LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Modestas Žilius
DERMATOLOGINIŲ PUSKIEČIŲ FORMŲ
SU PROPOLIO PRODUKTAIS
MODELIAVIMAS, OPTIMIZAVIMAS IR
BIOFARMACINIS VERTINIMAS
Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai, farmacija (08B) Kaunas, 2014Disertacija rengta 2008–2014 metais Lietuvos sveikatos mokslų univer-sitete, Medicinos akademijoje
Mokslinis vadovas
Prof. dr. Vitalis Briedis (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medi-cinos akademija, biomediMedi-cinos mokslai, farmacija – 08B)
Konsultantas
Prof. dr. Kristina Ramanauskienė (Lietuvos sveikatos mokslų universi-tetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, farmacija – 08B)
3
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
ĮVADAS... 6
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Propolio cheminė sudėtis ir biologinis aktyvumas ... 10
1.2. Fenolinių rūgščių, aldehidų struktūros ir biologinio aktyvumo ryšys ... 16
1.3. Žmogaus odos struktūra ir išorinių faktorių sukelti odos pažeidimai ... 21
1.4. Puskiečių formų modeliavimas, optimizavimas ir biofarmacinis vertinimas ... 27
2. TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODAI ... 30
2.1. Tyrimų objektas ... 30
2.2. Reagentai ir medžiagos ... 30
2.3. Tyrimų metodai ir metodika ... 30
2.3.1. Etanolinių ir vandeninių propolio ištraukų gamyba ... 30
2.3.2. Eksperimentinės propolio puskietės formos ... 31
2.3.3. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas propolio produktuose ... 32
2.3.4. Propolio produktų analizė efektyviąja skysčių chromatografija ... 33
2.3.5. Propolio fenolinių rūgščių ir aldehidų efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos pritaikymas ir validacija ... 33
2.3.6. Propolio fenolinių junginių atpalaidavimo iš eksperimentinių propolio puskiečių formų in vitro tyrimai ... 35
2.3.7. Propolio fenolinių junginių skvarbos į odą ex vivo tyrimai ... 36
2.3.8. Eksperimentinių propolio puskiečių formų fizikinių savybių nustatymas ... 37
2.3.9. Eksperimentinių propolio puskiečių formų stabilumo tyrimas ... 38
2.3.10. Statistinis duomenų vertinimas ... 38
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 39
3.1. Propolio produktų kokybinės ir kiekybinės sudėties įvertinimas ... 39
3.1.1. Fenolinių junginių kiekio nustatymas tirštajame propolio ekstrakte ... 39
3.1.2. Ekstrahento ir žaliavos-ekstrahento santykio įtaka etanolinių ir vandeninių propolio ištraukų kokybei ... 41
4
3.2. Pradinių eksperimentinių propolio puskiečių formų sudėties
modeliavimas ir jų reologinis, biofarmacinis vertinimas ... 43
3.3. Puskiečių formų su propolio produktais optimizavimas ... 49
3.4. Optimalios sudėties propolio puskiečių formų fizikinių charakteristikų vertinimas ... 58
3.5. Fenolinių junginių atpalaidavimas iš optimalios sudėties propolio puskiečių formų in vitro ... 63
3.6. Propolio fenolinių junginių skvarba į odą ex vivo ... 69
3.6.1. Fenolinių junginių skvarba į žmogaus odą iš vandeninės propolio ištraukos ... 69
3.6.2. Fenolinių junginių skvarba į žmogaus odą iš optimalios sudėties propolio puskiečių formų ... 70
3.6.3. Fenolinių junginių skvarba į žmogaus odą iš eksperimentinio propolio aliejus-vanduo tipo gelifikuoto kremo ... 73
3.7. Veikliųjų junginių skvarbą į odą įtakojantys veiksniai ... 74
3.7.1. Fenolinių junginių skvarba iš vandeninės propolio ištraukos į žmogaus odą su pašalintu raginiu sluoksniu ... 74
3.7.2. Skvarbą skatinančių medžiagų įtaka fenolinių junginių skvarbai į žmogaus odą ... 75
3.8. Optimalios sudėties propolio puskiečių formų stabilumo vertinimas ... 77
3.9. Puskiečių formų tyrimų apibendrinimas ... 81
IŠVADOS ... 84
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 86
DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 102
5
SANTRUMPOS
ABTS•+ 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfono rūgšties) radikalas (angl. 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)
radical)
DPPH• 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas (angl.
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical)
ERK tarpląstelinio signalo reguliuojama kinazė (angl. extracellular
signal-regulated kinase)
Gr- gram-neigiama (angl. gram-negative) Gr+ gram-teigiama (angl. gram-positive) IL interleukinas (angl. interleukin)
JNK c-jun N-galo kinazė (angl. c-jun-N-terminal kinase)
logP oktanolio/vandens pasiskirstymo koeficientas (angl.
n-octanol/water partition coefficient)
MAPK mitogeno aktyvinama proteinkinazė (angl. mitogen-activated
protein kinase)
MMP matricos metaloproteinazė (angl. matrix metalloproteinase) NADPH nikotinamido adenino dinukleotido fosfato, redukuota forma
(angl. nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced
form )
NF-κB branduolių faktorius kapa B (angl. nuclear factor kappa B) ORAC deguonies radikalų absorbcijos galia (angl. oxygen radical
absorbance capacity)
RNS reaktyvios azoto formos (angl. reactive nitrogen species) ROS reaktyvios deguonies formos (angl. reactive oxygen species) TGF-β transformuojantis augimo faktorius-β (angl. transforming
growth factor-β)
6
ĮVADAS
Įvairūs žmogaus odos sutrikimai yra viena iš svarbių ir aktualių problemų šiuolaikiniame pasaulyje. Per pastarąjį dešimtmetį padidėjo mokslininkų susidomėjimas odos senėjimu, oksidacinio streso poveikiu šiam procesui ir antioksidaciniu aktyvumu pasižyminčiomis medžiagomis, pritaikant jas odos senėjimo lėtinimui [62, 158].
Propolis – natūralus, dervingas bičių produktas, kuriame nustatyti feno-liniai junginiai: fenolinės rūgštys ir jų esteriai, flavonoidai, kurie lemia jo stiprų antioksidacinį aktyvumą [3, 42]. Šiems fenoliniams junginiams pri-skiriamas priešbakterinis, priešgrybelinis, priešvirusinis, priešuždegiminis, priešnavikinis aktyvumas [27, 91, 186] ir odos žaizdų gijimą skatinantis poveikis [166]. Biologinis propolio produktų aktyvumas priklauso nuo veik-liųjų junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties išgaunamos iš propolio ža-liavos. Didžiausi fenolinių junginių kiekiai išgaunami iš propolio žaliavos naudojant 70 proc. ar 80 proc. etanolį. Propolio fenolines rūgštis galima se-lektyviai ekstrahuoti, naudojant išgrynintą vandenį [62]. Propolio produktų standartizaciją apsunkina skirtinga propolio cheminė sudėtis, kuri priklauso nuo vietovės augalijos, klimatinių sąlygų. Vienas iš problemos sprendimo būdų yra susieti biologinį aktyvumą su propolio chemine sudėtimi [10, 11]. Propolio žaliavos ir propolio produktų kokybės vertinimui naudojama akty-vių veikliųjų junginių, kaip žymenų, kiekybinė analizė [119]. Propolio feno-linių junginių kokybinei ir kiekybinei analizei taikomi šiuolaikiniai analizės metodai: efektyvioji skysčių ir dujų chromatografija, kapiliarinė elektrofo-rezė [92, 123].
Oda yra biologinis barjeras, kuris saugo nuo žalingų išorinių veiksnių: ultravioletinės spinduliuotės, jonizuojančios radiacijos, infekcijos, cheminių medžiagų [169]. Saulės UV spinduliuotė vienas stipriausiai žmogaus odą veikiančių išorinių veiksnių (iki 80 proc.), kuris skatina laisvųjų radikalų, ypač reaktyvių deguonies formų, susidarymą odoje [46, 150]. Odoje veikia natūralios apsauginės sistemos, neutralizuojančios laisvuosius radikalus. Su-trikęs šių sistemų pajėgumas neutralizuoti susidariusius laisvuosius radika-lus, sukelia oksidacinį stresą, kuris gali turėti įtakos odos senėjimui ir vėžio patogenezei [148, 150]. Vienas iš būdų, kuris leistų apsaugoti žmogaus odą nuo susidariusių laisvųjų radikalų, yra siejamas su antioksidantų panaudo-jimu.
Siekiant efektyvaus propolio fenolinių junginių poveikio susidariusiems laisviesiems radikalams odoje, svarbu sumodeliuoti veiksmingai šiuos jun-ginius atpalaiduojančias ir tiekiančias į odą puskietes sistemas su propolio produktais [113, 114, 169]. Tinkamas nešiklio ir pagalbinių medžiagų
parin-7
kimas turi įtakos efektyviam veikliųjų medžiagų atpalaidavimui ir skvarbai į odą iš įvairių vaistų formų: tepalų, kremų, gelių, pleistrų, purškalų, putų [32, 128].
Darbo tikslas: Pagrįsti puskiečių formų su propolio produktais
modelia-vimo principus, optimizuoti eksperimentines puskietes formas ir suformu-luoti kokybės modelį, remiantis biofarmaciniais tyrimais.
