FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
VIKTORIJA GREIČIŪNAITĖ
MIKROEMULSIJŲ SU PROPOLIO FENOLINIAIS JUNGINIAIS
MODELIAVIMAS IR BIOFARMACINIS VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Lekt. dr. Modestas Žilius
FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data
MIKROEMULSIJŲ SU PROPOLIO FENOLINIAIS JUNGINIAIS
MODELIAVIMAS IR BIOFARMACINIS VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Lekt. dr. Modestas Žilius Data
Recenzentas Darbą atliko Magistrantė
Viktorija Greičiūnaitė Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Mikroemulsijų apibūdinimas ir klasifikacija ... 11
1.2. Mikroemulsijų privalumai ir trūkumai ... 12
1.3. Mikroemulsijų gamybai naudojami komponentai ... 13
1.4. Mikroemulsijų gamyba ... 14
1.5. Mikroemulsijų pritaikymo galimybės ... 15
1.6. Mikroemulsijų charakterizavimas ... 16
1.7. Mikroemulsijos su propolio junginiais ... 18
2. TYRIMO METODIKA ... 20
2.1. Tyrimo objektas ... 20
2.2. Tyrimų medžiagos ir įranga ... 20
2.2.1.Naudotos medžiagos ... 20
2.2.2. Naudota įranga ... 20
2.3. Tyrimų metodai ... 21
2.3.1. Propolio fenolinių junginių analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 21
2.3.2. Propolio fenolinių junginių tirpumas ... 21
2.3.3. Pseudotrinarių fazių diagramų sudarymas ir mikroemulsijų gamyba ... 21
2.3.4. Aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų termodinaminio stabilumo vertinimas ... 22
2.3.5. Aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų fizikinių-cheminių savybių nustatymas ... 22
2.3.6. Aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų sudėties optimizavimas ... 23
2.3.7. Propolio fenolinių junginių atpalaidavimo iš aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų in vitro tyrimai ... 24
2.3.8. Statistinė duomenų analizė ... 24
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 25
3.1. Tirtų propolio fenolinių rūgščių ir aldehido tirpumo vertinimas ... 25
3.2. Pseudotrinarės fazių diagramos formavimas ir aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų fizikinių-cheminių savybių vertinimas ... 26
3.4. Aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų sudėties optimizavimas... 32
3.5. Optimalios sudėties aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų fizikinių-cheminių savybių vertinimas 34 3.6. Propolio fenolinių junginių atpalaidavimas in vitro iš optimalios sudėties aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų ... 41
4. IŠVADOS ... 44
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 46
V. Greičiūnaitės magistro baigiamasis darbas ,,Mikroemulsijų su propolio fenoliniais junginiais modeliavimas ir biofarmacinis vertinimas‘‘/ mokslinis vadovas lekt. dr. Modestas Žilius; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Klinikinės farmacijos katedra. – Kaunas.
Darbo tikslas: sumodeliuoti aliejus-vanduo tipo mikroemulsijas ir įvertinti propolio fenolinių rūgščių (vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo rūgščių) ir vanilino atpalaidavimą in vitro iš jų.
Darbo uždaviniai: įvertinti propolio fenolinių junginių tirpumą mikroemulsijų komponentuose; sumodeliuoti aliejus-vanduo tipo mikroemulsijas ir įvertinti jų termodinaminį stabilumą ir fizikines-chemines savybes; optimizuoti pasirinktų mikroemulsijų sudėtį; įvertinti mikroemulsijų su propolio fenoliniais junginiais fizikines-chemines savybes; įvertinti propolio fenolinių rūgščių ir vanilino atpalaidavimą iš optimalios sudėties mikroemulsijų.
Metodai: propolio fenolinių junginių kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui naudotas validuotas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Mikroemulsijų dalelių dydžiai ir polidispersiškumo indeksai nustatyti dinaminės šviesos sklaidos metodu. Biofarmacinis atpalaidavimo in vitro tyrimas atliktas naudojant modifikuotas Franz tipo difuzines celes.
Rezultatai: optimalios sudėties aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų, turinčių propolio fenolinių junginių, vidutinis dalelių dydis buvo nuo 171,3 nm iki 311,6 nm, polidispersiškumo indeksas buvo 0,077–0,178 ribose, pH varijavo nuo 4,5 iki 5,3, klampa buvo nuo 48,9 mPa·s iki 59,2 mPa·s, elektrinis laidis buvo 13,2–23,3 μS/cm ribose. Didžiausias suminis propolio fenolinių junginių kiekis atpalaiduotas per 4 val. buvo 5,28 ± 0,51 proc., o srautas 75,58 ± 7,23 µg/cm2 iš aliejus-vanduo tipo mikroemulsijios, kuri sudaryta iš 7,0 proc. izopropilo miristato, 31,0 proc. išgryninto vandens ir 62,0 proc. surfaktanto ir kosurfaktanto mišinio (santykis 5:1). Parinkus tinkamą sudėtį, sumodeliuota kokybės parametrus atitinkanti aliejus-vanduo tipo mikroemulsija, kurios sudėtyje buvo 1,1 proc. izopropilo miristato, 36,9 proc. išgryninto vandens ir 62,0 proc. labrasolio ir PEG-400 mišinio (santykis 5:1).
Išvados: didžiausias kiekis propolio fenolinių junginių (p-kumaro, ferulo, vanilo, kavos rūgščių ir fenolinio aldehido vanilino) išekstrahuotas naudojant etanolį. Kokybės parametrus atitiko mikroemulsija, sudaryta iš 1,1 proc. izopropilo miristato, 36,9 proc. išgryninto vandens ir 62,0 proc. labrasolio ir PEG-400 mišinio (santykis 5:1). Mikroemulsija, kurios sudėtyje yra 7,0 proc. izopropilo miristato, 31,0 proc. išgryninto vandens ir 62,0 proc. labrasolio ir PEG-400 mišinio (santykis 5:1) yra tinkamiausia atpalaiduoti didžiausią propolio fenolinių junginių kiekį.
V. Greičiūnaitė‘s final thesis for masters’s degree ,,Modelling and biopharmaceutical evaluation of microemulsions containing propolis phenolic compounds‘‘/ scientific supervisor lect. dr. Modestas Žilius; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, department of Clinical Pharmacy. – Kaunas.
The aim of work: to formulate oil-in-water type microemulsions and to evaluate propolis phenolic acids (vanillic, caffeic, p-coumaric, ferulic acids) and vanillin release in vitro from modelled microemulsions.
Main tasks: to evaluate solubility of propolis phenolic coumpounds in the components of microemulsions; to formulate oil-in-water type microemulsions and to evaluate thermodynamic stability and physicochemical properties of microemulsions; to optimize the composition of selected microemulsions; to evaluate physicochemical properties of microemulsions containing propolis phenolic compounds; to evaluate the release of propolis phenolic acids and vanillin from the optimal composition of microemulsions.
Methods: identification and quantification of propolis phenolic compounds was performed by validated HPLC method. The particles sizes and values of polydispersity indexes of microemulsions were determined by dynamic light scattering method. Biopharmaceutical in vitro release studies were performed by modified Franz type diffusions cells system.
Results: the average particle size of oil-in-water type optimal composition microemulsions containing propolis phenolic compounds was from 171.3 nm to 311.6 nm. The polydispersity index was in the range of 0.077–0.178, pH varies from 4.5 to 5.3, the viscosity was in the range of 48.9–59.2 mPa·s, the conductivity was in the range of 13.2–23.3 μS/cm. After 4 hours the highest amount of released propolis phenolic compounds were 5.28 ± 0.51% and the flux was 75.58 ± 7.23 µg/cm2 from oil-in-water type microemulsion containing 7.0% of isopropyl myristate, 31.0% of purified oil-in-water, 62.0% of the mixture of surfactant and cosurfactant (5:1 ratio). After the selection of suitable composition, oil-in-water type microemulsion, complied with the requirements of the quality, was modelled. This microemulsion containing 1.1% of isopropyl myristate, 36.9% of purified water, 62.0% of the mixture of labrasol and PEG-400 (5:1 ratio).
Conslusions: the largest amount of propolis phenolic compounds (p-coumaric, ferulic, vanillic, caffeic acids and vanillin) was extracted using ethanol. Microemulsion containing 1.1% of isopropyl myristate, 36.9% of water, 62.0% of the mixture of labrasol and PEG-400 (5:1 ratio) complied with the requirements of the quality. The most suitable to release the highest amount of propolis phenolic compounds is microemulsion containing 7.0% of isopropyl myristate, 31.0% of water, 62.0% of the mixture of labrasol and PEG-400 (5:1 ratio).
PADĖKA
Už suteiktas puikias darbo sąlygas, materialinius išteklius, teorinę bei praktinę pagalbą rengiant mokslinį tiriamąjį darbą ,,Mikroemulsijų su propolio fenoliniais junginiais modeliavimas ir biofarmacinis vertinimas‘‘ dėkoju darbo vadovui lekt. dr. Modestui Žiliui ir visam Klinikinės farmacijos katedros kolektyvui.
SANTRUMPOS
A-v – aliejus vandenyje tipo sistema V-a – vanduo aliejuje tipo sistema VDD – vidutinis dalelių dydis PDI – polidispersiškumo indeksas
ĮVADAS
Siekiant išvengti virškinamąjį traktą dirginančio poveikio, pirmos eilės metabolizmo kepenyse, preparato sisteminio poveikio, yra naudojami vietiniu veikimu pasižymintys preparatai – tepalai, kremai, geliai [35, 67]. Dėl didelės šių puskiečių preparatų klampos, iš šių farmacinių formų veiklieji junginiai atpalaiduojami sunkiau, tai nulemia mažesnį prasiskverbusį jų kiekį į odą [3, 6, 37]. Kremai yra termodinamiškai nestabilūs, norint padidinti jų stabilumą, reikia naudoti emulsiklius. Tepalai riebūs, juos sunku nuplauti, todėl ne visada malonūs vartoti. Naudojant hidrofilinius gelius yra ribotas lipofilinių medžiagų tirpumas, todėl šių junginių atpalaidavimas yra nedidelis [6, 66, 70]. Tam, kad būtų pagerintas junginių tirpumas, atpalaidavimas, skvarba, modeliuojamos mikroemulsijos. Jos atpalaiduoja didesnius veikliųjų medžiagų kiekius, pasižymi geresne junginių skvarba į odą nei tepalai, kremai, geliai [37, 59]. Tai lemia mikroemulsijų maža klampa, mažas dalelių dydis, gamyboje naudojami aliejinė fazė, surfaktantai ir kosurfaktantai, kurie gali veikti kaip skvarbą gerinančios medžiagos [31, 35, 50]. Mikroemulsijos pagerina lipofilinių medžiagų tirpumą, lipofilinėje fazėje ištirpusios veikliosios medžiagos lengviau pereina odos lipidinį barjerą, todėl pagerėja skvarba. Mikroemulsijų vandeninė fazė drėkina odos raginį sluoksnį ir pagerina veikliųjų junginių skvarbą [37]. Mikroemulsijos yra termodinamiškai stabilios, padidina vaisto veiksmingumą, sumažina nepageidaujamus poveikius, jose kartu gali būti ir hidrofiliniai, ir lipofiliniai vaistai [39, 50, 64].
