Kauno technologijos universitetas Cheminės technologijos fakultetas
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Farmacijos fakultetas
Mikroemulsijų su lidokainu modeliavimas ir biofarmacinis
vertinimas
Baigiamasis magistro projektas
Indrė Bertulytė Projekto autorė
Prof. dr. Vitalis Briedis Vadovas
Kauno technologijos universitetas Cheminės technologijos fakultetas
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Farmacijos fakultetas
Mikroemulsijų su lidokainu modeliavimas ir biofarmacinis
vertinimas
Baigiamasis magistro projektas
Medicininė chemija (6281CX001)
Indrė Bertulytė Projekto autorė
Prof. dr. Vitalis Briedis Vadovas
Lekt. dr. Vaida Juškaitė Recenzentė
Kauno technologijos universitetas Cheminės technologijos fakultetas
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Farmacijos fakultetas
Indrė Bertulytė
Mikroemulsijų su lidokainu modeliavimas ir biofarmacinis
vertinimas
Akademinio sąžiningumo deklaracija
Patvirtinu, kad mano, Indrės Bertulytės, baigiamasis projektas tema „Mikroemulsijų su lidokainu modeliavimas ir biofarmacinis vertinimas“ yra parašytas visiškai savarankiškai ir visi pateikti duomenys ar tyrimų rezultatai yra teisingi ir gauti sąžiningai. Šiame darbe nei viena dalis nėra plagijuota nuo jokių spausdintinių ar internetinių šaltinių, visos kitų šaltinių tiesioginės ir netiesioginės citatos nurodytos literatūros nuorodose. Įstatymų nenumatytų piniginių sumų už šį darbą niekam nesu mokėjęs.
Aš suprantu, kad išaiškėjus nesąžiningumo faktui, man bus taikomos nuobaudos, remiantis Kauno technologijos universitete galiojančia tvarka.
Indrė Bertulytė. Mikroemulsijų su lidokainu modeliavimas ir biofarmacinis vertinimas. Baigiamasis magistro projektas / vadovas prof. dr. Vitalis Briedis; Kauno technologijos universitetas, Cheminės technologijos fakultetas; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas.
Medicininė chemija: chemija, fiziniai mokslai.
Reikšminiai žodžiai: mikroemulsijos, lidokainas, biofarmacinis vertinimas. Kaunas, 2019. 53 psl.
Santrauka
Šio darbo tikslas – pagaminti stabilias mikroemulsijų sistemas, pritaikyti jas vaistinės medžiagos (lidokaino) įterpimui, nustatyti kokybės parametrus bei atlikti biofarmacinį vertinimą.
Darbo uždaviniai: parinkti mikroemulsijų (ME) gamybai tinkamus komponentus bei sudaryti ME pseudo-trinares fazių diagramas, gamybai naudojant skirtingus surfaktanto – kosurfaktanto (S/KoS) santykius 5:1, 6:1, 7:1, remiantis šiomis diagramomis bei kritiniais kokybės parametrais, pasirinkti ME formuluotes tolimesniems tyrimų etapams; įvertinti sumodeliuotų ME sistemų kokybės parametrus, taip pat atlikti stabilumo tyrimus; sumodeliuotas ME pritaikyti vaistinės medžiagos įterpimui, įvertinti pagamintų ME sistemų kokybės parametrus, bei atlikti stabilumo tyrimus; atlikti modelinį ME su lidokainu biofarmacinį vertinimą.
Lidokaino kiekybinis vertinimas buvo atliktas naudojant validuotą ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodą. ME modeliavimui pasirinktas titravimo lipofiline faze metodas. Dinaminiu šviesos sklaidos metodu įvertinti ME dalelių dydžiai ir polidispersiškumo indeksai (PDI). Atliktas kokybinis ME parametrų nustatymas: viskozimetru buvo išmatuota ME klampa, konduktometru nustatytas ME elektrinis laidis, pH-metru įvertintos ME pH reikšmės. Atpalaidavimo in vivo ir skvarbos į odą ex vivo tyrimai vykdyti naudojant modifikuotas Franz ir Bronaugh tipo difuzines celes. ME modeliavimui pasirinktos pagalbinės medžiagos: Labrasol® (nejoninis surfaktantas), 1,2-propandiolis (kosurfaktantas), oleino rūgštis (aliejinė fazė). Sudarytos pseudo-trinarės fazių diagramos, ME gamybai naudojant skirtingus S/KoS santykius (5:1, 6:1 ir 7:1). Remiantis pseudo trinarėmis fazių diagramomis ir kokybės vertinimo kriterijais (vidutinis dalelių dydis (VDD), PDI ir smailių skaičius) pasirinktos trys kompozicijos ME gamybai, kurių S/KoS santykis 5:1, 6:1 ir 7:1. Sumodeliuotos ME pasižymėjo termodinaminiu stabilumu, vidutinis dalelių dydis varijavo nuo 79,53 ± 1,68 nm iki 81,16 ± 1,06 nm, nustatytas PDI ribose nuo 0,265 ± 0,002 iki 0,273 ± 0,006, ME pasižymėjo sąlyginai maža klampa nuo 37,20 ± 0,34 mPa*s iki 39,06 ± 0,70 mPa*s, elektrinio laidžio vertės patvirtino aliejus-vandenyje (A/V) dispersinės sistemos tipo egzistavimą, pH reikšmės, kurios buvo mažesnės už 6,5 patvirtino, kad sumodeliuotos ME yra tinkamos tolimesniam vystymui. Į ME formuluotes įterpta 10 % ir 15 % lidokaino. Lidokaino inkorporavimas į pasirinktas ME formuluotes turėjo įtakos ME kokybės parametrams, dėl manomo vaistinės medžiagos dalelių kaupimosi tarpfaziniame sluoksnyje, nustatytas VDD padidėjimas, taip pat PDI sumažėjimas, taip pat padidėjo klampa, elektrinis laidis bei pH (p < 0,05). Nepaisant pokyčių, ME su lidokainu kokybės parametrai atitiko ME keliamus reikalavimus: VDD < 200 nm, o PDI < 0,5. ME laikant pagreitinto stabilumo tyrimo sąlygomis (40 ˚C temperatūra, 75 ± 5 proc. santykinė drėgmė), nustatytas 5:1, 6:1 ir 7:1 ME VDD didėjimas (p < 0,05), kuris parodė, kad aukštesnė temperatūra ir santykinė drėgmė turėjo įtakos ME su lidokainu stabilumui. Atpalaidavimo tyrimai in vitro patvirtino, jog sumodeliuotos 5:1, 6:1 ir 7:1 ME geba atpalaiduoti vaistinę medžiagą, per 6 val. atpalaiduotas lidokaino kiekis 29,2 % - 42,04 %. Geriausia atpalaidavimo kinetika pasižymėjo lidokaino ME, kurioje S/KoS santykis 5:1. Ex vivo skvarbos į odą tyrimų rezultatai patvirtino, kad lidokaino skvarba į odą iš ME buvo efektyvesnė nei iš lidokaino kremo. Biofarmacinių tyrimų rezultatai leidžia teigti, kad ME yra tinkama vaisto forma lidokaino tiekimui į odą.
Indrė Bertulytė. Modeling and Biopharmaceutical Characterization of Lidocaine Containing Microemulsions. Master's Final Degree Project / supervisor prof. dr. Vitalis Briedis; Faculty of Chemical Technology, Kaunas University of Technology; Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences.
Medicine chemistry: Chemistry, Physical Sciences.
Keywords: microemulsions, lidocaine, biopharmaceutical charakterization. Kaunas, 2019. 53 pages.
Summary
Aim of study - to make stable microemulsions' systems, then to adapt them to the medicine (lidocaine) insertion, finally to evaluate quality parameters and to perform a biopharmaceutical evaluation. Objectives: to choose microemulsions' (ME) components that are already suitable for the production, to create pseudoternary phase diagrams when the production is based on the different surfactant – cosurfactant (S/CoS) relation. Taking these diagrams and critical quality parameters into consideration, it is also very important to make stability analysis. Moreover, it is necessary to moderate ME and prepare it for the incorporation, also to evaluate the quality parameters of the same ME, prepare stability analysis and do the simulative ME (with the lidocaine) evaluation.
Lidocaine's quality evaluation has been done while using validated ultra – high performance liquid chromatography method. For the ME modeling, the method of the lipophilic phase titration has been adopted. Dynamic light scattering method was chosen to evaluate the size of the ME particles and the polidispersity index (PDI). Viscosity measurements were performed using viscosimeter, electrical conductivity values were tested using conductivity meter, for pH measurements pH-meter was used. Finally, the release study in vivo and permeation study ex vivo was conducted while using modificated Franz and Bronaugh diffusion cells.
Auxiliary components for the ME modelling: Labrasol® (surfactant), 1,2-propandiol (cosurfactant), oleic acid (oil). Pseudoternary phase diagrams have been made while using different S/CoS relations (5:1, 6:1 ir 7:1) for the production of ME. Moreover, according to the quality evaluation criteria of the diagrams (average size of the particles (ASP), PDI and number of pics), three compositions have been chosen to prepare the ME (the relation of S/CoS of these compositions were 5:1, 6:1 and 7:1). These ME had thermodynamic stability, an average size of the particles were from 79,53 ± 1,68 nm to 81,16 ± 1,06 nm. They have also been determined in the terms of PDI which were from 0,265 ± 0,002 to 0,273 ± 0,006, the viscosity was quite small from 37,20 ± 0,34 mPa*s to 39,06 ± 0,70 mPa*s, the values of electric conductivity has proven the existence of the oil-water (O/W) dispersity system, pH values were lower than 6,5. The amount of lidocaine in the ME was from 10 to 15 percents and this has only proven the suitability of chosen ME. Furthermore, the incorporation of the lidocaine had an affect on the ME quality parameters, due to the entrechment of the medicine into the interfacial layer. Moreover, it was noticed that ASP and the viscosity got higher and PDI got lower, electric conductivity and pH also got higher (p < 0,05). If not taking these changes into the consideration, the quality parameters of the ME had met the requirements of ASP < 200 nm and PDI < 0,5. While holding ME in the accelerated research conditions (40 ˚C, 75 ± 5 percent of the relative humidity), it was noticed that the ME of the 5:1, 6:1, 7:1 had changes in VDD (p < 0,05), that had shown that higher temperature and such humidity have an affect on the stability of the ME with lidocaine. The release study in vitro has proven that modeled 5:1, 6:1 ir 7:1 ME with lidocaine have an ability to release the medicine, the released amount of the lidocaine was 29,2 % - 42,04 % over 6 hours. The best release kinetics were seen in the lidocaine's ME (the S/CoS relation 5:1). Ex vivo permeation study has also proven that such permeation from ME to the skin is more effective than the one from the cream made of the lidocaine. Finally, the biopharmaceutical studies' results have proven that ME is appropriate medicine form for the lidocaine's delivery into the skin.
