HETEROCIKLŲ, TURINČIŲ S IR N HETEROATOMŲ SINTEZĖ, ANALIZĖ IR METABOLOMINIŲ POKYČIŲ TYRIMAS VEIKIANT S.AUREUS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

MONIKA REMEZAITĖ

HETEROCIKLŲ, TURINČIŲ S IR N HETEROATOMŲ SINTEZĖ,

ANALIZĖ IR METABOLOMINIŲ POKYČIŲ

TYRIMAS VEIKIANT S.AUREUS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas prof. dr. Hiliaras Rodovičius

KAUNAS, 2016

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis _______ 2016 - ___ - ___

HETEROCIKLŲ, TURINČIŲ S IR N HETEROATOMŲ SINTEZĖ,

ANALIZĖ IR METABOLOMINIŲ POKYČIŲ

TYRIMAS VEIKIANT S.AUREUS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

prof. dr. Hiliaras Rodovičius _______ 2016 - ___ - ___

Recenzentas Darbą atliko

Vardas, pavardė _______ magistrantė Monika Remezaitė ________ 2016 - ___ - ___ 2016 - ___ - ___

KAUNAS,

3

TURINYS

6.1 Masių spektrometrijos pritaikymas metabolomikoje ... 13

6.1.1 Mėginių paruošimas SC – MS analizei ... 14

6.1.2 Automatinė jonų detekcija ir statistinė analizė ... 14

6.1.3 Metabolitų identifikavimas ... 16

6.2 S. aureus biologiniai taikiniai ... 16

6.3 Folio rūgšties biosintezės keliai, jų slopinimas ir metabolitų nustatymas ... 18

6.3.1 Folio rūgšties apykaitos keliai ... 18

6.4 Penkianarių heterociklų apžvalga ... 22

7. METODAI ... 28 7.1 Junginių sintezė ... 28 7.2 Analizės metodai ... 32 7.2.1 Plonasluoksnė chromatografija (PLC) ... 32 7.2.2 FT–IR spektroskopija ... 32 7.2.3 UV spektrofotometrija ... 33 7.2.4 SC–MS spektrometrija ... 33 7.2.5 Lydymosi temperatūra ... 33

7.3 Mikrobiologinio mėginio paruošimas... 34

4

7.3.2 Ląstelių mėginių ėmimas ir intraceliuliarių metabolitų ekstrakcija ... 34

7.4 Metabolinio tyrimo įvertinimas SC–MS spektrometrijos metodu... 35

7.5 Molekulinis modeliavimas ir in silico atranka ... 36

7.5.1 Baltymo struktūros parinkimas ir paruošimas darbui ... 36

7.5.2 Ligandų modeliavimas ir paruošimas darbui ... 37

7.5.3 Numanomo aktyvumo nustatymas ... 37

8. REZULTATAI ... 37

8.1 Junginių analizės rezultatai ... 37

8.1.1 Plonasluoksnė chromatografija ... 37

8.1.2 FT–IR spektroskopija ... 38

8.1.3 UV spektrofotometrija ... 39

8.1.4 SC – MS analizė ... 40

8.2 Metabolinio tyrimo analizė ... 41

8.3 In silico analizė ir rezultatai ... 44

9. IŠVADOS ... 46

10. REKOMENDACIJOS ... 47

11. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 48

5

1. SANTRAUKA

Monikos Remezaitės magistro baigiamasis darbas „Heterociklų, turinčių S ir N heteroatomų metabolominių pokyčių tyrimas veikiant S.aureus“. Mokslinio darbo vadovas prof. dr. Hiliaras Rodovičius. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra – Kaunas.

Tyrimo tikslas: nustatyti heterociklų, turinčių S ir N heteroatomų, metabolominį poveikį S. aureus folio rūgšties kaskadai.

Tyrimo uždaviniai:

1. Sintetinti penkianarius heterociklus, turinčius S ir N heteroatomus (MR). 2. Nustatyti MR junginių tapatybę, fiziko-chemines savybes.