Propolis yra natūralus bičių produktas, pasižymintis lipofilinėmis savybėmis [18, 23]. Jis gali būti naudojamas išoriškai ir į vidų. Propolis pasižymi priešuždegiminėmis, antibakterinėmis, priešgrybelinėmis, antinavikinėmis, antioksidacinėmis, imunitetą aktyvinančiomis savybėmis [24, 73]. Dėl plačios kaupiamų biologiškai aktyvių junginių sudėties, propolis yra efektyvus gydant odos infekcijas, jis skatina odos žaizdų ir nudegimų gijimą, audinių regeneraciją, veikia antimikrobiškai, malšina uždegimą ir skausmą [67].
Dėl plačių propolio pritaikymo galimybių siekiama sumodeliuoti mikroemulsijas, turinčias propolio fenolinių junginių. Siekiant sumodeliuoti kokybės parametrus atitinkančias mikroemulsijas bus optimizuota jų sudėtis, įvertinami termodinaminis stabilumas, pH reikšmė, klampa, elektrinis laidumas. Taip pat bus įvertinami vidutinis dalelių dydis, polidispersiškumo indeksas dinaminės šviesos sklaidos metodu. Bus atliktas biofarmacinis atpalaidavimo in vitro tyrimas, kurio metu bus nustatyti atpalaiduoti propolio fenolinių junginių kiekiai iš mikroemulsijų.
Šio darbo tikslas yra sumodeliuoti aliejus-vanduo tipo mikroemulsijas ir įvertinti propolio fenolinių rūgščių (vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo rūgščių) ir vanilino atpalaidavimą in vitro iš jų.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo objektas: aliejus-vanduo tipo mikroemulsijos, turinčios propolio fenolinių junginių (vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo rūgščių ir fenolinio aldehido vanilino).
Darbo tikslas: sumodeliuoti aliejus-vanduo tipo mikroemulsijas ir įvertinti propolio fenolinių rūgščių (vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo rūgščių) ir vanilino atpalaidavimą in vitro iš jų.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti propolio fenolinių junginių tirpumą mikroemulsijų komponentuose.
2. Sumodeliuoti aliejus-vanduo tipo mikroemulsijas ir įvertinti jų termodinaminį stabilumą ir fizikines-chemines savybes.
3. Optimizuoti pasirinktų mikroemulsijų sudėtį.
4. Įvertinti mikroemulsijų su propolio fenoliniais junginiais fizikines-chemines savybes. 5. Įvertinti propolio fenolinių rūgščių ir vanilino atpalaidavimą iš optimalios sudėties
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Mikroemulsijų apibūdinimas ir klasifikacija
Kolumbijos universitete 1959 metais mikroemulsijos apibrėžimą suformulavo profesorius Jack H. Shulman [50, 62]. Mikroemulsijos makroskopiškai vienafaziai, termodinamiškai stabilūs, daugiakomponentės sudėties, optiškai izotropiški, skaidrūs skysčiai. Jos sudarytos iš dviejų tarpusavyje nesimaišančių skysčių, kurie stabilizuoti surfaktanto arba surfaktanto mišinio tarpfazine plėvele, dažnai naudojant kartu ir kosurfaktantą. Mikroemulsijos sudarytos iš vandens, aliejaus, surfaktanto ir kosurfaktanto [18, 25]. IUPAC apibūdina mikroemulsiją kaip dispersiją, sudarytą iš vandens, aliejaus ir surfaktanto (-ų), tai yra izotropinė ir termodinamiškai stabili sistema, turinti dispersinės srities diametrą, kuris yra ne daugiau 200 nm [10, 39].
Mikroemulsijų sistemos, priklausomai nuo jų mikrostruktūros, kurią lemia fizikocheminės savybės ir medžiagų kiekis, klasifikuojamos į mikroemulsijas, kurias sudaro hidrofilinės dalelės aliejuje (vanduo-aliejuje tipo mikroemulsijos), į mikroemulsijas, kurias sudaro hidrofobinės dalelės vandenyje (aliejus-vandenyje tipo mikroemulsijos) arba į biištisines, sudarytas iš abiejų, vanduo-aliejuje ir aliejus-vandenyje tipo, sistemų, kurių dispersinė fazė nanometrinio dydžio, stabilizuota paviršinio aktyvumo medžiagos (PAM) plėvele [18, 25].
Pagal Winsor, yra 4 mikroemulsijų fazių tipai, egzistuojantys pusiausvyroje. Šios fazės vadinamos Winsor fazėmis [15, 28]:
Winsor I – tai aliejus-vandenyje tipo mikroemulsija, kurioje aliejaus dalelės apsuptos surfaktanto plėvele. Vidinė fazė yra pasiskirsčiusi hidrofilinėje fazėje. Surfaktantas yra tirpus vandenyje.
Winsor II – mikroemulsijos vandens dalelės yra apsuptos aliejine faze. Surfaktanto polinės galvutės įsiterpia į vandens daleles, o riebalų rūgščių uodegėlės yra lipofilinėje fazėje. Mikroemulsijos yra pusiausvyroje su hidrofilinės fazės pertekliumi. Surfaktantas yra lipofilinis ir suformuojama vanduo-aliejuje tipo mikroemulsija.
Winsor III – mikroemulsijos sistemoje vandens ir aliejaus kiekiai yra panašūs, todėl tiek vanduo, tiek aliejus yra ištisinė fazė. Šios fazės mikroemulsija gali būti plastiška ir turėti neniutonines savybes, o tai naudinga vietinei vaistų pernašai arba intraveniniam vartojimui. Winsor IV – tai vienafazis, micelinis tirpalas, kuris susiformuoja pridėjus reikiamą kiekį
1.2. Mikroemulsijų privalumai ir trūkumai
Mikroemulsijos, lyginant su kitomis vaistų formomis (pavyzdžiui, emulsijomis, kremais, losjonais) turi privalumų: yra termodinamiškai stabilios, tinka ilgalaikiam naudojimui, pagerina vaisto tirpumą, absorbciją, skvarbą, veiksmingumą, sumažina nepageidaujamų poveikių pasireiškimą, padeda apsaugoti veikliąją medžiagą nuo nestabilumo (padeda išvengti vaisto hidrolizės ir oksidacijos procesų), naudojant mikroemulsijas gali būti kontroliuojamas vaisto atpalaidavimas [39, 46, 50]. Mikroemulsijas paprasta pagaminti, jos gali destabilizuotis pasikeitus temperatūrai, tačiau vėl tampa stabilios, kai yra pasiekiama joms optimali temperatūra. Mikroemulsijos geba ištirpinti ir hidrofilinius, ir lipofilinius vaistus, net ir tuos, kurie netirpūs hidrofiliniuose ar lipofiliniuose tirpikliuose. Vienoje mikroemulsijoje gali būti kartu ir lipofilinė, ir hidrofilinė medžiagos. Lipofilinė ar hidrofilinė dispersinė fazė gali būti atitinkamai lipofilinei ar hidrofilinei medžiagai kaip rezervuaras [64]. Tačiau jos turi ir trūkumų: kai kuriais atvejais didelės surfaktanto ir kosurfaktanto koncentracijos, kurios reikalingos norint suformuoti stabilias mikroemulsijas, gali sukelti toksiškumą [39, 50]. Reikalingi dideli surfaktanto kiekiai norint stabilizuoti mikroemulsiją, o stabilumui daro įtaką tam tikri veiksniai (temperatūra, pH) [46, 64].
Pagrindiniai skirtumai tarp mikroemulsijų ir emulsijų yra šie [10, 64, 69]: Mikroemulsijos permatomos, skaidrios, o emulsijos drumstos, nepermatomos. Mikroemulsijos optiškai izotropiškos, o emulsijos ne.
Mikroemulsijų paviršiaus įtemptis labai maža, o emulsijų – didelė.
Lyginant mikrostruktūrą, emulsijos yra statiškos, nekintančios, nejudrios, o mikroemulsijos yra dinaminės (sąlyčio paviršius nepertraukiamai ir spontaniškai keičiasi).
Mikroemulsijų dalelių dydis ne didesnis nei 200 nm, o emulsijų – didesnis nei 500 nm. Mikroemulsijos suformuoja homogeninę sistemą, o emulsijos heterogeninę.
Mikroemulsijos yra termodinamiškai stabilios, todėl pasižymi ilgu galiojimo terminu, o emulsijos yra termodinamiškai nestabilios, palaipsniui fazės atsiskiria.
Mikroemulsijos vienafazės sistemos, o emulsijos yra dvifazės sistemos.
Mikroemulsijas paprasta gaminti, santykinai pigu, o emulsijų gaminimas reikalauja didelių energijos sąnaudų, todėl kainuoja daugiau.
Mikroemulsijos pasižymi maža klampa, o emulsijos didele klampa.
Apibendrinant šiuos mokslinės literatūros duomenis, mikroemulsijos dauguma savybių skiriasi nuo tradicinių emulsijų. Mikroemulsijos turi privalumų, jų, kaip vaisto nešiklių, naudojimas gali pagerinti vaisto tirpumą, absorbciją, veiksmingumą ir sumažinti toksinį poveikį, tačiau yra ir trūkumų, kurie daro įtaką mikroemulsijų stabilumui, poveikiui [46, 64].