Turinys
Santrumpų ir terminų sąrašas ... 8
Įvadas ... 9
1.Literatūros apžvalga ... 11
1.1 Mikroemulsijos ... 11
1.2 Mikroemulsijų gamybai naudojamų komponentų atranka ... 11
1.2.1 Surfaktanto reikšmė modeliuojant mikroemulsijas ... 11
1.2.2 Kosurfaktanto reikšmė modeliuojant mikroemulsijas ... 12
1.2.3 Lipofilinės fazės parinkimas mikroemulsijų modeliavimui ... 12
1.3 Mikroemulsijų ir emulsijų skirtumai ... 13
1.4 Mikroemulsijų klasifikacija, tipai ... 13
1.5 Mikroemulsijų gamyba ... 14
1.6 Mikroemulsijos kaip vaistinių medžiagų tiekimo sistemos ... 15
1.7 Mikroemulsijų kokybės parametrų vertinimas ... 16
1.8 Mikroemulsijų pritaikymas vaistų gamyboje ... 17
1.9 Vietinio poveikio mikroemulsijos ... 18
1.9.1 Vietinio poveikio mikroemulsijų modeliavimo ypatybės ... 18
1.9.2 Vaistinių medžiagų skvarba į odą iš vietinio poveikio mikroemulsijų ... 19
1.10 Mikroemulsijų pritaikymas vietinių anestetikų su lidokainu gamyboje ... 20
2. Medžiagos ir tyrimų metodai... 21
2.1 Tyrimo objektas ... 21
2.2 Ekspermentui naudoti įrenginiai ir medžiagos ... 21
2.3 Tyrimo metodai ir metodika ... 22
2.3.1 Lidokaino tirpumo nustatymas ... 22
2.3.2 Pseudo trinarių diagramų sudarymas ... 22
2.3.3 Mikroemulsijų gamyba ... 22
2.3.4 Mikroemulsijų su lidokainu gamyba ... 22
2.3.5 Termodinaminio stabilumo nustatymas ... 23
2.3.6 Mikroemulsijų dalelių dydžio ir polidispersiškumo indekso vertinimas... 23
2.3.7 Mikroemulsijų fizikinių - cheminių parametrų nustatymas ... 23
2.3.8 Mikroemulsijų stabilumo vertinimas ... 24
2.3.9 Lidokaino atpalaidavimo in vitro tyrimas ... 24
2.3.10 Lidokaino skarbos į odą tyrimas ex vivo ... 24
2.3.11 Lidokaino kiekybinio nustatymo metodika ... 25
2.3.12 Statistinis duomenų vertinimas ... 25
3.Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas ... 26
3.1 Komponentų atranka mikroemulsijų gamybai ... 26
3.2 Pseudo - trinarių fazių diagramų sudarymas ... 27
3.3 Mikroemulsijų modeliavimas ... 29
3.4 Mikroemulsijų formuluočių atranka ... 30
3.5 Mikroemulsijų stabilumo vertinimas ... 32
3.6 Mikroemulsijų su lidokainu gamyba ir kokybės parametrų nustatymas ... 33
3.7 Mikroemulsijų su lidokainu stabilumo vertinimas ... 39
3.8 Mikroemulsijų kokybės parametrų vertinimas stabilumo tyrimų metu ... 42
3.9.1 Atpalaidavimo tyrimas in vitro ... 44
3.9.2 Lidokaino skvarbos į odą vertinimas ... 45
Išvados ... 47
Literatūros sąrašas ... 48
Santrumpų ir terminų sąrašas Santrumpos:
A/V – aliejus-vandenyje tipo dispersinė sistema HLB – hidrofilinis-lipofilinis balansas
S/KoS – surfaktanto-kosurfaktanto mišinys PAM – paviršinio aktyvumo medžiagos PDI – polidispersiškumo indeksas ME – mikroemulsijos
V/A – vanduo-aliejuje tipo dispersinė sistema VDD – vidutinis dalelių dydis
Įvadas
Vietinio veikimo anestetikai yra plačiai naudojami medicinoje skausmo, kuris sukeliamas skausmingų medicininių procedūrų metu, mažinimui, pvz. intraveninis kaniuliavimas, juosmens punkcijos, apipjaustymai, odos biopsijos ir kitos operacijos, kurioms reikalinga vietinė nejautra. Intraderminių vietinio veikimo anestetikų infiltracija užtikrina veiksmingą ir greitą analgeziją, tačiau infiltracijos procedūros deformuoja veikimo vietas, adatų dūriai yra skausmo ir diskomforto priežastis. Šiuo atveju, ant odos tepami vietinio veikimo anestetikai turi didelį pranašumą [2]. Lidokainas yra dažniausiai naudojamas vietinio veikimo anestetikas, pasižymintis maža alerginių reakcijų tikimybe bei vidutinės trukmės veikimu [1]. Šiuo metu yra didelė pasiūla farmacinių produktų su lidokainu, tokių kaip geliai, kremai, liposomos ir pleistrai. Tačiau atlikti tyrimai rodo, jog naudojant šiuos farmacinius produktus, susiduriama su keliomis svarbiomis problemomis: lėta vietinio anestetiko poveikio pradžia ir nepakankamu anestezijos poveikiu. Didelę įtaką vaisto veikimo pradžiai turi odos pralaidumas [3].
Tradiciniai kremai ar geliai negali užtikrinti efektyvaus bazinio lidokaino ar lidokaino HCl perėjimo per nepažeistos odos raginį sluoksnį stratum corneum, kuris atlieka odos barjero funkciją. Šią problemą bandoma spręsti tinkama formuluote, galinčia užtikrinti greitesnį veikimo pradžios laiką bei prailginti veikimo trukmę. Todėl lidokaino perėjimas per odos barjerą vis dar yra aktuali mokslinių tyrimų sritis [4,5].
Vis dažniau kaip šiuolaikinė vaisto forma yra naudojamos mikroemulsijos (ME). ME formuojasi spontaniškai, be jokių reikšmingų energijos sąnaudų, maišant aliejinę fazę su vandenine faze, naudojant PAM (paviršinio aktyvumo medžiagas) – surfaktantą, kosurfaktantą, todėl ME gamyba nereikalauja sudėtingų sąlygų ar brangių įrenginių [15]. Šios sistemos veikia kaip vaistų tirpikliai, gali ištirpinti hidrofilines, hidrofobines vaistines medžiagas, įskaitant ir tokias, kurios santykinai yra netirpios tiek hidrofiliniuose, tiek hidrofobiniuose tirpikliuose [18, 21]. ME pasižymi savybe gerinti vietinio poveikio vaistinių medžiagų biofarmacines savybes, t.y. gerina vaistinių medžiagų pernešimą per odos barjero funkcijas atliekantį raginį sluoksnį stratum corneum, bei užtikrina patekimą į gilesnius odos sluoksnius [11].
Mokslinių tyrimų rezultatai parodė, kad ME yra efektyvesnės vaistinių medžiagų tiekimo sistemos, nei įprastinės priemonės, tokios kaip hidrogeliai, emulsijos ir liposomos. Nustatyta, jog transderminis lidokaino prasiskverbimas yra geresnis iš ME nei iš emulsijos [6]. Pakankamai didelių lidokaino kiekių įterpimas į ME sudėtį, kuris užtikrintų greitą ir ilgalaikį anestetinį poveikį, vis dar išlieka iššūkiu. Šio tyrimo tikslas buvo sumodeliuoti vietinio poveikio ME, į kurias įterptos didelės lidokaino dozės (10 %, 15 %) ir ištirti sumodeliuotų ME biofarmacines savybes.
Darbo tikslas: pagaminti stabilias mikroemulsijų sistemas, pritaikyti jas vaistinės medžiagos (lidokaino) įterpimui, nustatyti kokybės parametrus bei atlikti biofarmacinį vertinimą.
Darbo uždaviniai:
1. atrinkti ME gamybai tinkamus komponentus bei sudaryti ME pseudo trinares fazių diagramas, gamybai naudojant skirtingus S/KoS santykius 5:1, 6:1, 7:1; remiantis šiomis diagramomis bei kritiniais kokybės parametrais, pasirinkti ME formuluotes tolimesniems tyrimų etapams. 2. įvertinti sumodeliuotų ME sistemų kokybės parametrus, taip pat atlikti stabilumo tyrimus. 3. sumodeliuotas ME pritaikyti vaistinės medžiagos įterpimui, įvertinti pagamintų ME sistemų
kokybės parametrus, bei atlikti stabilumo tyrimus.
1. Literatūros apžvalga 1.1 Mikroemulsijos
Mikroemulsijos – skaidrios, optiškai izotropinės ir termodinamiškai stabilios sistemos, dažniausiai sudarytos iš aliejaus, vandens ir paviršinio aktyvumo medžiagų (PAM), pasižyminčios mažu dalelių dydžiu, kuris dažniausiai svyruoja nuo 5nm iki 200 nm. ME kelia farmacijos pramonės susidomėjimą dėl saugumo, efektyvumo ir nesudėtingo paruošimo metodų, kurie nereikalauja brangios įrangos. ME sistemos yra puikus farmacinis įrankis vaistinių medžiagų kompozicijų, sudarytų tiek iš hidrofilinių, tiek iš hidrofobinių komponentų, besiskiriančių savo fizikocheminėmis savybėmis, pernešimui [18, 50, 35, 46].
1.2 Mikroemulsijų gamybai naudojamų komponentų atranka
ME panaudojimo galimybės farmacijos ir kosmetikos srityse priklauso nuo biologiškai ir farmaciškai suderinamų komponentų parinkimo, ypatingą dėmesį skiriant paviršinio aktyvumo medžiagoms (PAM). Tinkamų komponentų parinkimas, kosmetinio ir farmacininio naudojimo ME, yra vienas iš svarbiausių veiksnių norint įgyvendinti geros tiekimo sistemos reikalavimus, t.y padidinti vaistinių medžiagų skvarbą ar bioprieinamumą, užtikrinti saugią produkto sudėtį ir ilgą galiojimo laiką [9].
1.2.1 Surfaktanto reikšmė modeliuojant mikroemulsijas
Paviršinio aktyvumo medžiaga (surfaktantas) yra mažo ar vidutinio molekulinio svorio junginys, kurio sudėtyje yra viena hidrofobinė dalis, kuri paprastai lengvai tirpsta aliejuje, bet yra mažai tirpi ar visiškai netirpi vandenyje ir viena hidrofilinė dalis, kuri mažai tirpi arba netirpi aliejinėje fazėje, bet gerai tirpsta vandenyje. Pagrindinė ir pati svarbiausia surfaktanto paskirtis yra stabilizuoti ir mažinti paviršiaus įtemptį iki mažiausios reikšmės (< 10-3Mn/m) tarp aliejaus ir vandens fazių [15, 48].