3. Atlikti sintetintų MR junginių metabolitų pokyčio tyrimą veikiant S. aureus. 4. Atlikti gautų junginių molekulinį modeliavimą in silico

Tyrimo metodai: MR junginiai sintezuojami ciklizacijos reakcijos metodu. MR sintetinių junginių struktūra įrodyta ultravioletinės (UV), infraraudonosios (IR) spinduliuotės ir masių spektrometrijos metodais. Grynumas nustatytas efektyviosios skysčių chromatografijos su masių spektrometrija (ESC-MS) metodu. Lydymosi temperatūra nustatyta Koflerio prietaisu.

Tyrimo rezultatai: Išanalizavus duomenis nustatyta kad visi susintetinti MR junginiai mažina 10-formil 7,8-dihidrofolato (FFH2) kiekį, lyginant su kontrole. 83 % heterociklų veikia aktyviau į timidilato sintazę nei kontrolė, nustatytas deoksiuridino monofosfato (dUMP) padidėjimas. Be to, įvertinta, kad 92 % junginių sukelia 5 – aminoimidazolo – 4 – karboksiamido ribonukleotido (AICAR) padidėjimą lyginant su kontrole. Apibendrinus rezultatus nustatyta, jog penkianariai heterociklai, turintys sieros ir azoto atomus, statistiškai patikimai veikia į S. aureus bakterijų kultūrą: visuose sintezuotuose junginių mėginiuose FFH2 sumažėjo daugiau negu 3 kartus (log2(T/K)=3), dUMP - 3 karto (log2(T/K)=2.89), o AICAR padaugėjo ne

mažiau kaip 2 karto (log2(T/K)=2.78), kai statistinis patikimumas p<0.001.

Tyrimo išvados: Sintetinta 12 MR junginių, jų išeiga svyravo 50 – 93 %. Kiekvieno MR junginio struktūra patvirtinta PLC, UV , IR ir MS spektrinėmis analizėmis, o jų grynumas – ESC metodu, grynumas svyravo 90 – 95 %. Nustatyta, kad visi MR junginiai mažina FFH2 kiekį, lyginant su neigiama kontrole. Taip pat 83 % sintezuotų heterociklų didina dUMP kiekį. Nustatyta, kad 92 % junginių sukelia AICAR kiekio padidėjimą, lyginant su kontrole. MR – 12 junginys aktyviausiai jungiasi su baltymo 3qna (6-piruvoiltetrahidropterino sintaze) aktyviajame centre.

Tyrimo rekomendacijos: atlikti detalesnius metabolitų pokyčių tyrimus, identifikuojant visų metabolitų pokyčius ir nustatyti junginių tikslų veikimo mechanizmą.

6

2. SUMMARY

Master thesis by Monika Remezaitė „Synthesis, analysis and change of metabolomics profile analysis against S. aureus " of five members, which have S and N heteroatoms derivatives. Supervisor – Hiliaras Rodovičius, professor, Ph. D. Lithuanian university of health sciences, faculty of Pharmacy, Department of Drug chemistry.

Aim of study: to perform synthesis of five member heterocycles, which have S and N heteroatoms and identify it metabolomic profile against S. aureus.

Study objective’s: To synthesize five member heterocycles, which have S and N heteroatoms Study methods: synthesis of compounds was done in cyclization reactions. The identity of compounds was confirmed by means of UV, IR and MS spectral data. Purity analysis was performed LC-MS method. Melting points were determined by using Kofler bench. In silico studies was done using Schrodinger program

Study results: purity of the synthesized compounds is 90 – 95%. The metabolitic change of the synthesized compounds to S. aureus was analized. It was found that 100% of the compounds reduced the amount of 10-formyl-dihydrofolate (FFH2) compared to the control. 83 % of the compounds increases the amount of Deoxyuridine monophosphate (dUMP) compered to the control and 92 % of the compounds increases the amount of 5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR) compered to the control. Summarizing the results of observation of the five-membered heterocyclic ring containing sulfur and nitrogen atoms, statistically reliable function in Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC 25923) bacterial culture: all the synthesized compounds in samples of FFH2 fell more than 3 times (log 2 (T / K) = 3) dUMP - 3 times (log 2 (T / K) = 2.89) and AICAR increased at least 2 times (log2 (T / K) = 2.78) when the statistical significance p <0.001. MR - active compound 12 bound to protein 3qna (6-piruvoiltetrahidropterin synthase) in the active site.