Uždaviniai:
1. Atlikti puskiečių formų su propolio produktais modeliavimą, pa-grindžiant pagalbinių medžiagų pritaikymą;
2. Susieti puskiečių formų su propolio produktais kokybę ir biofar-macinius rodiklius, ir optimizuoti atrinktas formas;
3. Charakterizuoti eksperimentines puskietes formas pagal propolio veikliųjų junginių atpalaidavimo tyrimų in vitro rezultatus;
4. Įvertinti veikliųjų junginių skvarbą į odą ex vivo iš optimalios su-dėties puskiečių formų su propolio produktais;
5. Vertinti optimalios sudėties eksperimentinių puskiečių formų su propolio produktais kokybę ir stabilumą.
Ginami teiginiai:
1. Veiksmingą propolio fenolinių junginių atpalaidavimą iš puskie-tės formos lemia jos tipas;
2. Propolio fenolinių rūgščių ir vanilino fizikinės-cheminės savybės leidžia prognozuoti jų skvarbą į odą ir pasiskirstymą tarp epider-mio ir dermos;
3. Puskietis nešiklis atlieka aktyvų vaidmenį propolio fenolinių rūgščių ir vanilino skvarbos į odą procese;
4. Raginis odos sluoksnis ir skvarbą skatinančios medžiagos turi įta-kos propolio fenolinių junginių skvarbai į odą.
Mokslinio darbo naujumas. Pirmą kartą įvertinta atskirų fenolinių
rūgš-čių (vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo rūgšties) ir vanilino skvarba į žmogaus odą iš vandeninės propolio ištraukos ir eksperimentinių propolio puskiečių formų (tepalo, vanduo-aliejus (v-a) tipo kremo, hidrogelio, aliejus-vanduo (a-v) tipo gelifikuoto kremo). Patvirtintas aktyvus puskietės sistemos vaid-muo, atpalaiduojant ir darant įtaką propolio veikliųjų junginių (vanilo, ka-vos, p-kumaro, ferulo rūgščių ir vanilino) skvarbai į odą. Siekiant pagrįsti propolio produktų veikimo mechanizmus, atrinkti vyraujantys propolio fe-noliniai junginiai (vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo rūgštys ir vanilinas) ir įvertintas jų pasiskirstymas odos sluoksniuose (epidermyje ir dermoje). Įver-tinta raginio sluoksnio barjerinė funkcija propolio fenolinių junginių skvar-bai į odą.
Išvystyta ir validuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika, kuri pritaikyta propolio fenolinėms rūgštims (galo, vanilo, kavos, p-kumaro,
8
ferulo rūgštims) ir vanilinui nustatyti žmogaus odoje. Taikant ją, atlikta pro-polio produktų ir eksperimentinių puskiečių formų kokybinė ir kiekybinė analizė. Nustatyta, kad Lietuvoje surinktoje propolio žaliavoje vyrauja p-ku-maro, ferulo, vanilo, kavos rūgštis ir vanilinas. Galo rūgštis nenustatyta šio-je propolio žaliavošio-je.
Praktinė ir teorinė reikšmė. Atlikti ex vivo skvarbos tyrimai ir gauti
re-zultatai įrodo propolio fenolinių rūgščių (vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo rūgšties) ir vanilino skvarbą į žmogaus odą. Nustatytas šių junginių pasi-skirstymas tarp epidermio ir dermos, kuris susietas su skirtingu jų lipofi-liškumu. Santykinai lipofiliniai junginiai (ferulo ir p-kumaro rūgštis) kaupė-si epidermyje, o santykinai hidrofiliniai junginiai (vanilo rūgštis ir vanilinas) migravo į dermą. Kavos rūgštis, kurios tirtuose propolio produktuose yra mažesnis kiekis negu kitų fenolinių rūgščių (vanilo, p-kumaro, ferulo rūgš-ties), nustatyta tik epidermyje. Gauti biofarmacinių tyrimų in vitro ir ex vivo rezultatai yra informatyvūs, vertinant propolio puskiečių formų kokybę.
Eksperimentinių propolio puskiečių sistemų sudėties optimizavimui nau-dotas eksperimentinis planavimas. Tai leido efektyviai sumažinti eksperi-mentų skaičių ir suskirstyti modelines puskietes formas pagal veikliųjų jun-ginių atpalaidavimo iš jų tyrimo in vitro rezultatus. Praktiškai patvirtintas šio metodo tinkamumas vaisto formų sudėties optimizavimui. Optimizavi-mo parametrai leido prognozuoti propolio veikliųjų junginių atpalaidavimą iš puskiečių sistemų.
Propolio puskiečių formų kokybė vertinta, nustatant jų fizikines savybes (pH, dinaminę klampą, reologines charakteristikas) ir taikant veikliųjų jun-ginių atpalaidavimo in vitro, stabilumo tyrimus. Pritaikyta efektyviosios skysčių chromatografijos metodika suteikia galimybę atskirti ir išskirstyti propolio fenolinius junginius (galo, vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo rūgštis ir vaniliną). Išekstrahuoti žmogaus odos komponentai netrukdo kiekybiškai nustatyti šių fenolinių rūgščių ir vanilino. Šių propolio fenolinių junginių išskirta iš epidermio ir dermos ≥ 96 proc. Gauti rezultatai yra svarbūs, sie-kiant pagrįsti skvarbos pro biologines membranas tyrimų veiksmingumui.
Darbo rezultatų aprobavimas. Tyrimų rezultatai pristatyti 4 mokslinėse
konferencijose: 18th International Student Scientific Conference for Students and Young Doctors (2010 m. balandžio 22–24 d., Gdanskas, Lenkija); 5th International Scientific conference „The Vital Nature Sign“ (2011 m. gegu-žės 19–21 d., Kaunas, Lietuva); Tarptautinė farmakognozijos ir kitų farma-cijos mokslų konferencija skirta prof. K. Grybausko 125-ųjų ir doc. E. Ka-nopkos 100-ųjų gimimo metinių paminėjimui (2011 m. lapkričio 11–13 d., Kaunas, Lietuva); Achievements and development perspectives of pharma-ceutical chemistry and other sciences: the international conference on phar-maceutical sciences and pharmacy practice dedicated to 125th Birth
Anni-9
versary of prof. Benediktas Šiaulis (2012 m. lapkričio 24 d., Kaunas, Lietu-va).
Tyrimų tematika paskelbti 3 moksliniai straipsniai, iš kurių 2 išspausdinti leidiniuose, įtrauktuose į Mokslinės informacijos instituto duomenų bazę.
Darbo apimtis ir struktūra. Daktaro disertaciją sudaro įvadas,
literatū-ros apžvalga, tyrimų objektas ir metodai, tyrimų rezultatai ir jų aptarimas, išvados, bibliografijos sąrašas (207 literatūros šaltiniai), priedas (6 lentelės), disertacijos tema paskelbtų publikacijų sąrašas. Disertacijoje pateikta 9 lentelės ir 37 paveikslai. Disertacijos apimtis 106 puslapiai.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Propolio cheminė sudėtis ir biologinis aktyvumas
Propolis yra natūralus, dervingas bičių (Apis mellifera) produktas, ku-riame yra nustatyta daugiau negu 300 įvairių cheminių junginių: fenolinių rūgščių ir jų esterių, flavonoidų (flavonų, flavanonų, flavonolių, chalkonų, dihidroflavonolių,), aromatinių aldehidų ir alkoholių, β-steroidų, terpenų, seksviterpenų, stilbeno terpenų [153, 191, 197]. Jo cheminė sudėtis priklau-so nuo augalijos tipo ir klimatinių sąlygų. Todėl, propolio pavyzdžiai iš Eu-ropos, Azijos, Pietų Amerikos ir kitų geografinių regionų turi skirtingą che-minę sudėtį (1.1 lentelė) [2].
1.1 lentelė. Skirtingo geografinio regiono propolio cheminė sudėtis
Geografinis regionas
Fenolinės rūgštys ir jų esteriai
Flavonoidai Kiti junginiai Literatūros
šaltiniai
Europa Hidroksibenzo rūgštys,
Hidroksicinamono rūgštys,
Kavos rūgšties fenetilo esteris Flavonai, Flavanonai, Flavonoliai Vanilinas [63, 64, 84, 98, 152] Azija Hidroksicinamono rūgštys,
Kavos rūgšties fenetilo esteris Flavonai, Flavanonai, Flavonoliai Vanilinas, Klerodano diterpenoidai (Irakas) [2, 98, 185] Šiaurės Amerika Hidroksicinamono rūgštys (p-kumaro rūgštis) Flavonai, Flavanonai [98] Pietų Amerika Hidroksibenzo rūgštys, Hidroksicinamono rūgštys,
Kavos rūgšties fenetilo esteris Flavonai, Flavanonai, Flavonoliai Artepilinas C (3,5-diprenil-p-kumaro rūgštis) (Brazilija) [30, 98] Afrika Hidroksicinamono rūgštys Flavonai, Flavanonai, Flavonoliai [1, 68, 69, 98, 117]
Okeanija Kavos rūgšties fenetilo
esteris
Flavonai, Flavanonai
[98]
Liudas Ivanauskas [78], Kristina Ramanauskienė ir kt. [155] nustatė, kad Lietuvoje surinktame propolyje aptinkamos fenolinės rūgštys – galo, vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo, chlorogeno, rozmarino, cinamono rūgštis ir feno-linis aldehidas – vanilinas. Taip pat, paskelbė, kad šiame propolyje
vyrau-11
jančios p-kumaro ir ferulo rūgštys gali būti tarp pagrindinių kokybės žyme-nų, standartizuojant propolio žaliavą ir produktus.
Propolis pasižymi antioksidaciniu, antiradikaliniu, priešbakteriniu, prieš-grybeliniu, priešvirusiniu, antiparazitiniu, priešuždegiminiu, priešvėžiniu (priešnavikiniu), imunomoduliaciniu aktyvumu [54, 153, 171].
