Kauno technologijos universitetas
Cheminės technologijos fakultetas
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
Farmacijos fakultetas
Hidrofilinių sistemų su propolio ekstraktu modeliavimas ir
biofarmacinis vertinimas
Baigiamasis magistro projektas
Deimantė Kipšaitė
Projekto autorė
Prof. dr. Vitalis Briedis
Vadovas
Kauno technologijos universitetas
Cheminės technologijos fakultetas
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
Farmacijos fakultetas
Hidrofilinių sistemų su propolio ekstraktu modeliavimas ir
biofarmacinis vertinimas
Baigiamasis magistro projektas
Medicininė chemija (6281CX001)
Deimantė Kipšaitė
Projekto autorė
Prof. dr. Vitalis Briedis
Vadovas
Lekt. dr. Modestas Žilius
Kauno technologijos universitetas
Cheminės technologijos fakultetas
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
Farmacijos fakultetas Deimantė Kipšaitė
Hidrofilinių sistemų su propolio ekstraktu modeliavimas ir
biofarmacinis vertinimas
Akademinio sąžiningumo deklaracija
Patvirtinu, kad mano, Deimantės Kipšaitės, baigiamasis projektas tema „Hidrofilinių sistemų su propolio ekstraktu modeliavimas ir biofarmacinis vertinimas“ yra parašytas visiškai savarankiškai ir visi pateikti duomenys ar tyrimų rezultatai yra teisingi ir gauti sąžiningai. Šiame darbe nei viena dalis nėra plagijuota nuo jokių spausdintinių ar internetinių šaltinių, visos kitų šaltinių tiesioginės ir netiesioginės citatos nurodytos literatūros nuorodose. Įstatymų nenumatytų piniginių sumų už šį darbą niekam nesu mokėjęs.
Aš suprantu, kad išaiškėjus nesąžiningumo faktui, man bus taikomos nuobaudos, remiantis Kauno technologijos universitete galiojančia tvarka.
Kipšaitė Deimantė. Hidrofilinių sistemų su propolio ekstraktu modeliavimas ir biofarmacinis vertinimas. Baigiamasis magistro projektas / vadovas prof. dr. Vitalis Briedis; Kauno technologijos universitetas, Cheminės technologijos fakultetas; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas.
Studijų kryptis ir sritis (studijų krypčių grupė): chemija, fiziniai mokslai.
Reikšminiai žodžiai: propolis, fenoliniai junginiai, vandeninė propolio ištrauka, hidrofilinės sistemos. Kaunas, 2019. 55 p.
Santrauka
Gausus aktyviųjų deguonies ir azoto formų kiekis sukelia oksidacinį stresą ir dėl to organizme atsiranda įvairių ląstelių pažeidimų bei audinių funkcijų sutrikimų, o tai skatina organizmo senėjimą ir įvairių ligų vystymąsi, tokių kaip cukrinis diabetas, asteosklerozė bei piktybinių navikų augimas. Nustatyta, kad polifenoliai junginiai pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis. Jie inaktyvuoja laisvuosius radikalus ir mažina žalingą aktyviųjų deguonies ar azoto formų poveikį. Propolyje aptinkami polifenoliniai junginiai – fenolinės rūgštys – taip pat pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis. Propolio panaudojimas vietinio poveikio produktuose gali būti veiksminga priemonė oksidaciniam stresui mažinti, taip palaikant sveiką odos būklę. Tačiau veikliųjų medžiagų tiekimas į odą vis dar išlieka dideliu iššūkiu, norint suderinti veiksmingumą su šiuo vietiniu vartojimo būdu. Hidrogeliai yra laikomi viena iš geriausių vaistų tiekimo sistemų, norint pasiekti vietinį veikliųjų medžiagų poveikį odoje. Todėl, šio projekto tikslas buvo sumodeliuoti hidrogelius su propolio vandeniniu ekstraktu ir įvertinti jų tinkamumą fenolinių junginių tiekimui į odą. Projekto uždaviniai buvo šie: įvertinti vandeninių propolio ištraukų kokybę pagal juose esančių fenolinių junginių kiekybinę sudėtį, pagaminti skirtingus hidrogelius su propolio ekstraktu bei įvertinti jų fizikochemines savybes, atlikti puskiečių hidrofilinių sistemų biofarmacinį vertinimą pagal fenolinių junginių atpalaidavimo kinetiką, įvertinti propolio fenolinių junginių skvarbą į odą ex vivo ir palyginti gautus rezultatus su paskelbtais analogiškų tyrimų rezultatais. Gauti eksperimentinio tyrimo rezultatai patvirtino paskelbtus mokslinius duomenis, kad Lietuvoje surinktame propolyje vyraujančios fenolinės rūgštys yra p-kumaro, ferulo ir vanilo bei dominuoja fenolinis aldehidas – vanilinas. Hidrofilinės sistemos, kurių sudėtyje buvo vandeninės propolio ištraukos, turėjo panašias arba vienodas fizines savybes, tokias kaip spalva, kvapas, lipnumas ir nuplaunamumas. Gaminant hidrogelius karbomero ir polivinilpirolidono pagrindu, buvo konstatuotas komponentų nesuderinamumas ir tolimesni tyrimai su šiomis hidrofilinėmis sistemomis nebuvo vykdomi. Nustatyta, kad visi hidrogeliai buvo homogeniški ir kad hidrofilinių sistemų reologinėms savybėms įtakos turi pagalbinės medžiagos ir jų kiekis. Gauti rezultatai parodė, kad sintetinės kilmės gelifikuojančios medžiagos pasižymi stipresnėmis gelifikuojančiomis savybėmis nei pusiau sintetinės kilmės gelius formuojančios medžiagos.In vitro atplaidavimo tyrimo rezultatai parodė, kad
veikliųjų junginių atpalaidavimo greičiui įtakos turi pasirinktos gelifikuojančios medžiagos, jų koncentracija, konsistencijos koeficiento reikšmė ir tekėjimo indekso reikšmė. Didžiausi fenolinių junginių kiekiai į odos sluoksnius prasiskverbė iš karbomero gelio, lyginant su rezultatais, gautais tiriant fenolinių junginių skvarbą iš karbomero-hidroksipropilceliuliozės gelio. Palyginus gautus
Kipsaite Deimante. Modeling and Biopharmaceutical Characterization of Hydrophilic Systems Containing Propolis Extracts / work adviser prof. dr. Vitalis Briedis; Faculty of Chemical Technology, Kaunas University of Technology; Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences.
Study field and area (study field group): Chemistry, Physical Sciences.
Keywords: propolis, phenolic acids, aqueous propolis extract, hydrophilic systems. Kaunas, 2019. 55 pages.
Summary
The large quantity of active oxygen and nitrogen forms causes oxidative stress, resulting in various cell damages and tissue function disorders, which promotes the aging of the body and the development of various diseases such as diabetes mellitus, asteosclerosis and growth of malignant tumors. Polyphenols have been found to have a strong antioxidant properties. They inactivate free radicals and reduce the harmful effects of active oxygen or nitrogen forms. Polyphenol compounds found in propolis – phenolic acids – also have a strong antioxidant properties. The use of propolis in topical products can be an effective way of reducing oxidative stress, thus maintaining a healthy skin condition. However, the delivery of active ingredients into the skin remains a major challenge to reconcile the efficacy with this topical use. Hydrogels are considered to be one of the best drug delivery systems to achieve local effect of the active ingredients into the skin.Therefore, the aim of this project was to design hydrogels with aqueous propolis extract and assess their suitability for the supply of phenolic compounds into the skin. The project objectives were these: to evaluate the quality of aqueous propolis extracts based on the quantitative composition of the phenolic compounds in them, to produce different hydrogels with propolis extract and to evaluate their physicochemical properties, to perform a biopharmaceutical evaluation of semisolid hydrophilic systems according to the kinetic release of phenolic compounds, to evaluate the penetration of propolis phenolic compounds into the skin ex vivo and to compare the results with the published results of similar studies. The results of the experimental study confirmed the published scientific data that in the propolis, which is collected in Lithuania, the predominant phenolic acids are p-coumaric, ferulic and vanilic, and phenolic aldehyde – vanillin dominates. Also, hydrophilic systems containing aqueous propolis extracts had similar or identical physical properties, such as color, odor, adhesiveness, and washability. In the production of hydrogels based on carbomer and polyvinylpyrrolidone, incompatibility of the components was found, and further studies with these hydrophilic systems were not performed. It was found that all the hydrogels were homogeneous and that the rheological properties of the hydrophilic systems were influenced by the excipients and their amount. The results showed that the gelling agents of synthetic origin have a stronger gelling properties than the gelling material of semi-synthetic origin. The results of in vitro release study showed that the release rate of the active compounds is influenced by the selected gelifying agents, their concentration, the value of the consistency coefficient and the value of the flow index. The highest amounts of phenolic compounds penetrated into the skin layers from the carbomer gel compared to the results obtained from the penetration of phenolic compounds from the carbomer-hydroxypropylcellulose gel. Comparing the results with the data provided by other researchers, the carbomer gel also showed better penetration of the active compounds into the skin. Therefore, it is considered that the carbomer is more suitable for formulation of hydrophilic systems with the aqueous propolis extract.