ME modeliavimui naudojami nejoniniai, katijoniniai, anijoniniai ir cviterjoniniai surfaktantai. Savo universaliomis savybėmis išsiskiria nejoniniai surfaktantai, kurie pasižymi mažiau odą dirginančiomis savybėmis [13, 16, 48].Dėl šių savybių nejoniniai surfaktantai pasirenkami per os ir parenteraliai vartojamų biofarmacinių ME gamybai. Dažniausiai ME gamybai naudojami šie nejoniniai surfaktantai: gliceridai ar esteriai, riebalų rūgštys, tokios kaip lauro, palmitino, stearino ar oleino, taip pat diglicerido ar triglicerido riebalų rūgščių esteriai [14, 18]. Kai kuriais atvejais nejoniniai surfaktantai, tokie kaip polioksietileno n-alkilo esteriai (CnEm) pasižymi savybe formuoti mikroemulsijas be kosurfaktanto. Tai padeda sumažinti fazių funkcionavimo sudėtingumą bei pašalina reikalavimą įtraukti vidutinės grandinės alkoholį (kosurfaktantą) į ME gamybą, nes tik šie kosurfaktantai pasižymi žemu toksiškumu [17].
ME, kurių gamybai naudojami nejoniniai surfaktantai, yra jautresnės temperatūros pokyčiams dėl skirtingo komponentų tirpumo vandenyje nei tos, kurios pagamintos naudojant joninius surfaktantus. Padidėjus temperatūrai nejoninių surfaktantų tirpumas vandenyje sumažėja, o aliejinėje fazėje - padidėja. Esant aukštai temperatūrai toks fazių tirpumo skirtumas apsunkina ME susidarymą [58]. Anijoniniai surfaktantai yra toksiškesni, nei nejoniniai surfaktantai, o anijoniniai retai naudojami dėl itin didelio toksiškumo. Netoli izoelektrinio taško cviterjoniniai surfaktantai gali turėti neutralų krūvį, leidžiantį jiems elgtis panašiai kaip nejoniniams surfaktantams [18].
Santykis tarp hidrofilinių ir lipofilinių grupių nejoniniuose surfaktantuose yra vadinamas hidrofiliniu – lipofiliniu balansu (HLB) [31]. Mažo HBL (3-6) surfaktantai naudojami V/A ME gamybai, o aukšto
HBL (8-18) surfaktantai pasirenkami A/V ME modeliavimui. Joniniams surfaktantams, tokiems kaip natrio dodecilsulfatas, kurio HBL yra didesnis nei 20, reikalingi kosurfaktantai, sumažinantys HBL iki ME formavimuisi reikalingos ribos [16].
Formuluojant ME sistemas surfaktanto parinkimas yra vienas svarbiausių žingsnių. Mokslininkai (Furqan A. Maulvi ir kt.) ištyrė skirtingų surfaktantų grandinės ilgių poveikį (natrio kaprilatas (C8), Tween 20 (C12), Tween 80 (C18)) ME stabilumui ir vaisto atpalaidavimo kinetikai iš ME su ciklosporinu. Gauti tyrimo rezultatai parodė, kad ME stabilumas didėja, padidinus paviršinio aktyvumo medžiagų anglies grandinės ilgius ir pluronikų molekulinę masę [10]. Moksliniuose šaltiniuose teigiama, kad surfaktanto kiekis turėtų viršyti 25%, jog būtų išlaikyta ME mikrostruktūra ir pagerinama vaisto skvarba į odą [11].
1.2.2 Kosurfaktanto reikšmė modeliuojant mikroemulsijas
Priklausomai nuo formuluotės kompozicijos, ME gali būti su kosurfaktantu, arba be kosurfaktanto [16]. Kosurfaktanto paskirtis ME sistemose yra mažinti tarpfazinį paviršiaus įtempimą, pagerinti surfaktanto tirpumą, taip užtikrinant hidrofilinį-lipofilinį balansą tarpfaziniame sluoksnyje. Nejoniniai surfaktantai, alkoholiai, alkano rūgštys, alkano dioliai ir alkilaminai gali būti naudojami kaip kosurfaktantai [17]. ME gamybai dažniausiai naudojami kosurfaktantai yra trumpos grandinės n-alkoholiai, tokie kaip n-butanolis, n-heksanolis ir n-oktanolis. Pasirinkto n-alkoholio grandinės ilgis turi įtakos vandeninės fazės pasiskirstymui ir fazių tarpusavio sąveikai [12].
Kinijos mokslininkai (Ying Ling ir kt.) ištyrė sumaišytų kosurfaktantų sinergetinį poveikį indometacino transderminiam tiekimui iš A/V ME. Buvo įvertintos formuluotės su skirtingais kosurfaktantais, siekiant ištirti sumaišytų kosurfaktantų poveikį vaistinės medžiagos skvarbai į odą. Atlikti tyrimai parodė, jog keičiamos ME kosurfaktantų kompozicijos gali pagerinti vaisto skvarbą į odą [11].
1.2.3 Lipofilinės fazės parinkimas mikroemulsijų modeliavimui
ME gamybai, kaip lipofilinė fazė, gali būti naudojamos riebalų rūgštys (oleino r.), riebalų rūgščių esteriai ir alkoholiai (izopropilo miristatas, izopropilo palmitatas), vidutinės grandinės trigliceridai, triacetinas, terpenai (mentolis, limonenas, cineolis) ir kiti skvarbos stiprikliai. Lipofiline faze gali būti pavieniai komponentai, arba jų mišiniai [26]. Aliejinės fazės komponentai turi įtakos vaistinės medžiagos atpalaidavimui iš ME, vaistinės medžiagos tirpumui (įkrovos galia) ME, vaistinių medžiagų skvarbai į odą iš ME [54].
Aliejinės fazės parinkimas priklauso nuo vaisto pobūdžio, taip pat nuo vaisto vartojimo būdo. Ji dažniausiai parenkama įvertinus vaistinės medžiagos tirpumą joje, tačiau ankstesni tyrimai parodė, kad geresnis vaistinės medžiagos tirpumas šioje fazėje nebūtinai užtikrins geresnę vaistinių medžiagų skvarbą į odą, todėl kartais tinkamai parinktos lipofilinės fazės komponentų poveikis odai aktualesnis nei vaistinės medžiagos tirpumo pagerinimas. Pavyzdžiui, oleino rūgštis gerina membranos pralaidumą, skystindama poodinio sluoksnio lipidus. Aliejinės fazės komponentų poveikis odai gali priklausyti ir nuo visos ME sudėties; buvo nustatyta, kad oleino rūgšties veikimas yra efektyvesnis A/V ME [49, 54].
Apibendrinus mokslinėje literatūroje pateikiamą informaciją, galima tvirtinti, kad vyrauja didelė įvairovė pagalbinių medžiagų, kurios naudojamos ME gamybai. Pasirenkant šias medžiagas ME gamybai, svarbu įvertinti jų toksiškumą, suderinamumą ir papildomas savybes, kurios užtikrintų gerą skvarbą į odą ar pagerintų ME bioprieinamumą.
1.3 Mikroemulsijų ir emulsijų skirtumai
Tradicinės emulsijos yra termodinamiškai nestabilios dėl didelių dalelių, kurių dydis siekia nuo 100 nm iki 100 μm, tarpfazinės paviršiaus įtempties. Priešingai, nei emulsijos, ME yra termodinamiškai stabilios sistemos, kurios sudarytos iš vandens, aliejaus ir PAM. Jos pasižymi maža paviršiaus įtemptimi fazių sąlyčio taške, bei mažu dalelių dydžiu (5nm iki 200 nm). Abi sistemos yra tinkamos tiek hidrofobinių, tiek hidrofilinių vaistinių medžiagų įterpimui [25, 47, 51].
Vienas iš esminių skirtumų tarp ME ir emulsijų, yra tai, jog ME susiformavimo procesui pakanka švelnaus pašildymo ir maišymo, kai tuo tarpu emulsijos gamyba reikalauja didelių energijos sąnaudų - aukšto slėgio homogenizacijos ir ultragarso [46, 51]. ME gamybai dažniausiai naudojami didesni PAM (surfaktanto ir kosurfaktanto) kiekiai, o tai reiškia, kad naudojant tokias formuluotes, jos gali labiau dirginti odą.
Emulsijos yra drumstos ir klampios sistemos, priešingai nei ME, kurios pasižymi maža klampa ir yra skaidrios. Kalbant apie emulsijų ir ME išvaizdą gali pasitaikyti išimčių. Viena iš jų glaudžiai susijusi su optiniu kriterijumi. Emulsija taip pat gali būti optiškai skaidri, jei dviejų nesimaišančių fazių lūžio rodikliai yra panašūs. Kita išimtis, kai ME yra arti kritinio taško (kur yra tikimybė išsisluoksniuoti), gali būti neskaidri ir todėl gali būti painiojama su emulsija [46].
1.4 Mikroemulsijų klasifikacija, tipai
ME mikrostruktūra turi įtakos skirtingiems taikomųjų sričių fizikocheminiams parametrams. Išskiriamos trys pagrindinės ME mikrostruktūros: aliejus/vandenyje (A/V), vanduo/aliejuje (V/A), ir biištisinė struktūra (1 pav.).
1 pav. Mikroemulsijų struktūros: A- A/V mikroemulsija, B-biištisinė mikroemulsijos sistema, C- V/A
mikroemulsija [17].
Biištisinėje struktūroje, vandeninės ir aliejinės fazės komponentai yra padalinti į du daugkartinius tarpusavyje sujungtus subvienetus, kurių kiekvienas yra fiziškai nepertraukiamas ir gali skirtis sudėtimi. Paprastesnis būdas konceptualizuoti biištisinę ME struktūrą – įsivaizduoti tarpusavyje sujungtą hidrofilinės ir lipofilinės fazių kanalų tinklą, atskirtą monomolekuline surfaktanto (kartais sumaišyto su kosurfaktantu) plėvele [35, 46]. Biištisinės struktūros yra dinamiškos ir amfifiliškos, pasižymi geresne fliuktuacija, mažesne tarpfazine įtampa bei geresnėmis tirpumo savybėmis, lyginant su įprastomis A/V ir V/A ME [26].