Antioksidacinis, antiradikalinis aktyvumas. Moksliniais tyrimais nusta-tyta, kad Lietuvoje surinkto propolio etanolinės ištraukos pasižymi antioksi-daciniu aktyvumu. Šis aktyvumas yra siejamas su kavos ir ferulo rūgštimis iš tirtų fenolinių junginių: pastarųjų rūgščių, pinocembrino, pinostrobino ir chrizino [164]. Vandeninės propolio ištraukos, kurių gamyboje naudotas po-lietilenglikolis 400 ir fenolinių junginių ekstrakcija vykdyta 70°C tempe-ratūroje, pasižymi didesniu fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiu ir sti-presniu antiradikaliniu aktyvumu negu vandeninės propolio ištraukos, ku-rios gamintos kambario temperatūroje ir naudojant tviną kaip paviršiaus aktyvią medžiagą [12]. Skirtingo geografinio regiono propolio antioksida-cinis aktyvumas didėja tokia seka: Tailando < Pietų Afrikos, JAV, Uzbekis-tano < Brazilijos, Urugvajaus, Bulgarijos < Ukrainos, Naujosios Zelandijos, Australijos < Vengrijos, Kinijos, Čilės, Argentinos, o antiradikalinis akty-vumas didėja tokia seka: Tailando < Urugvajaus, Brazilijos, Čilės, Pietų Af-rikos, Ukrainos < Uzbekistano, JAV, Argentinos, Bulgarijos < Vengrijos, Kinijos, Naujosios Zelandijos, Australijos [98]. Nebojša Potkonjak ir kt. [151] nustatė, kad Serbijoje surinkto propolio etanolinės ištraukos, dėl di-desnio fenolinių junginių kiekio, pasižymi stipresniu antioksidaciniu ir anti-radikaliniu aktyvumu negu glikolinės ištraukos. Moksliniais tyrimais nusta-tyta, kad propolis surinktas iš Portugalijos šiaurės rytų regiono, dėl didesnio fenolinių junginių kiekio, pasižymi stipresniu antioksidaciniu aktyvumu ne-gu iš centrinio regiono [126]. Maria Graca Mine-guel ir kt. [121] nustatė, kad propolis surinktas iš Portugalijos pietų regiono taip pat pasižymi antioksi-daciniu aktyvumu. Fenolinių junginių kiekis propolio skirtingose ištraukose didėja tokia seka: vanduo < metanolis < etanolis. Paskelbtais duomenimis propolis surinktas iš Italijos šiaurės regiono pasižymi stipriu antioksidaciniu aktyvumu, dėl jame esančių fenolinių junginių: kavos rūgšties, 1,1-dimetil-alilkafeato, kavos rūgšties fenetilo esterio, galangino, kemferolio, kvercetino [63]. Propolio pavyzdžiai iš Graikijos centrinio regiono ar centrinės Pelopo-neso pusiasalio dalies pasižymi stipriu antioksidaciniu ir antiradikaliniu ak-tyvumu, lyginant su propolio pavyzdžiais iš kitų Graikijos regionų ar Kipro salos [84]. Ilhami Gulcin ir kt. [64] nustatė, kad Turkijos rytų regiono pro-polio liofilizuota vandeninė ištrauka pasižymi antioksidaciniu, antiradika-liniu aktyvumu.
Moksliniais tyrimais nustatyta, kad propolis surinktas iš Irano šiaurės re-giono, dėl didesnio fenolinių junginių kiekio, pasižymi stipresniu
antioksi-12
daciniu aktyvumu negu iš centrinio ar šiaurės rytų regiono [124]. Irako pro-polio pavyzdžių antioksidacinis, antiradikalinis aktyvumas yra panašus į Egipto propolio ir stipresnis negu Kinijos, Naujosios Zelandijos, Bulgarijos ir Vengrijos propolio pavyzdžių [185]. Kinijos propolis, išskyrus iš pietų regiono (Yunnan ir Hainan), pasižymi palyginti stipriu antioksidaciniu, anti-radikaliniu aktyvumu, dėl jame esančio didelio fenolinių junginių kiekio [2]. Rajibul Arif Laskar ir kt. [102] nustatė, kad Indijoje surinkto propolio van-deninės ištraukos, dėl didesnio fenolinių junginių kiekio, pasižymi stipres-niu antioksidacistipres-niu aktyvumu negu etanolinės ištraukos.
Moksliniais tyrimais nustatyta, kad propolis surinktas iš Meksikos šiaurės vakarų regiono, dėl jame esančių fenolinių junginių (daugiausia flavonoidų), pasižymi antioksidaciniu ir antiradikaliniu aktyvumu [195]. Brazilijos pro-polio pavyzdžiai pasižymi antioksidaciniu, antiradikaliniu aktyvumu, dau-giausia dėl fenolinių rūgščių [44, 58]. Dauguma Argentinos propolio pavyz-džių iš šiaurės regiono pasižymi antioksidaciniu, antiradikaliniu aktyvumu, kuris yra panašus į Kinijos, Čilės, Australijos, Naujosios Zelandijos pro-polio aktyvumą [30, 76]. Paskelbtais duomenimis Egipto propro-polio pavyz-džiai iš šiaurės regiono taip pat pasižymi antioksidaciniu, antiradikaliniu aktyvumu [68].
Franciane Marquele-Oliveira ir kt. [113] paskelbė, kad kremas su etano-line propolio ištrauka gali būti veiksmingas, apsaugant odą nuo UV-B tipo spindulių sukeltų pažeidimų. Pawel Olczyk ir kt. [136] nustatė, kad propolis sumažina laisvųjų radikalų kiekį žaizdose, kurios susijusios su nudegimu. Juliana Marques Senedese ir kt. [169] nustatė, kad hidrofiliniai geliai su Brazilijos propoliu, kurie yra naudojami gydyti nudegimus, nerodo muta-geninio poveikio.
Stiprus propolio antioksidacinis, antiradikalinis aktyvumas siejamas su didesniu fenolinių junginių kiekiu, kuris priklauso nuo: (i) geografinio re-giono, augmenijos ir klimatinių sąlygų, (ii) tirpiklio naudojamo ekstrakcijai: vanduo, glikoliai < metanolis < etanolis. Propolio ištraukos, kurios gamina-mos, naudojant tą patį tirpiklį ir skirtingo geografinio regiono propolio ža-liavą, gali pasižymėti panašiu antioksidaciniu aktyvumu. Tai siejama su ats-kirais fenoliniais junginiais: fenolinėmis rūgštimis (pvz., kavos rūgštimi, kavos rūgšties fenetilo esteriu) ir flavonoidais (pvz., kvercetinu, galanginu), dėl didesnio jų kiekio propolyje ir panašaus stipraus antioksidacinio aktyvu-mo.
Priešmikrobinis aktyvumas. Paskelbtais duomenimis galima išskirti ke-letą propolio mechanizmų prieš bakterijų augimą: (i) ląstelių dalijimosi slo-pinimas, (ii) bakterijų citoplazmos, ląstelių membranos ir sienelės suardy-mas, (iii) bakteriolizė ir (iv) baltymų sintezės slopinimas [56].
13
Kristina Ramanauskienė ir kt. [153, 154] nustatė, kad Lietuvoje surinkto propolio etanolinių ištraukų priešmikrobinis aktyvumas didėja tokia seka:
Klebsiella pneumoniae (Gr- bakterija) < Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis (Gr- bakterijos) < Enterococcus faecalis, Sta-phylococcus aureus (Gr+ bakterijos) < Bacillus cereus, Bacillus subtilis
(Gr+ bakterijos) = Candida albicans (mieliagrybis). Propilenglikolinių Lie-tuvoje surinkto propolio ištraukų priešmikrobinis aktyvumas prieš
Kleb-siella pneumoniae yra stipresnis, o prieš Candida albicans yra silpnesnis,
lyginant su etanolinėmis ištraukomis. Alvydas Pavilonis ir kt. [145] nustatė, kad Lietuvoje surinkto propolio tirštojo ekstrakto priešmikrobinis aktyvu-mas didėja tokia seka: Klebsiella pneumoniae (Gr- bakterija) < Escherichia
coli, Proteus mirabilis (Gr- bakterijos) = Enterococcus faecalis, Staphylo-coccus aureus (Gr+ bakterijos) < Pseudomonas aeruginosa (Gr- bakterija) = Bacillus cereus (Gr+ bakterija) < Bacillus subtilis (Gr+ bakterija) = Candida albicans (mieliagrybis). Kristina Ramanauskienė ir kt. [152] nustatė, kad
aliejinių Lietuvoje surinkto propolio ištraukų didėjantis priešmikrobinis ak-tyvumas pasireiškia taip: Escherichia coli (Gr- bakterija) < Klebsiella
pneu-moniae (Gr- bakterija) < Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis (Gr-
bakterijos) < Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis (Gr+ bakterijos) <
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus (Gr+ bakterijos) = Candida albicans
(mieliagrybis). Aliejus-vanduo tipo emulsinės sistemos su Lietuvoje surink-to propolio produktais pasižymi stipresniu priešmikrobiniu aktyvumu prieš gram-teigiamas bakterijas (Staphylococcus aureus < Bacillus cereus) ir mie-liagrybius (Candida albicans) negu prieš gram-neigiamas bakterijas
(Pseu-domonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae < Escherichia coli) [154].
Paskelbtais duomenimis propolio pavyzdžiai iš Europos, Azijos, Šiaurės ir Pietų Amerikos, Afrikos ir Okeanijos įvairių regionų pasižymi stipresniu priešbakteriniu aktyvumu prieš gram-teigiamas bakterijas (Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis) negu prieš gram-neigiamas
bak-terijas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) [167]. Tarp Europos re-giono propolio pavyzdžių, stipresniu priešbakteriniu aktyvumu pasižymi Di-džiosios Britanijos, Bulgarijos, Makedonijos propolis negu jo pavyzdžiai iš Lietuvos, Rusijos, Portugalijos, Izraelio. Serbijos [183], Meksikos [195], Graikijos ir Kipro [84] propolis pasižymi stipresniu priešmikrobiniu aktyvu-mu prieš gram-teigiamas bakterijas (Staphylococcus aureus, S. epidermidis,
S. sciuri, S. xylosus, S. lentus, S. intermedius, Bacillus cereus, B. subtilis, Micrococcus luteus, Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis) ir
mieliagrybius (Candida albicans, C. guilliermondii, C. parapsilosis, C.
tropicalis) negu prieš gram-neigiamas bakterijas (Escherichia coli, Entero-bacter aerogenes, Salmonella typhimurium, S. enteritidis, Shigella
dysente-14
riae, Shigella flexneri, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica, Kleb-siella pneumoniae, Morganella morganii, Providencia stuartii, P. rettgeri, Pseudomonas aeruginosa). Azijos ir Okeanijos propolio pavyzdžių
prieš-bakterinis aktyvumas didėja tokia seka: Papua Naujoji Gvinėja < Indija, Kinija < Saliamono salos. Brazilijos propolis pasižymi silpnesniu prieš-bakteriniu aktyvumu, lyginant su Argentinos ir JAV propoliu [167]. Joa-quim F. M. da Silva [44], Ary Fernandes Junior ir kt. [56] nustatė, kad Bra-zilijos propolio pavyzdžiai, o Lucrecia L. Chaillou ir kt. [30] nustatė, kad Argentinos propolio pavyzdžiai pasižymi priešbakteriniu aktyvumu prieš
Staphylococcus aureus. Etanolinės Brazilijoje surinkto propolio ištraukos
(20 proc.) [162] ir geliai [161] yra veiksmingi, gydant burnos kandidozę, kuri yra siejama su stomatitu, dėl naudojamų dantų protezų. Tarp Afrikos regiono propolio pavyzdžių, stipresniu priešbakteriniu aktyvumu pasižymi Kamerūno, Tanzanijos, Pietų Afrikos propolis negu jo pavyzdžiai iš Keni-jos, Ugandos, Zambijos [167]. Paskelbtais duomenimis propolis iš Albani-jos, BulgariAlbani-jos, MongoliAlbani-jos, Egipto, BraziliAlbani-jos, Kanarų salų pasižymi prieš-bakteriniu (Staphylococcus aureus) ir priešgrybeliniu (Candida albicans) aktyvumu. Albanijos, Bulgarijos, Mongolijos, Brazilijos propolis taip pat pasižymi priešvirusiniu aktyvumu prieš paukščių gripo virusą A (H7N7) [96]. Ahmed G. Hegazi [68, 69], Faten K. Abd El Hady ir kt. [1] nustatė, kad Egipto propolio pavyzdžiai pasižymi priešmikrobiniu aktyvumu prieš
Staphylococcus aureus, Escherichia coli ir Candida albicans.