Turinys
Santrumpų ir terminų sąrašas ... 7
Įvadas ... 8
1. Literatūros apžvalga ... 9
1.1. Propolis, jo susidarymas, cheminė sudėtis, farmakologinės savybės ... 9
1.2. Fenoliniai junginiai – polifenolinės rūgštys ir jų antioksidacinis aktyvumas ... 10
1.3. Fenolinių rūgščių antioksidacinis aktyvumas ... 11
1.4. Propolio ekstrakto gamybos metodai ... 12
1.5. Propolio ekstrakto pritaikymas dermatologijoje ... 12
1.6. Odos sandara ir jos funkcijos ... 13
1.6.1. Epidermis (epidermis) ... 13
1.6.2. Tikroji oda, derma (corium) ... 14
1.7. Aktyviosios deguonies formos, jų susidarymas, žala bei kenksmingumo pašalinimas ... 14
1.8. Hidrogeliai, jų sudėtis, gebėjimas atpalaiduoti veikliąsias medžiagas... 17
1.9. Hidrogeliams būdingos savybės ir kaip jos tiriamos ... 19
1.10.Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 20
2. Medžiagos ir tyrimų metodai ... 21
2.1. Tyrimų medžiagos, priemonės ir prietaisai ... 21
2.1.1. Darbe naudotos medžiagos ... 21
2.1.2. Darbe naudotos priemonės ir prietaisai ... 21
2.2. Tyrimų metodai ... 22
2.2.1. Vandeninės propolio ištraukos gamyba... 22
2.2.2. Hidrogelių gamyba ... 22
2.2.3. Hidrogelių modeliavimas ... 24
2.2.4. Fizikocheminių savybių vertinimas ... 27
2.2.5. Homogeniškumo vertinimas ... 27
2.2.6. Propolio fenolinių junginių atpalaidavimo iš eksperimentinių hidrogelių tyrimas in vitro .. 28
2.2.7. Vandeninės propolio ištraukos atpalaiduoto suminio medžiagų kiekio nustatymas ... 28
2.2.8. Propolio vandeninės ištraukos produktų analizė efektyviąja skysčių chromatografija ... 29
2.2.9. Propolio junginių skvarbos į odą ex vivo tyrimas ... 29
2.2.10. Statistinis duomenų vertinimas ... 30
3. Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas ... 31
3.1. Vandeninių propolio ištraukų veikliųjų junginių kiekio nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodu ... 31
3.2. Hidrofilinių sistemų fizinių savybių vertinimas ... 32
3.3. Hidrofilinių sistemų homogeniškumo vertinimas ... 34
3.4. Eksperimentinių hidrofilinių sistemų pH reikšmės vertinimas... 35
3.5. Eksperimentinių hidrofilinių sistemų reologinių savybių vertinimas ... 35
3.6. Hidrofilinių sistemų su propolio ekstraktu suminio fenolinių junginių kiekio biofarmacinis vertinimas ... 38
3.7. Fenolinių junginių atpalaidavimo iš eksperimentinių hidrogelių tyrimo in vitro rezultatai ... 41
Santrumpų ir terminų sąrašas
Santrumpos:
°C – laipsniai Celsijaus;
CMCNa - karboksimetilceliuliozės natrio druska; ESC – efektyvioji skysčių chromatografija; HPC – hidroksipropilceliuliozė;
K – konsistencijos koeficientas; min. – minutės;
n – tekėjimo indeksas; pH – vandenilio potencialas; PVA – polivinilo alkoholis; PVP – polivinilpirolidonas; r. – rūgštis;
ROS – aktyviosios deguonies ar azoto formos; val. – valandos;
Įvadas
Ultravioletinė spinduliuotė, jonizuojančioji spinduliuotė, ultragarsas, rūkymas, aplinkos tarša ir daugelis kitų išorės veiksnių skatina aktyviųjų deguonies ar azoto formų susidarymą [1, 2]. Gausus aktyviųjų deguonies ir azoto formų kiekis sukelia oksidacinį stresą, dėl ko organizme atsiranda įvairių ląstelių pažeidimų bei audinių funkcijų sutrikimų, o tai skatina organizmo senėjimą ir įvairių ligų vystymąsi: cukrinio diabeto, asteosklerozės, nutukimo, astmos, kataraktos, širdies ir kraujagyslių ligų, piktybinių navikų augimą, kvėpavimo sistemos ligų, neurodegeneracinių ligų ir reumatoidinio artrito [1, 2]. Yra nustatyta, kad polifenoliniai junginiai pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis [3, 4, 5]. Jie inaktyvuoja laisvuosius radikalus ir mažina žalingą aktyviųjų deguonies ar azoto formų poveikį [2]. Polifenolinių antioksidantų gausu daržovėse, vaisiuose ir augaluose [2]. Propolyje taip pat aptinkami polifenoliniai junginiai – fenolinės rūgštys [3, 4, 6, 7]. Remiantis mokslinių tyrimų rezultatais, daugelis propolyje esančių fenolinių rūgščių pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis ir veikia kaip laisvųjų radikalų akceptoriai [3, 4, 5]. Taigi propolio panaudojimas vietinio vartojimo kasdienės odos priežiūros produktuose gali būti veiksminga priemonė oksidaciniam stresui mažinti, taip palaikant sveiką odos būklę. Tačiau veikliųjų medžiagų tiekimas į odą vis dar išlieka dideliu iššūkiu tyrėjams, kurie siekia suderinti veiksmingumą su šiuo vietiniu vartojimo būdu [8]. Yra pasiūlyta daug skirtingų farmacinių strategijų tam, kad būtų kuriamos veiksmingos vaistų tiekimo sistemos dermatologinių ligų vietiniam gydymui arba odos būklės gerinimui. Hidrogeliai yra laikomi viena iš geriausių vaistų tiekimo sistemų, norint pasiekti vietinį veikliųjų medžiagų poveikį odoje [9].
Darbo tikslas ir uždaviniai
Projekto tikslas – sumodeliuoti puskietes hidrofilines sistemas su propolio vandeniniu ekstraktu ir
įvertinti jų tinkamumą fenolinių junginių tiekimui į odą.
Projekto uždaviniai:
1. įvertinti vandeninių propolio ištraukų kokybę pagal juose esančių fenolinių junginių kiekybinę sudėtį;
2. pagaminti skirtingas hidrofilines sistemas su propolio ekstraktu bei įvertinti jų fizikochemines savybes;
3. atlikti puskiečių hidrofilinių sistemų biofarmacinį vertinimą pagal fenolinių junginių atpalaidavimo kinetiką;
4. įvertinti propolio fenolinių junginių skvarbą į odą ex vivo ir palyginti gautus rezultatus su paskelbtais, analogiškų tyimų, rezultatais.
1. Literatūros apžvalga
1.1. Propolis, jo susidarymas, cheminė sudėtis, farmakologinės savybės
Propolis – natūralus, lipnus, tąsus ir dervingas bičių produktas, kurį bitės pagamina naudodamos bičių vašką, bičių liaukų išskiriamą medžiagą (mandibuliarinių bei hipofaringinių liaukų sekretas), žiedadulkes ir dervas, surinktas iš įvairių augalų (tuopa, spygliuočiai, beržas, alksnis, palmė, gluosnis) pumpurų ir eksudatų (1 pav.) [10, 11, 12, 13]. Propolio žaliavą sudaro maždaug 50 % dervos, 30 % vaško, 10 % eterinių ir aromatinių aliejų, 5 % žiedadulkių ir 5 % kitų organinių junginių [10, 12, 13, 14]. Bitės jį pagamina tam, kad užkimštų angas aviliuose, išlygintų vidines sienas. Taip pat, kad visus metus avilyje būtu palaikoma drėgmė ir pastovi temperatūra bei apsaugotų įėjimą nuo įsibrovėlių [10, 11, 15].
1 pav. Propolis, patiektas bitininko, surinktas Varėnos rajone, Lietuvoje (2017 m.)
Propolis buvo naudojamas taip pat ir liaudies medicinoje jau 300 metų prieš Kristų daugelyje pasaulio regionų [15, 16]. Senovės egiptiečiai, persai ir romėnai naudojo propolį tam, kad palengvintų daugelį negalavimų ir kaip balzamavimo medžiagą [17].
Iki šiol atlikti tyrimai rodo, jog propolis pasižymi antioksidacinėmis, antibakterinėmis, antivirusinėmis, antivėžinėmis bei fungicidinėmis savybėmis [10, 13, 15]. Taip pat pasižymi anestezuojančiu poveikiu. Daugelyje mokslinių straipsnių aprašomas ir sėkmingas žaizdų, opų, tuberkuliozės, mikozės infekcijos ar egzemos gydymas naudojant propolį [10, 13]. Moksliniai tyrimai rodo, jog propolis apsaugo ir nuo peršalimų, reumato, dantų karieso, diabeto, vėžio ar širdies sutrikimų [10, 15]. Šios vertingos propolio savybės sukėlė susidomėjimą jo chemine sudėtimi. Nors sudėtis yra sudėtinga, tačiau, naudojant įvairias atskyrimo ir valymo technologijas, tokias kaip efektyvioji skysčių chromatografija, plonasluoksnė chromatografija, dujų chromatografija, masės spektroskopija, branduolinis magnetinis rezonansas, dujų chromatografija ir masės spektroskopija, propolyje nustatyta daugiau kaip 600 cheminių komponentų [10, 12, 18, 19]. Pagrindines propolio junginių grupes sudaro fenolinės rūgštys ir jų esteriai, flavonoidai (chalkonai, flavanonai, flavonai, flavonoliai ir dihidroflavonoliai), terpenai, vitaminai (B, C, D, PP, E ir provitaminas A (β-karotinas)), mineraliniai elementai (didžiausi aptinkami kiekiai yra kalcio, mangano, cinko, vario, silicio, geležies ir aliuminio), baltymai, aminorūgštys, cukrūs ir angliavandeniai [10, 12, 20]. Tačiau propolio sudėtis nėra vienoda. Remiantis moksliniais tyrimais, išanalizavus daugelį propolio mėginių nustatyta, kad
cheminė kompozicija, kuri lemia jo biologinį aktyvumą, priklauso nuo geografinės vietovės, augalijos ir nuo bičių rūšies [10, 11, 12]. Pavyzdžiui, propolis Europoje sudarytas iš daugelio rūšių flavonoidų, fenolinių rūgščių bei jų esterių, o pagrindiniai Brazilijos propolio komponentai yra terpenoidai ir prenilinti p-kumaro rūgščių dariniai [15].
1.2. Fenoliniai junginiai – polifenolinės rūgštys ir jų antioksidacinis aktyvumas
Tarp daugelio propolio komponentų svarbiausias vaidmuo tenka fenoliniams junginiams, ypač fenolinėms rūgštims (junginiai, sudaryti iš benzeno žiedo, karboksilo ir hidroksilo grupių) ir jų esteriams [12, 21]. Remiantis Lenkijos mokslininkų pateiktais duomenimis, polifenolinių junginių kiekis, Lenkijoje surinktame propolyje, sudaro apie 58 % [12]. Russ’as ir kt. [22] taip pat ištyrė polifenolinių junginių kiekį propolyje, kuris buvo surinktas pietų Čilėje. Jie nustatė, kad polifenolinių junginių kiekis propolyje sudaro 63,9 % [22, 23]. Panašius tyrimo rezultatus gavo ir Sun’as ir kt. [6]. Kinijoje surinktame propolyje jie nustatė apie 60 % polifenolinių junginių kiekio [6].