Conclusions: Successfully performed the synthesis of 12 compounds. . It was found that 100% of the compounds reduced the amount of FFH2 compared to the control. 83 % of the compounds increases the amount of dUMP compered to the control and 92 % of the compounds increases the amount of AICAR compered to the control. MR - active compound 12 bound to protein 3qna (6-piruvoiltetrahidropterino synthase) in the active site.

Recommendations: do more in depth metabolomic change research, identifying all metabolites changes and identify compounds exact mechanism of action.

7

PADĖKA

Noriu padėkoti savo magistro darbo vadovui prof. dr. Hiliarui Rodovičiui už idėjas vykdant magistro darbo eksperimentinę dalį, pagalbą rašant teorinę dalį bei visus organizacinius aspektus.

Dėkoju LSMU FF Vaistų chemijos asistentui Liudui Šlepikui, kuris dvejus magistratūros studijų metus padėjo man kryptingai mokytis ir gilinti žinias, vykdant magistrinio darbo rengimą.

Dėkoju LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos instituto vedėjui prof. dr. Alvydui Povilioniui bei laborantėms už nuoširdžią pagalbą ir mokslinę konsultaciją vykdant mikrobiologinį tyrimą.

Dėkoju LSMU FF Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros vedėjui prof. dr. Liudui Ivanauskui ir doktorantui Mindaugui Marksai už pagalbą atliekant magistro tiriamąją dalį.

Dėkoju studijų kolegoms Eligijui Kupriūnui, Giedrei Tautkevičienei ir Ryčiui Mačioniui už pagalbą atliekant magistro tyrimą ir bendras diskusijas.

prof. dr. Hiliaras Rodovičius Liudas Šlepikas prof. dr. Alvydas Povilionis

8

3. SANTRUMPOS

S. aureus Auksinis stafilokokas (lot. Staphylococcus aureus)

MR Sintezuotų penkianarių heterociklų, turinčių S ir N heteroatomų. kodas DMSO Dimetilsulfoksidas

UV Ultravioletinė spinduliuotė Rf Paviršiaus šiurkštumo faktorius IR Infraraudonoji spinduliuotė

FT–IR Furjė transformacijos infraraudonųjų spinduliuotė MS Masių spektrometrija

SC–MS Skysčių chromatografija – masių spektrometrija PLC Plonasluoksnė skysčių chromatografija

MRSA Meticilinui rezistentiškas S. aureus

PCA Pagrindinė komponentų analizė (ang., principal component analysis) FH4 Tetrahidrofolatas

FFH2 10-formil 7,8-dihidrofolato

AICAR 5 – aminoimidazolo – 4 – karboksiamido ribonukleotidas FAICAR 5 – foraminoimidazolo – 4 – karboksiamido ribonukleotidas FGAR Fosforibosil – N – formilglicinamidas

GAR Glicinamido ribonukleotidas CH2FH4 Metileno tetrahidrofolatas

dTMP Deoksitimidino monofosfatas

dUMP Deoksiuridino monofosfatas Ser Serinas

Gly Glicinas

ATP Adenozin 5 – trifosfatas ADP Adenozin 5 – difosfatas

NADP+ Nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas

NAPH Nikotinamido adenino dinukleotido fosfato oksidazė DNR Deoksiribonukleorūgštis

DHPS Dihidropteroato sintazė DHFR Dihidrofolato reduktazė

9 GTP Guanozino trifosfatą

GCYH I Guanino ciklohidrolazė I

TIM Izomerazės tipo vamzdinis (ang. barrel) baltymas DHNTH Dihidroneopterino hidrolazė

DHNA Dihidroneopterino aldolazė HPPK Dihidropterino pirofosfokinazė DHFS Dihidrofolato sintetazė

FPGS Folilpoliglutamato sintetazė CFU Kolonijas sudarančios vienetai PTFE Politetrafluoretilenas

SD Standartinis nuokrypis (ang. standard deviation) MSK Mažiausia slopinančioji koncentracija

TMP Trimetoprimas NRS Nordulfazolis SPD Sintetinis produktas

10

4. SĄVOKOS

Aduktas – jonizuotas jono ir kito atomo jonizuotas kompleksas Analitė – mėginyje nustatomas komponentas.