Drago ir kt. [47] nustatė, kad vandeninio propolio (Actichelated®) tirpalo bakteriostatinis aktyvumas didėja tokia seka: Escherichia coli,
Pseudo-monas aeruginosa (Gr- bakterijos) < Proteus mirabilis (Gr-), Staphylo-coccus aureus (Gr+ bakterija) < Haemophilus influenzae (Gr-), Entero-coccus rūšys (Gr+) < StreptoEntero-coccus pyogenes (Gr+), o baktericidinis
akty-vumas stipriau pasireiškia prieš Staphylococcus aureus ir Haemophilus
in-fluenzae. Šis vandeninis propolio tirpalas taip pat pasižymi priešvirusiniu
aktyvumu, kuris didėja tokia seka: gripo virusas, Herpes simplex viruso tipas 1 < paragripo virusas < adenovirusas. Be to, jis pasižymi stipresniu priešbakteriniu ir priešvirusiniu aktyvumu negu hidroalkoholinė propolio ištrauka [47]. Actichelated® propolis, dėl priešbakterinio, priešvirusinio aktyvumo ir bakterijų prikibimo (adhezijos) slopinimo, gali būti naudoja-mas, užkertant kelią pradinėje stadijoje bakterijų kolonizacijai ir žmogaus ląstelių infekcijai [47]. Propolis yra naudojamas dermatologijoje žaizdoms ir nudegimams gydyti, audinių regeneracijai ir nuo Herpes simplex viruso su-keltos pūslelinės [124]. Paskelbtais duomenimis etanolinė propolio ištrauka, dėl sinergistinio poveikio ir gebėjimo padidinti antibiotikų, priešgrybelinių vaistų aktyvumą, gali būti naudojama kartu su šiais priešmikrobiniais pre-paratais [56, 183].
15
Priešuždegiminis aktyvumas. Paskelbtais duomenimis propolis pasižymi priešuždegiminiu aktyvumu ir gali būti naudojamas nuo ūminio ir lėtinio už-degimo [7, 24]. Joleen Lopes Machado ir kt. [109] nustatė, kad žaliojo Bra-zilijos propolio produktai pasižymi priešuždegiminiu aktyvumu. Šie pro-duktai slopina navikų nekrozės faktoriaus-α (TNF-α), interleukino (IL)-6 sekreciją ir skatina transformuojančio augimo faktoriaus-β (TGF-β), IL-10 sekrecijos padidėjimą. Bachiega ir kt. [8] nustatė, kad propolis slopina IL-6 ir IL-10 gamybą makrofaguose. Fuliang Hu ir kt. [74] nustatė, kad Kinijoje surinkto propolio vandeninės ir etanolinės ištraukos pasižymi priešuždegi-miniu aktyvumu, kurios slopina prostaglandino E2 ir IL-6 kiekio padidėjimą
ir taip pat pasižymi azoto oksidą slopinančiu poveikiu. Vandeninės propolio ištraukos slopina leukocitų ir neutrofilų kiekio padidėjimą [74]. Paskelbtais duomenimis propolis slopina ciklooksigenazių ir lipoksigenazių aktyvumą, ko pasekoje yra slopinama prostaglandinų ir leukotrienų gamybą. Propolis taip pat slopina indukuojamosios azoto oksido sintazės genų ekspresiją, blokuoja navikų nekrozės faktoriaus-α veikiamą branduolių faktoriaus kapa B (NF-κB) aktyvinimą ir sumažina T ląstelių reguliuojamą imuninį atsaką [54].
Komerciniai hidroalkoholiniai ir hidroglicerininiai purškalai su propoliu yra naudojami gydyti vietinį burnos, ryklės gleivinės uždegimą. Vandeninis purškalas su Actichelated® propolio tirpalu pasižymi stipriu vietiniu prieš-uždegiminiu aktyvumu ir gali būti pritaikytas gydyti burnos, ryklės glei-vinės uždegimą, nes mažiau dirgina gleivinę negu hidroalkoholiniai ir hidro-glicerininiai propolio preparatai [179]. Etanolinė propolio ištrauka, viena ar įterpta į vaisto formas, yra naudojama gydyti periodonto (dantį supančių at-raminių audinių) ligas [26]. Tereza N. C. Dantas ir kt. [45] paskelbė, kad mikroemulsinės sistemos su etanoline propolio ištrauka pasižymi priešbak-teriniu aktyvumu prieš Staphylococcus aureus (Gr+ bakterija). Aerozoliai su šiomis propolio mikroemulsinėmis sistemomis gali būti pritaikytos vietiškai gydyti bakterijų sukeltas burnos ir gerklės uždegimines ligas. Paskelbtais duomenimis dantų pastos ir tirpalai burnai skalauti naudojami gydyti gin-givitą (dantenų uždegimą), cheilitą (lūpų uždegimą) ir stomatitą (burnos gleivinės uždegimą) [124].
Priešvėžinis aktyvumas. Paskelbtais duomenimis propolio priešvėžinis aktyvumas pasireiškia prieš leukemijos (HL-60, CI41, U937), krūtų karci-nomos (MCA), žmogaus kiaušidžių karcikarci-nomos (SK-OV-3), gimdos kakle-lio vėžio (ME180), plaučių karcinomos (NCI-H358), žmogaus kepenų ląste-lių karcinomos (HepG2), kasos vėžio (PANC-1, BxPC-3), žmogaus epitelio karcinomos (HeLa) ląstelių linijas [112, 165, 202]. Yasam Barlak ir kt. [13] nustatė, kad dimetilsulfoksido ir vandeninės Turkijoje surinkto propolio iš-traukos turi citotoksinį poveikį prieš prostatos vėžinių ląstelių linijas (PC-3)
16
ir pasižymi antiproliferaciniu aktyvumu, kuris siejamas su jų antioksidaciniu poveikiu. Renata Markiewicz-Żukowska ir kt. [112] nustatė, kad propolis sumažina glioblastomos (U87MG) ląstelių augimą, dėl proliferacijos slopi-nimo ir apoptozės skatislopi-nimo. Propolio priešnavikinis aktyvumas yra sieja-mas su jo gebėjimu stimuliuoti makrofagų aktyvumą ir antikūnų gamybą, kurie naikina navikus ir slopina kancerogenezę. Propolio produktai yra nau-dojami odos ir plaučių vėžio, gerklės ir smegenų navikų gydymui [33, 176]. Propolio pritaikymas. Ilgą laiką propolis buvo naudojamas gydyti įvai-rias patologines būkles, ypatingai odos, burnos, ryklės ir kvėpavimo takų, kurios yra sukeliamos ar palaikomos uždegimo ir infekcijos sukėlėjų [179]. Sehn ir kt. [166] nustatė, kad propolio tepalas turi įtakos žaizdų gijimo pro-cesui, nes skatina keratinocitų proliferaciją. Propolis pasižymi netiesioginiu audinių regeneraciją skatinančiu poveikiu, kuris yra siejamas su jo prieš-mikrobiniu, priešuždegiminiu, antiradikaliniu ir medžiagų apykaitą stimu-liuojančiu aktyvumu. Paskelbtais duomenimis propolis yra veiksminga žaiz-dų gijimą skatinanti medžiaga, kuri yra tinkama pūliuojančių ir nepūliuo-jančių odos sužalojimų gydymui [166]. Dėl įvairaus biologinio aktyvumo, propolio ištraukos, ekstraktai ir tinktūros įeina į hidroalkoholinių tirpalų, muilų, tepalų, kremų, gelių, losjonų, burnos skalavimo skysčių, kosmetikos ir kitų produktų sudėtį [45, 54].
1.2. Fenolinių rūgščių, aldehidų struktūros ir biologinio aktyvumo ryšys
Fenolinės rūgštys yra antriniai augalų metabolitai. Tai fenoliniai jungi-niai, kurių molekulė sudaryta iš vieno fenolio žiedo su prijungta viena ar daugiau hidroksilo arba metoksi grupių [159, 160]. Fenolinės rūgštys skirs-tomos į dvi grupes: (i) hidroksibenzo rūgšties darinius, kurių pirmtakas yra benzo rūgštis ir (ii) hidroksicinamono rūgšties darinius, kurių pirmtakas yra cinamono rūgštis [83, 160, 175]. Hidroksibenzo rūgšties dariniams priklauso
p-hidroksibenzo, protokatechino, vanilo, galo, siringo, salicilo, gentizo
rūgš-tys. Hidroksicinamono rūgšties dariniams priklauso kumaro, kavos, ferulo, sinapo, chlorogeno, rozmarino rūgštys (1.2 lentelė) [37, 116, 192]. Chloro-geno rūgštis yra esteris, sudarytas iš kavos ir kvino rūgšties [70], o rozma-rino rūgštis yra taip pat esteris, sudarytas iš kavos ir 3,4-dihidroksifenilpieno rūgšties [52].
