FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
JUSTINA VAITEKĖNAITĖ
HIDROGELIŲ SU POLOKSAMERU 407 IR VANDENINE
PROPOLIO IŠTRAUKA MODELIAVIMAS, OPTIMIZAVIMAS IR
BIOFARMACINIS VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovas Lekt. dr. Modestas Žilius
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
HIDROGELIŲ SU POLOKSAMERU 407 IR VANDENINE
PROPOLIO IŠTRAUKA MODELIAVIMAS, OPTIMIZAVIMAS IR
BIOFARMACINIS VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovas Darbą atliko
Lekt. dr. Modestas Žilius Magistrantė
Data Justina Vaitekėnaitė
Data Recenzentas
Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 PADĖKA ... 8 1. SANTRUMPOS ... 9 ĮVADAS ... 10DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
2.1. Gelių charakteristika ... 12
2.2. Hidrogeliai ... 14
2.3. Poloksamerinių hidrogelių charakteristika ... 18
2.4. Gelių su propoliu pritaikymas medicinoje ... 20
3. TYRIMO METODIKA ... 22
3.1. Tyrimo objektas, medžiagos ir įranga ... 22
3.1.1.Tyrimo objektas ... 22
3.1.2. Naudotos medžiagos ... 22
3.1.3. Naudota įranga ... 22
3.2. Tyrimų metodai ... 23
3.2.1. Vandeninės propolio ištraukos gamyba ... 23
3.2.2. Vandeninės propolio ištraukos analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu . 23 3.2.3. Eksperimentinių propolio hidrogelių gamyba ... 24
3.2.4. Eksperimentinių propolio hidrogelių fizikinių ir cheminių savybių nustatymas ... 24
3.2.5. Akceptorinės terpės parinkimas in vitro atpalaidavimo tyrimams ... 25
3.2.6. Fenolinių rūgščių ir vanilino atpalaidavimo in vitro tyrimas ... 25
3.2.7. Statistinis duomenų vertinimas ... 25
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27
4.2. Eksperimentinių propolio hidrogelių fizikinių ir cheminių savybių vertinimas ... 28
4.3. Akceptorinės terpės parinkimas in vitro atpalaidavimo tyrimams ... 32
4.4. Fenolinių rūgščių ir vanilino atpalaidavimo in vitro iš eksperimentinių propolio hidrogelių vertinimas ... 33
4.5. Eksperimentinių propolio hidrogelių sudėties optimizavimas ... 38
4.6. Tyrimų rezultatų apibendrinimas pagal optimalios sudėties hidrogelio fizikinius, cheminius ir biofarmacinius parametrus ... 45
5. IŠVADOS ... 48
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 49
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 50
PUBLIKACIJOS DARBO TEMA ... 56
SANTRAUKA
J. Vaitekėnaitės magistro baigiamasis darbas: „Hidrogelių su poloksameru 407 ir vandenine propolio ištrauka modeliavimas, optimizavimas ir biofarmacinis vertinimas“ / mokslinis vadovas lekt. dr. M. Žilius; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Klinikinės farmacijos katedra. – Kaunas.
Darbo tikslas: Sumodeliuoti hidrogelius su poloksameru 407 ir vandenine propolio ištrauka, optimizuoti eksperimentinius hidrogelius ir biofarmaciniais tyrimais įvertinti jų kokybę.
Darbo uždaviniai: Pagaminti vandeninę propolio ištrauką ir įvertinti jos kokybinę ir kiekybinę sudėtį; įvertinti eksperimentinių hidrogelių fizikines ir chemines savybes (pH, klampą, reologinius rodiklius); ištirti ir įvertinti fenolinių junginių atpalaidavimą iš eksperimentinių propolio hidrogelių; optimizuoti eksperimentinio propolio hidrogelio sudėtį pagal fizikines, chemines savybes ir biofarmacines charakteristikas.
Metodai: Propolio fenolinių junginių kokybiniam ir kiekybiniam tyrimui naudotas validuotas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Eksperimentinių hidrogelių pH buvo nustatomos pH– metru, o klampa ir reologiniai rodikliai matuoti naudojant reometrą. Atpalaidavimo in vitro tyrimai atlikti naudojant modifikuotas Franz tipo difuzines celes.
Rezultatai: Eksperimentinių propolio hidrogelių pH reikšmės buvo intervale 4,86 ± 0,01–5,20 ± 0,01. Klampos reikšmės buvo intervale 0,22 ± 0,03–492,35 ± 28,23 Pa·s. Eksperimentinių hidrogelių konsistencijos koeficientas varijavo nuo 0,281 ± 0,118 iki 239,325 ± 2,185 Pa·sn, tekėjimo indeksas –
nuo 0,224 ± 0,007 iki 0,940 ± 0,058. Jautriausias temperatūriniams pokyčiams buvo hidrogelis, kuriame poloksamero koncentracija buvo 20 proc. Propolio hidrogelių atsparumas deformacijai buvo iki 0,182– 0,418 proc. Po 4 val. didžiausias fenolinių junginių srautas (129,1 ± 8,1 μg/cm2) ir atpalaiduotas kiekis
(19,0 ± 1,3 proc.) nustatytas iš hidrogelio, kurio sudėtyje poloksamero koncentracija buvo 20 proc. Po 4 val. mažiausias fenolinių junginių srautas (55,7 ± 8,4 μg/cm2) ir kiekis (8,3 ± 1,2 proc.) nustatytas iš
hidrogelio, kuriame poloksamero koncentracija buvo 30 proc. Optimalios sudėties hidrogelio pH buvo 4,93 ± 0,01, klampa – 119,28 ± 4,34 Pa·s, konsistencijos koeficientas – 34,54 ± 4,36 Pa·sn, tekėjimo
indeksas – 0,33 ± 0,02, atsparumas deformacijai – iki 0,26 proc. Nustatytas fenolinių junginių srautas iš optimalios sudėties hidrogelio po 4 val. buvo 117,9 ± 9,0 μg/cm2, o atpalaiduotas kiekis – 17,3 ± 1,3
proc.
Išvados: Metil-β-ciklodekstrinas padidino propolio fenolinių junginių tirpumą vandenyje. Didėjant poloksamero koncentracijai hidrogelyje, didėja puskietės sistemos klampa ir mažėja fenolinių junginių atpalaidavimas. Suminis tirtų fenolinių junginių srautas ir atpalaiduotas kiekis iš optimalios sudėties propolio hidrogelio, kuriame poloksamero 407 koncentracija sudarė 22,4 proc., buvo statistiškai nereikšmingai mažesni nei iš propolio sistemos, kuriame poloksamero 407 koncentracija sudarė 20 proc.
SUMMARY
Final master‘s thesis of J. Vaitekėnaitė: „Modelling, optimization and biopharmaceutical evaluation of poloxamer 407-based hydrogels containing aqueous propolis extract“ / scientific supervisor lect. dr. Modestas Žilius; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Clinical Pharmacy. – Kaunas.
The aim of work: To produce poloxamer 407-based hydrogels with an aqueous propolis extract, to optimize the experimental hydrogels and to justify their quality in biopharmaceutical studies.
Main tasks: To produce an aqueous propolis extract and to evaluate its qualitative and quantitative compositions; to evaluate poloxamer 407-based hydrogels containing an aqueous propolis extract by determining their physicochemical characteristics (pH, viscosity and rheological properties); to investigate and evaluate the release of phenolic compounds from the experimental propolis hydrogels; to optimize the experimental propolis hydrogel composition according to the physicochemical properties and biopharmaceutical characteristics.
Methods: Identification and quatification of propolis phenolic compounds was performed by validated HPLC method. Hydrogels pH was measured by pH-meter. Viscosity and rheological properties of semisolid systems were determined by rheometer. In vitro release studies were performed by modified Franz type diffusions cells system.
Results: Poloxamer 407-based hydrogels containing an aqueous propolis extract pH values were in the range of 4,86 ± 0,01–5,20 ± 0,01.The viscosity was in the range of 0,22 ± 0,03–492,35 ± 28,23 Pa·s. The consistency coefficient varied from 0,281 ± 0,118 to 239,325 ± 2,185 Pa·sn, the flow index was in
range of 0,224 ± 0,007–0,940 ± 0,058. The most sensitive to changes of temperature was hydrogel containing 20% of poloxamer 407. Propolis hydrogels demonstrated low resistance to deformation which was in range of 0,182–0,418%. The largest flux (129,1 ± 8,1 μg/cm2) and amount (19,0 ± 1,3%)
of released propolis phenolic compounds were determined from hydrogel containing 20% of poloxamer 407. The smallest flux (55,7 ± 8,4 μg/cm2) and amount (8,3 ± 1,2%) of released propolis phenolic
compounds were determined from hydrogel containing 30% of poloxamer 407. The pH value of optimal composition poloxamer 407-based hydrogel was 4,93 ± 0,01, the viscosity was 119,28 ± 4,34 Pa·s, the consistency coefficient was 34,54 ± 4,36 Pa·sn, the flow index – 0,33 ± 0,02 and the resistance to
deformation was 0,26%. The flux of propolis phenolic compounds from optimal composition poloxamer 407-based hydrogel was 117,9 ± 9,0 μg/cm2, and the released amount was 17,3 ± 1,3%.
Conclusions: Methyl-β-cyclodextrin improved solubility of relatively lipohilic propolis phenolic acids in purified water. Increasing the concentration of poloxamer 407 in the hydrogel, increases the viscosity of semisolid system‘s and decreases the release of propolis phenolic compounds from hydrogels. The
flux and released amount of propolis phenolic compounds from optimal poloxamer 407-based hydrogel were statistically insignificant lower than from hydrogel containing 20% of poloxamer 407.
PADĖKA
Už suteiktas puikias darbo sąlygas, materialinę bazę ir pagalbą rengiant mokslinį tiriamąjį darbą „Hidrogelių su poloksameru 407 ir vandenine propolio ištrauka modeliavimas, optimizavimas ir biofarmacinis vertinimas“ dėkoju darbo vadovui lekt. dr. Modestui Žiliui, katedros vedėjui prof. dr. Vitaliui Briedžiui ir visam klinikinės farmacijos katedros kolektyvui.
1. SANTRUMPOS
γ – deformacija (proc.)