1.3. Mikroemulsijų gamybai naudojami komponentai
Pagrindiniai mikroemulsijų gamybai naudojami komponentai yra aliejinė fazė, surfaktantas (pirminis surfaktantas), kosurfaktantas (antrinis surfaktantas) ir vandeninė fazė [31, 39].
Vandeninė fazė. Vandeninei fazei sudaryti naudojamas išgrynintas vanduo, į kurį gali būti
įdėta klampumą ir skvarbą gerinančių medžiagų, izotoninių medžiagų, buferinių tirpalų, konservantų [28, 60, 64].
Aliejinė fazė. Aliejinė fazė svarbi formuojant mikroemulsijas, kadangi geba tirpinti lipofilines
veikliąsias medžiagas ir pagerinti absorbciją pro lipidų sluoksnį organizme, kadangi lengviau prasiskverbia pro ląstelių sienelę[39].
Pagrindinės medžiagos, naudojamos kaip aliejinė fazė mikroemulsijoms gaminti, gali būti natūralios arba sintetinės kilmės [10, 31, 39, 60, 69]:
trigliceridai;
nesočiųjų ir sočiųjų riebalų rūgštys bei jų esteriai (oleino rūgštis, lauro etilo arba metilo esteriai, izopropilo miristatas, izopropilo palmitatas, etilo oleatas);
augaliniai aliejai (kokosų aliejus, dygmių aliejus, sojų aliejus, kukurūzų aliejus, alyvuogių aliejus, saulėgrąžų aliejus).
Kai kurios sočiosios (lauro, miristo, kapro) ir nesočiosios (oleino, linolo, linoleno) riebalų rūgštys gali būti naudojamos gaminant mikroemulsijas dėl skvarbą gerinančių savybių [69].
Surfaktantai. Surfaktantas yra paviršinio aktyvumo medžiaga, kuri sumažina paviršiaus
įtemptį iki labai mažos, taip palengvindama emulsavimo procesą ir suteikdama mikroemulsijai stabilumo [12, 31, 39]. Surfaktantas sudarytas iš lipofilinių ir hidrofilinių grupių, kurios atitinkamai pasiskirsto hidrofilinėje arba lipofilinėje dalyse [50]. Surfaktanto pasirinkimas pagal hidrofilinio-lipofilinio balanso (HLB) reikšmę leidžia suformuoti norimą mikroemulsiją [39]. Gaminant vanduo-aliejus (v-a) tipo mikroemulsijas naudinga naudoti surfaktantus, kurių HLB reikšmės yra 3–8, o gaminant aliejus-vanduo (a-v) tipo mikroemulsijas naudingiau naudoti surfaktantus, kurių HLB reikšmės yra 8–16 [28, 39, 50].
Surfaktantai gali būti nejoniniai, anijoniniai, katijoniniai, cviterijoniniai. Surfaktantų
prigimtis lemia mikroemulsijos stabilumą. Joniniai surfaktantai naudojami rečiau atsižvelgiant į jų toksiškumą ir tai, kad juos naudojant mikroemulsijų gamyboje dažniau susiduriama su stabilumo problemomis. Anijoniniai ir katijoniniai surfaktantai yra odą dirginančios medžiagos, be to, katijoniniai surfaktantai pasižymi citotoksinėmis savybėmis. Nejoniniai surfaktantai yra mažiau toksiškos ir odą dirginančios medžiagos lyginant su anijoniniais ir katijoniniais surfaktantais, todėl juos yra saugu vartoti ant odos ir jie yra dažniau naudojami gaminant mikroemulsijas [36, 39, 47, 60].
Kaip surfaktantai naudojami polisorbatai (tvinai), sorbitano esteriai (spanai), lecitinas, natrio dodecilsulfatas, kaprilo-kaproilo makrogolio gliceridas [10, 31, 35, 39, 47].
Kosurfaktantai. Gaminant mikroemulsijas, gali būti naudojami ir kosurfaktantai, kurie
padeda surfaktantams sumažinti paviršiaus įtemptį, kad galėtų įvykti savaiminis mikroemulsijos susiformavimas [25, 39]. Kosurfaktantai padeda ištirpinti palyginus didelės koncentracijos surfaktantus ir lipofilinius vaistus. Kosurfaktantai paviršinę plėvelę padaro pakankamai lanksčią, todėl atsiranda skirtingas išsilenkimas, ir sąlyčio pasidengimas plėvele gali padidinti mikroemulsijos stabilumą, galimas platesnės sudėties mikroemulsijos suformavimas [39, 50]. Mikroemulsijose naudojami kai kurie kosurfaktantai (pavyzdžiui, etanolis, propilenglikolis) gali veikti kaip skvarbą gerinančios medžiagos lengviau patekdami pro įvairius difuzinius barjerus [33, 48]. Tačiau kai kurių kosurfaktantų (pavyzdžiui, trumpos ar vidutinio ilgio grandinės alkoholių) naudojimas gali sukelti papildomą odos sudirginimą ir dehidrataciją [60].
Pagrindiniai mikroemulsijų gamyboje naudojami kosurfaktantai yra etanolis, propanolis, izopropanolis, butanolis, propilenglikolis, polietilenglikolis (PEG-400), kai kurie aminai ir rūgštys [10, 33, 39, 46, 47].
Žinojimas apie tinkamų komponentų pasirinkimo svarbą leidžia suformuoti kokybiškas, tinkamas vartoti mikroemulsijas. Mikroemulsijų gamybai naudojamų komponentų pasirinkimas labai įvairus, tačiau renkantis komponentus svarbu atsižvelgti į tai, kad jie būtų netoksiški, nedirgintų odos, užtikrintų optimalų vaistinės medžiagos biologinį pasisavinimą ir būtų priimtini klinikiniam naudojimui. Svarbu pasirinkti tinkamus, kuo mažesnius surfaktantų ir kosurfaktantų kiekius, nes naudojant dideles šių medžiagų koncentracijas galimos odos dirginimo, toksiškumo problemos.
1.4. Mikroemulsijų gamyba
Mikroemulsijų formulavimui naudojami trys ar keturi komponentai (vandeninė fazė, aliejinė fazė, surfaktantas ir, jeigu reikia, gali būti naudojamas kosurfaktantas) [31, 39]. Sumaišius tinkamus reikalingų komponentų kiekius, mikroemulsijos formuojasi spontaniškai [35]. Jos susiformuoja, kai surfaktantas kartu su kosurfaktantu sumažina paviršiaus įtemptį tarp aliejinės ir vandeninės fazių iki labai mažos (10–3 mN/m-1) reikšmės. Paviršius išsiplečia ir susidaro sąlygos suformuoti gerai disperguotas daleles [12]. Surfaktanto koncentracija turi būti pakankama, kad sumažintų paviršiaus įtemptį ir stabilizuotų mikroemulsiją [64].
Mikroemulsijos gali būti gaminamos keliais metodais [10, 39, 64]:
Fazės titravimo metodas – tai spontaninis emulgavimo metodas, norint sudaryti fazių diagramas. Galimas titravimo vandenine faze metodas, kai pagamintas aliejaus ir
surfaktanto mišinys titruojamas vandenine faze arba titravimo aliejine faze metodas, kai pagamintas vandens ir surfaktanto mišinys titruojamas aliejine faze.
Fazių inversijos metodas – mikroemulsijos fazių inversija pasireiškia, kai pridedamas perteklinis kiekis dispersinės fazės. Mikroemulsijų fazių inversija reiškia konversiją aliejus-vandenyje tipo į vanduo-aliejuje tipo sistemą, pridedant dispersinės fazės perteklių arba pakeliant temperatūrą.
Modeliuojant mikroemulsijas sudaroma pseudotrinarė fazių diagrama, kuri yra trikampio formos, o kiekviename krašte yra mikroemulsiją sudarantys komponentai – vanduo, aliejus, surfaktanto ir kosurfaktanto mišinys. Sudarius pseudotrinarę fazių diagramą, nustatoma mikroemulsijų susiformavimo riba. Riba, kurioje susiformuoja mikroemulsijos, apibūdina ir susidariusios mikroemulsijos tipą – tai gali būti aliejus-vandenyje tipo arba vanduo-aliejuje tipo mikroemulsijos. Po mikroemulsijos sričių identifikavimo fazių diagramoje, jos modeliuojamos pasirinkus norimą komponentų santykį [22, 50].
Mikroemulsijų sudėties optimizavimui plačiai taikomi pilno faktorialo, centrinės kompozicijos, Box-Behnken, D-optimalus, Doehler modeliai [13]. D-optimalus dizaino modelis yra efektyvus būdas optimizuoti farmacinių formų sudėtis, nes paaiškina santykį, ryšį ir pagrindinius veiksnius tarp nepriklausomų ir priklausomų kintamųjų [16, 42]. D-optimalus optimizavimo modelis sumažina dispersiją, susijusią su koeficientų įvertinimais modelyje. Dėl to mikroemulsijų sudėties optimizavimui plačiausiai taikomas D-optimalus dizaino modelis [26, 72]. Optimizuojant mikroemulsijos sudėtį reikėtų pasirinkti optimizavimo kriterijus, pagal kuriuos formuojama norimas savybes turinti mikroemulsija [9, 16, 40, 42].
Modeliuojant mikroemulsijas, susiduriama su šiomis problemomis [31]: Pagaminti mikroemulsiją, kuri būtų kosmetiškai patraukli;
Pagaminti mikroemulsiją, kuri būtų netoksiška, nedirginanti, nesukeltų jautrumo, pasižymėtų nedideliu alergines reakcijas galinčiu sukelti poveikiu.
Apibendrinant, gaminant mikroemulsijas yra naudojamos trys arba keturios medžiagos, kurias sumaišius, mikroemulsijos formuojasi spontaniškai. Formuojant mikroemulsijas svarbu, kad jos būtų saugios vartoti, nesukeltų neigiamo poveikio [31, 35, 39].