Hidroksibenzo ir hidroksicinamono rūgštys yra silpnos organinės rūgštys, kurios skiriasi savo lipofiliškumu. Šių rūgščių lipofiliškumui turi įtakos pH (karboksilo grupės krūvis), fenolio žiedo pakaitai (hidroksilo ir metoksi grupės), o cinamono rūgšties dariniams taip pat dviguba jungtis –CH=CH– COOH grandinėje. Mažėjant pH, padidėja nedisocijuotų fenolinių rūgščių
17
kiekis, kurių aktyvumas, dėl didesnio lipofiliškumo, yra stipresnis negu di-socijuotų jų formų.
1.2 lentelė. Fenolinių rūgščių ir aldehidų cheminės struktūros
Fenolinės rūgštys Hidroksibenzo rūgšties dariniai
OH O R1 R2 R3 R4 R1=H, R2=H, R3=H, R4=H R1=H, R2=H, R3=OH, R4=H R1=H, R2=OH, R3=OH, R4=H R1=H, R2=CH3O, R3=OH, R4=H R1=H, R2=OH, R3=OH, R4=OH R1=H, R2=CH3O, R3=OH, R4=CH3O R1=OH, R2=H, R3=H, R4=H R1=OH, R2=H, R3=H, R4=OH Benzo rūgštis p-Hidroksibenzo rūgštis Protokatechino rūgštis Vanilo rūgštis Galo rūgštis Siringo rūgštis Salicilo rūgštis Gentizo rūgštis Hidroksicinamono rūgšties dariniai
R1 R2 R3 R4 OH O R1=H, R2=H, R3=H, R4=H R1=OH, R2=H, R3=H, R4=H R1=H, R2=OH, R3=H, R4=H R1=H, R2=H, R3=OH, R4=H R1=H, R2=OH, R3=OH, R4=H R1=H, R2=CH3O, R3=OH, R4=H R1=H, R2=CH3O, R3=OH, R4= CH3O O O O H O H O H OH OH OH O O O O H O H OH O OH OH Cinamono rūgštis o-Kumaro rūgštis m-Kumaro rūgštis p-Kumaro rūgštis Kavos rūgštis Ferulo rūgštis Sinapo rūgštis Chlorogeno rūgštis Rozmarino rūgštis Fenoliniai aldehidai O O H H O C H3 Vanilinas
Mažėjant hidroksilo (–OH) grupių skaičiui arba didėjant kartu metoksi (CH3O–) ir hidroksilo (–OH) grupių skaičiui fenolio žiede, didėja tiktai
hidroksibenzo rūgščių lipofiliškumas ir aktyvumas (ypač priešmikrobinis). Tačiau hidroksicinamono rūgštys, dėl dvigubos jungties –CH=CH–COOH grandinėje, yra lipofiliškesnės negu hidroksibenzo rūgštys [160]. Paskelbtais duomenimis lipidinėje terpėje kavos rūgštis ir chlorogeno rūgštis pasižymi didesniu antioksidaciniu aktyvumu negu ferulo ir p-kumaro rūgštys [180]. Fenolinių antioksidantų pasiskirstymo koeficientai n-oktanolio/fosfatinio
18
buferio tirpalo (pH 7,4) sistemoje galėtų paaiškinti jų giminingumą lipi-dams. Pagal mažėjančią pasiskirstymo koeficiento reikšmę fenolines rūgštis galima išdėstyti tokia seka: fenolinių rūgščių esteriai > p-kumaro rūgštis > ferulo rūgštis > sinapo rūgštis ≥ kavos rūgštis > galo rūgštis [93]. Marie-Elisabeth Cuvelier ir kt. [42] patvirtino „poliškumo paradokso“ hipotezę, pagal kurią poliniai (hidrofiliniai) antioksidantai yra aktyvesni nepolinėje terpėje, o nepoliniai (lipofiliniai) antioksidantai yra aktyvesni polinėje ter-pėje [93, 187]. Terpės pakeitimas gali turėti įtakos labiau polinių antioksi-dantų aktyvumui negu mažiau polinių antioksiantioksi-dantų [134]. Daugiafazėse sistemose antioksidaciniam aktyvumui gali turėti įtakos keletas kriterijų: (i) antioksidantų koncentracija, (ii) pasiskirstymas ir (iii) sąveika su kitais junginiais (pvz., pereinamaisiais metalais – Cu2+, Fe2+) [93].
Fenolinių rūgščių antioksidacinis aktyvumas yra siejamas su: (i) jų che-mine struktūra, ypač su aromatinio žiedo elektronų delokalizacija, (ii) gebė-jimu atiduoti vandenilio atomą ar elektroną ir (iii) biologinių molekulių ap-sauga nuo oksidacijos. Fenolinėms rūgštims reaguojant su laisvaisiais ra-dikalais, susidaro šių rūgščių radikalai, kurie yra stabilizuojami aromatinio žiedo rezonansinio efekto pagalba [42, 196]. Paskelbtais duomenimis hi-droksicinamono rūgštys, dėl –CH=CH–COOH grupės fenolio žiede, pasi-žymi stipresniu antioksidaciniu ir antiradikaliniu aktyvumu negu atitinka-mos hidroksibenzo rūgštys, turinčios karboksilo (–COOH) grupę ir tokius pat pakaitus fenolio žiede [28, 187]: o-kumaro rūgštis > salicilo rūgštis, p-kumaro rūgštis > p-hidroksibenzo rūgštis, kavos rūgštis > protokatechino rūgštis, ferulo rūgštis > vanilo rūgštis ir sinapo rūgštis > siringo rūgštis. Hidroksicinamono rūgščių dviguba jungtis (–CH=CH–) gali dalyvauti, sta-bilizuojant jų susidariusį radikalą [42, 87, 196].
Fenolinių rūgščių antioksidacinis, antiradikalinis ir vandenilio peroksidą sujungiantis aktyvumas taip pat priklauso nuo pakaitų, jų skaičiaus ir padė-ties fenolio žiede [42, 180]. Paskelbtais duomenimis fenolinės rūgštys, tu-rinčios fenolio žiede dvi hidroksilo (–OH) grupes, pasižymi stipresniu anti-oksidaciniu aktyvumu negu fenolinės rūgštys, turinčios fenolio žiede vieną hidroksilo (–OH) grupę: protokatechino rūgštis > p-hidroksibenzo rūgštis, gentizo rūgštis > salicilo rūgštis ir kavos rūgštis > p-kumaro rūgštis. Galo rūgštis, turinti fenolio žiede trys hidroksilo (–OH) grupes, pasižymi sti-presniu antioksidaciniu aktyvumu negu protokatechino rūgštis su dviem OH grupėm. Tačiau daugiau negu trys hidroksilo grupės fenolio žiede nepadi-dina antioksidacinio aktyvumo. Viena ar daugiau metoksi (CH3O–) grupių
fenolio žiedo meta padėtyse padidina fenolinių rūgščių antioksidacinį akty-vumą: p-hidroksibenzo rūgštis (0 CH3O) < vanilo rūgštis (1 CH3O) < siringo
rūgštis (2 CH3O) ir p-kumaro rūgštis (0 CH3O) < ferulo rūgštis (1 CH3O) <
hi-19
droksilo (–OH) grupes, pasižymi stipresniu antioksidaciniu aktyvumu negu fenolinės rūgštys su viena metoksi (CH3O–) grupe: protokatechino rūgštis >
vanilo rūgštis ir kavos rūgštis > ferulo rūgštis [42, 87, 196]. Paskelbtais duo-menimis chlorogeno rūgšties silpnesnis antioksidacinis aktyvumas, lyginant su kavos rūgštimi, yra siejamas su struktūroje esančia kvino rūgštimi. Roz-marino rūgštis, dėl dviejų susijungusių fenolinių rūgščių (kavos ir 3,4-di-hidroksifenilpieno rūgšties) derinio, pasižymi stipresniu antioksidaciniu ak-tyvumu negu kavos rūgštis [42, 134].
Apibendrinant paskelbtus duomenis pagal struktūros–aktyvumo ryšį, hidroksibenzo rūgščių antioksidacinis aktyvumas mažėja tokia seka: galo rūgštis (3 OH) > gentizo rūgštis (2 OH) > protokatechino rūgštis (2 OH) > siringo rūgštis (1 OH, 2 CH3O) > vanilo rūgštis (1 OH, 1 CH3O) >
p-hidrok-sibenzo rūgštis (1 OH) = salicilo rūgštis (1 OH). Hidroksicinamono rūgščių antioksidacinis aktyvumas mažėja tokia seka: rozmarino rūgštis (4 OH) > kavos rūgštis (2 OH) > chlorogeno rūgštis (2 OH) > sinapo rūgštis (1 OH, 2 CH3O) > ferulo rūgštis (1 OH, 1 CH3O) > p-kumaro rūgštis (1 OH). Abiejų
grupių fenolinių rūgščių mažėjantis antioksidacinis aktyvumas gali būti išdėstytas tokia seka: rozmarino rūgštis > kavos rūgštis ≥ galo rūgštis > gentizo rūgštis > protokatechino rūgštis > chlorogeno rūgštis > sinapo rūgš-tis > ferulo rūgšrūgš-tis > siringo rūgšrūgš-tis > kumaro rūgšrūgš-tis > vanilo rūgšrūgš-tis > p-hidroksibenzo rūgštis = salicilo rūgštis [42, 196].
Rentian Feng ir kt. [55] nustatė, kad chlorogeno rūgštis gali slopinti UV-B tipo spindulių stimuliuojamus mitogeno aktyvinamos proteinkinazės (MAPK), aktyvatoriaus baltymo-1 ir branduolių faktoriaus kapa B signalo perdavimo kelius. Luana Dalbem Rocha ir kt. [159] nustatė, kad chlorogeno rūgštis, kavos rūgštis ir jos fenetilo esteris pasižymi matricos metaloprotei-nazių (MMP-2, MMP-9) ir branduolių faktoriaus kapa B aktyvumą slopi-nančiu poveikiu vėžinėse ląstelėse ir priešuždegiminiu aktyvumu. Paskelb-tais duomenimis ferulo ir chlorogeno rūgštis gali slopinti ciklooksigenazės-2, kuri susijusi su prostaglandino E2 sinteze, ir indukuojamosios azoto
oksi-do sintazės, kuri susijusi su azoto oksioksi-do gamyba, signalo perdavimo kelius [159]. Vanilo rūgštis gali slopinti tirozinazės ir dihidroksifenilalanino (DOPA) oksidazės aktyvumą, tokiu būdu slopindama α-melanocitus stimu-liuojančio hormono sukeltą melanino gamybą ląstelėse [36]. Žmogaus epi-dermio melanocituose tirozinazės aktyvumą ir melanino gamybą taip pat slopina p-kumaro rūgštis, kuri pasižymi silpnesniu antimelanogeniniu po-veikiu negu metilo p-kumaratas [170, 177]. Paskelbtais duomenimis vanilo, cinamono, kumaro, ferulo ir rozmarino rūgštys gali apsaugoti ląsteles nuo laisvųjų radikalų sukeltos baltymų oksidacijos ir lipidų peroksidacijos [52, 207].