γ͘͘͘͘ – poslinkio greitis (s-1)
η – klampa (Pa·s)
τ – poslinkio įtempis (Pa)
ω – kampinis dažnis (rad·s−1)
G′ – elastingumo modulis (Pa) G″ – klampos modulis (Pa)
k – konsistencijos koeficientas (Pa·sn)
LVI – linijinis viskoelastinis intervalas n – tekėjimo indeksas
PEO – polietilenoksidas PPO –polipropilenoksidas
ĮVADAS
Puskietės vaistų formos – geliai, kremai ir tepalai – yra naudojamos kaip vaistinių medžiagų nešikliai, siekiant sukelti vietinį ar sisteminį vaistinės medžiagos poveikį, jas vartojant vietiškai [30]. Hidrogeliai yra gelių rūšis, gaminama iš hidrofilinių polimerų, kurie tirpdami vandeninėje fazėje, formuoja įvairias vidines struktūras (micelinius tirpalus, miceles, tinklines struktūras) [8, 73]. Didelis vandens kiekis hidrogeliuose suteikia panašumą į biologinius audinius, todėl hidrogeliai pasižymi geru biologiniu suderinamumu ir yra plačiai pritaikomi medicinoje (audinių inžinerijoje, ligų diagnostikoje) [1, 42]. Į hidrogelius įterpiant vaistines medžiagas, galima prailginti šių medžiagų atpalaidavimą vartojimo vietoje ir padidinti terapijos efektyvumą [23, 49]. Hidrogeliai yra malonūs vartoti, nes jie neriebina odos, yra lengvai nuplaunami, vėsina odą [17, 59]. Susidomėjimas hidrogeliais nuolatos auga. Tai rodo kasmet didėjantis mokslinių publikacijų apie hidrogelius skaičius [15].
Poloksameras 407 (polietilenoksido-polipropilenoksido-polietilenoksido kopolimeras) yra dažnai hidrogelių gamyboje naudojamas polimeras, pasižymintis mažu toksiškumu ir indiferentiškumu [20, 36]. Poloksameras 407 pasižymi amfifilinėmis savybėmis, todėl padidina sunkiai vandenyje tirpių vaistinių medžiagų tirpumą ir palengvina jų įterpimą į hidrogelius [20, 44]. Jo suformuojami hidrogeliai yra jautrios temperatūriniams pokyčiams sistemos, standžią konsistenciją įgaunančios didėjant temperatūrai, priklausomai nuo poloksamero 407 koncentracijos hidrogelyje [12, 56]. Naudojant poloksamerą 407 galima sukurti efektyvų ir prailgintą [23, 43, 52] veikliųjų junginių atpalaidavimą suteikiančią puskietę vaisto formą.
Propolis yra natūralios kilmės medžiaga, kuri naudojama nuo uždegimo, oksidacinio streso sukeltos pažaidos, virusinių, bakterinių, grybelinių susirgimų. Šiuos poveikius lemia sinergistinis propolio fenolinių junginių (fenolinių rūgščių ir jų esterių, flavonoidų, fenolinių aldehidų) veikimas [67, 69, 72]. Mokslinėje literatūroje aprašytos puskietės vaistų formos su propolio ištraukomis, kurios pritaikomos įvairių susirgimų profilaktikai ir gydymui: tepalai [66], aliejus-vanduo emulsinio tipo kremai [65], kremai, apsaugantys odą nuo UV spinduliuotės sukeliamos oksidacinės pažaidos [51], geliai makšties kandidozės gydymui [7, 60], hidrogeliai periodontito [5, 12] ir endodontiniam gydymui [25].
Šio darbo tikslas yra sumodeliuoti hidrogelius su poloksameru 407 ir vandenine propolio ištrauka, eksperimentinius hidrogelius optimizuoti ir įvertinti jų kokybę biofarmaciniais tyrimais.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo objektas: eksperimentiniai hidrogeliai su poloksameru 407 ir vandenine propolio ištrauka.
Darbo tikslas: sumodeliuoti hidrogelius su poloksameru 407 ir vandenine propolio ištrauka, optimizuoti eksperimentinius hidrogelius ir biofarmaciniais tyrimais įvertinti jų kokybę.
Darbo uždaviniai:
1. Pagaminti vandeninę propolio ištrauką ir įvertinti jos kokybinę ir kiekybinę sudėtį;
2. Įvertinti eksperimentinių hidrogelių fizikines ir chemines savybes (pH, klampą, reologinius rodiklius);
3. Ištirti ir įvertinti fenolinių junginių atpalaidavimą iš eksperimentinių propolio hidrogelių;
4. Optimizuoti eksperimentinio propolio hidrogelio sudėtį pagal fizikines ir chemines savybes, ir biofarmacines charakteristikas.
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. Gelių charakteristika
Geliai – puskietės vaistų formos, sudarytos iš skystyje išbrinkusių gelifikuojančių medžiagų, kurios, suformuodamos trimates tinklines struktūras, suteikia sistemoms standžią formą [13, 55]. Geliai klasifikuojami pagal jį sudarančių medžiagų prigimtį.
1) Pagal gelifikuojančios medžiagos prigimtį skirstomi į:
Neorganinius gelius, pvz., aliuminio hidroksido, bentonito gelis (dažniausiai dvifaziai, neskaidrūs geliai);
Organinius gelius, pvz., karbomero, tragakanto, celiuliozės ir celiuliozės darinių, poloksameriniai geliai (vienafaziai, skaidrūs geliai) [23, 58].
2) Pagal skystos fazės prigimtį skirstomi į:
Hidrogelius, kurių skystą fazę sudaro vanduo ar vandens ir gerai su juo besimaišančių medžiagų (pvz., etanolio, propilenglikolio, glicerolio) mišiniai;
Oleogelius, kurių skystą fazę sudaro angliavandeniliai (pvz., vazelinas, plastibazė), riebaliniai/augaliniai riebalai (pvz., taukai, kakavos sviestas), muilai (pvz., aliuminio stearatas) ar hidrofiliniai junginiai (pvz., polietilenglikolis) [23].
Gelius sudarančios medžiagos yra suderinamos su dauguma pagalbinių medžiagų [34, 57], o jų gamyba paprastesnė nei tepalų ir kremų. Laikymo metu geliai pasižymi didesniu stabilumu, nei kremai, nes nevyksta fazių atsiskyrimas ir išsisluoksniavimas [68] Priešingai nei kremai ir tepalai, geliai neužkemša jos porų ir nesutrikdo odos kvėpavimo, todėl uždegimo ar alerginių reakcijų rizika yra mažesnė [30]. Į gelius gali būti įterpiami dideli skystoje fazėje tirpių medžiagų kiekiai. Tuo geliai yra pranašesni už hidrofilinius tepalus, kuriuose skystos fazės su joje ištirpintais veikliaisiais junginiais gali būti iki 20 proc. [74]. Geliai, dėl juose esančio didelio skysčio kiekio, dažniausiai yra suderinami su biologiniais audiniais, todėl vartojami įvairiais būdais – per burną, į nosį, tepami ant odos, į akis, vaginaliniu ar rektaliniu būdu [68]. Šios gelių savybės lemia jų, kaip vaistų nešiklių, pasirinkimą, kuriant vietinio vartojimo vaistų formas.
Tiriant veikliųjų junginių atpalaidavimą iš puskiečių preparatų, nustatyta, kad atpalaidavimą lemia ne tik vaisto koncentracija formuluotėje, bet ir nešiklio savybės bei veikliųjų junginių tirpumas naudojamame nešiklyje. Vaisto tirpumą lipofilinėje arba hidrofilinėje fazėje nusako pasiskirstymo oktanolis/vanduo koeficientas logP. Kai LogP > 0, vaistas yra lipofiliškas, o kai vaisto LogP < 0, jis hidrofiliškas. Yener G. ir kt. [39] nustatė, kad atpalaiduotas meloksikamo (LogP = 3,02) kiekis iš hidrogelio formuluotės buvo iki 20 kartų didesnis, nei iš kitų nešiklių – aliejus-vanduo, vanduo-aliejus, vanduo-aliejus-vanduo ir vanduo-aliejus-vanduo-karbomeras tipo emulsijų, pasižyminčių lipofilinėmis
savybėmis. Dua K. ir kt. [19] lygino norfloksacino ir metronidazolo atpalaidavimą iš karbopolio, polietilenglikolio, hidroksipropilmetilceliuliozės gelių ir tepalo, sudaryto iš DMSO, izopropilmiristato, skysto parafino, vazelino ir vaško. Iš formuluočių, kurių pagrindą sudarė polietilenglikolis ir karbopolis, norfloksacino ir metronidazolo atpalaiduota iki 1,4–1,7 karto daugiau nei iš tepalo pagrindo. Didesnę vaistų difuziją iš karbopolio gelio lėmė porėta gelio struktūra ir mažas lipofiliškų vaistinių medžiagų tirpumas vandeniniame nešiklyje. Todėl vaistinių medžiagų difuzija iš nešiklio buvo lengvesnė ir atpalaidavimas vyko greičiau. Žilius M. ir kt. [79] tyrė fenolinių junginių atpalaidavimą iš puskiečių sistemų ir nustatė, kad nešikliai, kurių sudėtyje mažiau lipofiliškų junginių (pvz., gelis lyginant su tepalais ir kremais) efektyviau atpalaiduoja hidrofobinius junginius. Santykinai lipofiliškos propolio fenolinės rūgštys geriausiai atpalaiduotos iš hidrofilinio gelio (atpalaiduotas beveik visas kiekis), o iš tepalų ir kremų atpalaiduota atitinkamai 5 proc. ir 22 proc. fenolinių rūgščių. Rafiee-Tehrani M. ir kt. [62] lygino piroksikamo atpalaidavimą iš aliejus-vanduo tipo kremų ir hidroalkoholinių gelių. Didesnis piroksikamo kiekis atpalaiduotas iš hidroalkoholinių gelių, o difuzijos koeficientas buvo iki 19 kartų didesnis nei iš aliejus-vanduo emulsinio tipo kremų. Tą lėmė piroksikamo tirpumą vandenyje didinančių medžiagų – 2-propanolio ir propilenglikolio – naudojimas. Šios medžiagos mažino hidroksipropilceliuliozės gelių klampą, todėl piroksikamas buvo atpalaiduotas lengviau nei iš aliejus-vanduo tipo kremų. Mažesnė sistemos klampa lemia lengvesnį veikliųjų junginių judėjimą puskiečio preparato matricoje. Patel N. A. ir kt. [58] tyrė natūralios, fotokumarinų grupei priklausančios medžiagos, psoraleno atpalaidavimą iš skirtingų sudėčių kremų ir gelių formuluočių ir nustatė, kad didžiausi psoraleno kiekiai atpalaiduojami iš tų gelių, kurių klampa yra mažesnė nei kremų ar kitų sudėčių gelių klampa. Ramanauskienė K. ir kt. [63] tyrė rozmarino fenolinių junginių atpalaidavimą iš puskiečių vaistų formų – vanduo-aliejus emulsijos tipo kremo, absobcinio-hidrofobinio tepalo, oleogelio, aliejus-vanduo emulsijos tipo kremo, hidrogelio ir aliejus-vanduo emulsijos tipo gelifikuoto kremo. Nustatyta, kad didžiausius rozmarino fenolinių junginių kiekius atpalaidavo ir antibakteriniu aktyvumu pasižymėjo hidrogelio ir gelifikuoto kremo formuluotės, nes jų klampa buvo mažiausia nei kitų tirtų puskiečių sistemų.