Propolyje esančios fenolinės rūgštys sudarytos iš benzoinės arba cinamono rūgšties ir jų darinių. Tarp labiausiai paplitusių benzoinės rūgšties darinių yra galo rūgštis, vanilo rūgštis, protokatechino rūgštis, salicilo rūgštis, gentisinė rūgštis, p–metoksibenzenkarboksirūgštis, 3, 4 – dimetoksibenzenkarboksirūgštis, p-hidroksibenzenkarboksirūgštis (PHBA) ir 2 – amino – 3 – metoksibenzenkarboksirūgštis [12]. Kalbant apie cinamono rūgšties darinius, tarp labiausiai paplitusių yra kavos rūgštis, p-kumaro rūgštis, ferulo rūgštis, izoferulo rūgštis ir 3, 4 - dimetoksicinamono rūgštis [12].
Daugelis mokslininkų ilgą laiką tyrė fenolines rūgštis propolyje. Mohdal’is ir kt. [4] nustatė, kad Egipte surinktame propolyje dominuojančios fenolinės rūgštys yra ferulo, p-kumaro ir kavos. Jie taip pat nustatė galo ir vanilo rūgštis, kurių kiekiai nebuvo dideli. Sun’as ir kt. [6] taip pat atliko tyrimą ir nustatė, kad Kinijoje surinktame propolyje dominuojančios fenolinės rūgštys yra kavos, p-kumaro,
ferulo, izoferulo ir 3,4-dimetoksicinamo. Ramanauskienė ir kt [7] nustatė, kad Lietuvoje surinktame propolyje vyraujančios fenolinės rūgštys yra p-kumaro ir ferulo. Jie paskelbė, kad, standartizuojant propolio žaliavą ir jos preparatus, šios rūgštys galėtų būti kokybės rodikliu. Ivanauskas ir kt. [3] taip pat ištyrė Lietuvoje surinktą propolį ir nustatė šias fenolines rūgštis: galo, chlorogeno, vanilo, kavos,
p-kumaro, ferulo, rozmarino ir cinamono. Taip pat nustatė ir fenolinį aldehidą – vaniliną.
Daugelis tyrimų rodo, kad fenolinės rūgštys pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis ir veikia kaip laisvųjų radikalų akceptoriai (kavos r., galo r.), turi sveikatai palankų poveikį ir gali turėti slopinamąjį poveikį mutagenezei, karcinogenezei ir naviko genezei (kavos r., chlorogeno r., ferulo r., galo r.) [3]. Lagour’is ir kt. [5] nustatė, kad ferulo rūgštis apsaugo DNR ir lipidus nuo oksidacijos, kurią sukelia reaktyvūs deguonies junginiai, o galo rūgštis yra stiprus antioksidantas emulsijų arba lipidų sistemose. Mohdal’is ir kt. [4] nustatė, kad hidroksichinamino rūgštys (kavos r., p-kumaro r.,
ferulo r. ) pasižymi stipriu antioksidaciniu aktyvumu in vitro. Jie taip pat savo publikacijoje pateikė informaciją, kad kavos ir ferulo rūgštys buvo nustatytos kaip antibakteriniai komponentai. Valenzuela-Barr’as ir kt. [23] straipsnyje pateikė informaciją, kad kavos rūgšties fenetilo esteris (CAPE), kavos, ferulo, p-kumaro, cinamono ir chromogeninės rūgštys bei fenolinis aldehidas – vanilinas – slopina fermentų COX-1 ir COX-2 aktyvumą, kurie sukelia uždegimą, skausmą ir
1.3. Fenolinių rūgščių antioksidacinis aktyvumas
Fenolinių rūgščių antioksidacinis aktyvumas priklauso nuo hidroksilo grupių skaičiaus jų molekulėse ir nuo erdvinio poveikio. Hidroksilo grupių padėtis, taip pat pakaitalo tipas aromatiniame žiede turi įtakos šių junginių antioksidaciniam aktyvumui. Taip yra todėl, kad ryšys tarp vandenilio atomo ir deguonies atomo hidroksilo grupėje, prijungtoje prie aromatinio žiedo sistemos, yra mažesnis nei alifatinių junginių atveju. Sumažėjęs elektronų tankis deguonies atomo atžvilgiu yra aromatinio žiedo rezonansinio poveikio rezultatas, dėl kurio vandenilio atomas atsiskiria nuo hidroksilo grupės, o fenoliniai junginiai tampa fenoksilo radikalais, kurie yra santykinai stabilūs dėl krūvio pasikeitimo aromatiniame žiede. Jungdamiesi fenoksilo radikalai sukuria chinonus arba patenka į kitas reakcijas, tokias kaip dimerizacija arba radikalų pakeitimas [12].
Fenolinių rūgščių antioksidacinis aktyvumas yra atvirkščiai proporcingas O-H jungties disociacijos entalpijos dydžiui silpnai poliarinėje aplinkoje. O-H jungties atskyrimo fenoliniame žiede mechanizmas susideda iš vandenilio atomo perdavimo (HAT) į superoksido radikalą [12]. Benzoinės rūgšties, su viena hidroksilo grupe, monohidroksi- dariniai žiedo orto- arba para- padėtyje neturi antioksidacinio aktyvumo, priešingai nei meta-monohidroksi- radikalų dariniai, kurie susidarė vandeninėje fazėje. Tai susiję su karboksilo grupės gebėjimu pritraukti elektronus ir paveikti orto- arba para- padėtį žiede. Monohidroksi- rūgštys – efektyvūs hidroksilo radikalai. Be to, antioksidacinis aktyvumas padidėja, kai rūgštys su viena hidroksilo grupe kartu papildomai turi ir metoksi-grupę žiede. Alkilo arba metoksi- grupės pakaitalas orto- padėtyje padidina fenolinių rūgščių stabilumą ir antioksidacines savybes [12].
Benzoinės rūgšties dihidroksi- dariniai pasižymi intensyviausiomis antioksidacinėmis savybėmis, kai hidroksilo grupės yra 3 ir 5 padėtyse. Tarp benzoinės rūgšties darinių galo rūgštis, turinti tris hidroksilo grupes 3, 4 ir 5 padėtyse, pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis. Galo rūgšties karboksilo grupės esterinimas sumažina antioksidacinių savybių veikimą [12].
Fenolinių rūgščių antioksidacinis aktyvumas priklauso nuo hidroksilo grupių išsidėstymo vietos. Grupė neigiamai veikia hidroksibenzoato ir jo darinių donoro savybes. Turint šoninę grandinę, kurioje yra etileno grupė, hidroksichinaminės rūgštys turi didesnį gebėjimą atiduoti vandenilį ir tokiu būdu sukurtas radikalas yra stabilesnis. Taigi cinamono rūgšties dariniai pasižymi geresnėmis antioksidacinėmis savybėmis nei benzenkarboksirūgščių dariniai. Etileno grupės prijungimas prie fenilo žiedo, turinčio hidroksi grupę para-padėtyje ir karboksilo grupę, kaip ir p-kumaro rūgštyje, padidina hidroksilo grupės redukcines savybes lyginant su cinamono rūgštimi. Ferulo rūgštis su metoksigrupe 3 padėtyje rodo didesnį gebėjimą stabilizuoti fenoksi radikalus nei p-kumaro rūgštis. Tačiau vandenilio keitimas į metilo grupę hidroksilo grupėje gali turėti skirtingą poveikį fenolinių rūgščių antioksidaciniam aktyvumui. Lipofilinėje fazėje dihidroksicinamono rūgšties dariniai turi didesnį gebėjimą sujungti laisvuosius radikalus nei monohidroksi- dariniai. Kavos rūgštis pasižymi geresniu reaktingumu radikalams vandens aplinkoje nei ferulo rūgštis. Ferulo rūgšties afinitetas lipidams yra susijęs su vandenilio atomo pakeitimu hidroksilo grupėje metilo grupe. Todėl ferulo rūgštis pasižymi geresnėmis antioksidacinėmis savybėmis emulsijos tipo aplinkoje lyginant su kavos rūgštimi. Ferulo rūgštis turi metoksi- grupę, todėl ir yra efektyvesnė nei p-kumaro rūgštis. Metoksi- grupė, kaip elektronų donorė, didina gebėjimą stabilizuoti ariloksi- radikalus. Hidroksilinimas, pakeistas metoksilinimu, daro tokios struktūros junginį efektyvesniu antioksidantu. Taip pat atliktuose tyrimuose dėl riebalų oksidacijos nustatyta, kad antioksidacinis aktyvumas yra išsidėstęs didėjančia tvarka: kavos rūgštis> ferulo rūgštis> p-kumaro rūgštis [12].
1.4. Propolio ekstrakto gamybos metodai
Propolio ekstrakto gamybai ekstrahentu daugiausiai naudojamas skirtingų koncentracijų etanolis [19, 24]. Nors ekstrahavimas etanoliu yra paprastas ir efektyvus metodas, jis turi trūkumų, tokių kaip stiprus ir nemalonus liekamasis skonis, naudojimo apribojimai kosmetikos ir farmacijos pramonėje. Medicinoje etanolio ekstraktai yra netinkami oftalmologinių, otorinologinių ir pediatrinių ligų gydymui. Platesniam propolio panaudojimui yra gaminami vandeniniai ekstraktai [19, 24].
Remiantis mokslinių tyrimų duomenimis, neetanoliniai propolio ekstraktai ir jų pagrindiniai junginiai turi didesnį farmakologinį aktyvumą, lyginant su etanoliniais ekstraktais [24]. Taip pat vandeninis propolio ekstraktas efektyviau slopina laisvųjų radikalų susidarymą ir vandenyje tirpūs propolio dariniai bei polifenoliniai junginiai sumažina navikinių ląstelių augimą ir proliferaciją [24].
Šiame tiriamajame darbe buvo pasirinkta gaminti vandeninį propolio ekstraktą dėl prieš tai pateiktų teigiamų savybių.