1.5. Mikroemulsijų pritaikymo galimybės
Ieškoma naujų vaistų tiekimo sistemų, kurios pakeistų klasikinių vaistų formų nepageidaujamas fizikines-chemines savybes. Inovatyvios sistemos yra mikroemulsijos, nanoemulsijos, liposomos, etosomos, niosomos, fitosomos, mikrosferos, lipidų nanokapsulės,
mikrodalelės, nanodalelės (magnetinės, gelinės nanodalelės). Mikroemulsijos, lyginant su klasikinėmis vaistų formomis, gali pagerinti medžiagų tirpumą, skvarbą, absorbcijos, pasiskirstymo procesus, sumažinti toksiškumą ir veikia kaip vaisto nešikliai, pristatydami vaistą į veikimo vietą [25, 55].
Mikroemulsijos naudojamos kaip veikliosios medžiagos nešikliai, jų pritaikymas įvairus – jos gali būti vartojamos per os, į poodį, į akis, į nosį, ant odos, intraveniniu ir transderminiu būdais. Mikroemulsijos yra perspektyvi vaisto forma, nes jas paprasta gaminti, jos susiformuoja spontaniškai, yra termodinamiškai stabilios, gaminant gali būti naudojami skvarbą gerinantys komponentai. Mikroemulsiją sudarančios dalelės yra mažos, todėl pagerėja vaisto absorbcija, biologinis pasisavinimas, skvarba. Be to, mikroemulsijos geba padidinti vaistų tirpumą, tirpinti lipofilines medžiagas, naudojant mikroemulsijas yra kontroliuojamas vaistinės medžiagos atpalaidavimas, sumažinamas vaisto nepageidaujamas poveikis ir toksiškumas, apsaugoma nuo išorinių veiksnių poveikio, padidinamas veiksmingumas [24, 25, 31, 35, 50, 55].
Vietinio veikimo preparatai priskiriami medikamentams, kurie vartojami išoriškai tam tikroje kūno dalyje. Tokie vaistai veikia tik tam tikrame, specifiniame kūno plote ir šių vaistų sisteminė absorbcija minimali. Reikia tinkamos vaisto formos tam, kad būtų galima pereiti barjerinį odos sluoksnį per raginį sluoksnį molekuliniu lygmeniu nukreipiant vaistą į gyvąjį epidermį ir dermą. Mikroemulsijos gali transportuoti per odą į reikiamą vietą didelius kiekius vandens, vietiškai veikiančias medžiagas, nes jos veikia kaip rezervuaras prastai tirpiems vaistams, padidina jų tirpumo greitį ir taip pagerina tirpumą. Lyginant su kitomis vaistų formomis (pavyzdžiui, emulsijomis, vandeniniais tirpalais) mikroemulsijos padidina tiek lipofilinių, tiek hidrofilinių medžiagų absorbciją. Be to, lipofiliniai ir hidrofiliniai vaistai toje pačioje mikroemulsijoje gali būti kartu [25, 31, 65].
Apibendrinant, mikroemulsijos gali būti vartojamos įvairiais būdais, yra naudojamos kaip įvairių vaistų nešikliai, pasižymi stabilumu, tirpumą, absorbciją, biologinį pasisavinimą, skvarbą gerinančiomis savybėmis, geba sumažinti vaisto toksiškumą.
1.6. Mikroemulsijų charakterizavimas
Mikroemulsijų savybes ir kokybę apibūdinantys parametrai yra termodinaminis stabilumas, dalelių dydis, polidispersiškumo indeksas, klampa, elektrinis laidumas, pH reikšmė [9, 50, 56, 64, 65].
Termodinaminis stabilumas vertinamas mikroemulsijas laikant žemoje, kambario temperatūroje ir aukštesnėje nei kambario temperatūroje ir tai atliekant keliais ciklais. Termodinaminiam stabilumui įvertinti atliekamas centrifugavimas. Jei tyrimų metu mikroemulsijos išlieka vienafazės, nėra fazių atsiskyrimo, kitų pokyčių, laikoma, kad jos yra termodinamiškai stabilios [56, 64, 65].
Pagal vidutinį dalelių dydį galima identifikuoti, ar tai yra mikroemulsijos, ir įvertinti jų stabilumą [54, 61]. Vidutinis dalelių dydis nustatomas naudojant dinaminės šviesos sklaidos metodą. Taikant šį metodą nustatoma ir polidispersiškumo indekso reikšmė [56, 61]. Polidispersiškumo indeksas parodo mikroemulsijų homogeniškumą ir siaurą dalelių pasiskirstymą [9]. Mokslinės literatūros duomenimis, mikroemulsijos yra homogeniškos, jei polidispersiškumo indeksas yra mažiau nei 0,5 [11, 41]. Žema polidispersiškumo indekso reikšmė rodo, kad sistemos dalelių dydžio pasiskirstymas yra vienodas [56, 61].
Klampos įvertinimas leidžia nustatyti, kokio tipo mikroemulsija yra sumodeliuota. Mokslinės literatūros duomenimis, mažą klampą turinčios mikroemulsijos yra aliejus-vanduo tipo, o didesnė klampa būdinga vanduo-aliejus tipo mikroemulsijoms [47, 52, 61]. Klampa svarbus rodiklis, nes ji turi įtakos stabilumui, veikliosios medžiagos atpalaidavimui ir skvarbai į odą [47, 61].
Įvertinus elektrinį laidumą galima nustatyti mikroemulsijos tipą. Aliejus-vandenyje tipo mikroemulsijos pasižymi dideliu elektriniu laidžiu (10–100 μS/cm), o vanduo-aliejuje tipo mikroemulsijos visai neturi elektrinio laidžio arba jis yra mažas [47, 61].
pH nustatymas leidžia įvertinti, ar mikroemulsija yra tinkama vartoti ant odos, ar nesukelia dirginančio poveikio. Mokslinės literatūros duomenimis, odos paviršiaus pH yra 4–6, todėl sumodeliuotos mikroemulsijos, kurių pH yra panašus, yra tinkamos vartoti ant odos [7, 32, 56].
Gali būti atliekami ir kiti mikroemulsijas apibūdinantys tyrimai [39, 56, 65]:
Skiedimo testas leidžia nustatyti, kokio tipo mikroemulsija sumodeliuota. Mikroemulsija skiedžiama vandeniu ir stebima, ar neatsiranda fazių atsiskyrimas.
Šviesos laidumas (proc.) – spektrofotometru įvertinamas mikroemulsijų skaidrumas. Fazės savybių tyrimas – vizualiai vertinamas homogeniškumas, takumas, skaidrumas.
Vertinama struktūra ir morfologija naudojant transmisinę elektroninę mikroskopiją, fazės skirtumai vertinami mikroskopu. Skaidrios, izotropinės, vienafazės sistemos yra mikroemulsijos.
Zeta potencialo matavimas – dalelių elektrinis krūvis turi įtakos flokuliacijai ir biologiniam pasisavinimui. Krūvis (neigiamas, teigiamas, neutralus) priklauso nuo veikliosios medžiagos ir pagalbinių medžiagų krūvių. Zeta potencialas turėtų būti –30 ir +30 ribose.
Branduolių magnetinio rezonanso tyrimas suteikia informaciją apie dalelių struktūrą, dinamiką.
1.7. Mikroemulsijos su propolio junginiais
Propolis arba bičių klijai yra natūrali, sakinga, lipni medžiaga, pagaminta iš bičių surinktų pumpurų arba augalų eksudatų (sakų) [23]. Propolis lipofilinė medžiaga, malonaus aromatinio kvapo, gali būti įvairių spalvų, tai priklauso nuo jo šaltinio ir amžiaus [18].
Pagrindinės propolį sudarančios medžiagos yra sakų ir augalų balzamas (50%), vaškas (30%), eteriniai ir aromatiniai aliejai (10%), žiedadulkės (5%) ir kitos medžiagos, tokios kaip organiniai junginiai bei mineralai (5%). Propolyje aptinkama daugiau nei 300 biologiškai aktyvių junginių. Nustatyti organiniai junginiai yra fenolinės rūgštys ir esteriai, substituoti fenoliniai esteriai, flavonoidai (flavonai, flavanonai, flavonoliai, dihidroflavonoliai, chalkonai), riebalų rūgštys, terpenai, steroidai, aromatiniai aldehidai ir alkoholiai, seksviterpenai, naftalenai, stilbeno derivatai. Dažniausiai propolio biologinį aktyvumą lemia fenoliniai junginiai [8, 73]. Propolio cheminė sudėtis priklauso nuo vegetacijos, klimato, sezono ir aplinkos sąlygų ten, kur buvo surinkta žaliava, todėl surinktas propolis iš kitų geografinių regionų (pavyzdžiui, Europos, Azijos, Pietų Amerikos) skiriasi savo chemine sudėtimi [5, 8]. Mokslinės literatūros duomenimis, Lietuvoje surinktame propolyje aptinkami junginiai yra fenolinės rūgštys – p-kumaro, ferulo, vanilo, kavos, galo, rozmarino, cinamono rūgštys ir fenolinis aldehidas vanilinas [2, 3].
Propolis gali būti naudojamas išoriškai ir į vidų. Jis pasižymi įvairiais biologiniais ir farmakologiniais poveikiais – priešuždegiminiu, antibakteriniu, priešgrybeliniu, antinavikiniu, antioksidaciniu. Be to, propolis aktyvina imuninę sistemą, apsaugo lipidus ir kitus junginius nuo laisvųjų radikalų poveikio ir oksidacijos [24, 73]. Naudojamas ant odos propolis pagreitina odos žaizdų gijimą, regeneraciją, audinių atsinaujinimą, veikia antimikrobiškai ir slopina odos uždegiminius procesus [45, 49]. Propolis pasižymi bakteriocidinėmis ir bakteriostatinėmis savybėmis. Dauguma jo sudedamųjų dalių yra natūralūs maisto komponentai ir pripažįstami kaip saugios vartoti medžiagos [23].