Siekiant sumodeliuoti optimaliomis savybėmis pasižyminčius gelius, labai svarbu žinoti gelį sudarysiančių medžiagų ypatybes. Natūralios kilmės gelifikuojančios medžiagos (pvz., alginatai, pektinai, chitosanas), priklausomai nuo gamtinių sąlygų, gali skirtis jas sudarančių polimerų polimerizacijos laipsniu. Skirtinga polimero sudėtis lemti ir gelių savybių – reologinių parametrų, veikliųjų junginių atpalaidavimo profilio – skirtumus. Natūralios kilmės gelifikuojančios medžiagos dažnai gali turėti priemaišų, sukeliančių alergines reakcijas [16, 71]. Polimerai, sudaryti iš polivinilo alkoholio (PVA), polietilenglikolio (PEG), poliakrilamido (PAAm), yra sintetinės kilmės gelifikuojančios medžiagos, pasižyminčios nekintama polemerine sudėtimi ir grynumu [71]. Dėl lengvo gelių pašalinimo nuo odos paviršiaus, veikliųjų junginių buvimo vartojimo vietoje trukmė yra
trumpesnė, lyginant su tepalais ir kremais [76]. Gelių buvimo vartojimo vietoje trukmę galima prailginti pridėjus bioadhezines savybes stiprinančių polimerų, pavyzdžiui, polikarbofilo, hidroksipropilceliuliozės, polivinilpirolidono ar karbopolio [12]. Hidrogeliai lyginant su oleogeliais, yra pranašesni tuo, kad neriebina odos ir yra lengvai nuplaunami, be to, į oleogelių sudėtyje esantys nevandeniniai tirpikliai gali būti nesuderinami su biologiniais audiniais [75]. Tinkamas gelius sudarančių medžiagų parinkimas leidžia sumodeliuoti optimaliomis savybėmis pasižyminčias puskietes vaisto formas.
2.2. Hidrogeliai
Hidrogeliai yra puskietė vaisto forma, kurią sudaro hidrofiliniai polimerai, vandeninėje terpėje formuojantys įvairias vidines struktūras (micelinius tirpalus, įvairios struktūros miceles, tinklines struktūras) [8, 73]. Dėl polimerų molekulėse esančių hidroksilo OH), karboksilo COOH), amido (-CONH-), sulfo rūgšties (-SO3H) grupių, polimerai yra linkę hidratuotis ir sudaryti vandenilinius ryšius
su vandens molekulėmis. Hidrogelių sudėtyje vandens masė gali būti iki kelių tūkstančių kartų didesnė nei polimero masė [29]. Dėl didelio vandens kiekio, hidrogeliai yra gerai suderinami su biologiniais audiniais ir medicinoje yra naudojami įvairiose srityse – audinių inžinerijoje, ligų diagnostikoje ir kaip vaistinių medžiagų tiekimo sistemos [1, 36, 42]. Hidrogeliai yra tinkami žaizdų gydymui, nes sugeria žaizdų eksudatą, tuo pačiu išlaikydami reikiamą drėgmės kiekį žaizdoje. Be to, yra pralaidūs deguoniui. Hidrogeliai vėsina odą, yra veiksmingi gydant vietinį uždegimą [17, 59, 76].
Standžios konsistencijos hidrogelių matricą sudaro tinklinė struktūra. Apibūdinant hidrogelio tinklinę struktūrą, yra svarbūs trys parametrai: polimero tūrio dalis hidrogelyje, polimerų molekulių masė tarp skersinių jungčių M̅c ir porų dydis ξ [49]. Tinklinė hidrogelio struktūra susidaro jungiantis
polimerų molekulėms skersinėmis jungtimis. Hidrogeliams būdinga tinklinė struktūra pavaizduota 1 paveiksle.
1 pav. Tinklinė hidrogelių struktūra , M̅c –polimerų grandžių, esančių tarp skersinių jungčių,
Pagal gelifikuojančios medžiagos kilmę, jie yra skirstomi į natūralius hidrogelius (pvz., algino rūgštis, alginatai, chitosanas, dekstranas, hialurono rūgštis, kolagenas, karageninas, pektinas), sintetinius hidrogelius (pvz., akrilamido dariniai, polietilenglikolis, polivinilo alkoholis, polivinilacetatas, poloksamerai) bei į natūralių ir sintetinių hidrogelių mišinius (pvz., kolagenas-akrilatas) [1, 37]. Nors iš natūralios kilmės polimerų sudaryti hidrogeliai yra gerai suderinami su biologiniais audiniais, tačiau natūralūs polimerai negali suteikti geliams reikiamų mechaninių savybių. Varijuojanti natūralių polimerų sudėtis lemia jų struktūrinius pokyčius ir savybių kintamumus, be to, natūralūs hidrogeliai gali turėti patogenų ar sukelti imuninius ir uždegiminius procesus [49]. Natūralius hidrogelius plačiai pakeitė sintetiniai hidrogeliai, nes jų sukeliamų imuninių reakcijų rizika maža, turi ilgesnį galiojimo laiką, į jų struktūrą gali būti įterpiamas didesnis vandens kiekis ir jie yra atsparesni mechaniniams veiksniams [1].
Hidrogeliai susidaro jungiantis gelifikuojančių polimerų molekulėms cheminiu arba fizikiniu būdu. Kai molekulių jungimąsi inicijuoja spinduliuotė, cheminės medžiagos (pvz., gliutaraldehidas, diepoksidas, diizocianatas, etilenglikolio dimetakrilatas) susidaro kovalentinėmis jungtimis susijungę cheminiai hidrogeliai (pvz., polietilenoksido hidrogelis) [37]. Kai gelifikuojančios medžiagos jungiasi dėl fizikinių – joninių, vandenilinių ar hidrofobinių – sąveikų, gaunami fizikiniai, arba grįžtamos struktūros hidrogeliai (pvz., polietilenoksido-polipropilenoksido-polietilenoksido (PEO-PPO-PEO) kopolimero hidrogelis, polietilenglikolio-poliesterio kopolimero hidrogelis) [32, 37]. Šios jungtys susidaro arba suyra polimerui reaguojant į fizikinius (temperatūra, elektrinis ir magnetinis laukas, tirpiklio sudėtis, slėgis, šviesa, garsas) ar cheminius-biocheminius aplinkos sąlygų pokyčius (pH, joninės jėgos, specifinių molekulių buvimą). Nors cheminiu būdu sujungti hidrogeliai yra atsparesni aplinkos sąlygų pokyčiams ir jų struktūra pastovesnė nei fizikiniu būdu susijungusių hidrogelių [37], tačiau cheminiu būdu susijungę hidrogeliai gali reaguoti su įterptomis vaistinėmis medžiagomis ir sumažinti jų aktyvumą. Chemines jungtis sudarančios medžiagos daugeliu atvejų yra nuodingos, todėl turi būti pašalintos prieš vartojant in vivo [16]. Tuo fizikiniu būdu sujungti hidrogeliai yra pranašesni, nes polimerų jungimuisi pagalbinės cheminės medžiagos nereikalingos. Hidrogeliams reaguojant į aplinkos sąlygų pasikeitimus, pakinta hidrogelių konsistencija ir veikliųjų junginių atpalaidavimas [32, 37, 61]. Terapiniais tikslais naudojant aplinkos sąlygoms jautrius hidrogelius, gali būti pasiektas specifinis vartojimo vietai, kontroliuojamas vaistinių medžiagų tiekimas. Pavyzdžiui, gliukozei jautrūs hidrogeliai veikia kaip išmaniosios insulino sistemos, kuriomis galima reguliuoti kraujo gliukozės koncentraciją. Į hidrogelius įterpiama gliukozės oksidazė katalizuoja gliukozės perteklių į gliukurono rūgštį, kuriai esant, hidrogelis pradeda brinkti ar tirpti. Remiantis specifine antikūnų atpažinimo funkcija, buvo sukurti antigenams jautrūs hidrogeliai, brinkstantys terpėje esant antigenų [32].
Svarbiausi aplinkos sąlygų pokyčiai, kuriems gali būti jautrios vaistų tiekimo sistemos, yra pH ir temperatūra. Jautriausiai į pH pokyčius reaguoja joniniai (turintys krūvį) hidrogeliai. Jų struktūroje yra polinių grupių, kurios, reaguodamos į aplinkos pH, prisijungia arba atiduoda protonus [32]. Yra du
joninių hidrogelių tipai – anijoniniai ir katijoniniai hidrogeliai. Anijoninius hidrogelius sudaro hialurono rūgštis, akrilo rūgštis, dekstranas, katijoninius – chitosanas, vinilpiridinas, metakrilo rūgšties dariniai [37, 71]. pH pokyčiams jautrūs hidrogeliai dažniausiai naudojami modeliuoti kontroliuojamo atpalaidavimo per os vartojamas vaisto formas. Tai lemia skrandžio ir žarnyno terpių pH skirtumas (skrandyje pH < 3, o žarnyno terpė neutrali ar šarminė). Tokie pH skirtumai yra pakankamai dideli, kad hidrogeliuose įvyktų struktūriniai pokyčiai ir pakistų jų konsistencija – standžios konsistencijos hidrogelis pradėtų skystėti ir prasidėtų veikliųjų junginių atpalaidavimas iš hidrogelio matricos. pH jautrūs hidrogeliai gali būti pritaikomi navikų gydymui. Dėl greito glikolizės proceso naviko audiniuose, ekstraceliuliniame skystyje kaupiasi pieno rūgštis. Reaguodamas į pH sumažėjimą audinyje, hidrogelis pradeda skystėti, o mažėjanti klampa lemia vaistinės medžiagos atpalaidavimą iš sistemos. pH sumažėjimas gali vykti ir kituose patologiniuose audiniuose, pavyzdžiui, išemijos ar infekcijos paveiktose srityse [21].