1.5. Propolio ekstrakto pritaikymas dermatologijoje
Siekiant ištirti propolio gydomąjį poveikį skirtingiems odos pažeidimams yra atlikta nemažai klinikinių tyrimų. Pavyzdžiui, Gregor’is ir kt. [25] atliko klinikinį tyrimą, kuriame gydant nedidelius nudegimus jie naudojo propolio odos kremą ir sidabro sulfadiazino ((SSD) vietinio veikimo antibakterinis vaistas, plačiai naudojamas žaizdoms ir nudegimams gydyti) kremą. Palyginus rezultatus nustatyta, kad žaizdos, gydytos SSD kremu, buvo kur kas skausmingesnės nei tos, kurios buvo gydytos propolio kremu, skirtu vartoti ant odos. Mokslininkai pateikė informaciją, kad žaizdos gijo kur kas greičiau naudojant propolio kremą nei naudojant SSD kremą [14, 25]. Buvo atliktas dar vienas tyrimas, kuriame taip pat buvo lyginamas propolio ir sidabro sulfadiazino poveikis [26]. Jų poveikis buvo lyginamas gydant pragulas. Tyrimų duomenimis propolis pastebimai sumažino laisvųjų radikalų aktyvumą pragulose ir paskatino gijimo procesą [26]. Kitame klinikiniame tyrime propolio gydymo veiksmingumas buvo išbandytas, gydant trofines kojų opas. Tyrime dalyvavo 56 pacientai, iš kurių 28 pacientai buvo gydomi, naudojant vietinio veikimo propolio tepalą kartu su elastiniu tvarsčiu (I grupė) , o kiti 28 pacientai buvo gydomi, naudojant „Unna boot" impregnuoto cinko oksido tvarsliavą (II grupė). Rezultatai rodo, kad I grupėje dalyvavusių pacientų trofinės opos buvo išgydytos jau po 6 savaičių, o II grupėje tik po 16 savaičių [14]. Dar viename klinikiniame tyrime buvo vertinamas propolio veiksmingumas gydant aknę (paprastieji spuogai). Tyrime dalyvavo 40 pacientų (13-24 metų amžiaus), kurie sirgo veido akne. Pacientai buvo suskirstyti į dvi grupes: I grupėje buvo 20 pacientų, kurie buvo gydomi vietinio veikimo propolio ekstrakto tirpalu, o II grupėje buvo 20 pacientų, kurie buvo gydomi vietinio veikimo etanolio tirpalu. I grupėje klinikinis veiksmingumas, uždegiminių ir neuždegiminių pakitimų sumažėjimas buvo žymiai didesnis lyginant su II grupe. Taip pat šiame tyrime vietinio veikimo propolio ekstrakto tirpalas turėjo didesnį poveikį prieš gramteigiamų anaerobinių (P. acnes) ir gramteigiamų aerobinių (S. epidermidis) bakterijų augimą [27].
Tyrimai rodo, kad, gydant įvairius odos pažeidimus, pastebimai padidėjo propolio produktų naudojimas daugiausia dėl jo priešalerginio, priešuždegiminio, antioksidacinio, antimikrobio
1.6. Odos sandara ir jos funkcijos
Oda dengia visą žmogaus kūną bei atskiria vidinę organizmo terpę nuo potencialiai kenksmingos išorinės aplinkos. Ji yra didžiausias kūno organas, kurio paviršiaus plotas varijuoja nuo 1,2 iki 2,2 m² ir kurį sudaro daugiau nei 10 % kūno masės svorio [28, 29, 30]. Žmogaus odos storis svyruoja nuo 0,5 mm iki 2mm [31, 32]. Odos paviršiaus vandenilio potencialas (pH) dažniausiai yra intervale nuo 4,2 iki 6,1 (vadinama „rūgštine mantija“) [33]. Odos pH priklauso nuo daugelio vidinių ir išorinių veiksnių, tokių kaip epidermio ląstelių, liaukų (riebalinės, apokrininės ir ekrininės), amžiaus ir lyties [34]. Skiriami du pagrindiniai odos sluoksniai: epidermis ir tikroji oda (derma) [30].
1.6.1. Epidermis (epidermis)
Daugiasluoksnis plokščiasis ragėjantis epitelis (lot. epithelium stratificatum squamosum
cornificatum) dengia visą mūsų kūno paviršių. Jis dar vadinamas epidermiu (išorinis odos sluoksnis)
[35, 36]. Jį sudaro įvairaus brandumo epitelinės ląstelės, kitaip dar žinomos kaip epiteliocitai [30]. Epidermio storis svyruoja nuo 0,03 iki 0,6 mm [30, 36]. Jo storis priklauso nuo kūno vietos. Ant delno ir padų epidermis yra storas (601-637 µm), lankstus ir atsparus mechaniniam sužalojimui. Akių vokuose jis yra labai plonas (31-71 µm) ir leidžia maksimaliai judėti [32, 35]. Epidermis apsaugo nuo vandens ir kūno skysčių netekimo, atsparus mechaniniam ir cheminiam sužalojimui, yra blogas šilumos laidininkas ir apsaugo nuo mikroorganizmų invazijos [35, 36]. Tačiau epidermis savo sluoksnyje neturi kraujagyslių, dėl to jį maitina limfa, kuri teka pro bazalinę membraną [35]. Ragėjančio epitelio rūšys yra dvi: plaukuotosios odos ir neplaukotosios odos. Neplaukuotos odos daugiasluoksnį ragėjantį epitelį sudaro penki sluoksniai: pamatinis (stratum basale), dygliuotasis (stratum spinosum), grūdėtasis (stratum granulosum), skaidrusis (stratum lucidum) ir raginis (stratum
corneum), o plaukuotosios odos epidermis yra plonesnis už neplaukuotos odos ir jis neturi skaidraus
sluoksnio [30, 36].
Pamatinis sluoksnis – tai giliausias epidermio sluoksnis, kuris susideda iš kubiškųjų arba stulpiškųjų epiteliocitų ir yra sudarytas iš vienos ląstelių eilės. Šis sluoksnis yra suaugęs su pamatine membrana, kuri sudaro pamatinio sluoksnio jungtį su derma. Ant pamatinės membranos išsidėsčiusios stulpinės ląstelės, kurios yra mitoziškai aktyvios, todėl jos nuolat dauginasi ir vis papildo pamatinį sluoksnį, o tai lemia epidermio atsinaujinimą (maždaug per 10-30 parų). Šiame sluoksnyje išsidėsto ir makrofagocitai, T limfocitai, lytėjimo epiteliocitai ir melanocitai. Makrofagocitai (Langerhanso ląstelės) priklauso imuninei sistemai. Makrofagocitai suriša antigenus ir perduoda juos T limfocitams, kurie juos neutralizuoja. Lytėjimo epiteliocitai (Merkelio ląstelės) jungiasi su gretimais epiteliocitais ir formuoja nekapsulėtąjį nervinį kūnelį, ir veikia kaip mechanoreceptoriai (receptoriai, jautrūs mechaniniams dirgikliams). Melanocitai vykdo pigmento melanino sintezę, kuris epidermiui ir kitoms struktūroms suteikia spalvą ir saugo giliau esančius audinius nuo žalingo ultravioletinės spinduliuotės poveikio [30, 37].
Dygliuotasis sluoksnis susideda iš daugelio eilių dygliuotjų epiteliocitų (kubiniai, daugiakampiai). Šios ląstelės taip pat gali dalintis. Dygliuotosios ląstelės aktyviai gamina keratiną. Šiame sluoksnyje taip pat yra T limfocitų ir pavienių Langerhanso ląstelių [30, 36].
Grūdėtasis sluoksnis – tai sluoksnis, kuris yra išsidėstęs tarp dygliuotojo ir skaidriojo sluoksnių. Jis susideda iš 3-4 eilių plokščiųjų daugiakampių epiteliocitų. Šiame sluoksnyje dar randama gyvų ląstelių. Tačiau epiteliocitai jau turi akivaizdžius ragėjimo požymius (organėlės, tokios kaip mitochondrijos, ribosomos, Goldžio aparatas, piknotiški branduoliai, endoplazminis tinklas randami
su irimo požymiais). Grūdėtasis sluoksnis yra nepralaidus vandeniui. Jis taip pat reguliuoja maisto medžiagų transportą [30, 36].
Skaidrusis (blizgantysis) sluoksnis yra išsidėstęs virš grūdėtojo sluoksnio ir taip pat sudarytas iš 3-4 eilių plokščiųjų epiteliocitų. Šio sluoksnio epiteliocitų branduoliai beveik išnykę, o citoplazmoje gausu difuziškai pripildyto baltymo eleidino [30, 36].
Raginis sluoksnis – tai viršutinis epidermio sluoksnis, kuris tiesiogiai kontaktuoja su išorine aplinka [31]. Šis sluoksnis yra labai hidrofobiškas [31], o jo eilių skaičius varijuoja nuo 3 iki 50, kadangi tai priklauso nuo žmogaus kūno vietos [30]. Raginio sluosknio epitelinės ląstelės neturi branduolio. Epitelinių ląstelių citoplazma yra pripildyta keratino ir todėl šios ląstelės dažnai dar vadinamos keratinocitais. Kai ląstelės migruoja link odos paviršiaus, iš epitelinių ląstelių į tarpląstelinius tarpus išsiskiria rūgšti fosfotazė ir lizosomos. Rūgšti fosfotazė ir lizosomos ardo desmosomas. Dėl šios priežasties ląstelės netenka tarpusavio ryšio ir atsiskiria viena nuo kitos bei pleiskanoja. Taip epidermio sluoksnis atsinaujina per 10-30 parų (epidermio regeneracija) [30, 31].
1.6.2. Tikroji oda, derma (corium)
Tikroji oda (derma) – hidrofilinis sluoksnis, sudarytas iš skaidulinio jungiamojo audinio, kurio kolageninės skaidulos suteikia odai tvirtumo, o elastinės skaidulos suteikia tamprumo [30, 37]. Derma yra po epidermio sluoksniu. Jos storis svyruoja nuo 0,5 iki 2 mm [28]. Tačiau jos storis ant nugaros gali siekti net iki 4 mm. Ploniausias šio odos sluoksnio storis yra ant vokų ~ 0,5 mm [38]. Tikrosios odos sluoksnis yra išraizgytas kraujagyslių, limfagyslių, nervų ir įvairios sandaros neuroreceptorių (nespecifiniai dariniai). Taip pat turi į sluoksnį įsiterpusių plaukų folikulų, riebalų ir prakaito liaukų (specifiniai dariniai) [30, 31]. Dermoje yra ir tinklinių (retikulinių) skaidulų tinklas, kuriame gausu makrofagų, putliųjų ląstelių bei leukocitų. Šio tinklo skaidulos formuoja pamatinę membraną, o prie jos tvirtinasi pamatinės epidermio ląstelės [30, 31]. Po dermos sluoksniu yra hipodermos sluoksnis. Tai poodinis riebalinis audinys, kuris užtikrina šilumos izoliaciją ir saugo kūną nuo mechaninių pažeidimų [39].