Druskingumas, vandens kiekis, surfaktanto ir kosurfaktanto koncentracijos turi įtakos ME mikrostruktūrai. Esant didesniam vandeninės fazės kiekiui, ME gali būti išorinė vandens sistema su aliejumi, ištirpusiu micelių šerdyse. Nors mišiniai lieka vienfaziai ir termodinamiškai stabilūs, tačiau ME struktūra keičiasi dėl tarpinių būsenų. Šių tarpinių būsenų struktūra nėra gerai žinoma. Tačiau tirpalai yra termodinamiškai stabilūs ir izotropiniai. Druskingumas taip pat gali pakeisti ME struktūrą. Padidėjus druskingumui, tiesioginė ME keičiasi į atvirkščią ME. Esant mažam druskingumui sistema išlieka išorinėje vandens fazėje, tačiau padidinus druskingumą, sistema atskiriama į aliejaus išorinę ME [35].
Keturi pusiausvyros tipai pastebėti mikroemulsijų atžvilgiu:
1. Winsor Ⅰ – (dvifazė sistema) A/V ME egzistuojanti su aliejinės fazės pertekliumi.
2. Winsor Ⅱ – (dvifazė sistema) V/A ME egzistuojanti kartu su vandeninės fazės pertekliumi. 3. Winsor Ⅲ – (trifazė sistema) vidurinės fazės ME egzistuojanti kartu su vandeninės bei
aliejinės fazės pertekliumi.
4. Winsor Ⅳ – (vienfazė sistema) homogeninė sistema, kurioje lipofilinė fazė, hidrofilinė fazė bei PAM yra tarpusavyje ištirpę. Perėjimai tarp Winsor Ⅰ ir Winsor Ⅱ gali vykti esant FIT (fazių inversijos temperatūra) metodui [46, 18].
1.5 Mikroemulsijų gamyba
ME paprastai formuojasi spontaniškai, be jokių reikšmingų energijos sąnaudų, maišant aliejinę fazę su vandenine faze, naudojant PAM (paviršinio aktyvumo medžiagas) – surfaktantą, kosurfaktantą. Maišymo metu, surfaktantas yra adsorbuojamas dviejų fazių (aliejinės ir vandeninės) sąlyčio taške, o tai nulemia disperguotos fazės išlinkimą. Surfaktanto plėvelės išlinkimas reikalingas tam, jog būtų pasiektas minimalus paviršiaus įtempimas fazių sąlyčio taške [15, 17].
Modeliuojant ME gali būti taikomi šie metodai: fazių inversijos metodas (angl. phase inversion method) ir fazių titravimo metodas (angl. phase titration method) [15].
ME fazių inversijos metodas yra paremtas disperguotos fazės pridėjimu arba temperatūros padidėjimu. Fazių inversijos metu vyksta fizikiniai ME pokyčiai, įskaitant ir dalelių dydžio padidėjimą ar sumažėjimą, o tai gali turėti įtakos vaisto atpalaidavimui in vivo ir in vitro. ME, kurių sudėtyje yra nejoninės PAM, fazių inversiją galima vykdyti keičiant sistemos temperatūrą. Žemoje temperatūroje egzistuojanti A/V ME atitinkamai pakėlus temperatūrą gali pasikeisti į V/A ME. ME fazių inversijai įtakos gali turėti ne tik temperatūros, tačiau ir druskų koncentracijos, bei pH pokyčiai [26, 75].
ME dažniausiai yra ruošiamos taikant fazių titravimo metodą. Fazių titravimas - tai mažos energijos reikalaujantis emulsifikacijos metodas, kurio metu vyksta spontaniškai susidaranti PAM ar tirpiklio molekulių difuzija į nepertraukiamą fazę dėl itin mažos paviršiaus įtempties [54]. Fazių titravimas gali būti vykdomas S/KoS ir vandens mišinį titruojant lipofiline faze arba aliejinės fazės ir vandens mišinį titruojant hidrofiline faze [26].
ME susidarymo regionas vaizduojamas pasitelkiant fazių diagramas. Kadangi ketvirtinės fazių diagramos (keturių komponentų sistema) sudarymas reikalauja daug laiko, taip pat sunku jas analizuoti, todėl norint identifikuoti ME ir kitų sistemų susidarymo regionus dažniausiai naudojamos pseudo-trinarės fazių diagramos. Kiekvienas pseudo-trinarės fazių diagramos kampas atitinka 100% konkretaus (A,V ar S/KoS) komponento, 2 paveiksle pateikiama pseudo-trinarė diagrama, vaizduojanti kitų sistemų ir ME susidarymo regionus [15, 17, 25].
2 pav. Mikroemulsijų ir kitų sistemų susidarymo regionai [15].
Apibendrinus pateikiamą informaciją apie ME gamybą, galima teigti, kad ME, lyginant su emulsijomis ir daugeliu kitų sistemų, išsiskiria savo paruošimo paprastumu. ME paruošimo metodai yra paprasti ir greitai įgyvendinami, taip pat nereikalaujantys didelių materialinių išteklių.
1.6 Mikroemulsijos kaip vaistinių medžiagų tiekimo sistemos
Privalumai. ME intensyviai tyrinėjamos kaip vaistinių medžiagų tiekimo sistemos dėl savo išskirtinių savybių, tokių kaip paruošimo paprastumas, spontaniškas susidarymas, termodinaminis stabilumas, aukštas hidrofilinių ir lipofilinių veikliųjų medžiagų tirpumas, skaidri ir presciziška išvaizda, pagerinta skvarba per biologines membranas, pagerintas bioprieinamumas ir mažas farmakokinetinis kintamumas [19].
ME sistemos yra puikus farmacinis įrankis vaistinių medžiagų kompozicijų, sudarytų tiek iš hidrofilinių, tiek iš hidrofobinių komponentų, besiskiriančių savo fizikocheminėmis savybėmis, pernešimui [18]. Jos veikia kaip vaistų tirpikliai, gali ištirpinti hidrofilines, hidrofobines vaistines medžiagas, įskaitant ir tokias, kurios santykinai yra netirpios tiek hidrofiliniuose, tiek hidrofobiniuose tirpikliuose. Taip yra todėl, jog egzistuoja skirtingo poliškumo mikrodomenai vienfaziame tirpale. A/V ME yra tinkamiausios lipofilinėms vaistinėms medžiagoms pernešti, o V/A ME naudojamos hidrofilinėms vaistinėms medžiagoms tiekti. Taip pat galimas amfifilinių vaistinių medžiagų įterpimas į ME, kartais leidžiantis išplėsti ME egzistavimo ribas [21, 22]
Kietos formos vaistai turi gerai ištirpti, jog būtų pasisavinti organizme. Išskiriami trys pagrindiniai procesai reikalingi kietos vaisto formos pasisavinimui, vartojant per os: suirimas, ištirpimas, absorbcija. Vaisto suirimas yra būtinas, jog kietos dalelės ištirptų skystoje terpėje prieš absorbciją [24]. ME natūraliai yra skystos formos, todėl išvengiamas papildomas kietos vaisto formos skaidymo etapas. Mokslinių tyrimų rezultatai parodė, kad ME ir skystos vaisto formos pasižymi greitesne vaistų absorbcija [23].
ME dalelių dydis paprastai varijuoja nuo 10 nm iki 200 nm. Toks mažas dalelių dydis padidina paviršiaus ploto ir tūrio santykį vaisto absorbcijai, kartu pagerinamas vaisto bioprieinamumas. Taip pat mažas dalelių dydis gali pasipriešinti gravitaciniam išskaidymui, o tai reiškia pagerintą ME stabilumą [54]. Mokslinių tyrimų rezultatai parodė, kad ME ypač pagerina stabilumą ir bioprieinamumą šių vaistinių medžiagų: Aprepitano (chemoterapijos sukeltam pykinimui ir vėmimui
gydyti), Troxerutino (hidrofilinis vazoprotektorius), Fenofibrato (cholesterolio mažinimo agentas), Gatifloksacino (antibiotikas), Ritonaviro (ŽIV antiretrovirusinis vaistas) [18].
ME pagerina vietinio poveikio ir transderminių formuluočių biofarmacines savybes, pagerina vaistinių medžiagų skvarbą per odos raginį sluoksnį stratum corneum ir kitus odos sluoksnius. Ši savybė gali būti siejama su keliais skirtingais veiksniais, pavyzdžiui surfaktantų ir kosurfaktantų, kurie veikia kaip skvarbos stiprikliai, buvimas, didelis paviršiaus plotas, kuris susidaro dėl mažo dalelių skersmens, gera drėkinimo galimybė. Dalelių sistemose, vidinė fazė gali veikti kaip aktyvių farmacinių junginių rezervas, kuris difunduoja per išorinę fazę į aplikavimo vietą. Todėl koncentracijos gradientas tarp ištisinės fazės ir odos yra palaikomas tokiame pat lygmenyje [34, 54]. Trūkumai. ME užtikrina tiek hidrofilinių, tiek lipofilinių veikliųjų medžiagų tiekimą, tačiau pasitaiko išimčių, kuomet veiklioji medžiaga nepatenka nei į vieną iš šių kategorijų. Puikus to pavyzdys mineralinės medžiagos, pvz. kalcis, magnis ir pan., įterpus šias medžiagas į ME sistemas, formuojasi suspensijos. Tokiais atvejais, kieta vaisto forma, pvz. tabletė, gali būti geresnis pasirinkimas [18]. Veikliosios medžiagos turi būti tirpinamos atitinkamoje ME fazėje, tačiau tirpimo mastą dažnai riboja nepakankamas atitinkamos fazės tūris, todėl gali nepavykti įterpti reikiamo veikliosios medžiagos kiekio. Taip pat ME yra jautrios temperatūros ir druskingumo pokyčiams. Temperatūros ar druskingumo koncentracijų pokyčiai gali sukelti ME fazių atsiskyrimą [18].
1.7 Mikroemulsijų kokybės parametrų vertinimas
Svarbūs kriterijai, pagal kuriuos įvertinama suformuluotos ME kokybė: vidutinis dalelių dydis (VDD), polidispersiškumo indeksas (PDI), elektrinis laidis ir klampa, pH reikšmė.
ME VDD ir PDI gali būti nustatomas šviesos sklaidos arba elektronų mikroskopijos metodu [25, 36]. Dinaminė šviesos sklaida, kitaip vadinama fotonų koreliacijos spektroskopija (PCS), naudojama analizuoti lazeriu apšviečiamo mėginio, šviesos intensyvumo svyravimus, kuriuos sukelia mėginyje, esančių dalelių Brauno judesiai [26].
ME dalelių dydis gali koreliuoti su surfaktanto HLB reikšme. Surfaktantai, turintys mažą HLB reikšmę, linkę turėti mažiau hidratuotas polines grupes, nei surfaktantai su didesne HLB reikšme. PAM, kurių polinės grupės nelinkę didėti, suformuoja labiau kompaktiškas struktūras, t.y. mažesnes ME daleles [30]. ME dalelių dydis tiesiogiai koreliuoja su ME klampa, kuo mažesnės dalelės, tuo mažesnė klampa [30, 31].