Mažai pH pokyčiams jautrūs yra nejoniniai (neutralūs) hidrogeliai. Šiuos hidrogelius sudaro poliakrilamidas (PAAm), polivinilo alkoholis (PVA), polietilenglikolis (PEG), polietilenoksido– polipropilenoksido (PEO–PPO) blokiniai kopolimerai [21, 71]. Hidrogeliai, sudaryti iš šių polimerų, pasižymi jautrumu temperatūriniams pokyčiams. Tai labiausiai ištirta aplinkos sąlygoms jautrių polimerų klasė [21]. Šie polimerai brinksta vandeninėje terpėje tik dėl vandens – polimero sąveikų, tirpiklio pH. Druskų buvimas brinkimui įtakos dažniausiai neturi [71]. Reikiamas skystos konsistencijos hidrogelio kiekis įšvirkščiamas, įlašinamas ar kitaip aplikuojamas tiksliai vartojimo vietoje (pavyzdžiui, makštyje [60], sąnaryje [77], akyje [22]) ir kūno temperatūroje sudaro standžios konsistencijos hidrogelį. Tai padidina vaistinių medžiagų bioprieinamumą ir prailgina veikliųjų junginių atpalaidavimą [32, 42].
Veiklieji junginiai iš hidrogelių atpalaiduojami šiais mechanizmais:
1. Difuzijos kontroliuojamu atpalaidavimu. Tai dažniausiai pritaikomas mechanizmas, nusakantis veikliųjų junginių atpalaidavimą iš hidrogelių. Ištirpintos ar disperguotos vandeninėje fazėje, vaistinės medžiagos difunduoja per hidrogelio poras. Hidrogelių porų dydį lemia skersinių jungčių hidrogelio matricoje kiekis, polimero cheminė struktūra ir veiksniai (temperatūra, pH, joninė jėga). Medicinoje naudojamų hidrogelių porų dydis (5–100 nm) yra daug didesnis už daugumos vaistinių medžiagų molekulių dydį [49]. Todėl mažos molekulės vaistinių medžiagų difuzija iš hidrogelių matricos nėra reikšmingai modifikuojama. Didelės molekulinės masės medžiagų (peptidų, baltymų, oligonukleidų) difuzija pro hidrogelio poras leidžia gauti pageidaujamo greičio makromolekulių atpalaidavimą iš hidrogelio. Difuzijos kontroliuojamą atpalaidavimo modelį galima pritaikyti, hidrogelį naudojant kaip membraną, skiriančią veikliuosius junginius nuo išorės aplinkos. Veikliųjų junginių atpalaidavimas kontroliuojamas membranos tankumu, veikliųjų junginių koncentracijos skirtumu abiejose membranos pusėse ir pasiskirstymo koeficientu [49, 59].
2. Hidrogelio brinkimo kontroliuojamu atpalaidavimu. Šis modelis pritaikomas daug mažesnių nei poros dydis molekulių atpalaidavimui. Vaistinės medžiagos yra ištirpintos ar disperguotos hidrogelio matricoje. Kontaktuodama su skysčiais, polimero matrica pradeda brinkti ir hidrogelyje susidaro dvi skirtingos fazės – standi vidinė ir skystėjanti išorinė fazė. Vaistinės medžiagos atpalaidavimas kontroliuojamas išorinės ir vidinės fazių santykiu, nes iš standžios vidinės hidrogelio fazės veikliųjų junginių atpalaidavimas nevyksta [29, 49].
3. Cheminių procesų kontroliuojamu atpalaidavimu. Jis naudojamas nusakyti veikliųjų junginių atpalaidavimą dėl hidrogelių matricoje vykstančių reakcijų. Dažniausiai hidrogelyje vykstančios reakcijos yra polimero molekulių skilimas dėl hidrolizinio ar fermentinio jų ardymo. Taip pat grįžtamos ar negrįžtamos reakcijos, vykstančios tarp polimero tinklo ir atpalaiduojamų junginių. Esant tam tikroms sąlygoms, hidrogelio paviršius pradedamas ardyti ir vyksta veikliųjų junginių atpalaidavimas iš hidrogelio. Hidrogelio matricos irimo greičio modifikavimas gali būti pritaikomas daug mažesnių nei hidrogelio poros dydis molekulių atpalaidavimui [49].
Gerai sumodeliuotos vaistų tiekimo sistemos gali užtikrinti kontroliuojamą vaistinių medžiagų tiekimą jų vartojimo metu. Iš kitų atpalaidavimą kontroliuojančių sistemų hidrogeliai išsiskiria tuo, kad vaistinių medžiagų atpalaidavimą galima kontroliuoti keičiant hidrogelio polimerų hidrofiliškumą, matricos skersinių jungčių tankumą ar porų dydį [21]. Porėta hidrogelių struktūra suteikia galimybę modeliuoti modifikuoto atpalaidavimo sistemas, iš kurių vaistinės medžiagos gali būti lėtai, bet pastoviu greičiu atpalaiduojamos, ilgiau išlaikant reikiamą vaisto koncentraciją audiniuose [36, 42]. Tačiau didelis vandens kiekis hidrogelyje ir didelio dydžio poros dažniausiai lemia santykinai greitą mažos molekulinės masės vaistinių medžiagų atpalaidavimą. Hidrogeliai yra mažai atsparūs mechaniniam veikimui, tai gali sukelti jų vidinės tinklinės struktūros suardymą. Juos gali būti sudėtinga sterilizuoti, o dėl mažo hidrofobinių vaistinių medžiagų kiekio, galimo įterpti į hidrogelius, yra ribojamas hidrogelių, kaip vaistinių medžiagų tiekimo sistemos, pasirinkimas [36]. Vandenyje sunkiai tirpių vaistų tirpumą padidinti galima juos įterpiant į liposomas [38], gaminant mikroemulsijas, pridedant ciklodekstrinų [10].
Hidrogeliai, pagal juos sudarančių polimerų sudėtį yra skirstomi į [1, 44, 71]:
monopolimerinius hidrogelius, sudarytus iš vienos rūšies polimero molekulių – pvz., poli-N-izopropilakrilamido (PNIPAAm), polivinilo alkoholio (PVA), poliakrilamido (PAAm), polietilenglikolio (PEG);
kopolimerinius hidrogelius, sudarytus iš dviejų rūšių monomerų, pvz. poli-N-izopropilakrilamido / polietilenglikolio (PNIPAAm) / PEG blokiniai kopolimerai, poli(etilenoksido) / poli(propilenoksido) blokiniai kopolimerai (PEO/PPO), (poli)etilenglikolio / (poli)-laktido-ko-glikolido (PEG/PLGA) blokiniai kopolimerai;
daugiapolimerinius hidrogelius, sudarytus iš trijų ir daugiau rūšių monomerų, pavyzdžiui, poliakrilinės rūgšties-hidroksietilmetakrilato (PAAc-HEMA)/želatinos hidrogeliai;
vienas į kitą įsiskverbusių polimerų tinklų hidrogelius, dažniausiai sudarytus iš dviejų polimerų, susijungusių cheminiais ryšiais (pvz., poliakrilamido ir poliakrilinės rūgšties hidrogelis).
Kopolimeriniai hidrogeliai, sudaryti iš dviejų, skirtingą giminingumą lipofilinei ir hidrofilinei fazėms turinčių monomerų. Jie pasižymi amfifilinėmis savybėmis ir gali veikti kaip paviršinio aktyvumo medžiagos, gebančios padidinti sunkiai vandenyje tirpių medžiagų tirpumą [32, 36, 44]. Ši gelifikuojančių medžiagų savybė leidžia hidrogelius formuoti, kai veikliosios medžiagos yra mažai tirpios vandeninėje terpėje. Aukščiau išvardintos dažnai naudojamos kopolimerinius hidrogelius sudarančios medžiagos priklauso sintetinėms, fizikinius nejoninius, temperatūriniams pokyčiams jautrius hidrogelius suformuojančioms medžiagoms [32, 71]. Vienos iš dažniausiai pasirenkamų kopolimerinius hidrogelius sudarančių medžiagų yra polietilenoksido-polipropilenoksido-polietilenoksido (PEO-PPO-PEO) kopolimerai (poloksamerai) [46]
2.3. Poloksamerinių hidrogelių charakteristika
Polietilenoksido-polipropilenoksido-polietilenoksido (PEO-PPO-PEO) kopolimerai – tai hidrogelius suformuojanti kopolimerų grupė. Šie kopolimerai sintetinami paeiliui jungiant propilenoksido ir etilenoksido monomerus propilenglikolio aplinkoje [8, 20]. PEO-PPO-PEO blokiniai kopolimerai skiriasi savo molekulinėmis masėmis ir PPO/PEO santykiu. Jų bendroji cheminė struktūra pavaizduota 2 paveiksle.
2 pav. Bendroji poloksamerų struktūra, x –etilenoksidas, y – propilenoksidas [44]
Poloksamerų stuktūroje yra dviejų skirtingų tirpumų monomerai (PEO, PPO), todėl pasižymi amfifilinėmis savybėmis, priklausančiomis nuo PEO/PPO santykio [20]. Registruoti šių kopolimerų pavadinimai (Pluronic®, Synperonic®, Tetronic®) apima didelį asortimentą skystų (angl. L – liquid), pastos (angl. P – pastes) ir dribsnių formos produktų, susintetinta daugiau nei 30 poloksamerų rūšių [8, 20]. Dažniausiai naudojami šie poloksamerai – 188 (F–68), 237 (F–87), 338 (F–108) ir 407 (F–127). Tai baltos, bekvapės ir beskonės granulės, lengvai tirpios žemos temperatūros vandenyje. Šie poloksamerai suformuoja gelius žemesnėje arba kūno temperatūroje [23]. Poloksameriniai hidrogeliai priklauso fizikiniu būdu susidarantiems hidrogeliams [36]. Vandeniniai poloksamerų tirpalai yra stabilūs esant rūgščių, šarmų, metalų jonų [23], tačiau yra jautrūs temperatūros pokyčiams. Didinant temperatūrą, dehidratuoja hidrofobiniai PPO polimero segmentai ir vyksta molekulių agregacija. Taip sumažinamas
hidrofobinio paviršiaus plotas, kontaktuojantis su vandeniu. Molekulės agreguoja suformuodamos miceles. Jų centre yra hidrofobinis polipropilenoksido sudaromas branduolys, apgaubtas hidrofilinių polietilenoksido grandinių išoriniu sluoksniu [23]. Dėl hidrofobinių sąveikų, micelės kaupiasi į sankaupas ir vyksta gelifikacija. Micelizacijos procesą lemia du svarbūs veiksniai – kritinė micelių susidarymo koncentracija (KMSK), kuri nusako polimero koncentraciją, reikalingą formuotis micelėms, ir kritinė micelizacijos temperatūra [8]. Micelizacija vyksta, kai pasiekiama kritinė micelių susidarymo koncentracija (KMSK) esant tinkamai temperatūrai. Viršijus šią koncentraciją, vyksta tirpalas–gelis fazių perėjimas [23]. Šie procesai pavaizduoti 3 paveiksle.