Propolis gali būti vartojamas įvairiose farmacinėse formose: kremuose, tepaluose, hidrogeliuose, tabletėse, kapsulėse, ampulėse, sirupuose, purškaluose (nosiai, burnai), pastilėse [3, 20]. G. Rassu ir kt. (2015) atliko tyrimą, kurio metu sumodeliavo nanodaleles su propoliu. Nustatyta, kad nanodalelės su propoliu galėtų būti naudojamos kaip vaisto nešikliai, jos veikia vietiškai ir yra tinkamos naudoti esant nosies ertmės ligoms [57]. Y. Tao ir kt. (2014) tyrimo metu sumodeliavo propolio flavonoidų liposomas ir įvertino jų gebėjimą padidinti imunologinį aktyvumą in vitro ir in
vivo tyrimų metu. Nustatyta, kad poodiniu būdu panaudotos liposomos su propolio flavonoidais
Modeliuojamos ir mikroemulsijos su propoliu, kurios yra veiksmingesnės nei kitos nanotechnologinės formuluotės, jos padidina propolio junginių biologinį aktyvumą, pasižymi geresniu terapiniu poveikiu ir skvarba į odą [18, 24, 67].
Atlikto mokslinio tyrimo rezultatai rodo, kad mikroemulsija su propolio etanoliniu ekstraktu yra veiksminga prieš Gramteigiamas Staphylococcus aureus bakterijas ir pasižymi antibakteriniu poveikiu, todėl galėtų būti naudojama slopinti burnos ir ryklės uždegiminių infekcijų, sukeltų burnoje esančių bakterijų, simptomus [18].
Mikroemulsijos su propolio etanoliniu ekstraktu galėtų būti pritaikomos odontologijos srityje, kadangi propolio ekstraktas gali slopinti demineralizacijos procesą, flavonoidai ir keletas dihidroflavonolių inhibuoja S. mutans vystymąsi. Taip pat nustatyta, kad mikroemulsija su propoliu pasižymi antibakterinėmis savybėmis prieš Staphylococcus mutans ir Lactobacillus sp. [58].
Taip pat mikroemulsijos su propoliu gali būti naudojamos gydyti ragenos žaizdas ir uždegimą. Atliktas tyrimas, kurio metu žiurkėms buvo pažeistas ragenos epitelis prideginant sidabro nitratu, ir nustatyta, kad naudojant mikroemulsiją su propoliu greičiau gyja žaizdos ir sumažėja uždegimas [44].
Atlikto tyrimo metu nustatyta, kad mikroemulsija su propoliu padidina propolio flavono efektyvumą, pagerina imuninės sistemos funkcijas, pasižymi antioksidaciniu poveikiu, todėl galėtų būti naudojama kaip imunomoduliuojanti medžiaga, kuri veikia ir kaip antioksidantas [24].
Apibendrinant, propolis gali būti naudojamas įvairiomis farmacinėmis formomis. Susidomėjimas propolio pritaikymu dermatologiniuose preparatuose didėja dėl jo plačios kaupiamų junginių sudėties ir sukeliamo biologinio poveikio. Modeliuojamos inovatyvios farmacinės formos – mikroemulsijos, kurios dėl savo teigiamų savybių pagerina propolio veiksmingumą.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Aliejus-vanduo tipo mikroemulsijos, turinčios propolio fenolinių junginių (vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo rūgščių ir fenolinio aldehido vanilino).
2.2. Tyrimų medžiagos ir įranga
2.2.1. Naudotos medžiagos
Propolio žaliava – UAB ,,Medicata Filia‘‘, Vilnius, Lietuva Išgrynintas vanduo
Propilenglikolis – Carl Roth GmbH+Co, Vokietija Polisorbatas 20 (Tvinas 20) – Acros, JAV
Izopropilo miristatas – Scharlab S. L., Ispanija
Etanolis, 96 proc. – AB ,,Vilniaus degtinė‘‘, Vilnius, Lietuva
Kaprilo-kaproilo makrogolio gliceridas (Labrasol®) – Gattefosse Saint–Priest, Prancūzija Polietilenglikolis-400 (PEG-400) – Carl Roth GmbH, Vokietija
Poligliceril-6-izostearatas – Gattefosse Saint–Priest, Prancūzija
2.2.2. Naudota įranga
Svarstyklės (Scaltec SBC 31, Scaltec Instruments GmbH, Vokietija)
pH–metras (pH–meter 766 su elektrodu Knick SE 104 N, (Knick Elektronische Messgerate GmbH and Co, Vokietija))
Termostatinė purtyklė (GFM, Vokietija)
Vibracinis viskozimetras (Vibro viscometer SV-10, A&D Company ltd, Japonija) ZetaSizer Nano ZS aparatas (Malvern Instruments, Ltd., Jungtinė Karalystė)
Magnetinė maišyklė su kaitinamuoju paviršiumi (IKA® C-MAG HS 7, IKA® - Werke GmbH & Co. KG, Vokietija.
2.3. Tyrimų metodai
2.3.1. Propolio fenolinių junginių analizė efektyviosios skysčių chromatografijos
metodu
Propolio fenolinių junginių (vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo rūgščių ir vanilino) kokybinės ir kiekybinės sudėties analizė atlikta kapiliariniu skysčių chromatografu su diodų matricos detektoriumi ,,Agilent 1260 Infinity‘‘, taikant laboratorijoje įdiegtą ir validuotą metodiką [5]. Chromatografinei analizei taikytos sąlygos:
Kolonėlė – C18 kolonėlė (150 × 0,5 mm, 5 µm dydžio dalelėmis);
Judri fazė – eliuentas A: 0,5 proc. acto rūgšties vandeninis tirpalas, eliuentas B: acetonitrilas;
Linijinio gradiento kitimas – nuo 1 iki 21 proc. B 25 min.; Injekcijos tūris – 0,2 µl;
Tėkmės greitis – 20 µl/min; Kolonėlės temperatūra – 25 °C; Fenolinių junginių detekcija – 290 nm.
2.3.2. Propolio fenolinių junginių tirpumas
Vertintas tyrime naudotos propolio žaliavos tirpumas skirtinguose tirpikliuose. Paruošiami skirtingi tirpalai: išgryninto vandens, izopropilo miristato, labrasolio, tvino 20, etanolio (96 proc.), propilenglikolio, PEG-400, su propolio fenoliniais junginiais, kai santykis yra 1:20. Propolio fenoliniai junginiai ekstrahuojami 48 val. termostatuojamoje purtyklėje, esant 25 °C temperatūrai ir 150 aps/min purtymo greičiui. Gauti tirpalai filtruojami pro nailoninį membraninį filtrą (0,22 µm) ir analizuojami efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
2.3.3. Pseudotrinarių fazių diagramų sudarymas ir mikroemulsijų gamyba
Pseudotrinarės fazių diagramos sudarymui pasirinkti išgrynintas vanduo, izopropilo miristatas, tvinas 20, propilenglikolis atitinkamai kaip vandeninė ir aliejinė fazės, surfaktantas ir kosurfaktantas. Surfaktanto ir kosurfaktanto mišinio santykis – 5:1. Taikytas titravimo aliejumi metodas, siekiant suformuoti aliejus-vanduo tipo mikroemulsiją. Kambario temperatūroje ant magnetinės maišyklės sumaišomi išgrynintas vanduo (30–60 proc.), surfaktanto ir kosurfaktanto
mišinys (40–70 proc.). Į gautą mišinį maišant ant magnetinės maišyklės lašinama po lašą aliejinė fazė ir, kai tirpalas nuskaidrėja, laikoma, kad susiformavo mikroemulsija [4, 63]. Pseudotrinarė fazių diagrama sudaroma norint nustatyti aliejaus, surfaktanto ir kosurfaktanto optimalias koncentracijas [22]. Tokiu pačiu metodu buvo sudaryta kita pseudotrinarė fazių diagrama, kurios sudarymui pasirinkti išgrynintas vanduo, izopropilo miristatas, labrasolis, PEG-400 atitinkamai kaip vandeninė ir aliejinė fazės, surfaktantas ir kosurfaktantas. Surfaktanto ir kosurfaktanto mišinio santykis – 5:1.
Eksperimentinės mikroemulsijos gaminamos titravimo aliejumi metodu. Į vandeninės fazės, surfaktanto ir kosurfaktanto mišinį kambario temperatūroje ant magnetinės maišyklės po lašą lašinama aliejinė fazė ir stebimas sistemos nuskaidrėjimas [29].
Formuojant eksperimentines mikroemulsijas, turinčias propolio fenolinių junginių, propolio žaliava tirpinama surfaktante ir kosurfaktante. Reikiamas propolio žaliavos kiekis sumaišomas su labrasoliu ir atskirai su PEG-400. Vykdoma propolio fenolinių junginių ekstrakcija termostatuojamoje purtyklėje 48 val. esant 150 aps/min. Gauti tirpalai filtruojami ir toliau mikroemulsijos gaminamos aukščiau aprašytu būdu.
2.3.4. Aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų termodinaminio stabilumo vertinimas
Pagamintos aliejus-vanduo tipo mikroemulsijos centrifuguojamos 30 minučių esant 3000 rpm apsisukimo greičiui ir vertinama vizualiai, ar nėra matomo fazių atsiskyrimo, susidrumstimo – tuomet mikroemulsijos yra termodinamiškai stabilios. Aliejus-vanduo tipo mikroemulsijoms atliekami 3 šildymo–šaldymo ciklai perdedant mikroemulsijas iš termostato, kuriame palaikoma 45°C temperatūra, į šaldytuvą, kuriame palaikoma 4°C temperatūra, kiekvienu atveju mikroemulsijos laikomos 48 val. ir vizualiai vertinama, ar jos yra termodinamiškai stabilios [21, 38, 43]. Atliekami 3 užšaldymo–atšildymo ciklai perdedant mikroemulsijas iš šaldiklio, kuriame palaikoma –21°C temperatūra į termostatą, kuriame palaikoma 25°C temperatūra, kiekvienu atveju mikroemulsijos laikomos 48 val. ir vizualiai įvertinama, ar nėra fazių atsiskyrimo, susidrumstimo – mikroemulsijos yra termodinamiškai stabilios [30, 43].
2.3.5. Aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų fizikinių-cheminių savybių nustatymas
Mikroemulsijų vidutinis dalelių dydis ir polidispersiškumo indeksas nustatomi dinaminės šviesos sklaidos metodu naudojant ZetaSizer Nano ZS aparatą.
Kambarioje temperatūroje mikroemulsijų klampa nustatyta naudojant vibracinį viskozimetrą, pH reikšmė įvertinta naudojant pH–metrą, elektrinis laidumas nustatytas naudojant konduktometrą.
