų dalelių. Intervale nuo 1,74 nm iki 2,33 nm, dalelių padaugėjo 16,1 proc., o intervale nuo 2,69 nm iki 4,19 nm, pastebimas 39,8 proc. dalelių sumažėjimas. Intervale nuo
-5 0 5 10 15 20 25 0.6213 0.8332 1.117 1.499 2.01 2.69 6 3.615 4.849 6.503 8.721 11.7 15.69 21.04 28.21 37.84 50.75 68.06 91.28 122.4 Proc ent ini s dal el ių sk ai či us Dalelių dydis (nm) ME_5%_pr_5%_po po 0 d. po 2 sav. po 4 sav. -5 0 5 10 15 20 25 30 0.6213 0.83 32 1.117 1.499 2.01 2.696 3.615 4.849 6.503 8.721 11.7 15.69 21.04 28.21 37.84 50.75 68.06 91.28 122.4 P roc enti nis dale li ų ska ičius Dalelių dydis (nm) ME_10%_po po 0 d. po 2 sav. po 4 sav.
4,85 nm iki 7,53 nm, dalelių padaugėjo 14,1 proc. ir atsirado naujų dalelių intervale nuo 8,72 nm iki 10,1 nm, kurios sudarė 0,8 proc. visų dalelių.
9 pav.ME_5%_pr_10%_po ir ME_15%_po vidutinio dalelių dydžio pokyčiai
Mikroemulsijoje ME_15%_po, po 2 savaičių atsirado 0,3 proc. naujų dalelių, kurių dydis buvo 1,29 nm ir 8 proc. padaugėjo dalelių intervale nuo 1,49 nm iki 3,12 nm. Intervale nuo 3,62 nm iki 7,53 nm, 8,5 proc. dalelių kiekis sumažėjo, o 0,1 proc. dalelių, kurių dydis buvo 8,72 nm nebeliko. Lyginant rezultatus po 2 savaičių ir po 4 savaičių pastebima, kad nebeliko 10,8 proc. dalelių, kurių dydis buvo nuo 1,29 nm iki 1,74 nm ir 13 proc. sumažėjo dalelių kiekis intervale nuo 2,01 nm iki 2,33 nm. Intervale nuo 2,69 nm iki 7,53 nm, dalelių padaugėjo 23,9 proc..
Wanli Kang ir kt. (2011) atliktas tyrimas parodė, kad į mikroemulsijas pridėjus polimero (dalinai hidrolizuotas poliakrilamidas), sistemos VDD padidėjo, tačiau dalelių pokyčiai sumažėjo, o pačių dalelių judėjimą pristabdė susidaręs polimero tinklas [68].
Lyginant skirtingų eksperimentinių mikroemulsijų dalelių dydžio kitimą po pagaminimo, po 2 savaičių ir po 4 savaičių, efektyviausiai dalelių dydžio kitimą stabdė ME_1%_pr – smailė tolygiai slinkosi į kairę. Kitose eksperimentinėse mikroemulsijose buvo pastebimi netolygūs smailių poslinkiai, smailių platėjimas ar antros smailės atsiradimas.
-5 0 5 10 15 20 25 30 0.6213 0.8332 1.117 1.499 2.01 2.696 3.615 4.849 6.503 8.72 1 11.7 15.69 21.04 28.21 37.84 50.75 68.06 91.28 122.4 P roc enti nis dale li ų ska ičius Dalelių dydis (nm) ME_5%_pr_10%_po po 0 d. po 2 sav. po 4 sav. -5 0 5 10 15 20 25 30 0.6213 0.8332 1.117 1.499 2.01 2.696 3.615 4.849 6.503 8.721 11.7 15.69 21.04 28 .21 37.84 50.75 68.06 91.28 122.4 P roc enti nis dale li ų ska ičius Dalelių dydis (nm) ME_15%_po po 0 d. po 2 sav. po 4 sav.
3.4. Propolio fenolinių junginių atpalaidavimas in vitro iš eksperimentinių aliejus–
vanduo tipo mikroemulsijų
Propolio fenolinių junginių atpalaidavimo tyrimams buvo pasirinktos ME_kontrolė, ME_1%_pr ir ME_5%_pr_5%_po, vertinant pagal mikroemulsijų dalelių dydžio pokyčius. Suminis atpalaiduotų fenolinių junginių kiekis iš eksperimentinių mikroemulsijų yra pavaizduotas 14 paveiksle.
14 pav. Suminis atpalaiduotų fenolinių jungnių kiekis iš eksperimentinių mikroemulsijų
Atlikti tyrimai parodė, kad didžiausias suminis fenolinių junginių kiekis po 6 valandų buvo atpalaiduotas iš mikroemulsijos ME_1%_pr – 1,2 ± 0,1 proc. (srautas 7 ± 0,3 µg/cm2). Mažiausias
suminis fenolinių junginių kiekis buvo atpalaiduotas iš ME_5%_pr_5%_po – 0,5 ± 0 proc. (srautas 2,8 ± 0 µg/cm2). Mikroemulsijos ME_kontrolė atpalaiduotas suminis fenolinių junginių kiekis buvo 1,1 ± 0,1 proc. (srautas 6,7 ± 0,4 µg/cm2). Statistinės analizės duomenimis, skirtumas tarp atpalaiduotų suminių fenolinių junginių kiekių iš skirtingų eksperimentinių mikroemulsijų yra statistiškai reikšmingas (p<0,05).
Iš eksperimentinių mikroemulsijų po 6 valandų atpalaiduotas vanilino kiekis yra pavaizduotas 15 paveiksle.
Daugiau vanilino po 6 valandų atpalaidavo ME_kontrolė – 4,4 ± 0,5 µg/g (srautas 3,8 ± 0,5 µg/cm2). Mikroemulsija ME_1%_pr atpalaidavo 4 ± 0,8 µg/g (srautas 3,5 ± 0,7 µg/cm2). ME_5%_pr_5%_po mėginiuose vanilinas buvo aptiktas po 4 valandų, tačiau jo atpalaiduota per mažai, kad būtų galima įvertinti jo kiekį. Statistinės analizės duomenimis, skirtumas tarp atpalaiduotų vanilino kiekių iš skirtingų eksperimentinių mikroemulsijų yra statistiškai nereikšmingas (p>0,05).
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
ME_kontrolė ME_1%_pr ME_5%_pr_5%_po
Sum ini s at pal ai duot ų fenol ini ų jung ni ų ki ek is (pr oc.) Po 4 valandų Po 6 valandų