3 pav. a – poloksamero koncentracija tirpale < KMSK, b – poloksamero koncentracija ≥ KMSK, c – poloksamero koncentracija didesnė ar lygi gelio susidarymo koncentracijai [23]
Poloksameriniai hidrogeliai turi daug micelių ir ertmių, iš kurių, gelio tirpimo metu, gali būti atpalaiduojamos vaistinės medžiagos. Didėjant poloksamero koncentracijai, didėja sudaromų micelių kiekis ir dydis, trumpėja tarpmiceliniai atstumai, susidaro daugiau tinklinių jungčių tarp gretimų micelių. Dėl to sudėtingėja vandeninės fazes judėjimas hidrogelio matricoje, lėtėja gelio tirpimas ir mažėja iš gelio atpalaiduojamo vaisto kiekis [77]. Micelės geba į savo struktūrą įterpti netirpias ar sunkiai vandenyje tirpias medžiagas, taip padidinant jų tirpumą ir prailginant atpalaidavimą iš hidrogelio [4, 8]. Mokslinėje literatūroje aprašyta poloksamerų 188, 235 ir 407 geba tirpinti priešvėžinio aktyvumo vaistines medžiagas, todėl poloksamerų sistemos yra efektyvus šių medžiagų nešiklis [8]. Mokslinių tyrimų metu nustatyta, kad poloksameras gerina sunkiai vandenyje tirpių junginių (pvz., indometacino, nifedipino, piroksikamo, insulino) tirpumą. Nustatyta, kad poloksamero 407 koncentracijai esant 22,5 proc. piroksikamo tirpumas vandenyje padidėja 11 kartų [20].
Poloksameras 407 yra polietilenoksido-polipropilenoksido-polietilenoksido kopolimeras, kurio 70 proc. sudaro hidrofiliškumo suteikiantis etilenoksidas, o 30 proc. – propilenoksidas. Šio polimero bendroji formulė yra PEO106-PPO70-PEO106, o molekulinė masė – 12600 [20, 23]. Tai dažnai hidrogelių
gamyboje naudojama indiferentiška pagalbinė medžiaga, tinkama įvairioms vaistų formoms gaminti – vietinio vartojimo, vartojamoms į nosį, akis, makštį, tiesiąją žarną, inhaliuojamosioms, geriamosioms ir injekcinėms formoms. Dėl mažo toksiškumo, didelio biologinio suderinamumo su audiniais ir silpno imunogeniškumo yra dažnai naudojamas polimeras, kuriant vaistų tiekimo sistemas [4, 20]. Hidrogeliai
su poloksameru 407 toleruojami vartojant vietiškai net esant odos nudegimams ir žaizdoms. Padengdami žaizdų paviršių, jie skatina gijimą [20, 23]. Poloksameras 407 pasižymi stipriomis bioadhezinėmis savybėmis, prailginančiomis vaistinio preparato buvimo vartojimo vietoje laiką, kuris yra ypač svarbus vietinio vartojimo preparatams. Bioadhezinės savybės stiprėja didėjant gelio tvirtumui, t.y. didinant temperatūrą arba poloksamero 407 koncentraciją [35].
Poloksameriniai hidrogeliai prailgina vaistinių medžiagų atpalaidavimą, nors vaistinių medžiagų tiekimas retai viršija keletą dienų. Poloksameriniai hidrogeliai yra tinkami trumpalaikei terapijai, pavyzdžiui, skausmo valdymui, infekcijos gydymui [8, 52]. Mazurkevičiūtė A. ir kt. [52] modeliavo antimikrobinės vaistinės medžiagos – ciklopirokso olamino gelius su hidroksipropilceliulioze, chitosanu ir poloksameru 407 ir nustatė, kad didžiausias ciklopirokso olamino kiekis atpalaiduotas iš poloksamerinio hidrogelio. Heilmann S. ir kt. [33] modeliavo poloksamero 407 hidrogelį su morfinu, skirtą vietiniam žaizdų gydymui ir nustatė, kad poloksamerinis hidrogelis yra tinkama nešiklio sistema morfinui, nes pasiekiamas prailgintas morfino atpalaidavimas ir skausmą malšinantis poveikis. Lusiana ir Muller-Goymann C. C. [54] modeliavo puskietes formas – kremus ir poloksamerinius hidrogelius – su terbinafino hidrochloridu ir nustatė, kad didžiausias terbinafino hidrochlorido srautas buvo iš poloksamero 407 formuluočių. Cafaggi S. ir kt. [14] tyrė poloksamero 407 gebą tirpinti nesteroidinį vaistą nuo uždegimo – tolfenaminę rūgštį – ir sumodeliuoti vietinio vartojimo poloksamero 407 hidrogelio formuluotę. Tyrimo rezultatai parodė, kad tolfenaminės rūgšties tirpumas vandenyje padidėjo 2000 kartų, o sumodeliuotos hidrogelių sistemos pasižymėjo prailgintu tolfenaminės rūgšties atpalaidavimu ir suteikė galimybę tolfenaminę rūgštį vartoti vietiškai. Su poloksameru 407 modeliuojama daug vietinio vartojimo puskiečių vaisto formų, kurios yra efektyvios vaistinių medžiagų nešiklių sistemos.
2.4. Gelių su propoliu pritaikymas medicinoje
Propolis yra dervinga, lipni, savito kvapo ir skonio medžiaga. Propolį sudaro 50% dervų, 30% vaškų, 10% eterinių aliejų, 5% žiedadulkių ir 5% kitų junginių. Cheminė propolio sudėtis priklauso nuo jo geografinės kilmės [12, 72]. Lietuvoje yra paplitęs tuopos tipo propolis, kuriame vyraujantys fenoliniai junginiai yra fenolinės rūgštys ir jų esteriai. Ramanauskienė M. ir kt. [64], Ivanauskas L. ir kt [40] nustatė, kad Lietuvoje paplitusiame tuopos tipo propolyje aptinkamos galo, kavos, p-kumaro, ferulo, cinamono, rozmarino, vanilo rūgštys ir fenolinis aldehidas vanilinas. Platų propolio biologinių ir farmakologinių poveikių spektrą lemia sinergistinis fenolinių junginių veikimas. Propolis naudojamas nuo uždegimo, bakterinės, virusinės kilmės susirgimų, oksidacinės pažaidos, kaip imunitetą stiprinanti medžiaga [69, 70, 72]. Marquele-Oliveira F. ir kt. [51], Žilius M. ir kt. [79] nustatė, kad fenoliniai
junginiai (vanilo rūgštis, kavos rūgštis, p-kumaro rūgštis, ferulo rūgštis, vanilinas) geba prasiskverbti į epidermį ir dermą, todėl propolis gali būti vartojamas vietiškai odos ligų gydymui ir prevencijai. Stiprios propolio antioksidacinės savybės gali sustiprinti odos apsaugą prieš žalingus laisvųjų radikalų sukeliamus poveikius, kurie sukelia odos senėjimą, vėžį, todėl propolis gali būti naudojamas, kaip vietinio poveikio antioksidantas. Tai skatina vietinio vartojimo propolio formuluočių vystymą [78, 79].
Marquele-Oliveira F. ir kt. [51] modeliavo vietinio vartojimo formuluotes su propolio ekstraktu, skirtas UV spinduliuotės sukeliamų odos ligų prevencijai ir gydymui. Modeliuoti celiulioziniai (hidroksietilceliuliozės, hidroksipropilmetilceliuliozės, metilceliuliozės, karboksimetilceliuliozės natrio druskos) hidrogeliai su vandenine propolio ištrauka [80]. Bruschi M. L. ir kt. [12] sumodeliavo hidrogelius su poloksameru 407, karbopoliu 934P ir etanoliniu propolio ekstraktu, skirtus periodontito ligų gydymui. Atpalaidavimo in vitro tyrimo metu, nustatyta, kad sumodeliuotos sistemos suteikė prailgintą ir kontroliuojamą fenolinių propolio junginių atpalaidavimą. Iš sistemų atpalaiduota apie 80 proc. fenolinių junginių, atpalaidavimas tęsėsi ilgiau nei 7 dienas. Dodov-Glavas M. ir kt. [31] modeliavo chitosano ir poloksamerų mišinio hidrogelius su propoliu ir nustatė, kad propolio atpalaidavimas iš modeliuotų hidrogelių tęsėsi daugiau nei 10 valandų ir hidrogeliai gali būti efektyvūs ir saugūs makšties infekcijų profilaktikai ir gydymui. Berretta A. A. ir kt. [7] modeliavo hidrogelius su propolio ekstraktu, skirtus makšties kandidozei gydyti. In vivo tyrimo rezultatai parodė, kad per 7 gydymo dienas, Candida albicans ir kitų Candida rūšių grybelių skaičius naudojant karbopolio 940, poloksamero 407 hidrogelį ir klotrimazolo kremą, sumažėjo atitinkamai 60,2, 84,8 ir 97,2 proc. Geliai su propoliu pasirodė esantys efektyvūs gydant grybelinius makšties susirgimus. Lima G. G. ir kt. [48] modeliavo polivinilo alkoholio ir poliakrilinės rūgšties gelius su etanoliniu propolio ekstraktu ir tyrė propolio gelių veikimą prieš 4 rūšių bakterijas – Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Salmonella typhimurium, ir Pseudomonas putida. Tyrimo rezultatai parodė, kad visos sumodeliuotos
sistemos pasižymėjo aktyvumu prieš bakterijas, kuris stiprėjo didėjant propolio koncentracijai, o efektyviausi buvo polivinilo alkoholio hidrogeliai, kurie gali būti naudojami kaip baktericidinės dangos.