2.3.6. Aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų sudėties optimizavimas
Eksperimentinių mikroemulsijų, turinčių propolio fenolinius junginius, sudėties optimizavimas atliktas taikant D-optimalų dizaino modelį. Sudėtis optimizuota pagal šiuos kriterijus:
minimalią polidispersiškumo indekso reikšmę; minimalią vidutinio dalelių dydžio reikšmę.
Nuspręsta papildomai pagaminti dvi optimalias sudėtis, kurios optimizuotos arba tik pagal minimalią vidutinio dalelių dydžio reikšmę, arba tik pagal minimalią polidispersiškumo indekso reikšmę. Naudojant D-optimalų dizaino modelį, buvo sugeneruota 12 a-v tipo mikroemulsijų sudėčių (1 lentelė).
1 lentelė. Mikroemulsijų sudėtys, sugeneruotos naudojant D-optimalų dizaino modelį
Eil. Nr. Izopropilo miristatas (proc.) Išgrynintasis vanduo (proc.) Labrasolis:PEG-400 (5:1) (proc.) 1. 1,0 31,0 68,0 2. 2,0 35,0 63,0 3. 4,0 34,0 62,0 4. 3,0 33,0 64,0 5. 7,0 31,0 62,0 6. 2,0 32,0 66,0 7. 7,0 31,0 62,0 8. 1,0 37,0 62,0 9. 4,0 31,0 65,0 10. 1,0 34,0 65,0 11. 1,0 31,0 68,0 12. 1,0 37,0 62,0
Įvertintos pagamintų a-v tipo mikroemulsijų vidutinio dalelių dydžio ir polidispersiškumo indekso reikšmės.
2.3.7. Propolio fenolinių junginių atpalaidavimo iš aliejus-vanduo tipo
mikroemulsijų in vitro tyrimai
In vitro atpalaidavimo tyrimai (n=4) atlikti naudojant modifikuotas Franz-tipo difuzines celes
ir regeneruotas celiuliozės dializės membranas. Akceptorinė terpė buvo 20 proc. etanolis, kurio pasirinktas tūris neribojo tirtų propolio fenolinių junginių tirpumo ir tirpimo proceso. Akceptorinės terpės temperatūra – 32°C, kuri palaikoma maišant. Difuzijos plotas – 1,13 cm2. Donorinės fazės begalinė dozė difuzinėje celėje 1,002 ± 0,001 g. Tam tikras akceptorinės terpės kiekis buvo imtas praėjus 1, 2, 3 ir 4 val. nuo tyrimo pradžios, įpilant tokį pat tūrį šviežios terpės. Mėginiai analizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
2.3.8. Statistinė duomenų analizė
Tyrimų metu gautų rezultatų statistinė analizė atlikta naudojant ,,Microsoft Office Excel 2010‘‘ ir SPSS 24.0 statistinės duomenų analizės paketus. Buvo skaičiuojami gautų rezultatų imčių vidurkiai, standartiniai nuokrypiai, determinacijos koeficientai, Spirmeno ranginės koreliacijos koeficientai, taikytas vieno faktoriaus dispersinės analizės modelis (angl. One–Way ANOVA), naudojant LSD (angl. Least Significant Difference) kriterijų. Statistinio reikšmingumo lygmuo p<0,05. Eksperimentinių mikroemulsijų sudėties optimizavimas atliktas naudojant Design–Expert 6.0 paketą bei taikant D-optimalų dizaino modelį.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Tirtų propolio fenolinių rūgščių ir aldehido tirpumo vertinimas
Propolio fenolinių junginių tirpumas pasirinktuose mikroemulsijos komponentuose nurodytas 2 lentelėje.
2 lentelė. Išekstrahuotų atskirų fenolinių junginių kiekis skirtinguose tirpaluose
Vanilo rūgštis (µg/g) Kavos rūgštis (µg/g) Vanilinas (µg/g) p-kumaro rūgštis (µg/g) Ferulo rūgštis (µg/g) Išgrynintas vanduo 35,6 ± 3,4 2,5 ± 0,5 59,9 ± 7,2 41,1 ± 13,4 26,1 ± 3,1 Izopropilo miristatas 79,7 ± 4,9 9,3 ± 0,8 126,0 ± 4,0 161,9 ± 6,7 93,5 ± 6,1 Tvinas 20 70,2 ± 5,5 11,0 ± 0,7 117,1 ± 5,1 154,9 ± 1,6 104,4 ± 5,0 Labrasolis 127,6 ± 9,6 15,1 ± 1,8 228,5 ± 16,8 318,3 ± 18,8 213,3 ± 12,0 PEG-400 132,7 ± 5,9 36,6 ± 3,0 233,5 ± 19,0 339,7 ± 20,1 235,5 ± 13,9 Propilenglikolis 156,8 ± 10,7 26,8 ± 2,3 278,1 ± 17,9 435,6 ± 26,7 298,4 ± 19,6 Etanolis 96 proc. 226,6 ± 11,8 39,8 ± 1,5 397,9 ± 26,4 583,7 ± 35,3 400,9 ± 20,3
Nustatyta, kad išgrynintas vanduo išekstrahavo didžiausią kiekį santykinai hidrofilinio aldehido vanilino (36,2 proc.), o fenolines rūgštis pagal išekstrahuotą kiekį galima išdėstyti mažėjančia tvarka: p-kumaro rūgšties (24,9 proc.), vanilo rūgšties (21,6 proc.), ferulo rūgšties (15,8 proc.), kavos rūgšties (1,5 proc.). Naudojant pasirinktus organinius tirpiklius, visais atvejais didžiausias kiekis išekstrahuotas santykinai lipofilinės p-kumaro rūgšties (33,9–36,4 proc.), o kitus fenolinius junginius pagal išekstrahuotą kiekį galima išdėstyti mažėjančia tvarka: vanilinas (23,3–26,8 proc.), ferulo rūgštis (19,9–25,0 proc.), vanilo rūgštis (13,1–16,9 proc.), kavos rūgštis (1,7–3,7 proc). Etanolis, propilenglikolis ir PEG-400 išekstrahavo didesnį kiekį santykinai lipofilinės ferulo rūgšties nei santykinai hidrofilinio vanilino, o labrasolis, tvinas 20 ir izopropilo miristatas išekstrahavo didesnį kiekį vanilino nei ferulo rūgšties.
Gauti duomenys patvirtina mokslininkų atliktų tyrimų gautus rezultatus, kad propolio žaliavoje, kuri surinkta Lietuvoje, didžiausias kiekis yra p-kumaro rūgšties, ferulo rūgšties ir fenolinio aldehido vanilino, o mažiausias kiekis aptinkamas kavos rūgšties [2, 3]. Nustatyta, kad didesnis propolio fenolinių junginių kiekis išekstrahuojamas naudojant kaip tirpiklį etanolį negu išgrynintą vandenį, tai patvirtina mokslininkų atliktų tyrimų rezultatus [5, 68].
3 lentelė. Suminis fenolinių junginių kiekis naudojant skirtingus tirpiklius
Didžiausias suminis tirtų propolio fenolinių junginių kiekis išekstrahuotas naudojant 96 proc. etanolį, o mažiausias kiekis – naudojant išgrynintą vandenį. Gauti rezultatai patvirtina mokslininkų gautus duomenis, kad didesnis kiekis propolio fenolinių junginių išekstrahuojamas naudojant etanolį, nei išgrynintą vandenį [5, 68]. Lyginant surfaktantus, statistiškai reikšmingai (p<0,05) didesnį kiekį (49,3 proc. daugiau) tirtų fenolinių junginių išekstrahavo labrasolis nei tvinas 20. Gauti rezultatai patvirtina mokslinių tyrimų duomenis, kad labrasolis, lyginant su tvinu 20, pagerina junginių tirpumą ir padeda išekstrahuoti didesnį kiekį junginių [17, 51]. Lyginant kosurfaktantus, etanolis išekstrahavo statistiškai reikšmingai (p<0,05) daugiau (atitinkamai 27,5 proc. ir 40,7 proc.) tirtų fenolinių junginių nei propilenglikolis ir PEG-400. Propilenglikolis išekstrahavo statistiškai reikšmingai (p<0,05) daugiau (18,2 proc.) tirtų fenolinių junginių nei PEG-400. Gauti rezultatai patvirtina mokslinių tyrimų duomenis, kad etanolis išekstrahuoja didesnį kiekį propolio fenolinių junginų nei propilenglikolis ar PEG-400 [1, 34].
3.2. Pseudotrinarės fazių diagramos formavimas ir aliejus-vanduo tipo
mikroemulsijų fizikinių-cheminių savybių vertinimas
Pagrindiniai mikroemulsijos komponentai be vandeninės ir aliejinės fazių yra surfaktantas ir kosurfaktantas [27]. Atlikus mokslinės literatūros analizę, kaip aliejinė fazė pasirinktas izopropilo miristatas, kuris pasižymi skvarbą gerinančiomis savybėmis [27, 29]. Tai viena iš dažniausiai naudojamų aliejinių fazių mikroemulsijose [31, 39, 60]. Kaip surfaktantas pasirinkta nejoninė paviršinio aktyvumo medžiaga – tvinas 20, kuri yra mažai toksiška ir mažai dirginanti, todėl yra saugi
0 500 1000 1500 2000 Išgrynintas vanduo Tvinas 20 Izopropilo miristatas
Labrasolis PEG-400 Propilenglikolis Etanolis (96
proc.) S um in is fe no li nių ju ng in ių k iek is (µg /g ) Tirpikliai
vartoti ant odos. Tvinas 20 pasižymi hidrofilinėmis savybėmis, geba formuoti mikroemulsijas ir sudarant fazių diagramas naudojant šį surfaktantą gaunama didesnė mikroemulsijų susiformavimo sritis. Tai klasikinis surfaktantas, kuris mikroemulsijose plačiai naudojamas [14, 18, 53, 60]. Kaip kosurfaktantas pasirinktas poliolis propilenglikolis, kurį, lyginant su kitais polioliais, naudojamais mikroemulsijų gamyboje, naudojant sudarant fazių diagramą gaunama didesnė mikroemulsijų susiformavimo sritis. Propilenglikolis pasižymi drėkinančiomis savybėmis, pagerina lipofilinių medžiagų tirpumą, yra saugus vartoti ant odos [14, 39].