Klampa yra svarbus kokybės rodiklis, turintis įtakos vaistinės medžiagos sulaikymui raginiame sluoksnyje stratum corneum ir gilesniuose epidermio sluoksniuose. Kai kurios gelifikuojančios medžiagos, tokios kaip karbopolis, ksantano derva ar karageninas, parenkamos pagerinti ME klampą. Taip suformuojami geliai ME pagrindu, pagerinami formuluotės sulaikymo odoje rodikliai bei skvarba į odą [27, 28, 35]. ME klampa taip pat turi įtakos ME stabilumui bei vaistinės medžiagos atpalaidavimui iš ME formuluočių. ME klampai įtakos turi jas sudarantys komponentai (surfaktantas, kosurfaktantas, aliejus, vanduo) bei jų koncentracijos ME formuluotėje. Pavyzdžiui, didesnis vandens kiekis ME sistemoje, lemia mažesnę klampą, o didesnis surfaktanto ir kosurfaktanto kiekis nulemia didesnę ME klampą, dėl padidėjusios paviršiaus įtempties tarp aliejinės ir vandeninės fazių. Klampos pokyčių stebėjimas yra skystų ir pusiau kietų preparatų, įskaitant ir ME formuluotes, stabilumo vertinimo metodas [26].
Elektrinio laidžio matavimai suteikia naudingos informacijos apie ME struktūrą, taip pat naudojami fazių inversijos reiškiniams ME nustatyti. Didelės elektrinio laidžio vertės yra būdingos A/V ME, o V/A ME pasižymi mažomis elektrinio laidžio vertėmis. Elektrinio laidžio matavimai yra pigūs, paprasti ir greiti, atliekami, prietaiso elektrodus įmerkus į ME formuluotę [29]. Žinoma, jog A/V ME
elektrinio laidžio reikšmės yra panašios į vandeninės fazės reikšmes. Nustatomos didelės elektrinio laidžio vertės dažniausiai dėl didelio procentinio vandens kiekio sistemoje, pagal tai ME priskiriama A/V tipui [37].
1.8 Mikroemulsijų pritaikymas vaistų gamyboje
Viena iš svarbiausių transderminių ME savybių, gebėjimas padidinti vaistinių medžiagų skvarbą per odą, taip padidinamas ME terapinis veiksmingumas. Kitas svarbus pranašumas, mažesnis veikliosios medžiagos kiekis kraujyje, nei vartojant per os, todėl vietinio poveikio formuluotės laikomos saugesnėmis. Be to, aplenkiant virškinamąjį traktą, išvengiama galimos veikliųjų medžiagų sąveikos [34]. Mokslininkai (Shahinaze A. Fouad ir kt.) sumodeliavo ir įvertino ME ir ME pagrindu pagamintą gelį, diklofenako epolamino transderminiam tiekimui. Optimizuota ME formuluotė (30 % Capryol®, 50 % S/KoS (Labrasol®/Transcutol® 1:2) ir 20 % H2O) išliko stabili tris mėnesius pagreitinto stabilumo tyrimo sąlygomis, bei nedirgino odos, todėl buvo saugi naudoti transderminiam vaistinės medžiagos tiekimui. Lyginant ME ir ME pagrindu pagamintą gelį ir Flector® komercinį kremą, didžiausią diklofenako epolamino transderminę skvarbą praėjus 8 valandoms parodė ME. ME reikšmingai pagerino transderminį diklofenako tiekimą [67].
Mokslinių tyrimų rezultatai rodo, kad lipidų pagrindu pagamintos ME gali pagerinti per os vartojamų vaistų bioprieinamumą, įskaitant ir peptidų. ME, naudojamos per os vartojamų vaistų gamybai, pasižymi šiais privalumais: pagerina vaistinių medžiagų tirpumą ir apsaugo nuo fermentų hidrolizės, taip pat pagerina vaistinių medžiagų absorbciją dėl PAM sukeltų membranos takumo ir pralaidumo pokyčių [63]. ME natūraliai yra skystos formos, todėl išvengiamas papildomas kietos vaisto formos skaidymo etapas, t.y. suirimas, ištirpimas [23]. Oraliai vartojamas insulinas buvo inkorporuotas į nano dydžio V/A ME, kurių gamybai buvo naudojama S80T80 ar PEG-7 (surfaktantai), etanolis (kosurfaktantas), ir izopropilo miristatas (lipofilinė fazė). Suformuotos ME pasižymėjo geru termodinaminiu stabilumu, esant 20 ˚C ir 40 ˚C temperatūrai. Pelių, kurios gavo sumodeliuotas ME su insulinu, kraujyje nustatytas gliukozės kiekis buvo 67 % mažesnis, lyginant su pelėmis, kurioms buvo duodamas insulino tirpalas [66].
ME sukėlė farmacijos pramonės susidomėjimą, jog dėl saugumo, efektyvumo ir patogumo galėtų būti pritaikomos oftalmologinių vaistų gamyboje. Grybelines akies ligas labai sunku gydyti, nes ligą sukėlę mikroorganizmai yra pasiskirstę akies audiniuose, o kai kurios vaistinės medžiagos pasižymi ne itin pakankama skvarba per rageną, jog pasiektų ligos sukėlėjus [51]. Mokslininkai (Kumar ir kt.) sumodeliavo ME su vorikonazolu. Atlikti ex vivo tyrimai parodė, jog ME pagerino vorikonazolo skvarbą per ragenos sluoksnį tris kartus lyginant su suspensija [64]. Be to, tyrimas parodė, jog ME turi mažiau dirginantį poveikį lyginant su kai kuriais rinkoje parduodamais akių lašais [15].
Apibendrinus mokslinės literatūros duomenis, galima tvirtinti, kad ME lyginant su kitomis vaisto formomis (emulsijos, kremai) išsiskiria savo privalumais. Dėl gebėjimo įterpti tiek hidrofobines, tiek hifdrofilines vaistines medžiagas, bei pagerinti jų skvarbą ir bioprieinamumą, gali būti pritaikomos įvairių farmacinių produktų gamybai.
Tyrimo metu buvo modeliuojamos vietinio poveikio ME su lidokainu, todėl kitame skyriuje išsamiau apžvelgiamos vietinio naudojimo ME, jų pritaikymas bei formulavimo ypatumai.
1.9 Vietinio poveikio mikroemulsijos
Vietinio poveikio ME yra perspektyvi vaisto forma, turinti privalumų. Dėl didelio vaistinių medžiagų kiekio, įterpiamo į ME formuluotę, padidinama vaistinių medžiagų termodinamika į odą. Pagerintas termodinaminis aktyvumas gali paskatinti geresnį vaisto pasiskirstymą odoje. ME komponentai gali sumažinti stratum corneum difuzinį barjerą ir pagerinti veikliųjų medžiagų skvarbą į odą, veikdami kaip skvarbos stiprikliai [32, 33].
Vietinio poveikio ME formuluotės lyginant su per os vartojamomis formuluotėmis turi keletą pranašumų. Veiklioji formuluotės medžiaga gali pasiekti uždegimo vietą, nepatekdama į kraują. Tokiu būdu išvengiama sisteminių šalutinių poveikių [34].
1.9.1 Vietinio poveikio mikroemulsijų modeliavimo ypatybės
Kuriant ME svarbu parinkti tinkamas PAM ar jų derinius, kurie ne tik veiksmingai mažintų paviršiaus įtempimą ir formuotų ME su atitinkamu dalelių dydžiu (iki 200 nm), bet ir pasižymėtų kuo mažesniu toksiškumu. Todėl kuriant vietinio poveikio ME, pirmenybė teikiama nejoniniams surfaktantams [15]. Dažniausiai naudojami šie nejoniniai surfaktantai: Tween® (polisorbatai), Cremophor® (makrogolio glicerolio hidroksistereato, PEG-40 ricinos aliejaus mišinys, polioksilo hidrintas ricinų aliejus), Transcutol® (dietilenglikolio monoetilo eteris), Plurol Oleique® (poligliceril-3-oleatas), Purol Isostearique® (poliglicerolių izostearo rūgšties esteris), Labrasol® (C8 ir C10 riebalų rūgščių mono-, di- ir tri- gliceridų mišinys, PEG mono ir diesteriai) [26].
ME sistemos gebėjimui gerinti vaistinių medžiagų skvarbą į odą dažniausiai turi įtakos naudojamos ME struktūra ir tipas, taip pat komponentų sudėtis ir koncentracija [54]. Taip pat kuriant ME vaistinės medžiagos tiekimui į odą, svarbu parinkti komponentus, kurie pasižymėtų skvarbos į odą gerinimo savybe. Tam tikri PAM monomerai, aliejinės fazės komponentai ar kiti svarbos stiprikliai, įtraukti į ME sudėtį, gali pasklisti odos paviršiuje ir pagerinti vaistinės medžiagos skvarbą į odą, taip pat gali suardyti paviršinio odos sluoksnio stratum corneum lipidų struktūrą (palengvinama difuzija per odos barjerą) arba pagerinti vaistinės medžiagos tirpumą odoje (t.y. didinant vaistinės medžiagos pasiskirstymo koeficientą tarp odos ir tiekimo sistemos). Kita svarbi ME skvarbos gerinimo savybė, ME galimybė talpinti didesnį vaistinės medžiagos kiekį [54].
Tinkamas pH yra vienas iš svarbiausių rodiklių, gaminant vietinio ir transderminio naudojimo ME formuluotes. Šis rodiklis turi įtakos ne tik aktyviųjų medžiagų tiekimui, tačiau taip pat yra svarbus odos dirginimo mažinimo rodiklis. Todėl vietiniam naudojimui tinkamiausios ME formuluotės, kurių pH yra artimas odos pH (4-6), tokia ME nesukels odos dirginimo [30]. Formuluotės, kurių pH reikšmės 6,5-8, pasižymi odą dirginančiu poveikiu, kadangi pakinta viršutiniuose epidermio sluoksniuose esančių fermentų aktyvumas, taip pat ir mikrobinė flora. PH homeostazės ir lipidų sudėties kitimai gali turėti įtakos odos hidratacijai, transepiderminiam vandens praradimui, dėl to sukeliama dehidratacija ir odos atrofija [57].
Mažos klampos ME lengvai pasiskirsto ant odos paviršiaus, tačiau dėl pernelyg skystos konsistencijos gali būti sunku kontroliuoti ME aplikavimą. Todėl vietiniam ir transderminiam naudojimui renkamasi didesnės klampos ME [30].
Apibendrinus mokslinės literatūros duomenis, galima tvirtinti, kad modeliuojant vietinio poveikio ME, yra svarbu atsižvelgti į odos struktūrą ir savybes. Pagalbinės medžiagos skirtos ME modeliavimui turėtų būti saugios ir nedirginančios odos, taip pat turėti gerą suderinamumą, kad pagamintos ME pagerintų vaistinių medžiagų skvarbą į odą.