Mokslininkų domėjimasis natūralios kilmės medžiagomis, tarp jų ir bičių produktais, kasmet didėja. Daug mokslinių tyrimų yra atlikta su vienu iš bičių produktų – propoliu, kuris pasižymi daugiafunkciškumu ir efektyvumu gydant įvairios kilmės ligas – bakterinės, virusinės, grybelinės kilmės ar sukeltas oksidacinės pažaidos. Modeliuojamos gelių sistemos su propoliu yra plačiai pritaikomos medicinoje ligų gydymui ir profilaktikai.
3. TYRIMO METODIKA
3.1. Tyrimo objektas, medžiagos ir įranga
3.1.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – eksperimentiniai hidrogeliai su poloksameru 407 ir vandenine propolio ištrauka.
3.1.2. Naudotos medžiagos
Standartizuota propolio žaliava (UAB „Medicata Filia“, Vilnius, Lietuva); Metil-β-ciklodekstrinas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija);
Poloksameras 407 (polietilenoksido-polipropilenoksido-polietilenoksido kopolimeras) ((Lutrol F127®), Fagron, Roterdamas, Olandija);
Propilenglikolis (1,2-propandiolis), ≥ 99,5 proc. (Carl Roth GmbH&Co, Vokietija);
Acetonitrilas (Chromasolv®), ≥ 99,9 proc. (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija);
Acto rūgštis ≥ 99,8 proc. (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija); Visi kiti naudoti reagentai buvo analitinio švarumo.
3.1.3. Naudota įranga
Svarstyklės (Scaltec SBC 31, Scaltec Instruments GmbH, Vokietija);
Magnetinė maišyklė su kaitinamuoju paviršiumi (IKA® C-MAG HS 7, IKA®-Werke GmbH & Co.
KG, Vokietija);
Termostatinė purtyklė (GFM, Vokietija);
pH-metras (pH–meter 766 su elektrodu Knick SE 104 N, Knick Elektronische Messgerate GmbH & Co, Vokietija);
Reometras (Anton Paar® GmbH, Modular Compact Rheometer, MCR 102, Austrija);
Kapiliarinis skysčių chromatografas (Agilent 1260 Infinity Capillary LC–DAD, Agilent technologies Inc., Santa Clara, JAV).
3.2. Tyrimų metodai
3.2.1. Vandeninės propolio ištraukos gamyba
Atitinkamas kiekis propolio žaliavos buvo sumaišytas su 5 proc. metil-β-ciklodekstrino vandeniniu tirpalu, kai žaliavos ir tirpiklio santykis 1:10. Fenolinių junginių ekstrakcija vykdyta maišant 500 aps./min. greičiu ant magnetinės maišyklės IKAMAG® C–MAG HS7 1 valandą, palaikant 70°C
temperatūrą. Gauta propolio ištrauka atvėsinama ir filtruojama, naudojant vakuuminę filtravimo sistemą ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki reikiamo tūrio.
3.2.2. Vandeninės propolio ištraukos analizė efektyviosios skysčių chromatografijos
metodu
Pagamintos vandeninės propolio ištraukos kokybinė ir kiekybinė sudėtis nustatyta naudojant kapiliarinį skysčių chromatografą su diodų matricos detektoriumi Agilent 1260 Infinity. Fenolinių junginių – vanilo, kavos, p–kumaro ir ferulo rūgščių ir fenolinio aldehido vanilino atskyrimo sąlygos nurodytos 1 lentelėje [78].
1 lentelė. Chromatografinės analizės sąlygos
Parametras Sąlygos
Kolonėlė C18 kolonėlė (150 × 0,5 mm, 5 μm dydžio dalelėmis Judri fazė Eliuentas A: 0,5 proc. acto rūgšties vandeninis tirpalas
Eliuentas B: acetonitrilas Linijinio gradiento kitimas Nuo 1 iki 21 proc. B 25 min.
Injekcijos tūris 0,2 μl
Tėkmės greitis 20 μl/min
Kolonėlės temperatūra 25°C Fenolinių junginių detekcija 290 nm
Fenolinių junginių – vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo rūgščių ir vanilino tapatybė nustatyta lyginant gautus spektrus su standartų spektrais 210–600 nm bangos ilgio intervale.
3.2.3. Eksperimentinių propolio hidrogelių gamyba
Atitinkami poloksamero 407 ir išgryninto vandens arba vandeninės propolio ištraukos kiekiai lėtai sumaišyti ir laikyti 4°C temperatūroje. Hidrogeliai susidaro sustingstant tirpalui kambario temperatūroje. Gamintų hidrogelių sudėtys nurodytos 2 lentelėje.
2 lentelė. Eksperimentinių hidrogelių su poloksameru 407 sudėtys Eil.
Nr.
Hidrogelio kodas
Komponentų kiekiai, %
Poloksameras 407 Išgrynintas vanduo VPI
1. HG–15 15 85 – 2. HG–20 20 80 – 3. HG–20P 20 10 70 4. HG–25 25 75 – 5. HG–25P 25 5 70 6. HG–30 30 70 – 7. HG–30P 30 – 70 8. HG–35 35 65 –
Gamybai buvo pasirinktos 15–35 proc. poloksamero 407 koncentracijos, iš kurių į 20, 25 ir 30 proc. poloksamero 407 formuluotes buvo įdėti vienodi vandeninės propolio ištraukos kiekiai. Literatūros duomenimis, poloksamero 407 koncentracija hidrogelyje sudaro 18–35 proc. [26, 33, 53, 56, 77]. Kai poloksamero 407 koncentracija formuluotėje yra 15–20 proc., tokie geliai 20°C temperatūroje elgiasi kaip niutoniniai skysčiai, pseudoplastines savybes įgaunantys 37°C temperatūroje. Esant didesnei nei 35 proc. poloksamero koncentracijai, jis skystoje terpėje ištirpsta nepilnai, todėl gelius pagaminti yra sudėtinga [20, 45, 77].
3.2.4. Eksperimentinių propolio hidrogelių fizikinių ir cheminių savybių nustatymas
Nustatytos eksperimentinių hidrogelių fizikinės ir cheminės savybės – pH, klampa, reologiniai rodikliai (konsistencijos koeficientai, tekėjimo indeksai), atsparumas deformacijai ir klampos priklausomybė nuo temperatūrinių pokyčių. Hidrogelių atsparumas deformacijai nustatytas reometru, veikiant hidrogelius 300 sekundžių didėjančia deformacija (amplitude) nuo 0,1 iki 100 proc., esant 20°C temperatūrai, kai kampinis dažnis 10 rad/s. Eksperimentinių propolio hidrogelių reologiniai rodikliai nustatyti 20°C temperatūroje, naudojant reometrą ir taikant kūgio–plokštelės geometrinę sistemą (kūgio skersmuo – 60 mm, kūgio kampas 2°, mėginio storis – 0,207 μm). Deformacijos greitis didintas 1 min.nuo 0,1 iki 100 s-1. Eksperimentinių hidrogelių klampa matuota reometru 20°C temperatūroje 20
sekundžių, kai poslinkio greitis 1 s-1. Hidrogelių pH buvo matuojamos pH–metru kambario
temperatūroje. Eksperimentinių hidrogelių klampos priklausomybė nuo temperatūrinių pokyčių nustatyta reometru, kai temperatūra kito 1°C kas 15 sek. trimis etapais:i) nuo 20°C iki 4°C laipsnių (240 sek.), ii) nuo 4°C iki 40°C laipsnių (540 sek.) ir iii) nuo 40°C iki 20°C laipsnių (300 sek.).
3.2.5. Akceptorinės terpės parinkimas in vitro atpalaidavimo tyrimams
Propolio žaliava tirpinta 10 proc., 15 proc. ir 20 proc. propilenglikolio vandeniniuose tirpaluose, kai žaliavos ir tirpiklio santykis 1:10. Mišiniai purtyti 100 aps./min. greičiu termostatinėje purtyklėje 24 val., palaikant 32°C temperatūrą. Mėginiai filtruoti pro 0,22 μm polivinilideno difluorido (PVDF) membraninius švirkštų filtrus (Q-Max® RR Syringe Filters, Frisenette ApS, Knebel, Danija) ir analizuoti
efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
3.2.6. Fenolinių rūgščių ir vanilino atpalaidavimo in vitro tyrimas
Propolio fenolinių junginių atpalaidavimo iš eksperimentinių hidrogelių in vitro tyrimai atlikti naudojant Franz tipo modifikuotas difuzines celes. Plotas, pro kurį vyko difuzija – 1,13 cm2. Donorinės
fazės begalinė dozė (1,01 ± 0,01 g) talpinta į difuzinę celę su regeneruotos celiuliozės dializės membrana Cuprophan® (Medicell International Ltd., Londonas, Didžioji Britanija). Membranos prieš eksperimentą laikytos 32°C temperatūros išgrynintame vandenyje, kad išbrinktų. Akceptorinė terpė (20 proc. propilenglikolio vandeninis tirpalas) ir jos pasirinktas tūris užtikrino fenolinių rūgščių ir vanilino tirpimą ir tirpumą. Akceptorinė terpė maišyta magnetine maišykle palaikant 32 ± 0,5°C temperatūrą. Po 0,5, 1, 2, 3, ir 4 val. imti akceptorinės terpės mėginiai, įpilant tokį patį šviežios akceptorinės terpės tūrį. Mėginių analizė vykdyta efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
3.2.7. Statistinis duomenų vertinimas
Gauti rezultatai analizuoti naudojant Microsoft Office Excel 2013 ir SPSS 24.0 statistinius duomenų analizės paketus. Skaičiuoti gautų rezultatų imčių vidurkiai, standartiniai nuokrypiai, determinacijos koeficientai, Spirmeno ranginės koreliacijos koeficientas, taikytas vieno faktoriaus dispersinės analizės modelis (One-Way ANOVA), naudojant LSD (angl. Least Significant Difference) kriterijų ir Mann‘o-Whitney U testas. Statistinio reikšmingumo lygmuo yra p < 0,05. Hidrogelių sudėties
optimizavimas atliktas naudojant Design–Expert 6.0 paketą ir taikant paviršiaus atsako vieno faktoriaus modelį.