20
Paskelbtais duomenimis fenolinės rūgštys slopina gram-teigiamų (Gr+ –
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneu-moniae, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes),
gram-neigiamų bakterijų (Gr- – Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
En-terobacter aerogenes, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Shi-gella dysenteriae, Yersinia enterocolitica) aktyvumą ar augimą [70, 108,
120, 127, 206]. Hidroksicinamono rūgštys pasižymi Helicobacter pylori aktyvumą slopinančiu poveikiu [159]. Hidroksibenzo rūgščių priešmikro-binis aktyvumas yra silpnesnis arba panašus, lyginant su tiek pat hidroksilo (–OH) grupių turinčiom hidroksicinamono rūgštim. Be to, hidroksibenzo rūgščių priešmikrobinis aktyvumas mažėja, didėjant hidroksilo (–OH) gru-pių skaičiui fenolio žiede. Tuo tarpu metoksi (CH3O–) grupės fenolio žiede
padidina hidroksibenzo rūgščių priešmikrobinį aktyvumą. Hidroksilo (–OH) ir metoksi (CH3O–) grupės fenolio žiede nedaro didelės įtakos
hidroksi-cinamono rūgščių priešmikrobiniam aktyvumui [160]. Paskelbtais duome-nimis šios rūgštys, dėl –CH=CH–COOH grandinės, yra mažiau polinės negu hidroksibenzo rūgštys ir todėl gali lengviau praeiti pro ląstelių membraną. Hidroksicinamono rūgščių (p-kumaro, kavos, ferulo rūgšties) bakterijų augi-mą slopinantis poveikis yra stipresnis negu hidroksibenzo rūgščių (galo, vanilo, siringo, p-hidroksibenzo, protokatechino rūgšties) [29]. Paskelbtais duomenimis hidroksicinamono rūgštys pasižymi vidutiniu ar stipriu bak-terijų membranas pažeidžiančiu aktyvumu [70]. Fenolinių rūgščių prieš-mikrobinis aktyvumas didėja, mažėjant pH. Tačiau jų priešprieš-mikrobinis akty-vumas yra silpnesnis, lyginant su jų metilo ir butilo esteriais. Didėjant alkilo grandinės ilgiui, šių esterių priešmikrobinis aktyvumas didėja [160]. Pas-kelbtais duomenimis bakterijų membranos paviršiaus hidrofobiškumas (Pseudomonas aeruginosa > Enterobacter aerogenes > Escherichia coli) turi įtakos atsparumui hidroksicinamono rūgščių sukeliamiems pažeidimams [70]. Fenolinių rūgščių mažėjantis priešbakterinis aktyvumas gali būti išdės-tytas tokia seka: cinamono rūgštis > p-kumaro rūgštis > kavos rūgštis > chlorogeno rūgštis > ferulo rūgštis > vanilo rūgštis > vanilinas (aldehidas) [70, 127].
Paskelbtais duomenimis fenolinės rūgštys pasižymi apsauginiu poveikiu nuo UV spinduliuotės, oksidacinio streso ir patogeninių mikroorganizmų su-keliamo neigiamo poveikio [159]. Jos pasižymi ne tik antioksidaciniu [42, 175, 196], antiradikaliniu [87, 196], priešbakteriniu [70, 160] aktyvumu, bet taip pat priešgrybeliniu [53], priešvirusiniu [52, 129], priešvėžiniu [159, 163], priešuždegiminiu [52, 59], antimelanogeniniu aktyvumu [36].
Vanilinas yra vienas iš fenolinių aldehidų, kuris priklauso benzaldehido dariniams (1.2 lentelė) [201]. Jis pasižymi antioksidaciniu, priešmikrobiniu, antimutageniniu, antiklastogeniniu, priešnavikiniu aktyvumu [104, 127,
21
188]. Akihiro Tai [188], Tzung-Han Chou ir kt. [36] nustatė, kad vanilino ABTS•+ radikalą sujungiantis aktyvumas yra silpnesnis negu fenolinių rūgš-čių: vanilinas < ferulo rūgštis < vanilo rūgštis. Etanolyje jis pasižymi labai silpnu arba iš viso nerodo DPPH• radikalą sujungiančio aktyvumo. A. Tai ir kt. [188] naudodami ORAC metodą nustatė, kad vanilino antioksidacinis aktyvumas yra stipresnis negu fenolinių rūgščių: vanilinas > vanilo rūgštis ≥ ferulo rūgštis. Jis taip pat slopina lipidų peroksidaciją ir baltymų oksidaciją, sujungdamas reaktyvias deguonies formas [85]. Ioannis Mourtzinos ir kt. [127] nustatė, kad vanilino priešmikrobinis aktyvumas mažėja tokia seka: Gr- bakterijos (Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Salmonella
ente-ritidis, Salmonella typhimurium, Yersinia enterocolitica) > Gr+ bakterijos
(Bacillus cereus, Listeria monocytogenes) > Gr+ bakterijos (Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis) ir yra silpnesnis negu vanilo rūgšties.
Remiantis struktūros–aktyvumo ryšiu stipriu antioksidaciniu aktyvumu pasižymi rozmarino, kavos, galo, gentizo ir protokatechino rūgštys. Chloro-geno, sinapo, ferulo, o-, m-, p-kumaro, siringo, vanilo, p-hidroksibenzo ir salicilo rūgštys pasižymi vidutiniu ar silpnu antioksidaciniu aktyvumu. Hi-droksicinamono rūgštys (p-kumaro, kavos, ferulo rūgštis) pasižymi stipres-niu priešbakteristipres-niu aktyvumu negu hidroksibenzo rūgštys. Vanilino anti-oksidacinis ir priešbakterinis aktyvumas yra silpnesnis už fenolinių rūgščių. Žinant fenolinių rūgščių ir aldehidų biologinį aktyvumą, galima kurti kryp-tingo poveikio dermatologinius produktus su šiais propolio fenoliniais jun-giniais. Apjungus šiuolaikinius biofarmacinius tyrimus in vitro ir ex vivo su analizės metodais (pvz., efektyviąja skysčių chromatografija) gaunami pa-tikimi rezultatai, kurie leidžia modeliuoti, optimizuoti propolio produktus, užtikrinant jų kokybę.
1.3. Žmogaus odos struktūra ir išorinių faktorių sukelti odos pažeidimai
Žmogaus oda yra sudaryta iš kelių anatomiškai skirtingų sluoksnių: ragi-nio sluoksragi-nio (stratum corneum), gyvojo epidermio, dermos ir hipodermos (poodinio audinio) [82]. Raginis sluoksnis yra apie 10–20 µm storio pavir-šinis odos sluoksnis [168], kuris sudaro pirminį barjerą junginių skvarbai, apsaugo nuo vandens netekimo (dehidratacijos) ir mikrobinės infekcijos [60]. Šis odos sluoksnis yra laikomas lipofiliniu dėl mažo vandens kiekio [23, 168]. Jo struktūra yra apibūdinama „plytų ir cemento“ modeliu, kuri sudaryta iš maždaug 10–15 plokščių korneocitų sluoksnių [60, 107]. Šios ląstelės yra apsuptos tarpląstelinių lipidų ir tarpusavyje jungiasi korneodes-mosomomis, kurios susideda iš tam tikrų baltymų [157]. Korneocitai yra užpildyti daugiausia keratino filamentais [21], o jų storas apvalkalas yra sudarytas iš baltymų: lorikrino, involukrino ir filagrino [67, 107]. Filagrinas
22
yra susijęs su natūraliu drėkinamuoju faktoriumi, kuris yra sudarytas iš ami-norūgščių [105, 156]. Keratinas yra pagrindinis struktūrinis raginio sluoks-nio baltymas, kurį gamina epidermio keratinocitai [203]. Pagrindiniai tarp-ląstelinės lipidinės matricos komponentai yra ceramidai, cholesterolis ir jo esteriai ar sulfatas, ilgos grandinės riebalų rūgštys (daugiausia sočiosios) [4, 60, 66].
Po raginiu sluoksniu yra 50–100 µm storio gyvasis epidermis [168], kuris skirstomas į kelis sluoksnius: grūdėtąjį, dygliuotąjį ir pamatinį. Be to, gyva-sis epidermis įsiterpia į dermą sudarydamas su ja jungtį [14, 203]. Dėl di-desnio vandens kiekio, gyvasis epidermis yra mažiau lipofilinis negu raginis odos sluoksnis [23, 168]. Gyvajame epidermyje vyrauja keratinocitai, kurie turi dvisluoksnę fosfolipidų membraną. Šios ląstelės grūdėtajame sluoksnyje yra paverčiamos į raginio sluoksnio korneocitus [203]. Gyvasis epidermis yra atsakingas už raginio sluoksnio susidarymą, vykstant odos pleiskano-jimui (deskvamacijai) ir naujų ląstelių susidarymui epidermio pamatiniame sluoksnyje [122, 157]. Gyvojo epidermio pamatiniame sluoksnyje yra taip pat melanocitų, kurie gamina pigmentą melaniną ir Merkelio ląstelių, kurios yra susijusios su jutimo perdavimu per odos nervus. Dygliuotajame sluoks-nyje yra Langerhanso ląstelių, kurios dalyvauja imunologinėse ir alerginėse reakcijose [14, 40, 130].