1.9.2 Vaistinių medžiagų skvarba į odą iš vietinio poveikio mikroemulsijų
Norint suprasti vaistinių medžiagų skvarbą į odą iš vietinio poveikio ME, yra svarbu paminėti odos struktūrą ir būdus, kuriais vyksta vaistinių medžiagų skvarba į odą.
Žmogaus odą sudaro trys pagrindiniai sluoksniai: epidermis, tikroji oda (derma) ir poodinis sluoksnis. Epidermis sudarytas iš raginio ,,stratum corneum‘‘, skaidriojo ,,stratum lucidum‘‘, grūdėtojo ,,stratum granulosum‘‘, dygliuotojo ,, stratum spinosum‘‘, ir pamatinio ,,stratum basale‘‘ sluoksnių [56]. Tačiau pagrindinis sluoksnis, kontroliuojantis vaistinių medžiagų skvarbą, yra raginis sluoksnis stratum corneum. Vaistinių medžiagų skvarba į odą gali vykti trimis skirtingais būdais:
intraląsteliniu, kuomet judėjimas vyksta tarp ląstelių, tinkamas hidrofilinėms medžiagoms
tarpląsteliniu, kai vaistinių medžiagų perdavimas vyksta per ląsteles, idealiai tinka lipofilinėms medžiagoms
per folikulus, bei kitus odos intarpus (prakaito liaukas) [56].
Ankstesni tyrimai parodė, kad naudojama surfaktanto ir (arba) kosurfaktanto rūšis (taip pat jų santykis), naudojamo aliejaus tipas ir skverbties stipriklių buvimas ME turi įtakos vaistinių medžiagų skvarbai į odą [54].
Siekiant pagerinti vaistinių medžiagų skvarbą į odą ir terapinį poveikį, reikalinga tinkama tiekimo sistema. ME yra potenciali vaistinių medžiagų tiekimo sistema, tiek transderminiam, tiek vietiniam vartojimui, siekiant pagerinti vaistinės medžiagos skvarbą į odą, pereinant odos barjerą [56].
JAV mokslininkai (Bhatia ir kt.) nustatė, kad ME ne tik padidino adaptaleno pralaidumą raginiam sluoksniui stratum corneum, tyrimo rezultatai taip pat parodė optimalų įsiskverbimą į plaukų folikulus. Adaptaleno skvarba į stratum corneum padidėjo nuo 1,40 𝜇g/cm2 iki 3,37 𝜇g/cm2 ir nustatyta ženkliai padidėjusi skvarba į plaukų folikulus nuo 0,017 𝜇g/cm2 iki 0,292 𝜇g/cm2 ME gydomoje odoje, lyginant su kontrole [62].
Vaistinių medžiagų skvarbai į odą įtakos turi ME struktūra. Įrodyta geresnė vaistinių medžiagų skvarba iš A/V ME nei iš V/A [54]. Mokslininkai (M. C. Huang ir kt.) sumodeliavo vietinio naudojimo A/V ir V/A ME ir įvertino jų tinkamumą prostaglandino E1 tiekimui į odą. Abi ME sistemos buvo sumodeliuotos naudojant tas pačias pagalbines medžiagas: oleino rūgštį kaip aliejinę fazę, Labrasol® ir Plurol Oleique® kaip surfaktantą. Tyrimo rezultatai parodė, jog geresni tiekimo rezultatai buvo naudojant A/V ME [17].
Mokslininkai (Neem ir kt.) palygino gelius pagamintus naudojant Carbopol® 934 ir ksantano dervą, ME pagrindu (5 % oleino rūgštis, 46 % Tween®20:etanolis 2:1, 44 % vanduo), taip pat hidroalkoholinius tirpalus (etanolis/vanduo), turinčius 5% flurbiprofeno. Flurbiprofeno skvarba į triušio odą buvo 18,75 ± 0,08 µg/cm2; 15,72 ± 0,05 µg/cm2; 9,80 ± 0,09 µg/cm2; 4,76 ± 0,07 µg/cm2 ir 2,70 ± 0,05 µg/cm2 per 24 val. atitinkamai iš negelifikuotos ME, ME gelifikuotos naudojant Carbopol® ir ksantano dervą, ir hidroalkoholinio tirpalo gelifikuoto naudojant Carbopol® ir ksantano dervą. Tyrimo rezultatai parodė, jog flurbiprofeno tiekimas iš ME buvo geresnis nei iš hidroalkoholinio tirpalo, taip pat buvo įrodyta, jog gelifikuojantys agentai mažina vaistinių medžiagų skvarbą į odą [65].
Tinkamų modelių parinkimas odos pralaidumo tyrimams (in vivo ir in vitro) yra svarbus žingsnis, siekiant tiksliai įvertinti šių sistemų, kaip būsimų terapinių produktų, potencialą. Idealiu atveju tyrimui yra naudojama pašalinta žmogaus oda ar savanoriai, taip pat kaip pakaitalas gali būti naudojama kiaulių ar paršelių oda [26].
Apibendrinus mokslinės literatūros duomenis, galima tvirtinti, kad ME yra šiuolaikinė vaisto forma, pritaikoma įvairiose farmacijos srityse. Tinkamai parinktos pagalbinės medžiagos užtikrina saugų ir
patogų vartojimą, bei užtikrina efektyvų vaistinių medžiagų tiekimą į odą lyginant su kitomis vaisto formomis (emulsijomis, kremais, suspensijomis).
1.10 Mikroemulsijų pritaikymas vietinių anestetikų su lidokainu gamyboje
Lidokainas, arba 2-(dietilamino)-N-(2,6-dimetilfenil)-acetamidas, yra amidas, kuriame yra amino jungtis kaip ir aminorūgštyse. Šis amidas turi NH (azoto-vandenilio) jungtį prie CO (anglies-deguonies, dvigubos jungties). Kitoje NH pusėje yra benzenas su dviem metilo grupėmis abiejuose orto padėtyse. Kitoje CO grupės pusėje yra anglis, kuri savo ruožtu, yra prijungta prie kito azoto, turinčio dvi etano grupes ( 3 paveikslas) [7].
3 pav. Lidokaino cheminė struktūra [7]
Lidokainas veikia sustabdydamas natrio jonų patekimą į natrio jonų kanalus. Taigi skausmo signalai yra sustabdomi dar prieš formuojant signalus. Lidokainas jungiasi prie natrio kanalų, amido grupė elgiasi kaip aminorūgštis ir sąveikauja su aktyviomis vietomis natrio kanalų domenuose. Tikslūs radikalai, su kuriais sąveikauja lidokainas, nėra žinomi, nors buvo pastebėta, kad jis gali sąveikauti su Phe-1764 ir Tyr-1771 radikalais. Šis anestetikas su natrio kanalais sąveikauja 1:1 santykiu. Taigi, viena lidokaino molekulė gali blokuoti vieną natrio kanalų molekulę [8]. Lidokainas pasižymi ypač mažu tirpumu vandenyje [3].
Kadangi ME veikia kaip vaistinių medžiagų tirpikliai, ir gali ištirpinti tiek hidrofilines, tiek hidrofobines vaistines medžiagas, įskaitant vaistines medžiagas, kurios santykinai yra netirpios tiek hidrofiliniuose, tiek hidrofobiniuose tirpikliuose [18], todėl jos puikiai tinka lipofilinių vietinių anestetikų tiekimui. Buvo įrodyta, jog ME formuluotės padidino lipofilinio (lidokaino) ir hidrofilinio (prilokaino HCl) anestetinių vaistinių medžiagų tirpumą, atitinkamai 58 % ir 36 %, lyginant su vaistinių medžiagų tirpumu pavieniuose ME komponentuose [61].
Mokslininkai (Sintovand Shapiro ir kt.) palygino lidokaino skvarbą į odą iš ME ir komerciškai prieinamų formuluočių: 5 % lidokaino kremo (Xylocaine®, Astra Zeneca), 2 % lidokaino hidrochlorido gelio (Xylocaine gel®, Astra Zeneca) ir EMLA (A/V emulsija, kurioje yra 2,5% lidokaino ir 2,5 % prilokaino) kremo. Tyrimo rezultatai parodė, jog ME padidino transderminį srautą, lyginant su įprastomis A/V emulsijomis, ir maždaug du kartus palyginus su EMLA kremu [60]. ME jau sėkmingai taikomos farmacinių produktų gamybai. Vienas tokių pavyzdžių, Topicaine® (ESBA Labaratories Inc., Jupiter, FL, USA) gelis pagamintas ME pagrindu (į ME sudėtį įeina jojobos aliejus, alavijo aliejus, etanolis, benzilo alkoholis, glicerinas ir glicerilio monostereatu emulsifikuotas vanduo, karbomeras 940) su lidokainu, vietinio skausmo malšinimui [26].
Apibendrinus mokslinės literatūros duomenis, galima tvirtinti, kad ME yra tinkama ir efektyvi vaisto forma lidokaino tiekimui. Lidokainas yra lipofilinė vaistinė medžiaga, pasižyminti ypač mažu tirpumu vandenyje, ME pagalbinių medžiagų dėka yra pagerinamas lidokaino tirpumas, o kartu pagerinamos ir biofarmacinės savybės, t.y. vaistinės medžiagos atplaidavimas ir skvarba į odą.