1.7. Aktyviosios deguonies formos, jų susidarymas, žala bei kenksmingumo pašalinimas
Daugelis išorės veiksnių, tokių kaip ultravioletinė spinduliuotė (UV), jonizuojančioji spinduliuotė, ultragarsas, rūkymas, aplinkos tarša, traumos, uždegimai, infekcijos, gausus alkoholio vartojimas ir antibiotikų vartojimas skatina aktyviųjų deguonies ar azoto formų susidarymą (ROS; angl. reactive oxygen species) [1, 2]. Aktyvias deguonies ar azoto formas sudaro chemiškai aktyvūs deguonies arba azoto junginiai ir radikalai. Aktyvios deguonies ar azoto formos skirstomos į deguonies ar azoto radikalus (laisvieji radikalai) ir neradikalinius deguonies ar azoto darinius (1 lentelė). Gausus aktyviųjų deguonies ir azoto formų kiekis sukelia oksidacinį stresą,dėl ko organizme atsiranda įvairių ląstelių pažeidimų bei audinių funkcijų sutrikimų [1]. ROS žalingas poveikis (pažaidos biomolekulėse: baltymuose, glikokonjugatuose, lipiduose, RNR, DNR) taip pat siejamas su odos randų atsiradimu, senėjimu ir odos vėžiu [1, 2, 40].
1 lentelė. Aktyviosios deguonies ir azoto formos [2]
Aktyviosios deguonies formos
Laisvieji radikalai Neradikaliniai dariniai
Superoksidas (O2-˙) Vandenilio peroksidas (H2O2)
Hidroksiradikalas (OH˙) Singuletinis deguonis (1O 2 )
Lipidų peroksiradikalai (LOO˙) Ozonas (O3)
Hidroksiperoksiradikalas (HO2˙) Hipochlorito rūgštis (HClO)
Aktyviosios azoto formos
Laisvieji radikalai Neradikaliniai junginiai
Azoto oksidas (NO˙) Nitrito rūgštis (HNO2)
Azoto dioksidas (NO2˙) Nitroksianijonas (NO-)
Peroksonitritas (ONOO-) Nitrozilkatijonas (N+O)
Mūsų ląstelėse yra apsaugos sistemos, kurios saugo nuo laisvųjų radikalų poveikio. Skiriamos 3 apsaugos sistemos:
fermentinė (superoksido dismutazė, katalazė, glutationo peroksidazė, glutationo reduktazė);
specialios molekulės gaudyklės (sugaudo laisvuosius radikalus);
baltymai ir kitos mokelukės (suriša pereinamųjų metalų jonus).
2 lentelėje pateikti antioksidaciniai fermentai (kur aptinkama, cheminės reakcijos bei funkcijos) [1, 2, 40].
2 lentelė. Antioksidaciniai fermentai [1, 2, 40]
Fermento pavadinimas
Aptinkama Cheminė reakcija Funkcijos
Superoksido dismutazė (SOD) SOD 1 (Cu/Zn) citozolyje; SOD 2 (Mn) mitochondrijose; 1 SOD 3 (Fe/Mn) bakterijų aktyvajame centre. 2 O2 ∙– + 2 H+ → H2O2 + O2 Apsaugo ląsteles, pašalindama superoksidą ir vandenilio peroksidą. Katalazė peroksisomose; mitochondrijose; citozolyje. 2 H2O2 → 2 H2O + O2 2 Apsaugo ląsteles, pašalindama superoksidą ir vandenilio peroksidą. Glutationo peroksidazė ląstelių citozolyje; branduolyje; mitochondrijose. a) H2O2 skaidymas: 2GSH + H2O2→GS-SG+ 2H2O
b) Lipidų hiperoksidų skaidymas: LOOH +2GSH→ LOH + GS-SG+ 2H2O
Katalizuoja vandenilio ir lipidų peroksidų
redukciją, yra svarbi kancerogenų bei mutagenų
2 lentelės tęsinys. Antioksidaciniai fermentai [1, 2, 40]
Fermento pavadinimas
Aptinkama Cheminė reakcija Funkcijos
Glutationo reduktazė
ląstelių citozolyje; branduolyje; mitochondrijose.
GS-SG+NADPH+H+→2GSH + NADP+ Palaiko pastovų
redukuoto glutationo kiekį.
Antioksidacinėje apsaugoje svarbų vaidmenį atlieka ne tik fermentiniai antioksidantai, bet ir nefermentiniai. Nefermentiniai antioksidantai veikia kaip laisvųjų radikalų gaudyklės vandeninėje terpėje arba membranose. Kadangi dėl skirtingos jų cheminės struktūros skiriasi ir jų tirpumas, todėl vieni jų yra hidrofiliniai (glutationas, L-askorbo rūgštis, šlapimo rūgštis), o kiti – lipofiliniai (tokoferoliai, ubichinonas KoQ, karotinoidai). Glutationas (GSH) – tai glutationo peroksidazės substratas, kuris dalyvauja vandenilio peroksido skaidyme ir taip pat gali susijungti bei neautralizuoti aktyviąsias deguonies ar azoto formas. L-askorbo rūgštis (vitaminas C) prisijungia laisvuosius radikalus vandeniniuose organizmo skysčiuose (audinių skystyje, ląstelių citozolyje). Taip pat askorbo rūgštis tokoferolio radikalą paverčia aktyviuoju tokoferoliu ir taip sustiprina tokoferolio antioksidacines savybes. Šlapimo rūgštis gali sudaryti chelatinius junginius su pereinamųjų metalų Fe3+ (geležies) ir Cu2+ (vario) jonais, o tai leidžia sustabdyti Fentono ar Haberio ir Veiso reakcijas, ko pasekoje slopinamas toksiškų hidroksilo radikalų susidarymas. Tokoferoliai (vitaminas E ir jo dariniai) – tai tirpus antioksidantas, kuris membranose neutralizuoja peroksi- radikalus (ROO˙) ir
singuletinį deguonį. Tokoferoliai taip pat užkerta kelią grandininėms lipidų peroksidacijos reakcijoms. Ubichinonas KoQ – palaiko antioksidacines tokoferolio savybes. Karotinoidai (likopenas, karotinas) taip pat, kaip ir tokoferoliai, reaguoja su peroksilo radikalais. Tai padeda apsaugoti nesočiąsias riebalų rūgštis nuo peroksidacijos [1, 2, 40].
Sveikoje žmogaus odoje skirtingos antioksidacinės sistemos yra pasiskirsčiusios pagal lipofilinį/ hidrofilinį gradientą nuo paviršiaus iki vidinių sluoksnių. Pavyzdžiui, viršutiniame raginiame epidermio sluoksnyje yra vandensir riebaluose tirpių antioksidantų, tokių kaip vitaminas C, vitaminas E, glutationas, šlapimo rūgštis, skvalenas, ir kofermentas Q10, kurių koncentracijos gradientai mažėja iš išorės į vidų. Epidermio sluoksnyje randami ir fermentai, tokie kaip superoksido dismutazė, katalazė ir glutationo peroksidazė. Hidrofiliniame dermos sluoksnyje yra vandenyje tirpių nefermentinių antioksidantų (vitaminas C, šlapimo rūgštis, glutationas) ir fermentinių anioksidantų [40].
Svarbu paminėti, kad antioksidacinėmis savybėmis pasižymi ir polifenoliai junginiai, kadangi jie inaktyvuoja laisvuosius radikalus ir mažina žalingą ROS poveikį. Polifenolinių antioksidantų gausu daržovėse, vaisiuose ir augaluose[2]. Propolyje taip pat aptinkami polifenoliniai junginiai, fenolinės rūgštys, kurios pasižymi antioksidacinėmis savybėmis [3, 4, 5]. Atsižvelgiant į tai, šios žaliavos panaudojimas vietinio vartojimo kasdienės odos priežiūros produktuose gali būti veiksminga priemonė oksidaciniam stresui mažinti, taip palaikant sveiką odos būklę.
1.8. Hidrogeliai, jų sudėtis, gebėjimas atpalaiduoti veikliąsias medžiagas
Remiantis Europos farmakopėjos straipsniu 04/2010:0132 [41], geliai – tai puskietė vaisto forma, kuri sudaryta iš skysčio ir gelifikuojančios medžiagos. Geliai yra skirstomi į dvi grupes: lipofilinius ir hidrofilinius.
Lipofiliniai geliai (oleogeliai) – tai preparatai, kurių pagrindas dažniausiai yra sudarytas iš skysto parafino kartu su polietilenu arba riebaliniais aliejais ir kuris yra gelifikuotas cinko ar aliuminio muilais arba koloidiniu silicio dioksidu [41].
Hidrofiliniai geliai, kitaip dar žinomi kaip hidrogeliai, tai preparatai, kurių pagrindą dažniausiai sudaro vanduo, glicerolis arba propilenglikolis ir kurie yra gelifikuojami, naudojant atitinkamas gelifikuojančias medžiagas, tokias kaip karbomeras, hidroksipropilmetilceliuliozė, magnio-aliuminio silikatai, poloksamerai ir daugelis kitų [41].