Derma yra 1–2 mm (gali būti iki 4 mm) storio odos sluoksnis [5, 82], ku-ris sudarytas iš jungiamojo audinio ir į jį įsiterpusių plaukų folikulų, riebalų ir prakaito liaukų, kraujagyslių, limfagyslių ir nervų [14]. Šiame sluoksnyje vyraujantis ląstelių tipas yra fibroblastai. Taip pat aptinkama imuninės sis-temos ląstelių: kamieninių ląstelių ir makrofagų [40]. Derma yra hidrofilinis sluoksnis [23], kuris yra sudarytas iš kolageno (vyrauja I ir III tipas) ir elas-tinių (elastino) skaidulų. Pagrindiniai tarpląstelinės matricos komponentai yra glikoproteinai, proteoglikanai, glikozaminoglikanai, vanduo ir hialurono rūgštis [40, 131]. Hipoderma yra odos riebalinis sluoksnis, kuris yra suda-rytas iš adipocitų [23].
Žmogaus oda yra heterogeninė struktūra, kuri pasižymi skirtingu laidumu hidrofilinėms ir lipofilinėms medžiagoms. Supratimas apie odos struktūrą, skirtingas atskirų odos sluoksnių (raginio sluoksnio, gyvojo epidermio, der-mos) barjerines savybes [6] ir apie veikliųjų medžiagų fizikinių-cheminių savybių (logP reikšmės, molekulinės masės, lydymosi temperatūros, joni-zacijos) įtaką jų skvarbai į odą [184], yra svarbus dermatologinių produktų modeliavimui ir optimizavimui.
Oda yra veikiama įvairių išorinių veiksnių: ultravioletinės (UV) spindu-liuotės, jonizuojančios radiacijos, oro užterštumo, rūkymo, įvairių cheminių medžiagų, mikroorganizmų. Saulės UV spinduliuotė yra vienas iš pagrin-dinių žmogaus odą veikiančių aplinkos veiksnių [19, 48, 150]. UV spindulių
23
skverbimosi į žmogaus odą gylis ir sąveika su skirtingomis ląstelėmis pri-klauso nuo jų bangos ilgio. UV-C tipo spinduliai (200–280 nm) yra visiškai sulaikomi atmosferos ozono sluoksnio [130] ir negali sukelti odos pažei-dimu, nors pasižymi stipriu mutageniniu poveikiu [95]. UV-B tipo (280–320 nm) ir UV-A tipo (320–400 nm) spinduliai sudaro atitinkamai 5–10 proc. ir 90–95 proc. visos prasiskverbusios UV spinduliuotės ir pasižymi žalingu poveikiu žmogaus odai [43, 95]. UV-B tipo spinduliai įsiskverbia į viršu-tinius odos sluoksnius t.y. epidermį ir paveikia jo keratinocitus. UV-A tipo spinduliai skverbiasi gyliau (iki 1000 µm) [95], paveikdami ir epidermio keratinocitus, ir dermos fibroblastus [18]. UV-B tipo spindulių poveikis žmogaus odai pasireiškia eritema (odos paraudimu) ar nudegimu kartu su uždegiminiu procesu ir vitamino D sintezės skatinimu, o UV-A tipo spindu-lių poveikis yra labiau susijęs su odos senėjimu [25, 40]. Ilgalaikis ir inten-syvus UV (A ir B tipo) spinduliuotės poveikis gali taip pat skatinti vėžinių ląstelių susidarymą ir augimą [95].
UV-B tipo saulės spinduliai tiesiogiai sąveikauja su DNR ir sukelia struktūrinius jos pažeidimus. UV-A tipo spinduliai daugiausia veikia ne-tiesiogiai t.y. per reaktyvių deguonies formų (ROS) susidarymą [18, 35]. Galima išskirti kelis UV spinduliuotės sukeltų reakcijų mechanizmus: (i) tiesioginis fotonų poveikis DNR struktūrai; (ii) reaktyvių laisvųjų radikalų susidarymas; (iii) prouždegiminių citokinų (navikų nekrozės faktoriaus-α, interleukinų) atpalaidavimas ir uždegiminių mediatorių (prostaglandinų, leukotrienų, histamino) susidarymas [72, 147]. Tiesioginis UV spindulių (ypač UV-B tipo) poveikis odos ląstelių branduolių DNR gali sukelti šių molekulių įvairius struktūrinius pažeidimus, chromosomų pakitimus, mu-tacijas ar ląstelių žūtį. UV spinduliuotė taip pat gali pažeisti ir odos mito-chondrinę DNR (mtDNR) [150]. Dėl tam tikrų mitochondrijose atliekamų oksidacinių reakcijų metu įvykstančių klaidų, gali susidaryti reaktyvių de-guonies formų, kurios tiesiogiai pažeidžia mitochondrinę DNR [35, 79]. Mitochondrinės DNR mutacijų dažnumas yra maždaug 50 kartų didesnis negu branduolio DNR, kadangi šiose organelėse yra mažiau veiksmingų DNR atitaisymo sistemų [18, 111]. DNR struktūrinių pažeidimų taisymas po UV spinduliuotės poveikio yra susijęs su baltymo p53 aktyvinimu ir regulia-vimu. Šis baltymas taip pat dalyvauja, slopinant ląstelių ciklą ir sukeliant apoptozę (ląstelių žūtį). Todėl baltymo p53 geno inaktyvinimas ar mutacija yra siejama su UV sukelta odos kancerogeneze [16, 97].
Laisvieji radikalai yra reaktyvūs cheminiai junginiai, turintys vieną ar daugiau nesuporuotų elektronų. Jiems priklauso reaktyvios deguonies (ROS) ir azoto (RNS) formos. Reaktyvios deguonies formos skirstomos į: (i) radikalus – superoksido anijono radikalas (O2−•), hidroksilo radikalas
24
singletinis deguonis (1O2). Reaktyvioms azoto formoms priklauso azoto
oksido radikalas (NO•), azoto dioksido radikalas (NO2•) ir peroksinitrito
anijonas (ONOO−) [103, 148, 150]. Reaktyvios deguonies formos yra vyrau-jantys laisvieji radikalai ląstelėse, kurie sąveikaudami su DNR, baltymais, lipidinėmis membranomis ir daugeliu kitų molekulių, sukelia jų struktūros pažeidimus [35]. UV-B tipo spinduliai skatina superoksido anijono radikalo (O2−•) gamybą žmogaus odoje per NADPH oksidazės aktyvinimą ir
mito-chondrijose vykstančias reakcijas. UV-A tipo spinduliai sukelia singletinio deguonies (1O2) gamybą per foto-jautrias reakcijas ir taip pat skatina
su-peroksido anijono radikalo (O2 −•
) gamybą per NADPH oksidazės aktyvi-nimą odoje [35, 118]. Peroksinitrito anijonas (ONOO−) susidaro, reaguojant superoksido anijono radikalui (O2−•) su azoto oksido radikalu (NO•), o
pas-tarasis susidaro iš arginino, veikiant azoto oksido (NO) sintazei [95, 103]. UV spinduliuotė žmogaus odos ląstelėse skatina reaktyvių deguonies formų susidarymą, kurios aktyvina tam tikrus ląstelinius signalo perdavimo kelius [99]. Ji taip pat stimuliuoja keratinocitų ir fibroblastų paviršiaus re-ceptorius: (i) augimo faktoriaus receptorius, kuriems priklauso epidermio augimo faktoriaus, keratinocito augimo faktoriaus, fibroblasto augimo fak-toriaus, trombocito gaminamo augimo faktoriaus receptoriai, insulino recep-toriai; (ii) citokinų receptorius, kuriems priklauso navikų nekrozės fak-toriaus-α, IL-1 receptoriai [46, 79]. Šiais receptoriais odos ląstelėse yra aktyvinamas mitogeno aktyvinamos proteinkinazės (MAPK) signalo per-davimo kelias, kuris reguliuoja tarpląstelinio signalo reguliuojamų kinazių (ERK1/2), c-jun N-galo kinazės (JNK) ir baltymo p38 kinazės aktyvumą [130]. Šios kinazės yra susijusios tarpusavyje, tačiau atlieka skirtingas funkcijas. Tarpląstelinio signalo reguliuojama kinazė yra daugiausia atsa-kinga už ląstelinio atsako į augimo faktorius aktyvinimą. C-jun N-galo ir p38 kinazės (p38 MAPK) yra daugiausia atsakingos už ląstelinį atsaką į citokinus ir fizinį stresą [95]. Toliau šios kinazės (ERK, JNK ir p38 MAPK) suaktyvina transkripcijos faktorius: aktyvatoriaus baltymą-1 ir branduolių faktorių kapa B (NF-κB). Aktyvatorius baltymas-1 skatina matricos metalo-proteinazių (MMP-1, MMP-3, MMP-9) genų ekspresiją [46, 99]. Šios proteinazės suardo odos matricos baltymus (I, II, III, IV, V tipo kolageną) t.y. pasižymi proteolitiniu aktyvumu [18]. Branduolių faktorius kapa B skatina uždegiminių citokinų (TNF-α, interleukinų) gamybą [79]. Navikų nekrozės faktorius-α yra svarbus UV spinduliuotės sukeltam uždegiminiam ir imunologiniam procesui. Šis faktorius taip pat aktyvina c-jun N-galo kinazę, p38 kinazę ir branduolių faktorių kapa B [130, 199]. Aktyvatorius baltymas-1 ir reaktyvios deguonies formos sumažina transformuojančio augimo faktoriaus-β, kuris stimuliuoja prokolageno genų ekspresiją, akty-vumą [79, 99]. Kolageno ir elastinės skaidulos, dėl padidėjusio matricos
25
metaloproteinazių kiekio, yra suardomos dermos tarpląstelinėje matricoje [147], o dėl sumažėjusio transformuojančio augimo faktoriaus-β kiekio, su-mažėja kolageno gamyba (susidaro odoje gilios raukšlės) ir padidėja elas-tino kiekis (pasireiškia elastozė) [35, 94]. Baltymo p38 MAP ir c-jun N-galo kinazės kelias taip pat turi įtakos, reguliuojant prouždegiminių citokinų ga-mybą ir ciklooksigenazės-2 aktyvumą [130, 198].