Pagamintos 9 mikroemulsijos iš pasirinktų komponentų (išgrynintas vanduo, izopropilo miristatas, tvinas 20, propilenglikolis) leido suformuoti plotą pseudotrinarėje fazių diagramoje (1 pav.).
1 pav. Pseudotrinarė fazių diagrama
Mokslinės literatūros duomenimis, suformuotas plotas pseudotrinarėje fazių diagramoje atitinka aliejus-vanduo tipo mikroemulsijas [39]. Gauta riba nurodo termodinamiškai stabilias mikroemulsijas, kurios gali būti pagamintos pagal ribose esančių komponentų koncentracijų reikšmes. Už šios ribos formuojasi kitos struktūros.
Pagamintų 9 mikroemulsijų (4 lentelė) kokybė vertinta pagal pagrindinius kokybę apibūdinančius parametrus: termodinaminį stabilumą, vidutinį dalelių dydį, polidispersiškumo indeksą, pH reikšmę, elektrinį laidumą ir klampą.
Atlikus centrifugavimo tyrimą, šildymo-šaldymo, užšaldymo-atšildymo ciklus, visos mikroemulsijos buvo termodinamiškai stabilios ir tai patvirtina jų skaidrumas, drumstumo, nuosėdų ar išsisluoksniavimo nebuvimas.
Įvertinus mikroemulsijų kokybės parametrus (pH reikšmę, klampą, elektrinį laidumą), nustatyta, kad jų pH buvo 5,01–5,49 ribose ir statistinė analizė parodė statistiškai reikšmingą (p<0,05) vidutinę netiesioginę koreliaciją (r = –0,717) tarp vandeninės fazės kiekio ir pH reikšmės – mažėjant vandeninės fazės kiekiui, pH reikšmė didėja. Nustatyta statistiškai reikšminga (p<0,05) stipri tiesioginė koreliacija (r = 0,817) tarp surfaktanto ir kosurfaktanto mišinio kiekio ir pH – didėjant šio mišinio kiekiui, pH didėja. Šias mikroemulsijas, pagal nustatytas jų pH reikšmes, galima naudoti ant odos, kurios pH yra 4–6 [32].
Mikroemulsijų klampa buvo nuo 1,04 iki 702 mPa·s ir statistinė analizė parodė statistiškai reikšmingą (p<0,05) stiprią netiesioginę koreliaciją (r = –0,883) tarp vandeninės fazės kiekio mikroemulsijose ir klampos – mažėjant vandeninės fazės kiekiui, klampa didėja. Statistiškai reikšminga (p<0,05) stipri tiesioginė koreliacija (r = 0,783) nustatyta tarp surfaktanto ir kosurfaktanto mišinio kiekio ir klampos – didėjant šio mišinio kiekiui, klampa didėja. Statistiškai reikšminga (p<0,05) stipri tiesioginė koreliacija (r = 0,833) nustatyta tarp aliejinės fazės kiekio ir klampos – didėjant aliejinės fazės kiekiui, klampa didėja.
Mikroemulsijų elektrinis laidis buvo nuo 33,3 iki 192,3 µS/cm. Statistinė analizė parodė statistiškai reikšmingą (p<0,05) stiprią tiesioginę koreliaciją (r = 0,950) tarp vandeninės fazės kiekio ir elektrinio laidumo – didėjant vandeninės fazės kiekiui, elektrinis laidumas didėja. Statistiškai reikšminga (p<0,05) stipri netiesioginė koreliacija (r = –1,000) nustatyta tarp surfaktanto ir kosurfaktanto mišinio kiekio ir elektrinio laidumo – mažėjant šio mišinio kiekiui, laidumas didėja.
Buvo įvertinti mikroemulsijų vidutinis dalelių dydis, polidispersiškumo indeksas ir smailių skaičius, kuris parodo dalelių dydžio pasiskirstymą (4 lentelė).
4 lentelė. Mikroemulsijų sudėtys ir tyrimų rezultatai Mikroemulsijų komponentai Vidutinis dalelių dydis (nm) Polidispersiškumo indeksas Nr. Išgrynintas vanduo (proc.) Aliejus (proc.) Surfaktantas:Kosurfaktantas (5:1 santykis), (proc.) 1. 58,8 0,6 40,6 13,04 0,532 2. 53,9 1,5 44,6 16,40 0,539 3. 48,9 2,1 48,9 19,55 0,693 4. 43,4 3,1 53,4 26,62 0,708 5. 38,0 5,0 56,9 48,78 0,591 6. 32,5 7,0 60,5 64,43 0,681 7. 27,1 9,4 63,5 78,92 0,758 8. 26,9 6,2 66,9 101,00 0,769 9. 27,4 0,5 72,0 110,40 0,568
Vertinant visų tirtų mikroemulsijų vidutinį dalelių dydį (VDD), gautuose intensyvumo grafikuose esančios 3 smailės parodė skirtingo dydžio dalelių pasiskirstymą mikroemulsijose. 1-oji smailė atitiko VDD, kuris varijavo nuo 2,92 iki 10,41 nm, 2-oji smailė atitiko 24,70–151,6 nm VDD, o 3-oji smailė atitiko VDD, kuris varijavo nuo 539,4 iki 3513 nm. Tirtų mikroemulsijų polidispersiškumo indekso (PDI) reikšmės varijavo nuo 0,532 iki 0,769, o vidutinis dalelių dydis buvo 13,04–110,40 nm. Statistinė analizė parodė statistiškai reikšmingą (p<0,05) stiprią netiesioginę koreliaciją (r = –0,950) tarp vandeninės fazės kiekio ir VDD – mažėjant vandeninės fazės kiekiui, VDD didėja. Nustatyta statistiškai reikšminga (p<0,05) vidutinė netiesioginė koreliacija (r = –0,700) tarp vandeninės fazės kiekio ir polidispersiškumo indekso – mažėjant vandeninės fazės kiekiui, PDI didėja. Nustatyta statistiškai reikšminga (p<0,05) vidutinė tiesioginė koreliacija (r = 0,733) tarp aliejinės fazės kiekio ir PDI – didėjant aliejinės fazės kiekiui, PDI didėja. Gauti rezultatai parodė, kad tirtos mikroemulsijos galimai yra heterogeninės sistemos, dėl aukštų polidispersiškumo indekso reikšmių (PDI>0,5) ir dalelių pasiskirstymo ne vienoje smailėje, todėl su šios sudėties mikroemulsijų formuluotėmis tyrimai toliau nebuvo vykdomi.
3.3. Termodinamiškai stabilių ir kokybiškų mikroemulsijų sudėties paieška
Kadangi anksčiau formuluota eksperimentinė mikroemulsijos sistema, sudaryta iš išgryninto vandens, izopropilo miristato, tvino 20 ir propilenglikolio (santykiu 5:1) neatitiko mikroemulsijų
kokybei keliamų reikalavimų, nuspręsta pasirinkti surfaktanto ir kosurfaktanto mišinio santykus 7:1 ir 9:1 ir įvertinti pagamintų mikroemulsijų polidispersiškumo indeksus ir smailių skaičius. Nustatyta, kad mikroemulsijų polidispersiškumo indekso reikšmės buvo atitinkamai 0,727 ir 0,519, kai surfaktanto ir kosurfaktanto mišinio santykiai yra 7:1 ir 9:1, o skirtingo dydžio dalelių pasiskirstymą mikroemulsijose vaizdavo 2 smailės, todėl šios sudėties mikroemulsijos atmestos kaip neatitinkančios kokybės (2 pav.).
2 pav. Mikroemulsijų santykių ir kosurfaktantų keitimas
Nuspręsta pakeisti propilenglikolį į kitus kosurfaktantus: etanolį, PEG-400, poligliceril-6-izostearatą, kai surfaktanto ir kosurfaktanto mišinio santykis mikroemulsijose 5:1 (2 pav.). Polidispersiškumo indekso reikšmės buvo atitinkamai 0,677 ir 0,574, kai naudojamas etanolis ir PEG-400 kaip kosurfaktantai, o skirtingo dydžio dalelių pasiskirstymą mikroemulsijose vaizdavo 2 smailės, todėl šios mikroemulsijos taip pat atmestos kaip nekokybiškos.
Nuspręsta keisti tviną 20 į naujesnės kartos surfaktantą – labrasolį ir atlikti tuos pačius surfaktanto-kosurfaktanto mišinio santykio ir sudėties pakeitimus (3 pav.).
Vandeninė fazė – išgrynintas vanduo Aliejinė fazė – izopropilo miristatas Surfaktantas – tvinas 20 Kosurfaktantas – propilenglikolis S/KoS santykis – 5:1 PDI – 0,798 Smailių skaičius – 2 Vandeninė fazė – išgrynintas vanduo Aliejinė fazė – izopropilo miristatas Surfaktantas – tvinas 20 Kosurfaktantas – propilenglikolis S/KoS santykis – 7:1 PDI – 0,727 Smailių skaičius – 2 Vandeninė fazė – išgrynintas vanduo Aliejinė fazė – izopropilo miristatas Surfaktantas – tvinas 20 Kosurfaktantas – propilenglikolis S/KoS santykis – 9:1 PDI – 0,519 Smailių skaičius – 2 Vandeninė fazė – išgrynintas vanduo Aliejinė fazė – izopropilo miristatas Surfaktantas – tvinas 20 Kosurfaktantas – PEG-400 S/KoS santykis – 5:1 PDI – 0,574 Smailių skaičius – 2 Vandeninė fazė – išgrynintas vanduo Aliejinė fazė – izopropilo miristatas Surfaktantas – tvinas 20 Kosurfaktantas – etanolis S/KoS santykis – 5:1 PDI – 0,677 Smailių skaičius – 2 Vandeninė fazė – išgrynintas vanduo Aliejinė fazė – izopropilo miristatas Surfaktantas – tvinas20 Kosurfaktantas – Poligliceril-6-izostearatas S/KoS santykis – 5:1 Mikroemulsija nesusiformavo, stebimas drumstumas
3 pav. Mikroemulsijų santykių ir kosurfaktantų keitimas
Kai labrasolio ir propilenglikolio mišinio santykiai buvo 5:1, 7:1, 9:1, polidispersiškumo indekso reikšmės buvo atitinkamai 0,364, 0,287, 0,285, tačiau skirtingo dydžio dalelių pasiskirstymą mikroemulsijose vaizdavo 2 smailės. Esant skirtingiems kosurfaktantams (propilenglikolis, etanolis, PEG-400, poligliceril-6-izostearatas) mikroemulsijose, kai surfaktanato ir kosurfaktanto mišinio santykis – 5:1, polidispersiškumo indekso reikšmės atitinkamai buvo 0,364, 0,289, 0,093, 0,285. Tačiau tik esant kosurfaktantui PEG-400 skirtingo dydžio dalelių pasiskirstymą mikroemulsijose vaizdavo 1 smailė. Todėl nuspręsta pasirinkti tolimesniems tyrimams mikroemulsiją, sudarytą iš surfaktanto labrasolio, kosurfaktanto PEG-400, išgryninto vandens ir izopropilo miristato, kadangi šios formuluotės PDI buvo mažiausias.