Apie hidrogelius 1960 metais pirmą kartą prakalbo čekų chemikai Wichterle’is ir Lím’as [42]. Hidrogeliai vis dažniau apibūdinami kaip dviejų ar daugiakomponenčių sistemų trimatis (3D) tinklas, sudarytas iš polimerinių grandinių ir vandens, kuris užpildo tarpus tarp makromolekulių (2 pav.) [43, 44, 45]. Polimerai, naudojami hidrogelių gamyboje, gali sugerti didelius vandens kiekius [43] (maždaug 1000 kartų didesnį kiekį už savo sausą svorį[46]). Remiantis Bahram’o ir kt. [42] literatūra, vanduo turi sudaryti ne mažiau kaip 10% visos masės arba tūrio, kad medžiaga būtų laikoma hidrogeliu, o tinklo hidrofiliškumą lemia tokios funkcinės grupės kaip -NH2, -OH, -COOH, -CONH-, -CONH2– ir -SO3H. Priklausomai nuo skersinių jungčių tipo-CONH-, kurios susidaro proceso metu-CONH-, hidrogeliai gali būti klasifikuojam į fizinius arba cheminius [44]. Cheminės arba fizinės skersinės jungtys hidogeliams suteikia tinklinę struktūrą ir fizinį stabilumą [47]. Hidrogeliai, sudaryti iš fizinių skersinių jungčių, dažnai vadinami „grįžtamaisiais“ arba „fiziniais“ hidrogeliais, kadangi jų polimerinės grandinės yra sujungtos ne kovalentinėmis jungtimis [44, 47]. Fizinių hidrogelių makromolekulės yra sutinklintos nekovalentiniais ryšiais, tokiais kaip hidrofobinės sąveikos, elektrostatinės sąveikos, vandeniliniai ryšiai [48]. Hidrogeliai, sudaryti iš cheminių skersinių jungčių, yra vadinami „cheminiais“ arba „pastoviais“ geliais, kadangi jų polimerinės grandinės yra sujungtos kovalentinėmis jungtimis, todėl sunku pakeisti tokių tinklų formą [44, 47]. Remiantis Vashist’o ir kt. [44] mokslinio straipsnio duomenimis, fiziniai hidrogeliai, lyginant su cheminiais hidrogeliais, turi daugiau privalumų. Pavyzdžiui, fiziniai hidogeliai ya mažiau toksiški nei cheminiai hidrogeliai bei yra jautresni išorės veiksnių pokyčiams, tokiems kaip pH, temperatūra, šviesa ir slėgis [44].
Dėl didelio vandens kiekio (paprastai 70-99 %) [49], poringumo, elastingumo ir minkštos konsistencijos hidrogeliai yra panašūs į natūralius, gyvus audinius, todėl jie yra plačiai naudojami biomedicinos, medicinos ir farmacijos srityse [42, 45, 50]. Pavyzdžiui, audinių inžinerijoje hidrogeliai dažnai naudojami kaip biologiškai aktyvių molekulių nešikliai [42].
2 pav.Erdvinė hidrogelio struktūra
Atsižvelgiant į įvairius, nedidelius aplinkos veiksnių pokyčius (pH, temperatūra, šviesa, slėgis), hidrogeliai geba prisitaikyti ir atitinkamai keisti savo tūrį. Be to, didelis hidrogeliuose esantis vandens kiekis padeda lengviau pernešti vandens garus ir deguonį į sveikus odos sluoksnius [51] arba žaizdas, tokias kaip kojų opos, chirurginės ir nekrotinės žaizdos bei nudegimai [50]. Hidrogeliai yra dažnai naudojami nudegimų gydymui (randami ir pimosios pagalbos rinkiniuose), kadangi jie taip pat turi ir vėsinamąjį bei drėkinamąjį poveikius [50]. Be to, hidrogelių kūrimas bei jų panaudojimas odos būklės gerinimui arba įvairių žaizdų gydyme yra patrauklus, kadangi jie yra netoksiški, juos lengva ir patogu vartoti. Taip pat jie yra lengvai nuplaunami vandeniu, kadangi jų pagrinduose nėra riebalų bei į riebalus panašių medžiagų [44, 51].
Hidrofilinės bazės paprastai pasižymi dideliu veikliųjų medžiagų atpalaidavimu in vitro, kadangi hidrofilinės bazės lengvai įsiskverbia į akceptorines terpes. Kai kurie hidrofilinių sistemų komponentai gali būti laikomi kaip skverbties stiprikliai [52]. Remiantis Jankowsk’iu ir kt. [52] vanduo, esantis hidrogelyje, gali padidinti raginio sluoksnio hidrataciją ir veikti kaip natūralus skverbties stipriklis. Dėl poringos struktūros hidrogeliai pasižymi ir dideliu įvairių vaistinių medžiagų atpalaidavimu, todėl daugelis vaistinių medžiagų gali būti lengvai įterptos į hidrofilines sistemas ir tinkamomis sąlygomis atpalaiduotos [42].
Hidrogeliai pasižymi gamybos įvairove ir gali būti gaminami iš įvairių natūralių (jūros dumblių polisacharidai, gyvūninės kilmės baltymai) bei sintetinių (karbomeras, polivinilo alkoholis, hidroksipropilceliuliozė, polivinilpirolidonas, karboksimetilceliuliozės natrio druska) polimerų [42, 45, 48].
Iš natūralių polimerų gaminamų hidrogelių panaudojimas yra patrauklus vaistinių preparatų kūrime, kadangi jie palaiko ląstelių veiklą ir yra biologiškai suderinami bei biologiškai skaidomi. Tačiau iš natūralių polimerų gaminami hidrogeliai gali turėti patogenų ir jų vartojimas gali sukelti imuninį atsaką [48]. Jie taip pat pasižymi ir silpnomis mechaninėmis savybėmis, dėl ko dažnai konstatuojamas jų savybių variavimas ir sunku užtikrinti kokybinių rodiklių atkartojamumą [46, 48].
hidrogeliai (hidrofiliniai homopolimerai arba kopolimerai, kurie yra sujungti kovalentiniais arba joniniais ryšiais) neturi patogeninių mikroorganizmų, kurie galėtų sukelti immuninį atsaką. Sintetinio tipo hidrogeliai gali sugerti kur kas didesnius kiekius vandens ir jų galiojimo laikas yra ilgesnis nei hidrogelių, pagamintų iš natūralių polimerų [43]. Be to, naudojant sintetinius polimerus, lengva kontroliuoti hidrogelių chemines (pH, jonai, specifinė cheminė sudėtis) savybes bei jų struktūrą [42]. Atsižvelgiant į palygintas natūralių ir sintetinių hidrogelių savybes, šiame tiriamajame projekte buvo pasirinkti skirtingi sintetiniai polimerai, hidrofilinių sistemų modeliavime.
1.9. Hidrogeliams būdingos savybės ir kaip jos tiriamos
Remiantis literatūros duomenimis hidrogelių fizikinių ir cheminių savybių įvertinimui dažniausiai taikomi šie metodai: klampos matavimas, pH matavimas, homogeniškumo vertinimas, in vitro atpalaidavimo metodas vietinio poveikio preparatams bei skvarbos į odą ex vivo tyrimas [9, 53, 54]. Reologiniai tyrimai leidžia išsamiai ištirti hidrogelių mechanines savybes. Atliekant šį tyrimą, naudojams nedidelis kiekis mėginio ir galima kiekybiškai išmatuoti vieną iš pagrindinių hidrogelio parametrų – klampą. Hidrofilinių sistemų klampa yra svarbi vaistinių medžiagų difuzijos greičiui [55].
Tirpalo pH – tai vandenilio jonų rodiklis, kuris yra lygus vandenilio jonų koncentracijos neigiamo ženklo dešimtainiam logaritmui: pH = - lg [H+] [56]. [H+] reiškia vandenilio jonų koncentraciją, kuri yra išreikšta moliais litre (mol/l). Vandenilio (H+) jonai lemia rūgštingumą. Kuo tirpale daugiau vandenilio jonų, tuo tirpalo terpės rūgštingumas didesnis. Taigi pH reikšmė leidžia nustatyti, kokia yra tirpalo terpė: rūgšti (pH < 7), neutrali (pH = 7) ar šarminė (pH > 7). pH reikšmę galima nustatyti elektrometriniais aparatais, kurie yra žinomi kaip pH-metrai [56, 57].
Dideli pH svyravimai hidrogeliuose gali sukelti polimerinių grandinių krūvio pokyčius, dėl kurių padidėja hidrogelio tūris ir atsipalaiduoja dideli vaistinių medžiagų kiekiai [58]. Modeliuojant hidrogelius, svarbu atlikti pH matavimus, kadangi tai yra svarbus kriterijus, vertinant preparato kokybę [55].
Homogeniškumo vertinimas atliekamas, norint įvertinti hidrogelių kokybę. Hidrogelių homogeniškumą galima įvertinti vizualiai, atliekant mikroskopavimą. Vizualinis preparato homogeniškumo vertinimas naudingas, norint patikrinti, ar hidrogelyje nėra susidarusių agregatų bei pašalinių medžiagų [59, 60].
Norint įvertinti vaistinių medžiagų skvarbą į odos sluoksnius ir kinetinius parametrus dažnai naudojami in vitro, ex vivo ir in vivo modeliai [61]. Tačiau vykdant in vivo tyrimus, kurie yra atliekami su gyvūnais arba žmonėmis [62, 63], sunku įvertinti veikliųjų medžiagų skvarbą į epidermį ir dermą dėl sudėtingų procesų, kurie vyksta odoje [64].
In vitro tyrimai atliekami, norint įvertinti vaistinių medžiagų atpalaidavimo kinetiką iš nešiklio. In vitro tyrimas yra svarbus vaistinio produkto vystyme, kadangi suteikia naudingos informacijos puskiečių hidrofilinių sistemų kokybės kontrolei [65]. In vitro atpalaidavimo greitis gali atspindėti bendrą fizinių ir cheminių parametrų poveikį, įskaitant tirpumą, veikliųjų junginių dalelių dydį ir vaisto formos reologines savybes [66]. Dažniausiai naudojamas in vitro metodas yra atviros kameros konstrukcija. Tai metodas, kurio metu naudojamos moodifikuotas Franz tipo difuzinės celės kartu su sintetinėmis membranomis, tokiomis kaip polisulfonas ar celiuliozės acetatas. Membrana atskiria
donorinę faze, kurioje yra tiriamasis produktas, nuo akceptorinės terpės, pavyzdžiui, tokios kaip vanduo, skirtos vandenyje tirpių vaistinių medžiagų atpalaidavimui iš puskiečių formų[66]. Pusiau kietų preparatų, skirtų vartoti ant odos in vitro tyrimai dažniausiai atliekami, palaikant 32 °C akceptorinės terpės temperatūrą, kadangi tai atitinka žmogaus odos paviršiaus temperatūrą [67]. Veikliųjų junginių difuzija per membraną iš pusiau kieto produkto yra įvertinama, analizuojant iš anksto nustatytais laiko tarpais surinktus akceptorinės terpės mėginius. Mėginiai dažniausiai analizuojami efektyviosios skysčių chromatografijos metodu [66].