2. Medžiagos ir tyrimų metodai 2.1 Tyrimo objektas
Mikroemulsijų sistemos su lidokainu, gamybai naudojant skirtingus S/KoS santykius. 2.2 Ekspermentui naudoti įrenginiai ir medžiagos
Tyrime naudoti įrenginiai:
Analitinės svarstyklės Scaltec SBC 31 (Scaltec Instruments GmbH, Vokietija)
Automatinės pipetės (Transferpette, Vokietija)
Centrifuga, Heraeus Labofuge 200, Osterode, Vokietija
Cirkuliacinė vandens vonelė Grant GD120(Grant Instruments Ltd.,UK),
Ultra-efektyvusis skysčių chromatografas Waters Acquity UPLC System (Waters, MA,
JAV)
Dalelių dydžio analizatorius, Zetasizer Nano (Malvern, Jungtinė Karalystė)
Magnetinė maišyklė IKAMAG® C-MAG HS7 (IKA – Werke GmbH &Co.KG, Vokietija)
Bronaugh tipo difuzinės celės
Cirkuliacinė vandens vonelė Grant GD120(Grant Instruments Ltd.,UK),
Peristaltinis siurblys (Masterflex L/S) su daugiakanale siurblio galva (ColeParmer
Instrument Co., Ilinojus, JAV)
pH – metras 766 Calimatic (Knick, Vokietija)
Kapiliarinis skysčių chromatografas Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV)
Konduktometras (Cond 3110 SET 1, Vokietija)
Klimatinės spintos Binder KBF (Binder GmbH, Vokietija)
Viskozimetras SV-10 (A&D Company, Japonija)
Ultragarso vonelė Bandelin Sonorex Digitec (Bandelin electronic, Vokietija)
UV spektrofotometras (Agilent)
Termostatinė purtyklė (GFL, Vokietija) Tyrime naudotos medžiagos :
Etanolis 96 proc. (AB ,,Stumbras‘‘, Vilnius, Lietuva)
Labrasol® (Gatteffose, Prancūzija)
Lidokainas (Sigma Aldrich, Milan, Italy)
1,2 Propandiolis (Carl Roth GmbH + Co, Vokietija)
NaCl (Carl RothGmbH, Karlsruhe, Vokietija)
Natrio azidas (POCh, Gliwice, Lenkija)
Metanolis (Sigma - Aldrich, Steinheim, Vokietija)
2.3 Tyrimo metodai ir metodika 2.3.1 Lidokaino tirpumo nustatymas
Paruošiami sotieji lidokaino tirpalai, lidokaino miltelių perteklinis kiekis ištirpinamas surfaktante (Labrasol®), kosurfaktante (1,2-propandiolis), aliejuje (oleino r.). Pagaminti tirpalai paliekami 24 valandoms 37˚C temperatūroje termostatinėje purtyklėje (GFL Vokietija). Po 24 valandų mėginiai nucentrifuguojami naudojant centrifugą (Heraeus Labofuge 200, Osterode, Vokietija) 3000 aps/min 5 min. Atlikus centrifugavimą, surenkamas supernatantas, atliekami skiedimai su 96 laipsnių etanoliu. Lidokaino koncentracija nustatoma naudojant UV spektrofotometrą (Agilent) prie 230 nm bangos ilgio. Kaip kontrolė naudojamas 96 laipsnių etanolis.
2.3.2 Pseudo trinarių diagramų sudarymas
Pseudo trinarės diagramos buvo sudaromos, jog būtų nustatytos ME susidarymo ribos. Surfaktantas (Labrasol®) buvo sumaišomas su kosurfaktantu (1,2-propandiolis) skirtingais santykiais (4:1, 5:1, 6:1, 7:1). Tuomet skirtingi kiekiai išgryninto vandens pridėti į surfaktanto ir kosurfaktanto mišinius (5:1, 6:1, 7:1) tokiomis proporcijomis: 2,33:1; 1,5:1; 1:1; 1:1,5; 1:2,33. Į paruoštus vandens ir kosurfaktanto/surfaktanto mišinius lašinama oleino r., maišant magnetine maišykle IKAMAG® C-MAG HS7 (IKA-Werke GmbH & Co.KG), kambario temperatūros sąlygomis. Sistemos nuskaidrėjimas vertinamas kaip ME susidarymas. Sulašintos oleino r. kiekis užfiksuojamas, apskaičiuojami išgryninto vandens, surfaktanto/ kosurfaktanto, aliejaus procentiniai kiekiai. Pseudo-trinarių fazių diagramos kuriamos naudojant programą CorelDRAW (Graphics Suite 2018).
2.3.3 Mikroemulsijų gamyba
Sudarinėjant pseudo - trinares diagramas buvo atliekami VDD ir PDI matavimai, remiantis šiais matavimais pasirinktos ME procentinės sudėtys. ME gamyba vykdyta analogiškai kaip ir sudarant pseudo-trinares diagramas. Oleino r. buvo naudojama kaip lipofilinė fazė, Labrasol® ir 1,2-propandiolis atitinkamai kaip surfaktantas ir kosurfaktantas, išgrynintas vanduo kaip hidrofilinė fazė. ME buvo gaminamos taikant titravimo lipofiline faze metodą. S/KoS mišinys sumaišomas su hidrofiline faze, tuomet lašinama lipofilinė fazė, kol ME sistema nuskaidrėja. Visi veiksmai ME gamybos metu atliekami ant magnetinės maišyklės IKAMAG® C-MAG HS7 (IKA-Werke GmbH &Co.KG, Vokietija), kambario temperatūros sąlygomis. Po ME pagaminimo buvo vykdoma ME ekvilibracija, t.y. ME paliekamos 24 valandoms, kambario temperatūros sąlygomis.
2.3.4 Mikroemulsijų su lidokainu gamyba
Buvo paskaičiuoti procentiniai komponentų kiekiai, kurie reikalingi pagaminti 5:1, 6:1 ir 7:1 ME su 10 % ir 15 % lidokaino, ME su lidokainu procentinės sudėtys, pagal kurias buvo gaminamos ME, pateikiamos 1 ir 2 lentelėse.
1 lentelė. Mikroemulsijų su 10 % lidokaino procentinės sudėtys.
LD kiekis, proc. S/KoS santykis ME
S/KoS, proc. H2O, proc. Oleino r., proc.
10%
5:1 50,5 % 33,6 % 5,9 %
6:1 50,1 % 33,4 % 6,5 %
2 lentelė. Mikroemulsijų su 15 % lidokaino procentinės sudėtys.
Lidokainas pasižymi ypač mažu tirpumu vandenyje, todėl ši vaistinė medžiaga, buvo tirpinama S/KoS mišiniuose, maišant ant magnetinės maišyklės IKAMAG® C-MAG HS7 (IKA-Werke GmbH &Co.KG, Vokietija). Lidokainui ištirpus S/KoS mišiniuose, sekančiame gamybos etape buvo pridedami atitinkami kiekiai išgryninto vandens bei vykdomas oleino r. titravimas. ME gamybos metu atitinkami medžiagų kiekiai buvo sveriami naudojant analitines svarstykles Scaltec SBC 31 (Scaltec Instruments GmbH, Vokietija). Po maišymo – gauti skaidrūs, mažai klampūs, vienfaziai mišiniai, tai įrodymas, jog susiformavo ME sistemos [5]. Pagaminus ME su lidokainu vykdoma mikroemulsijų ekvilibracija, t.y. ME laikomos 24 valandas, kambario temperatūros sąlygomis. 2.3.5 Termodinaminio stabilumo nustatymas
Pasirinktoms ME atliekamas termodinaminio stabilumo nustatymas. Jis buvo atliekamas užšaldymo-atšildymo principu. Tiriamos ME supilamos į 2 ml talpos mėgintuvėlius, kurie patalpinami šaldiklyje, -21 ˚C temperatūroje 30 min., išėmus 30 min. vykdomas atšildymas kambario temperatūros sąlygomis. Užšaldymo-atšildymo ciklas buvo kartojamas tris kartus, po kiekvieno ciklo įvertinama ME išvaizda, buvo stebima ar nesusidarė nuosėdų, ar neįvyko fazių atsiskyrimas. Po kiekvieno ciklo, taikant dinaminį šviesos sklaidos metodą, išmatuojama ME VDD ir PDI. VDD ir PDI matavimams buvo naudojamas dalelių dydžio analizatorius Zetasizer Nano (Malvern, Jungtinė Karalystė). 2.3.6 Mikroemulsijų dalelių dydžio ir polidispersiškumo indekso vertinimas
ME dalelių dydis ir polidispersiškumo indeksas nustatomas naudojant dinaminiu šviesos sklaidos metodo principu veikiantį dalelių dydžio analizatorių Zetasizer Nano (Malvern, Jungtinė Karalystė). ME dalelių dydžio matavimai buvo atliekami fiksuotu 173˚ kampu, 25 ± 0,2 ˚C temperatūroje, kiekvienas matavimas buvo kartojamas tris kartus. Matavimų rezultatai pateikiami vidutinės vertės ir standartinio nuokrypio pavidalu.
2.3.7 Mikroemulsijų fizikinių - cheminių parametrų nustatymas
ME kokybės parametrų nustatymas buvo atliekamas praėjus 24 valandoms nuo mikroemulsijų pagaminimo. ME kokybės parametrų vertinimas atliekamas nustatant pagamintų ME klampą, elektrinį laidį ir pH.
Sumodeliuotų ME Ph yra nustatomas naudojant pH-metrą 766 Calimatic (Knick, Vokietija). PH matavimai atliekami pH-metro stiklinį elektrodą panardinus į ME.
Konduktometras Cond 3110 (SET 1, Vokietija) buvo naudojamas ME elektrinio laidžio matavimams. ME klampa buvo matuojama naudojant viskozimetrą SV-10 (A&D Company, Japonija).
LD kiekis, proc. S/KoS santykis ME
S/KoS, proc. H2O, proc. Oleino r., proc.
15%
5:1 47,7 % 31,8 % 5,5 %
6:1 47,4 % 31,5 % 6,12 %
2.3.8 Mikroemulsijų stabilumo vertinimas
ME su įterpta vaistine medžiaga (10 % ir 15% lidokaino) įvertintos atliekant stabilumo tyrimus. Stabilumo tyrimų metu ME buvo laikomos 30 dienų skirtingomis sąlygomis :
pagreitinto stabilumo sąlygomis (40 ˚C temperatūra, 75 ± 5 proc. santykinė drėgmė)
ilgalaikio stabilumo sąlygomis (25 ˚C temperatūra, 60 ± 5 proc. santykinė drėgmė).
Pagreitinto ir ilgalaikio stabilumo sąlygomis ME buvo laikomos klimatinėse spintose Binder KBF ( Binder GmbH, Vokietija). Viso tyrimo metu mėginiai buvo sandariai uždaryti, skaidriose, nuo šviesos neapsaugotose talpyklėse. Stabilumo tyrimų metu atlikti VDD ir PDI matavimai, po 1, 4, 7, 14, 30, 60 dienų. Stabilumo tyrimo pabaigoje ME įvertintos vizualiai.
2.3.9 Lidokaino atpalaidavimo in vitro tyrimas
ME atpalaidavimo tyrimas in vitro buvo vykdomas praėjus 24 val. nuo ME pagaminimo. Atpalaidavimo tyrimui naudojamos modifikuotos Franz celės ir dializės membranos, kurios prieš tyrimą buvo 24 val. laikomos išgrynintame vandenyje. 1 ± 0,2 g. lidokaino ME patalpinama į modifikuotą Franz celę, apvertus šią celę su patalpinta ME, sandariai fiksuojama membrana. Kaip aksceptorinė terpė buvo naudojamas išgrynintas vanduo. Švirkšto dalis su donorine terpe (ME su lidokainu), kuri atskirta membrana, panardinama į aksceptorinę terpę (išgrynintas vanduo). Viso atpalaidavimo tyrimo in vitro metu mėginiai buvo laikomi ant magnetinės maišyklės su kontroliuojama temperatūros funkcija IKAMAG® C-MAG HS7 (IKA-Werke GmbH &Co.KG, Vokietija). Tyrimo metu aksceptorinėje terpėje palaikoma 32 ˚C temperatūra, taip atkartojant žmogaus odos paviršiaus temperatūrą [53], taip pat tyrimo metu aksceptorinė terpė buvo maišoma 300 rpm, kad būtų užtikrintas tolygus atpalaiduotos medžiagos pasiskirstymas. 1 ml aksceptorinės terpės mėginiai, naudojant automatinę pipetę (Transferpette, Vokietija), buvo imami atitinkamai kas 0,5, 1, 2, 3, 4 ir 6 valandas, po kiekvieno mėginio paėmimo, atgal buvo grąžinamas toks pat kiekis šviežios aksceptorinės terpės. Mėginiai buvo filtruojami naudojant membraninius švirkštų filtrus
Rotilabo® 0,20 μm (Carl Roth GmbH & Co.KG, Karlsruhe, Vokietija). Aksceptorinės terpės mėginių
analizė atlikta naudojant ultra-efektyvųjį skysčių chromatografą Waters Acquity UPLC System (Waters, MA, JAV).