UV spinduliuotė skatina įvairių uždegimo mediatorių: citokinų (TNF-α, interleukinų) [38, 147], chemokinų, prostaglandinų, histamino ir azoto oksi-do, gamybą ir atpalaidavimą odos ląstelėse [43, 149]. Navikų nekrozės fak-torius-α ir IL-1 skatina kitų prouždegiminių citokinų gamybą [147], sti-muliuoja matricos metaloproteinazių genų ekspresiją ir didina epidermio hiperplaziją [99]. Navikų nekrozės faktorius-α, transformuojantis augimo faktorius-β, IL-1α, IL-6 ir interferonas-β turi įtakos melanino gamybai, slopindami melanocitų proliferaciją ir tirozinazės aktyvumą. Interleukinas-1 ir transformuojantis augimo faktorius-β skatina elastino genų ekspresiją [94]. Oksidacinio streso metu odoje be citokinų yra stimuliuojama prosta-glandinų ir leukotrienų gamyba, kurie dalyvauja odos uždegiminiame proce-se [135]. UV spinduliuotė taip pat skatina uždegiminių ląstelių: neutrofilų, monocitų, makrofagų infiltraciją ir aktyvinimą odoje. Fagocitinės ląstelės (limfocitai ir makrofagai) pačios gali gaminti reaktyvias deguonies formas [99, 147], kurios dalyvauja uždegiminiame procese ir alerginėse reakcijose [95]. Neutrofilai ir monocitai patys gali atpalaiduoti prouždegiminius citokinus (TNF-α, IL-1), kurie didina kapiliarų pralaidumą uždegiminėms ląstelėms [147].
Melanino gamyba odoje yra vienas iš būdų, kuris saugo žmogaus odą nuo žalingų saulės UV spindulių poveikio [18]. Šis pigmentas susideda iš rudos/juodos spalvos eumelanino ir geltonos/raudonos spalvos feomelanino, turinčio sudėtyje sieros. Abu šie melanino biopolimerai susidaro iš dopakvi-nono, kuris gaunamas iš aminorūgšties tirozino oksidacijos metu, dalyvau-jant fermentui tirozinazei [40, 77]. Eumelaninas veiksmingiau sumažina UV spinduliuotės skverbimąsį pro epidermį į gilesnius odos sluoksnius negu feomelaninas [43]. Melaniną melanocitai gamina ir kaupia melanosomose, kurios jį gabena į keratinocitus. Tokiu būdu melanosomos suformuoja „me-lanino ekraną“, kuris apsaugo keratinocitų branduolių DNR (mažinant odos pažeidimus) ir dermos kolageną ir elastiną (mažinant odos senėjimą) nuo žalingos UV spinduliuotės poveikio [25, 39]. Didėjanti odos pigmentacija, kaip atsakas į UV spinduliuotę, yra susijusi su melanino gamybos skatinimu (melanogeneze) [40]. Pagrindinis melanocitų paviršiaus receptorius yra melanokortino-1 receptorius, kuris reguliuoja šių ląstelių funkciją ir odos pigmentaciją per įvairius transkripcijos faktorius melanocituose. Jis skatina pigmento melanino sintezę ir eumelanino kaupimąsi epidermyje. Šio
recep-26
toriaus agonistai yra α-melanocitus stimuliuojantis hormonas ir adreno-kortikotropinis hormonas, o antagonistas yra agouti signalinis baltymas [25, 43]. Odos pigmentaciją taip pat reguliuoja įvairūs faktoriai, gaminami kera-tinocitų, fibroblastų, endotelio ir uždegiminių ląstelių, nervų sistemos ir hor-monai, patenkantys per kraujotaką [80]. Pačios reaktyvios deguonies formos taip pat gali stimuliuoti papildomai melanino gamybą (melanogenezę) [40, 118]. Melaninas pasižymi net tik apsauginiu poveikiu, bet taip pat gali veikti toksiškai, ypač po ilgalaikės UV spinduliuotės poveikio žmogaus odai [25, 200]. Jo biopolimeras feomelaninas yra fotosensibilizuojanti medžiaga, kuri po UV spinduliuotės gali sukelti reaktyvių deguonies formų (O2
−•
, H2O2)
susidarymą melanocituose ir kitose ląstelėse. Tokiu būdu gali būti skatina-mas DNR pažeidiskatina-mas, mutacijos ir melanomų vystyskatina-masis [25, 71, 139].
Žmogaus oda taip pat turi vidinę antioksidantų sistemą, kuri yra sudaryta iš fermentinių ir nefermentinių komponentų, saugančių odos ląsteles nuo susidariusių reaktyvių deguonies formų [148]. Pagrindiniai nefermentiniai antioksidantai yra gliutationas, askorbo rūgštis, α-tokoferolis, šlapimo rūgš-tis ir ubikvinolis. Fermentiniams antioksidantams epidermyje priklauso ka-talazė, gliutationo peroksidazė, gliutationo reduktazė ir superoksido dis-mutazė [189]. Epidermis, ypač raginis sluoksnis, turi didesnę koncentraciją tiek hidrofilinių, tiek lipofilinių nefermentinių antioksidantų negu derma [35, 150]. Vienas iš svarbiausių ląstelinių antioksidantų yra gliutationas, kuris neutralizuoja laisvuosius radikalus. Jis gali pakeisti oksiduotas askorbo rūgšties ir α-tokoferolio formas į redukuotas, kurios taip pat neutralizuoja reaktyvias deguonies formas. Pačio gliutationo susidariusi oksiduota forma yra paverčiama į redukuotą, veikiant fermentui gliutationo reduktazei [35, 43]. Superoksido dismutazė yra fermentinis antioksidantas, kuris paverčia superoksido anijonus į vandenilio peroksidą ir deguonį. Kiti fermentiniai antioksidantai: gliutationo peroksidazė ir katalazė paverčia vandenilio pe-roksidą į vandenį ir deguonį [35, 118].
Padidėjęs reaktyvių deguonies formų susidarymas odoje ir nepakankamas vidinės apsauginės sistemos pajėgumas neutralizuoti šias reaktyvias formas, sukelia būklę vadinama oksidaciniu stresu [150, 173]. Oksidacinis stresas yra siejamas su odos senėjimu [95], odos vėžiu, kurių pagrindinė priežastis yra UV spinduliuotės skatinamas reaktyvių deguonies formų susidarymas [132]. Stiprus UV spinduliuotės poveikis odai gali sukelti eritemą (paraudi-mą), nudegimą, uždegimą, o ilgalaikė UV spinduliuotė sukelia odos senėji-mą, vėžį ir slopina imuninės sistemos komponentus odoje [25, 149]. UV sukeltas odos senėjimas yra procesas, kuris apima biocheminius, histolo-ginius (raginio sluoksnio hiperkeratozė, epidermio storio ir dermos struktūrų pakitimai) ir klinikinius (sausumas, raukšlių susidarymas, nenormali ar
27
hiperpigmentacija) odos pokyčius [18, 20]. Šie pokyčiai gali turėti įtakos odos barjerinei funkcijai [21].
Žmogaus odos struktūriniai ir funkciniai sutrikimai gali pasireikšti kaip kosmetinės būklės arba navikinės, genetinės ar uždegiminės odos ligos. Įvairūs odos pakitimai, keičiantys odos išvaizdą matomose kūno vietose, turi įtakos žmogaus psichologinei savijautai ir gyvenimo kokybei [73, 75, 204]. Supratimas apie išorinių faktorių sukeltus odos pokyčius ir vykstan-čius mechanizmus yra svarbus, siekiant užkirsti kelią jų vystymuisi ir odos sutrikimų atsiradimui. Antioksidantų panaudojimas yra vienas iš būdų, kuris padėtų apsaugoti žmogaus odą nuo reaktyvių deguonies formų ir kitų lais-vųjų radikalų [35]. Literatūros duomenimis askorbo rūgštis, tokoferoliai, karotinoidai, kofermentas Q10, epigalokatechino galatas, resveratrolis yra naudojami, užkertant kelią UV sukeltam odos senėjimui vystytis ir neutra-lizuojant susidariusius laisvuosius radikalus [118]. Per pastarąjį dešimtmetį didelis dėmesys buvo skiriamas natūraliems fenoliniams antioksidantams: epikatechinams, resveratroliui, silimarinui, kvino ir karnozo rūgštims, feno-linėms rūgštims (kavos, ferulo, chlorogeno, rozmarino rūgštims), flavonoi-dams (kvercetinui, apigeninui, genisteinui) ir jų pritaikymui, užkertant kelią UV sukeltų odos pažeidimų vystymuisi [138, 186].
1.4. Puskiečių formų modeliavimas, optimizavimas ir biofarmacinis vertinimas
Odos barjerines savybes lemia plonas viršutinis epidermio sluoksnis – raginis sluoksnis, kuris riboja medžiagų patekimą į jį ir gilesnius odos sluoksnius. Odos barjero įveikimas yra iššūkis, tiekiant vaistus pro odą ir siekiant vietinio arba sisteminio poveikio. Vietinis poveikis odoje yra pasie-kiamas, naudojant puskietes formas (pvz., tepalus, kremus, gelius), kuriose ištirpinta ar disperguota vaistinė medžiaga. Sisteminiam poveikiui pasiekti gali būti naudojami pleistrai [32]. Transderminis vaistų tiekimas dažniausiai yra pasyvus procesas. Vaistinių medžiagų skvarbai į odą turi įtakos keturi faktoriai: (i) veikliosios medžiagos koncentracija nešiklyje, (ii) pasiskirsty-mo koeficientas, (iii) difuzijos koeficientas ir (iv) difuzijos kelio ilgis. Veik-liosios medžiagos koncentracija nešiklyje ir pasiskirstymo koeficientas yra priklausomi nuo nešiklio [86].
Nešiklis yra svarbus net ir stipraus poveikio vaistinių medžiagų terapinio veiksmingumo pasireiškimui, kadangi nešiklio sudėtis apsprendžia absorb-cijos proceso greitį ir apimtį. Siekiant maksimalaus biologinio pasisavinimo, racionaliam dermatologinių nešiklių modeliavime yra esminiai du veiksniai: (i) ištirpusios vaistinės medžiagos koncentracija nešiklyje ir (ii) veiksmingas vaistinės medžiagos perėjimas iš nešiklio į raginį sluoksnį [6].