Mokslo srityje ex vivo – tai eksperimentas arba matavimas, kurio metu naudojant laboratorijos aparatus, sukuriama dirbtinė aplinka, kurioje be jokių pakeitimų iki 24 valandų vykdomas pasirinktas tyrimas, dažniausiai susijęs su ląstelėmis ar audiniais, paimtais iš gyvo organizmo [62, 68].Ex vivo
metodu užtikrinamos geriau kontroliuojamos sąlygos nei in vivo eksperimentinių tyrimų metu. Ex
vivo tyrimai kainuoja kur kas mažiau bei trunka mažiau laiko, lyginant su in vivo tyrimais [61].
Pagrindinis ex vivo modelių ir laboratorinių įrenginių tikslas - sukurti platformą, imituojančią organinės sistemos biologines, biochemines, biofizines ir biomechanines savybes [69].
Veikliųjų junginių iš hidrogelių skvarbos į odą ex vivo tyrimų metu gauti rezultatai turi gerą prognostinę reikšmę vertinant medžiagų in vivo biologinį pasisavinimą [60].
Visi prieš tai išvardinti ir trumpai apibūdinti metodai taip pat buvo pritaikyti ir šiame tyriamajame darbe.
1.10. Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Oda yra vienas iš lengviausiai prieinamų žmogaus organizmo organų, skirtų vietinio poveikio preparatų vartojimui, ir yra vienas iš pagrindinių vaistinių medžiagų tiekimo sistemos būdų [70]. Daugelis tyrimų rodo, kad propolyje esančios fenolinės rūgštys pasižymi antibakterinėmis [4], stipriomis antioksidacinėmis savybėmis ir veikia kaip laisvųjų radikalų akceptoriai [3]. Taip pat slopina fermentų COX-1 ir COX-2 aktyvumą, kurie sukelia uždegimą, skausmą ir karščiavimą [23] ir gali turėti slopinamąjį poveikį mutagenezei, karcinogenezei ir naviko genezei [3]. Yra atlikta nemažai tyrimų, kurie rodo, kad vietiškai vartojami propolio preparatai yra veiksmingi, saugūs, ir gerai toleruojami [25]. Atsižvelgiant į tai, propolio panaudojimas vietinio vartojimo kasdienės odos priežiūros produktuose gali būti veiksminga priemonė oksidaciniam stresui mažinti, taip palaikant sveiką odos būklę. Vienas iš galimų propolio fenolinių junginių tiekimo į odą būdų yra hidrogelio farmacinė forma. Per pastaruosius 50 metų hidrogeliai sulaukė daug dėmesio dėl jų plataus pritaikymo įvairiose srityse: biomedicinoje, medicinoje ir farmacijoje [42, 45, 50, 70]. Hidrogeliai yra laikomi vieni iš geriausių kandidatų dermatologinių ligų vietiniam gydymui arba odos būklės gerinimui [9]. Taigi fenolinių junginių tiekimas į odą gali būti pasiektas, sumodeliavus puskietes hidrofilines sistemas su propolio vandeniniu ekstraktu. Tačiau pagaminus hidrofilines sistemas svarbu įvertinti jų kokybę (pH, klampą, homogeniškumą). Taip pat svarbu įvertinti ir propolio fenolinių junginių atpalaidavimo greitį iš sumodeliuotų sistemų, kadangi nuo atpalaiduoto veikliųjų medžiagų kiekio priklauso produkto veiksmingumas.
2. Medžiagos ir tyrimų metodai
2.1. Tyrimų medžiagos, priemonės ir prietaisai 2.1.1. Darbe naudotos medžiagos:
Karbomeras 980 (Fagron, Olandija)
Natrio hidroksidas (Sigma-Aldrich, JAV)
Polivinilo alkoholis (Sigma-Aldrich, JAV)
Karboksimetilceliuliozės natrio druska (Sigma-Aldrich, JAV)
Hidroksipropilceliuliozė (Sigma-Aldrich, JAV)
Polivinilpirolidonas (Sigma-Aldrich, JAV)
Propolis, surinktas Varėnos raj. 2017 m. (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Kaunas, Lietuva)
2.1.2. Darbe naudotos priemonės ir prietaisai:
Dializės membrana, MWCO 6-8 kD (Spectra/Por®, JAV)
Filtravimo popierius, vidutinis/greitas filtravimo greitis, porų dydis 8-12 µm, maksimalus pelenų kiekis 0,007 %, diametras 90 mm (Frisenette, Danija)
Švirkštinis filtras CHROMAFIL® PVDF-20/25, 0,20 µm (Macherey-nagel GmbH & Co.,Vokietija)
Nailoninis membraninis švirkštinis filtras CHROMAFIL® AO-20/15 MS, 0,20 µm (Macherey-nagel GmbH & Co.,Vokietija)
Aliuminio folija (Carl Roth GmbH + Co., Vokietija)
Spektrofotometras su diodų matricos detektoriumi: Agilent 8453 UV-Vis/DAD (Agilent Technologies, JAV)
pHmetras 766 su elektrodu Knick SE 104 N (Knick Elektronische Meßgeräte GmbH & Co, Vokietija)
Reometras MCR (Modular Compact Rheometer) 102 (Anton Paar, Austrija)
Svarstyklės PBS/PBJ, (Kern &Sohn GmbH, Vokietija)
Analitinės svarstyklės SBC 31 (Scaltec Instruments GmbH, Vokietija)
Automatinės pipetės (Eppendorf, Vokietija)
Magnetinė maišyklė su kaitinimo įranga: IKA® C – MAG H57 (IKA®-Werke GmbH & Co. KG, Vokietija)
Kapiliarinis skysčių chromatografas „Agilent 1260 Infinity Capillary LC–DAD“ (Agilent technologies Inc., JAV)
Mikroskopas Olympus IX71 kartu su objektyvu LCAchNYOXPH (Olympus Co., Japonija)
Termostatuojama cirkuliacinė vandens vonelė Grant TC120 (Grant Instruments, Didžioji Britanija)
Peristaltinis siurblys Masterflex® L/S® su daugiakanale siurblio galva (Cole-Parmer Instrument Co., JAV)
2.2. Tyrimų metodai
2.2.1. Vandeninės propolio ištraukos gamyba
Šiame tiriamajame darbe išgrynintas vanduo buvo naudojamas kaip ekstrahentas. Žaliavos ir ekstrahento santykis 1:10 [71]. Susmulkinta propolio žaliava buvo pasverta naudojant analitines svarstykles SBC 31 ir suberta į stiklinį, karščiui atsparų indą. Atitinkamas tūris išgryninto vandens buvo užpiltas ant žaliavos. Stiklinis indas su propolio žaliava ir išgrynintu vandeniu buvo uždengtas aliuminio folija ir pastatytas ant magnetinės maišyklės su įkaitinimo įranga IKA® C – MAG H57. Propolio žaliava buvo ekstrahuojama 1 val. 70 °C temperatūroje, nustatytas 250 aps./min maišymo greitis. Vėliau propolio ekstraktas buvo nuimtas nuo maišyklės ir laikomas kambario temperatūroje. Naudojant „Frisenette” įmonės filtravimo popierių, kurio porų dydis 8-12 µm, propolio ekstraktas buvo filtruojamas. Vėliau, pagamintas propolio ekstraktas dar sykį filtruotas, naudojant švirkštinį filtrą CHROMAFIL® PVDF-20/25, porų dydis 0,20 µm. Pagamintas vandeninis propolio ekstaktas laikomas sandariai uždarytame stikliniame buteliuke 15-25 °C temperatūroje [41].
2.2.2. Hidrogelių gamyba
Hidrogelių pagrindų gamybai buvo pasirinktos šios pagalbinės medžiagos: karbomeras, polivinilo alkoholis, karboksimetilceliuliozės natrio druska, hidroksipropilceliuliozė ir polivinilpirolidonas. Hidrogeliai, kurių pagrindą sudarė tik viena medžiaga karbomeras, gaminti su išgrynintu vandeniu (vienas kontrolinis mėginys) arba su vandenine propolio ištrauka (trys mėginiai). Visi kiti hidrogeliai gaminti su vandenine propolio ištrauka (VPI) ir išgrynintu vandeniu (dvylika mėginių). Pagamintų hidrogelių sudėtys pateiktos 3 lentelėje.
3 lentelė. Hidrogelių sudėtis Hidrofilinė sistema Komponentai (%) Karbome- ras Polivinilo alkoholis Karboksi- metil- celiuliozės natrio druska Hidroksi-propil- celiuliozė Polivinil- pirolido-nas NaOH (10 % tirpalas) VPI H2O H-0 1 – – – – Iki 5,5 pH – 99 H-1.1 1 – – – – Iki pH 3,9-5,8 99 – H-2.1 1 1 – – – Iki 5,5 pH 79 19 H-2.2 1 2 – – – Iki 5,5 pH 79 18 H-2.3 1 3 – – – Iki 5,5 pH 79 17 H-3.1 1 – 1 – – Iki 5,5 pH 79 19 H-3.2 1 – 2 – – Iki 5,5 pH 79 18 H-3.3 1 – 3 – – Iki 5,5 pH 79 17 H-4.1 1 – – 1 – Iki 5,5 pH 79 19 H-4.2 1 – – 2 – Iki 5,5 pH 79 18 H-4.3 1 – – 3 – Iki 5,5 pH 79 17 H-5.1 1 – – – 1 Iki 5,5 pH 79 19 H-5.2 1 – – – 2 Iki 5,5 pH 79 18 H-5.3 1 – – -– 3 Iki 5,5 pH 79 17
maišytos kambario temperatūroje tol, kol susiformavo vientisas, klampus skystis. Vėliau pridėtas atitinkamas kiekis 10 % natrio hidroksido tirpalo, kuris paskatino gelinės struktūros formavimąsi. H-0 hidrogelio pagrindu buvo pagamintas vienas mėginys, kurio pH reikšmė buvo 5,5. H-1.1 hidrogelio pagrindu buvo pagaminti trys mėginiai, kurie skyrėsi pH reikšmėmis:
3,9
5,5
5,8
Visos šios skirtingos pH terpės buvo gautos į hidrogelį pridedant atitinkamą kiekį 10 % natrio hidroksido tirpalo, kurio tūris neviršijo 0,5 ml. Įvertinus natrio hidroksido svarbą susidarančio karbomero gelio reologinėms savybėms, buvo nuspręsta ištirti, kaip pridedamas natrio hidroksido kiekis lemia susidarančio gelio pH ir jo įtaką polifenolinių junginių atplaidavimo kinetikai.