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
4.1. Propolio vandeninės ištraukos kokybinės ir kiekybinės sudėties vertinimas
Tirti propolio fenoliniai junginiai – vanilo, kavos, p-kumaro, ferulo rūgštys ir vanilinas – yra santykinai lipofiliški (logP 1–2). Junginių lipofiliškumas nusakomas oktanolis–vanduo pasiskirstymo koeficientu (logP). Propolio fenolinių junginių lipofiliškumo didėjimo tvarka (pagal foodb.ca ChemAxon šaltinį): vanilo rūgštis (logP 1,17), vanilinas (1,22), kavos rūgštis (1,53), ferulo rūgštis (1,67), p-kumaro rūgštis (1,83). Dėl riboto lipofilinių junginių įterpimo į hidrogelių vandeninę fazę, ieškoma būdų, kaip šią problemą išspręsti. Siekiant padidinti šių junginių tirpumą vandenyje, gali būti naudojami ciklodekstrinai [10, 36]. Ciklodekstrinų molekulės turi hidrofilinį išorinį paviršių ir hidrofobinę vidinę ertmę, į kurią gali įsiterpti vaisto molekulės hidrofobinė sritis ir vandeniniuose tirpaluose suformuojami tirpūs kompleksai [10]. Tirtų propolio fenolinių junginių tirpumas vandenyje (pagal foodb.ca) yra: vanilo rūgštis 5,07 mg/ml, vanilinas 5,05 mg/ml, kavos rūgštis 1,61 mg/ml, p-kumaro rūgštis 1,02 mg/ml, ferulo rūgštis 0,906 mg/ml. Pagal Europos farmakopėją [24] ferulo rūgštis yra labai mažai tirpi vandenyje (0,1–1 mg/ml), visi kiti tirti junginiai yra mažai tirpūs vandenyje (1–10 mg/ml). Siekiant pagerinti šių propolio fenolinių junginių tirpumą vandenyje, naudotas metil-β-ciklodekstrino vandeninis tirpalas. Šis sintetinis ciklodekstrinų darinys yra netoksiškas ir tinkamas vartoti vietiškai. Jo tirpumas vandenyje (> 500 mg/ml) yra didesnis nei α-, β-, ar γ-ciklodekstrino (18,5– 232 mg/ml). Dėl struktūroje esančių metilo grupių šis ciklodekstrinas gali skverbtis pro biologines membranas ir padidinti vaistinių medžiagų pernešimą. Tirpius kompleksus su vaistine medžiaga sudaro efektyviau (kai koncentracija 0,5–50 mmol/l) nei kitas sintetinis darinys – hidroksipropil-β-ciklodekstrinas [10, 27]. Propolio fenolinių junginių (vanilo, kavos, p–kumaro ir ferulo rūgščių ir fenolinio aldehido vanilino) tirpumui pagerinti buvo naudotas 5 proc. metil-β-ciklodekstrino vandeninis tirpalas. Vandeninės propolio ištraukos kokybinė ir kiekybinė sudėtis pateikta 4 paveiksle.Vandeninėje ištraukoje iš Lietuvoje surinktos propolio žaliavos nustatyta 1303,9 ± 275,4 μg/ml fenolinių junginių. Didžiausias išekstrahuotas kiekis buvo p-kumaro rūgšties – 550,1 μg/ml, ferulo rūgšties ir vanilino išekstrahuota atitinkamai 274,6 μg/ml ir 271,3 μg/ml. Vanilo rūgšties ir kavos rūgšties išekstrahuota atitinkamai 3 ir 22,5 karto mažiau nei p-kumaro rūgšties. Fenolinių junginių procentinė dalis vandeninėje propolio ištraukoje: p-kumaro rūgšties 42,2 proc., ferulo rūgšties 21,1 proc., vanilino 20,8 proc., vanilo rūgšties 14,1 proc., kavos rūgšties 1,9 proc.
Gauti duomenys parodė, kad metil-β-ciklodekstrinas pagerina fenolinių junginių tirpumą vandenyje, nes fenolinių junginių išekstrahuota iki 5 kartų daugiau nei išekstrahuojama vandeniu [80].
4 pav. Vandeninės propolio ištraukos kokybinė ir kiekybinė sudėtis
Gauti rezultatai patvirtina Ramanauskienės M. ir kt. [64] atlikto tyrimo duomenis, kad Lietuvoje surinktoje propolio žaliavoje vyraujančios fenolinės rūgštys yra p-kumaro ir ferulo rūgštys, bei fenolinis aldehidas vanilinas [79].
4.2. Eksperimentinių propolio hidrogelių fizikinių ir cheminių savybių vertinimas
Deformacijos tyrimas taikomas siekiant nustatyti sistemų atsparumo deformacijai ribą. Sistemos atsparumą deformacijai parodo lygiagrečios elastingumo modulio ir klampos modulio kreivės ir tai vadinama linijiniu viskoelastiniu intervalu (LVI) [6]. Kai G′ ir G″ kreivės tampa nelygiagrečios, sistema pasidaro neatspari deformacijai, o kreivių susikirtimo tarškas parodo sistemos pokyčius [11]. Neniutoniniams skysčiams (puskietėms sistemoms) yra būdinga, kad G′ > G″, o niutoniniams skysčiams – G′ < G″. 5 paveiksle pavaizduotas eksperimentinių hidrogelių atsakas į veikiančią deformaciją.Visos eksperimentinių hidrogelių formuluotės (5 paveikslas B–H), išskyrus formuluotę HG–15 (5A paveikslas), demonstravo neniutoniniams skysčiams būdingą atsaką į deformaciją. Šių hidrogelių atsparumas deformacijai didėjo šia tvarka: HG–20P (0,182 proc.), HG–20 (0,287 proc.), HG–25P (0,414 proc.), HG–30P (0,418 proc.), HG–25 (0,527 proc.), HG–35 (0,531 proc.), HG–30 (0,535 proc.). Tuo tarpu hidrogelis HG–15, kurio sudėtyje buvo 15 proc. poloksamero 407, demonstravo niutoniniams skysčiams būdingą atsaką į deformaciją. Įterpus vandeninę propolio ištrauką į hidrogelį, puskietės sistemos atsparumas deformacijai statistiškai reikšmingai (p < 0,05) sumažėjo 1,3–1,6 karto.
Kavos rūgštis Vanilo rūgštis Vanilinas Ferulo rūgštis p-kumaro rūgštis
F enol ini ų jung ini ų ki eki s (μg /m l)
5 pav. Hidrogelių LVI nustatymas amplitudės (deformacijos) testu, A – HG–15 amplitudė, B – HG–
35 amplitudė, C – HG–20 amplitudė, D – HG–20P amplitudė, E –HG–25 amplitudė, F – HG–25P amplitudė, G – HG–30 amplitudė, B – HG–30P amplitudė
0.000001 0.00001 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 Pa γ (proc.) G' G'' A 0.1 10 1000 100000 0.1 1 10 100 Pa γ (proc.) G' G'' B 0.1 10 1000 100000 0.1 1 10 100 Pa γ (proc.) G' G'' C 0.1 10 1000 100000 0.1 1 10 100 Pa γ (proc.) G' G'' D 0.1 10 1000 100000 0.1 1 10 100 Pa γ (proc.) G' G'' E 0.1 10 1000 100000 0.1 1 10 100 Pa γ (proc.) G' G'' F 0.1 10 1000 100000 0.1 1 10 100 Pa γ (proc.) G' G'' G 0.1 10 1000 100000 0.1 1 10 100 Pa γ (proc.) G' G'' H
Literatūros duomenimis, didėjant poloksamero koncentracijai, susidaro daugiau skersinių jungčių tarp polimero molekulių, todėl struktūra yra tankesnė ir tvirtesnė. Tai didina struktūros atsparumą deformacijai [45]. Statistinė analizė parodė, kad didėjant poloksamero koncentracijai formuluotėje nuo 20 proc. iki 30 proc., hidrogelio LVI statistiškai reikšmingai (p < 0,05) didėja iki 1,8 karto. Tarp hidrogelių HG–30 ir HG–35 atsparumo deformacijai nebuvo statistiškai reikšmingo skirtumo (p > 0,05).
Tekėjimo kreivės parodo poslinkio įtempio (τ) priklausomybę nuo poslinkio greičio (γ͘), kuri leidžia nustatyti, ar sistema elgiasi kaip niutoninis ar neniutoninis skystis. Eksperimentinių hidrogelių tekėjimo kreivės pavaizduotos 6 paveiksle.
6 pav. A – HG-20, HG–20P tekėjimo kreivės, B – HG–25 ir HG–25P tekėjimo kreivės, C – HG–30 ir HG–30P tekėjimo kreivės
Visos eksperimentinių hidrogelių reogramos atitinka Ostwald-de-Waelle (Power Law) matematinį modelį (R2 = 0,720–0,983). Jis apskaičiuojamas pagal formules σ = kγ͘n, kai σ – poslinkio
įtempis, k – konsistencijos koeficientas , γ͘͘͘͘͘ – poslinkio greitis, n – tekėjimo indeksas. Įterpus vandeninę propolio ištrauką į hidrogelį, kurio sudėtyje buvo 25 proc. ar 30 proc. poloksamero 407, poslinkio įtempis buvo mažesnis. Tuo tarpu, įterpus į hidrogelį HG–20, įtempio pokytis nėra stebimas. Tirtos puskietės sistemos demonstravo pseudoplastišką elgesį, kuris būdingas neniutoniniams skysčiams. Įvertinus hidrogelių HG–15, HG–20 ir HG–20P, kurių sudėtyje buvo 15–20 proc. poloksamero 407,
0 200 400 600 800 1000 1200 0 200 400 600 800 1000 τ (P a) γ͘ (s-1) HG–20 HG–20P A 0 200 400 600 800 1000 1200 0 200 400 600 800 1000 τ (P a) γ͘ (s-1) HG–25 HG–25P B 0 200 400 600 800 1000 1200 0 200 400 600 800 τ (P a) γ͘ (s-1) HG–30 HG–30P C
kreivės tiesiškumą, gautos determinacijos koeficiento reikšmės (R2 = 1 ) patvirtina kreivės tiesiškumą.
Šios puskietės sistemos gali būti priskiriamos niutoniniams skysčiams. Tai patvirtina ir gauti tekėjimo indeksai (lentelėje), kurių reikšmės > 0,923. Nors hidrogeliai HG–20 ir HG–20P deformacijos tyrimo metu rodė geliams būdingą elgesį, jų tekėjimo kreivės (6A paveikslas) yra būdingos niutoniniams skysčiams. Hidrogeliai HG–20 ir HG–20P tekėjo kaip niutoniniai skysčiai dėl to, kad tyrimo metu palaikyta 20°C temperatūra yra žemesnė nei šių sistemų tirpalas–gelis virsmo temperatūra [20, 33]. Neniutoninis tekėjimas yra būdingas poloksamerų sistemoms, esant aukštesnei nei tirpalas–gelis virsmo temperatūrai [6].