Mikroemulsijos, sudarytos iš išgryninto vandens, izopropilo miristato, labrasolio ir PEG-400 (santykiu 5:1) leido suformuoti plotą pseudotrinarėje fazių diagramoje (4 pav.).
Vandeninė fazė – išgrynintas vanduo Aliejinė fazė – izopropilo miristatas Surfaktantas – labrasolis Kosurfaktantas – propilenglikolis S/KoS santykis – 5:1 PDI – 0,364 Smailių skaičius – 2 Vandeninė fazė – išgrynintas vanduo Aliejinė fazė – izopropilo miristatas Surfaktantas – labrasolis Kosurfaktantas – propilenglikolis S/KoS santykis – 7:1 PDI – 0,287 Smailių skaičius – 2 Vandeninė fazė – išgrynintas vanduo Aliejinė fazė – izopropilo miristatas Surfaktantas – labrasolis Kosurfaktantas – propilenglikolis S/KoS santykis – 9:1 PDI – 0,285 Smailių skaičius – 2 Vandeninė fazė – išgrynintas vanduo Aliejinė fazė – izopropilo miristatas Surfaktantas – labrasolis Kosurfaktantas – PEG-400 S/KoS santykis – 5:1 PDI – 0,093 Smailių skaičius – 1 Vandeninė fazė – išgrynintas vanduo Aliejinė fazė – izopropilo miristatas Surfaktantas – labrasolis Kosurfaktantas – etanolis S/KoS santykis – 5:1 PDI – 0,289 Smailių skaičius – 2 Vandeninė fazė – išgrynintas vanduo Aliejinė fazė – izopropilo miristatas Surfaktantas – labrasolis Kosurfaktantas – poligliceril-6-izostearatas S/KoS santykis – 5:1 PDI – 0,285 Smailių skaičius – 2 Smailių skaičius – 2
4 pav. Pseudotrinarė fazių diagrama
Mokslinės literatūros duomenimis, suformuotas plotas pseudotrinarėje fazių diagramoje atitinka aliejus-vanduo tipo mikroemulsijas [39]. Gauta riba nurodo termodinamiškai stabilias mikroemulsijas, kurios gali būti pagamintos pagal ribose esančių komponentų koncentracijų reikšmes. Už šios ribos formuojasi kitos struktūros.
Įvertinta, ar pagamintos mikroemulsijos yra termodinamiškai stabilios, atlikus centrifugavimo tyrimą, šildymo-šaldymo, užšaldymo-atšildymo ciklus – visos mikroemulsijos buvo termodinamiškai stabilios ir tai patvirtina jų skaidrumas, drumstumo, nuosėdų ar išsisluoksniavimo nebuvimas.
3.4. Aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų sudėties optimizavimas
Eksperimentinių mikroemulsijų sudėtis optimizuota taikant D-optimalų dizaino modelį, kuris, mokslinės literatūros duomenimis, yra dažniausiai naudojamas šiam tikslui [16, 26, 40, 42]. Aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų sudėties optimizavimui pasirinktos komponentų koncentracijos ribos: izopropilo miristato – 1,0–7,0 proc., išgryninto vandens – 31,0–37,0 proc., labrasolio ir PEG-400 mišinio (santykis 5:1) – 62,0–68,0 proc. Mikroemulsijų sudėtis optimizuota pagal kuo mažesnes dalelių dydžio, polidispersiškumo indekso reikšmes. Sugeneruota 12 sudėčių (1 lentelė), pagal kurias pagaminta aliejus-vanduo tipo mikroemulsijos ir įvertintas jų vidutinis dalelių dydis ir polidispersiškumo indeksas. Gauti rezultatai pateikti 5 lentelėje.
5 lentelė. Eksperimentinių mikroemulsijų vidutinio dalelių dydžio ir polidispersiškumo indekso reikšmės
Eil.Nr. Vidutinis dalelių dydis Polidispersiškumo indeksas
1. 250,4 ± 1,983 0,102 ± 0,015 2. 170,3 ± 1,461 0,132 ± 0,008 3. 182,6 ± 2,188 0,105 ± 0,011 4. 192,0 ± 1,547 0,103 ± 0,012 5. 221,4 ± 2,483 0,091 ± 0,016 6. 221,5 ± 1,915 0,088 ± 0,021 7. 243,5 ± 3,413 0,063 ± 0,018 8. 147,7 ± 1,107 0,143 ± 0,011 9. 270,4 ± 1,920 0,077 ± 0,023 10. 189,3 ± 1,623 0,120 ± 0,016 11. 251,8 ± 1,925 0,080 ± 0,018 12. 148,1 ± 1,513 0,136 ± 0,009
Gauti rezultatai parodė, kad visų tirtų mikroemulsijų dalelių pasiskirstymą mikroemulsijose vaizdavo 1 smailė. Statistinė analizė parodė statistiškai reikšmingą (p<0,05) stiprią netiesioginę koreliaciją (r = –0,939) tarp vandeninės fazės kiekio ir VDD – mažėjant vandeninės fazės kiekiui, VDD didėja. Statistiškai reikšminga (p<0,05) vidutinė tiesioginė koreliacija (r = 0,641) nustatyta tarp surfaktanto ir kosurfaktanto mišinio kiekio ir VDD – didėjant surfaktanto ir kosurfaktanto mišinio kiekiui, VDD didėja. Tačiau nustatyta statistiškai nereikšminga (p>0,05) silpna tiesioginė koreliacija (r = 0,259) tarp aliejinės fazės kiekio ir VDD. Statistinė duomenų analizė parodė statistiškai reikšmingą (p<0,05) stiprią tiesioginę koreliaciją (r = 0,917) tarp vandeninės fazės kiekio ir PDI – didėjant vandeninės fazės kiekiui, PDI didėja. Nustatyta statistiškai nereikšminga (p>0,05) vidutinė netiesioginė koreliacija (r = – 0,532) tarp aliejinės fazės kiekio ir PDI – mažėjant aliejinės fazės kiekiui, PDI didėja.
Atliktas sudėties optimizavimas pagal 3 variantus ir pasirinktus kriterijus: 1. minimalius VDD ir PDI;
2. minimalų VDD; 3. minimalų PDI.
Pagal pasirinktus 1 varianto kriterijus, gauta ME-OPT-I sudėtis. Pagal 2 varianto kriterijus, gauta ME-OPT-II sudėtis, o pagal 3 varianto kriterijus, gauta ME-OPT-III sudėtis.
Optimizavimo metu gautos statistiškai reikšmingos (p<0,05) matematinės lygtys, kurios leidžia prognozuoti aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų VDD ir PDI reikšmes.
Prognozavimo lygtys:
y = 5,52507 × c1 – 10,15723 × c2 + 8,23611 × c3
z = – 0,00417872 × c1 + 0,00703306 × c2 – 0,00183361 × c3
Čia y – vidutinis dalelių dydis, z – polidispersiškumo indeksas, c1 – aliejinės fazės (izopropilo miristato) koncentracija (proc.), c2 – vandeninės fazės (išgryninto vandens) koncentracija (proc.), c3 – surfaktanto (labrasolio) ir kosurfaktanto (PEG-400) mišinio (santykis 5:1), koncentracija (proc.).
1 varianto prognozės tikimybė buvo 56,5 proc., o gauta praktinė mikroemulsijų VDD ir PDI reikšmė atitiko teorinę reikšmę atitinkamai 88,6 proc. ir 95,6 proc. 2 varianto prognozės tikimybė buvo 100 proc., o gauta praktinė mikroemulsijų VDD reikšmė atitiko teorinę reikšmę 107,4 proc. 3 varianto prognozės tikimybė buvo 84,9 proc., o gauta praktinė mikroemulsijų PDI reikšmė atitiko teorinę reikšmę 142,7 proc.
Kiekvieną optimalios sudėties aliejus-vanduo tipo mikroemulsiją sudarančių komponentų kiekiai (proc.) pateikti 6 lentelėje.
6 lentelė. Optimalių mikroemulsijų sudėtys
ME-OPT-I* ME-OPT-II** ME-OPT-III***
Izopropilo miristatas (proc.) 5,6 1,1 7,0
Išgrynintas vanduo (proc.) 32,4 36,9 31,0
Surfaktantas ir
kosurfaktantas (5:1) (proc.) 62,0 62,0 62,0
Pastaba: *– mikroemulsijos optimali sudėtis I, **– mikroemulsijos optimali sudėtis II, ***– mikroemulsijos optimali sudėtis III.
Gautos optimalios sudėties aliejus-vanduo tipo mikroemulsijos, kurios buvo naudojamos propolio fenolinių junginių įterpimui ir tolimesniems kokybės ir biofarmaciniams tyrimams.
3.5. Optimalios sudėties aliejus-vanduo tipo mikroemulsijų fizikinių-cheminių
savybių vertinimas
Optimalių a-v tipo mikroemulsijų, sudėtyje neturinčių propolio fenolinių junginių ir turinčių propolio fenolinių junginių, fizikinės ir cheminės savybės vertintos praėjus 1 dienai, 7 dienoms ir 30 dienų po pagaminimo ir gauti rezultatai pateikti 7, 8, 9 lentelėse.