2.3.10 Lidokaino skarbos į odą tyrimas ex vivo
Skvarbos į odą tyrimas ex vivo atliktas naudojant Bronough tipo pratakias difuzines celes, kurių efektyviosios difuzijos sritis sudarė 0,64 cm2 . Tyrimui buvo naudojama baltaodžio žmogaus oda, kuri prieš atliekant tyrimą buvo laikoma -20 ˚C temperatūros sąlygomis, ne ilgiau nei 6 mėnesius. Prieš tyrimą oda atšildoma, o atšildžius sukarpoma ir patalpinama į celes. Celės su įtvirtintais odos mėginiais sudedamos ant termostatuojamo metalinio bloko, kuriame palaikoma pastovi 37˚C temperatūra dėl nuolatinės vandens cirkuliacijos. Pastovi cirkuliuojančio vandens temperatūra buvo palaikoma termostatinės cirkuliacinės vandens vonelės Grant GD120 (Grant Instruments Ltd., Jungtinė Karalystė) pagalba.
Prieš atliekant skvarbos tyrimą, 30 min buvo vykdoma ekvilibracija, kurios metu vyko aksceptorinės terpės (0,9 proc. NaCl, kurio sudėtyje yra 0,005 proc. natrio azido) cirkuliacija po oda [69]. Peristaltinis siurblys (Masterflex L/S), kuris sujungtas su daugiakanale siurblio galva (ColeParmer
Instrument Co., Ilinojus, JAV) užtikrino aksceptorinės terpės srautą. Aksceptorinės terpės srauto
Įvykdžius ekvilibraciją, ant odos mėginių, įtvirtintų celėse, uždedama donorinės fazės begalinė dozė (0,5g 15% lidokaino ME) ir celės sandariai uždengiamos sandarinimo plėvele ir folija. Skvarbos į odą tyrimas vykdomas 24 val.
Praėjus 24 val., donorinė fazė nuo odos kruopščiai nuplaunama etanoliu ir 0,9 proc. NaCl tirpalu. Po nuplovimo oda išimama iš celių, nusausinama ir išpjaunami 0,64 cm2 gabalėliai, ant kurių buvo užnešta donorinė fazė. Pasitelkiant ,,sauso karščio metodą‘‘ atskiriamas odos epidermio sluoksnis nuo dermos sluoksnio. Epidermio ir dermos ekstrahavimas vykdomas užpylus po 1 ml metanolio tirpalo ir patalpinus 0,5 val. į ultragarso vonelę Bandelin Sonorex Digitec (Bandelin electronic, Vokietija). Epidermio ir dermos mėginių ekstraktai nufiltruojami naudojant membraninius švirkštų filtrus Rotilabo® 0,20 μm (Carl Roth GmbH & Co.KG, Karlsruhe, Vokietija). Nufiltruotų mėginių analizė vykdoma ultra-efektyviuoju skysčių chromatografu Waters Acquity UPLC System (Waters, MA, JAV) [68].
2.3.11 Lidokaino kiekybinio nustatymo metodika
Kiekybiniam lidokaino įvertinimui buvo naudojama validuota ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodika.
Lidokaino atskyrimas nuo šalutinių produktų buvo atliekamas C18 kolonėlėje (2,1x50mm, dalelių dydis 1,7 µm).
Judrios fazės sudėtis:
Eliuentas A - 0,1% TFA (trifluoracto rūgšties vandeninis tirpalas),
Elientas B – acetonitrilas Linijinio gradiento kitimas :
0 iki 0,1 min 10% Eliuento B ir 90% Eliuento A
0,1 iki 5 min. nuo 10 iki 60% Eliuentas B, o nuo 90 iki 40% Eliuentas A. Kolonėlės temperatūra – 30˚, injekcijos tūris – 1 µl, tėkmės greitis – 0,70 ml/min. Detekcija lidokaino bazei ir jos priemaišoms buvo atliekama prie λ=230nm. 2.3.12 Statistinis duomenų vertinimas
Statistinis gautų tyrimo rezultatų vertinimas buvo atliekamas naudojant SPSS ir Microsoft Excel 2016 programas. Visi tyrimai atlikti po tris kartus, o gauti tyrimų rezultatai pateikiami kaip vidutinės reikšmės ± standartiniai nuokrypiai (SN). Statistinis duomenų vertinimas atliktas naudojant duomenų analizės metodą (One -Way ANOVA) naudojant Tukey‘o HSD kriterijų. Apskaičiuoti Spirmeno ranginės koreliacijos koeficientai. Rezultatų vertinimui buvo taikomas p < 0,05 reikšmingumo lygmuo.
3. Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas 3.1 Komponentų atranka mikroemulsijų gamybai
Vykdant ME su lidokainu gamybą, vienas iš svarbiausių etapų – tinkamas komponentų parinkimas. Lidokainas pasižymi blogu tirpumu vandenyje, todėl ypatingai svarbu parinkti tinkamą surfaktantą, kosurfaktantą ar aliejų ME gamybai, taip pat svarbu, jog viename iš jų gerai tirptų veiklioji medžiaga, nes tik gerai ištirpusi ji gali pereiti odos barjerą [41]. Pasirenkant PAM, atsižvelgiama į derinius, kurie veiksmingai sumažina tarpfazinę įtampą ir formuoja stabilias ME su mažais dalelių dydžiais, taip pat užtikrina minimalų odos dirginimą, todėl pirmenybė teikiama nejoniniams surfaktantams. Pastaruoju metu dažniausiai naudojamos paviršinio aktyvumo medžiagos: Tween 80®, Labrasol®, Cremophor RH 40®, Cremophor EL®, Transcutol®. Šie surfaktantai yra natūrali alternatyva sintetiniams surfaktantams [18]. Atsižvelgus į mokslinių tyrimų duomenis kaip surfaktantą pasirinkome Labrasol®. Labrasol® sudaro polietileno glikolio mono-, di- ir trigliceridų bei mono- ir di-riebalų rūgščių esterių mišinys, kuriame vyraujančios riebalų rūgštys yra kaprilo ir kaprino [76]. Šis surfaktantas dažnai naudojamas kaip tirpiklis ir drėkiklis, kuris turi santykinai stipresnį gebėjimą disperguotis vandeninėje fazėje, todėl sumodeliuotos ME pasižymi mažu dalelių dydžiu. Taip pat ištirta, jog Labrasol® pasižymi savybe padidinti lipofilinių vaistų tirpumą emulsifikacijos būdu [45]. Dauguma PAM, naudojamų ME gamybai yra farmaciškai patvirtintos, tačiau kai kurių PAM didelis procentinis kiekis formuluotėje gali dirginti arba pakenkti odai, Labrasol®, priešingai, saugus naudojamas ir didesniais kiekiais [44, 76].
Kaip aliejinė fazė buvo pasirinkta oleino rūgštis. Remiantis anksčiau atliktais tyrimais, oleino rūgštis veikia kaip skvarbos stipriklis [12].
Įvertintas lidokaino tirpumas surfaktante Labrasol®, oleino rūgštyje bei 1,2-propandiolyje. Lidokaino tirpumo rezultatai pateikiami 3 lentelėje.
3 lentelė. Lidokaino tirpumas surfaktante, kosurfaktante, bei aliejuje.
Tirpiklis Tirpumas mg/ml
Surfaktantas Labrasol® 216,9
Kosurfaktantas 1,2 - Propandiolis 365,7
Aliejus Oleino r. 184,1
Gaminant vietinio naudojimo ME, svarbu, jog atrinkti komponentai ME gamybai būtų saugūs, kompaktiški, hipoalerginiai ir nedirginantys odos. Įvertinus gautus lidokaino tirpumo rezultatus ME su lidokainu gamybai kaip surfaktantas pasirinktas Labrasol®, kosurfaktantas – 1,2-propandiolis, aliejinė fazė – oleino rūgštis. Atliktas tyrimas parodė, jog ME modeliavimui atrinktų komponentų suderinamumas yra geras, juos sumaišius, formuojasi ME.
3.2 Pseudo - trinarių fazių diagramų sudarymas
Pseudo-trinarės fazių diagramos buvo sudaromos 5:1, 6:1 ir 7:1 S/KoS (Labrasol®, 1,2-propandiolis) ir vandens mišinius palaipsniui titruojant aliejine faze (oleino r.). ME pseudo-trinarės fazių diagramos sudarytos naudojant skirtingus surfaktanto (Labrasol®) ir kosurfaktanto (1,2 - propandiolis) santykius 5:1, 6:1, 7:1, vaizduojamos 4, 5, 6 paveiksluose. Šios diagramos leidžia identifikuoti aliejinės fazės, vandeninės fazės bei S/KoS tinkamas santykines proporcijas, kurioms esant sumodeliuojamos stabilios ME sistemos [42]. Apibrėžtos fazių diagramų sritys iliustruoja ME susidarymo regionus, kurie esant 5:1 ir 6:1 S/KoS turi nedidelį skirtumą, o esant 7:1 S/KoS santykiui regiono plotas nežymiai sumažėja. Platesnis regiono plotas rodo geresnį emulsinimo efektyvumą ir reiškia geresnę sąveiką tarp aliejinės fazės, S/KoS ir vandeninės fazės. Nestabilios ir standartinės ME vaizduojamos tolimesniuose fazių diagramų regionuose [43]. Remiantis gautomis pseudo - trinarėmis diagramomis, kintant S/KoS (30-60%), hidrofilinės fazės (60-30%) ir aliejinės fazės (1-8%) proporcijoms, gamybai buvo pasirinkta 12 ME formuluočių. Titravimo metu buvo atliekamas VDD ir PDI nustatymas, kuriuo remiantis buvo pasirinktos ME formuluotės, atitinkančios ME keliamus reikalavimus, tolimesniems tyrimų etapams.
5 pav. Pseudo – trinarė fazių diagrama, kai S/KoS santykis 6:1