Eksperimentinių hidrogelių konsistencijos koeficientų, tekėjimo indeksų klampos ir pH reikšmės pateiktos 3 lentelėje.
3 lentelė. Propolio hidrogelių pH, klampa ir reologiniai rodikliai
Mažiausias konsistencijos koeficientas buvo HG–15 sudėties hidrogelio, kurio sudėtyje buvo 15 proc. poloksamero 407. Didžiausias konsistencijos koeficientas buvo HG–35 hidrogelio, kurio sudėtyje 35 proc. poloksamero 407. Didėjant poloksamero koncentracijai nuo 15 proc. iki 35 proc., hidrogelio konsistencijos koeficientas statistiškai reikšmingai (p <0,05) didėjo. Statistinė duomenų analizė parodė, kad hidrogelių HG–15 ir HG–20 konsistencijos koeficientai statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p > 0,05). Vertinant vandeninės propolio ištraukos įtaką hidrogelių konsistencijai, kuriuose poloksamero 407 koncentracijos vienodos, nustatyta, kad vandeninės propolio ištraukos pridėjimas statistiškai reikšmingos įtakos konsistencijos koeficientui neturi (p > 0,05). Šie rezultatai patvirtina Bruschi M. L. ir kt. [12] gautus puskiečių preparatų su propoliu reologijos tyrimų rezultatus, kad propolio ekstrakto pridėjimas puskiečio preparato konsistencijos koeficientui neturi.
Hidrogelių, kurių sudėtyje buvo 25–35 proc. poloksamero 407, tekėjimo indekso reikšmės buvo mažesnės nei 0,224 ir tai patvirtina jų neniutoninį elgesį. Hidrogeliai, kurių sudėtyje buvo 15–20 proc.
Gelio kodas Reologiniai rodikliai Klampa (Pa·s) pH Konsistencijos koeficientas (Pa·s)n Tekėjimo indeksas R 2 HG–15 0,129 ± 0,019 0,942 ± 0,013 0,885 ± 0,020 0,02 ± 0,01 7,21 ± 0,01 HG–20 0,279 ± 0,084 0,923 ± 0,056 0,962 ± 0,040 0,17 ± 0,02 7,34 ± 0,01 HG–20P 0,281 ± 0,118 0,940 ± 0,058 0,978 ± 0,029± 0,22 ± 0,03 4,86 ± 0,01 HG–25 154,195 ± 6,329 0,213 ± 0,003 0,983 ± 0,003 268,97 ± 13,88 7,50 ± 0,01 HG–25P 131,800 ± 4,158 0,213 ± 0,001 0,974 ± 0,016 263,23 ± 13,65 5,06 ± 0,01 HG–30 257,285 ± 7,559 0,216 ± 0,002 0,948 ± 0,032 543,96 ± 22,66 7,64 ± 0,01 HG–30P 239,325 ± 2,185 0,224 ± 0,007 0,970 ± 0,001 492,35 ± 28,23 5,20 ± 0,01 HG–35 748,635 ± 54,567 0,182 ± 0,014 0,720 ± 0,034 806,33 ± 38,55 7,73 ± 0,01
poloksamero, tekėjimo indekso reikšmės buvo didesnės nei 0,923 ir tai patvirtina jų niutoninį elgesį. Vertinant vandeninės propolio ištraukos įtaką hidrogelių reologinėms savybėms, kuriuose poloksamero 407 koncentracijos vienodos, nustatyta, kad vandeninės propolio ištraukos pridėjimas tekėjimo indeksams statistiškai reikšmingos (p > 0,05) įtakos neturi.
Didėjant poslinkio greičiui, puskietėse sistemose, kurioms būdingas neniutoninis tekėjimas, įvyksta struktūriniai pokyčiai – suardomi vidiniai ryšiai tarp polimero molekulių ir jos išsidėsto pagal veikiančio poslinkio kryptį. Tai lemia klampos sumažėjimą [22, 60]. Mažiausia klampa buvo hidrogelio HG–15, kurio sudėtyje buvo 15 proc. poloksamero 407. Didžiausia klampa buvo hidrogelio HG–35, kurio sudėtyje buvo 35 proc. poloksamero 407. Didėjant poloksamero koncentracijai hidrogelyje nuo 15 proc. iki 35 proc., hidrogelių klampa statistiškai reikšmingai (p < 0,05) didėjo. Didėjant poloksamero koncentracijai, didėja polimero micelių kiekis tūrio vienete. Dėl šios priežasties susidaro daugiau vidinių ryšių tarp gretimų micelių, sumažėja atstumas tarp jų, todėl hidrogelis tampa tvirtesnis ir klampesnis [77]. Vertinant vandeninės propolio ištraukos įtaką hidrogelių klampai, kuriuose poloksamero 407 koncentracijos vienodos, nustatyta, kad vandeninės propolio ištraukos pridėjimas statistiškai reikšmingos įtakos hidrogelių klampai neturi (p > 0,05).
Eksperimentinių hidrogelių be propolio pH yra 7,21–7,73, vandeninės propolio ištraukos pH buvo 4,15 ± 0,03. Pagamintų hidrogelių su vandenine propolio ištrauka pH buvo 4,86–5,20. Hidrogelių su vandenine propolio ištrauka pH buvo 1,5 mažesnė, lyginant su hidrogeliais be propolio ištraukos. Toks pH skirtumas galėjo būti susijęs su propolio junginiais, pasižyminčiais rūgštinėmis savybėmis (pvz., fenolinės rūgštys, kurių pKa 3,27–4,16). Eksperimentinių propolio hidrogelių pH yra artimas odos paviršiaus pH 4–6. Dermatologinis preparatas odos nedirgina, kai pH vertės yra 4,5–6,5 ribose [3]. Todėl pagaminti eksperimentiniai propolio hidrogeliai gali būti vartojami ant odos.
4.3. Akceptorinės terpės parinkimas in vitro atpalaidavimo tyrimams
Remiantis literatūros duomenimis in vitro atpalaidavimo tyrimams iš hidrogelio kaip akceptorinę terpę naudojant vandenį, gali būti atpalaiduojama iki 100 proc. veikliųjų junginių [9, 60, 79]. Tai lemia gelio tirpimas, kuris vyksta atpalaidavimo tyrimo metu vandeniui skverbiantis pro membraną į donorinę fazę [9, 29, 53, 79]. Siekiama modifikuoti terpę, kuri, užtikrindama fenolinių junginių atpalaidavimą, mažiau skverbtųsi į hidrogelį ir tirpintų. Akceptorinės terpės modifikavimui gali būti pasirinktas propilenglikolis. Jis yra su vandeniu besimaišantis tirpiklis, jo oktanolis/vanduo pasiskirstymo koeficientas yra neigiamas (logP = –1,41). Propilenglikolis sąveikauja su kitomis poloksamero sritimis nei vanduo, todėl mažiau veikia jo tirpimą, kai propilenglikolio–vandens masių santykis ne didesnis kaip 5,5:1 [41]. Be to, propilenglikolio vandeniniai tirpalai yra klampesni už
vandenį [1]. Esant klampesnei akceptorinei terpei, ji lėčiau skverbiasi į hidrogelį ir mažiau jį tirpina. Kristina Ramanauskienė ir kt. [67] , nustatė, kad daugiau fenolinių junginių ištirpsta vandeniniame propilenglikolio tirpale nei išgrynintame vandenyje. Dėl šių savybių propilenglikolis pritaikomas akceptorinės terpės modifikavimui tiriant fenolinių junginių atpalaidavimą in vitro.
Tyrimo metu buvo nustatoma skirtingų koncentracijų (10 proc., 15 proc., 20 proc.) propilenglikolio (PG) vandeninių tirpalų įtaka propolio fenolinių junginių tirpumui. Fenolinių junginių tirpumas skirtingų koncentracijų propilenglikolio vandeniniuose tirpaluose pateiktas 4 lentelėje.
4 lentelė. Fenolinių rūgščių ir vanilino tirpumas propilenglikolio (PG) vandeniniuose tirpaluose PG,
proc.
Fenolinių junginių tirpumas, μg/ml
Vanilo r. Kavos r. Vanilinas p-kumaro r. Ferulo r. Suma
10,0 106,3 ± 7,7 14,0 ± 1,2 141,5 ± 7,4 191,2 ± 11,7 100,1 ± 3,0 553,1 ± 19,3 15,0 114,5± 12,4 17,4 ± 2,2 170,6 ± 18,4 212,0 ± 18,3 115,9 ± 15,0 630,3 ± 59,9 20,0 114,0 ± 18,1 19,6 ± 2,7 180,2 ± 26,5 233,2 ± 31,3 130,9 ± 20,8 678,0 ± 95,1
Didžiausias suminis tirtų fenolinių junginių kiekis nustatytas 20 proc. propilenglikolio vandeniniame tirpale. Tai yra 1,1–1,2 daugiau nei atitinkamai 15 proc. ir 10 proc. propilenglikolio vandeniniuose tirpaluose. Nustatytas reikšmingas skirtumas (p < 0,05) tarp 10 proc. ir 20 proc. propilenglikolio vandeniniuose tirpaluose ištirpusio fenolinio junginių kiekio. Ištirpusio fenolinių junginių kiekio skirtumas 15 proc. ir 20 proc. propilenglikolio vandeniniuose tirpaluose buvo nereikšmingas (p > 0,05). Vertinant atskirų fenolinių junginių tirpumas propilenglikolio vandeniniuose tirpaluose didėja tvarka: kavos rūgštis < vanilo rūgštis < ferulo rūgštis < vanilinas < p-kumaro rūgštis.
Remiantis gautais duomenimis, in vitro atpalaidavimo tyrimams pasirinkta akceptorinė terpė – 20 proc. propilenglikolio vandeninis tirpalas.
4.4. Fenolinių rūgščių ir vanilino atpalaidavimo in vitro iš eksperimentinių
propolio hidrogelių vertinimas
Suminio fenolinių junginių srauto iš eksperimentinių propolio hidrogelių kinetika pavaizduota 7 paveiksle ir įvertinta pagal nulinės eilės, pirmos eilės ir Higuchi matematinius modelius (5 lentelė).