Hidrofilinė sistema H-0 (kontrolinis mėginys) buvo gaminama, norint palyginti fizines savybes, homogeniškumą ir klampą tarp skirtingų hidrofilinių sistemų: hidrofilinės sistemos, sudarytos iš vandens ir hidrofilinės sistemos, kurios sudėtyje buvo vandeninės propolio ištraukos.
Gaminant H-2.1-H-2.3 hidrogelius, pirmiausia polivinilo alkoholis buvo tirpinamas išgrynintame vandenyje 2 val. 95 °C temperatūroje, nustatytas 250 aps./min maišymo greitis. Atvėsus tirpalui, jis buvo sumaišomas su atitinkamu kiekiu VPI. Tada maišant buvo pridėtas atitinkamas karbomero kiekis. Susiformavus vienalytei masei, pridėtas atitinkamas kiekis 10 % natrio hidroksido tirpalo. Susiformavo gelinė struktūra.
Gaminant H-3.1-H-3.3 hidrogelius, VPI skiedžiama su atitinkamu išgryninto vandens tūriu, maišant pridedamas atitinkamas karboksimetilceliuliozės natrio druskos kiekis ir laikoma 15-25 °C temperatūroje, kol išbrinksta. Tada maišant pridedamas atitinkamas karbomero kiekis, kuris taip pat laikomas 15-25 °C temperatūroje, kol išbrinksta. pH reikšmė koreguojama pridedant atitinkamą kiekį 10 % natrio hidroksido tirpalo.
Gaminant H-4.1-H-4.3 hidrogelius, VPI skiedžiama su atitinkamu išgryninto vandens tūriu, maišant pridedamas atitinkamas hidroksipropilceliuliozė kiekis ir laikoma 15-25 °C temperatūroje, kol išbrinksta. Tada maišant pridedamas atitinkamas karbomero kiekis, kuris taip pat laikomas 15-25 °C temperatūroje, kol išbrinksta. pH reikšmė koreguojama pridedant atitinkamą kiekį 10 % natrio hidroksido tirpalo.
Gaminant H-5.1-H-5.3 hidrogelius, VPI skiedžiama su atitinkamu išgryninto vandens tūriu, maišant pridedamas atitinkamas polivinilpirolidono kiekis ir laikoma 15-25 °C temperatūroje, kol išbrinksta. Tada maišant pridedamas atitinkamas karbomero kiekis, kuris taip pat laikomas 15-25 °C temperatūroje, kol išbrinksta. pH reikšmė koreguojama pridedant atitinkamą kiekį 10 % natrio hidroksido tirpalo.
Siekiant užtikrinti vienodą polifenolinių junginių stabilumą tiriamuose hidrogeliuose buvo pasirinkta formuluoti gelius, kurių pH reikšmė būtų artima 5,5. Todėl tirti H-2.1-H-5.3 hidrogeliai turėjo skirtingas komponentų sudėtis, bet visų šių hidrogelių pH reikšmė buvo 5,5.
2.2.3. Hidrogelių modeliavimas
H-0-H-5.3 hidrogeliai buvo gaminami naudojant karbomerą 980 (Fagron, Olandija). Tai baltos spalvos, purūs, specifinio kvapo, higroskopiniai milteliai, kurie nėra toksiški, degūs ir nedirgina odos [72]. Karbomeras - sintetinis, didelio molekulinio svorio akrilo rūgšties polimeras, sujungtas su cukrų arba polialkoholių alkenilo eteriais. Karbomero struktūrinė formulė pavaizduota 3 pav. Karbomeras naudojamas skystų arba pusiau kietų farmacinių preparatų gamyboje. Formos gali būti: geliai, kremai, losjonai ir tepalai. Šios formos gali būti naudojamos akių, rektalinių, odos, vaginalinių vaistų gamybai. Gelių gamybai dažniausiai naudojama 0,5-2,0 % karbomero koncentracija [73]. Čižaitė ir kt. [74] taip pat sumodeliavo hidrofilines sistemas, kurių gamyboje, kaip pagrindinė gelifikuojanti medžiaga, buvo naudojamas karbomeras. Tyrimo metu minėti mokslininkai pagamino hidrofilines sistemas su skystuoju vaistinių melisų ekstraktu, kuriose buvo skirtinga karbomero koncentracija. Jie nustatė, kad, pasirinkus 1 % karbomero koncentraciją, pagaminamos tinkamos konsistencijos puskietės hidrofilinės sistemos, iš kurių atsipalaiduoja didesnis veikliųjų junginių kiekis nei iš hidrogelių, kuriuose karbomero kocentracija yra mažesnė.Todėl H-0-H-5.3 hidrogelių gamybai taip pat buvo pasirinkta 1 % karbomero koncentracija. Taip pat karbomerui išbrinkus vandenyje, susidaro rūgštinės koloidinės dispersijos, kurias neutralizavus (pridėjus bazę) susiformuoja klampi konsistencija. Karbomerų polimerams neutralizuoti gali būti naudojamos įvairios medžiagos: aminorūgštys, kalio hidroksidas, natrio bikarbonatas, natrio hidroksidas ir organiniai aminai, tokie kaip trietanolaminas [72, 73]. H-0-H-5.3 hidrogelių neutralizavimui buvo naudojamas 10 % natrio hidroksido tirpalas.
3 pav. Karbomero struktūrinė formulė [73]
H-2.1-H-2.3 hidrogelių pagrindą sudarė 1 % karbomeras 980 (Fagron, Olandija), nuo 1 iki 3% polivinilo alkoholis (Sigma-Aldrich, JAV), 79 % VPI ir nuo 19 iki 17 % išgrynintas vanduo.
Polivinilo alkoholis (PVA) – tai bekvapiai, gelsvai balti milteliai, gali būti ir permatomos granulės [72]. PVA gali būti gaunamas įvairiais metodais, tačiau dažniausiai naudojamas metodas yra sukurtas 1924 m. vokiečių mokslininkų Herrmann’o ir Haehnel’io. Pirmiausia yra vykdoma vinilo acetato laisvojo radikalo polimerizacija, po kurios susidaro tarpinis produktas, vadinamas polivinilo acetatu. Tada acetato grupė yra hidrolizuojama stipria baze, esant metanoliui, ir taip susidaro polivinilo alkoholis (4 pav.) [75]. Šis sintetinis polimeras yra tirpus vandenyje, mažai tirpus etanolyje (95 %), praktiškai netirpsta acetone [72]. Remiantis daugeliu mokslinių tyrimų, PVA geriausia tirpinti vandenyje, jį kaitinant ~ 90 °C temperatūroje [75, 76]. Atsižvelgiant į tai, gaminant H-2.1-H-2.3
suderinamas sintetinis polimeras. Jis dažnai naudojamas kremų, losjonų ir gelių gamyboje. Daugelis tyrimų rodo, kad PVA yra tinkamas kaip tablečių padengimo medžiaga. Taip pat dažnai naudojamas kaip stabilizatorius emulsijų gamyboje, kaip klampumą didinantis agentas klampiems preparatams, pavyzdžiui, oftalmologiniams produktams. Naudojamas dirbtinių ašarų ir kontaktinių lęšių tirpalų gamyboje (sumažina trintį). Visų šių preparatų gamybai dažniausiai naudojama 0,5-3,0 % polivinilo alkoholio koncentracija [73, 77]. Todėl hidrogelių H-2.1-H-2.3 gamybai atitinkamai buvo parinkta nuo 1 iki 3 % polivinilo alkoholio koncentracija.
4 pav. Polivinilo alkoholio sintezė [75]
H-3.1-H-3.3 hidrogelių pagrindą sudaro 1 % karbomero 980 (Fagron, Olandija), nuo 1 iki 3 % karboksimetilceliuliozės natrio druska (Sigma-Aldrich, JAV), 79 % VPI ir nuo 19 iki 17 % išgrynintas vanduo.
Karboksimetilceliuliozės natrio druska (CMCNa) – tai balti arba beveik balti, bekvapiai, beskoniai granuliuoti milteliai, higroskopiški po džiovinimo, praktiškai netirpsta acetone, etanolyje (95 %), eteryje ir toluene, tačiau lengvai tirpsta vandenyje ir sudaro skaidrius, koloidinius tirpalus (nepriklausomai nuo temperatūros) [72, 73]. Šis anijoninis, vandenyje tirpus polimeras paprastai gaunamas vykstant reakcijai tarp celiuliozės junginio kartu su natrio hidroksidu ir natrio monochloracetato (5 pav.) [78, 79].
CMCNa - netoksiška, nedirginanti, biologiškai suderinama ir nebrangiai kainuojanti medžiaga. Dėl savo gebėjimo padidinti klampumą, ji yra plačiai naudojamageriamųjų per burną (peroralinis būdas) ir vartojamų vietiškai (ant odos, gleivinių ir t.t.) vaistų kompozicijose. Karboksimetilceliuliozės natrio druska taip pat dažnai naudojama pagerinti tablečių suirimą (dezintegrantas), naudojama kaip tablečių rišiklis (padeda surišti visus ingredientus ir vaistui suteikia formą bei mechaninį stiprumą), naudojama emulsijų stabilizavimui arba gelių gamybai. Visų šių preparatų gamybai dažniausiai naudojama 0,05-6,0 % karboksimetilceliuliozės natrio druskos koncentracija [73, 80, 81]. Atsižvelgiant į hidrogelių H-2.1-H-2.3 kompozicijas, hidrogelių H-3.1-H-3.3 gamybai taip pat atitinkamai buvo parinkta nuo 1 iki 3 % CMCNa koncentracija.