Cerebrospinalinis skystis (lot. liquor cerebrospinalis) − skystis užpildantis smegenų skilvelius, talpyklas, subarachnoidinę ertmę ir povoratinklinį tarpą, esantį po voratinkliniu smegenų dangalu.

Fragmentacija (angl. fragmentation) – medžiagos ar molekulės dalijimąsi į mažus subvienetus.

Jonizacija – fizinis procesas, kurio metu atomas arba molekulė paverčiama jonu, keičiant santykį tarp protonų ir elektronų skaičių.

m/z dydis – dydis, kuris atspindi santykį tarp masės ir krūvio jonizuotoje formoje.

Sonifikacija – procesas, kurio metu taikant ultragarso energija organinės medžiagos suskaidomos į radikalus. Supernatantas – skaidrus skystis, kuris gaunamas po centrifugavimo.

11

5. ĮVADAS

Metabolomika – perspektyvi mokslo sritis, tirianti ląstelių, audinių ir organizmo metabolitų pokyčius. Pirmą kartą „metabolomikos“ terminą pavartojo 1998 metais Oliver S.G., o 2007 sausio 23 dieną buvo užbaigtas pirmas žmogaus metabolomikos tyrimas. Taigi, sąlyginai dar jauna biochemijos mokslo šaka – metabolomika, jau yra užėmusi labai svarbią poziciją tiriant visą vieno gyvybinio vieneto (prokariotinės ar eukariotinės ląstelės, audinio ar kitų biologinių darinių) medžiagų apykaitą.Metabolitai atspindi, kas vyksta ląstelėse ir organizmuose tam tikru momentu. Metabolominiai tyrimai vyksta pasitelkiant šiuolaikinius instrumentinės cheminės analizės prietaisus: branduolių magnetinį rezonansą (BMR), tandeminę dujų ar skysčių chromatografiją (atitinkamai – DC ir SC) su įvairiomis masių spektrometrijos (MS) modifikacijomis [1]. Literatūroje dažniausiai yra sutinkami šie metodai: DC–MS su smūgine elektronų jonizacija, SC–MS su elektropurkštuvine arba atmosferos slėgio chemine jonizacijomis. Taip pat yra taikomi tandeminiai MS/MS metodai, kada norima nustatyti galimus metabolitų fragmentus. Populiariausios pritaikomos MS/MS technikos yra trigubos kvadrupolinės (QqQ), kvadrupolinės su lėkio trukmės (Q–TOF) ir ant matricos vykstančios, sužadintos lazerio spinduliuote, desorbcijos/jonizacijos su lėkio trukmės detekcijomis (MALDI–TOF) [2,3]. Auksinis stafilokokas (lot. Staphylococcus aureus, S. aureus) vienas svarbiausių patogeninių bakterijų, kuri sukelia platų spektrą tiek įprastinių, tiek hospitalinių infekcinių ligų (pneumonija, pielonefritas, sepsis ir kt.).Remiantis „SENTRY Antimicrobial Surveillance Program“ duomenimis, kurioje teigiama 1997-2002 laikotarpiu 181.000 izoliuotų pacientų S. aureus buvo dažniausia hospitalinės bakteremija Šiaurės Amerikoje (paplitimą, 26,0%) ir Lotynų Amerikoje (paplitimas, 21,6%) ir buvo antra labiausiai paplitusi priežastis hospitalinės bakteremija Europoje (paplitimas, 19,5%) [4]. Taip pat, 2002-2003, 59 JAV ligoninėse buvo nustatyta, kad 6697 pacientai sergantys kraujo infekcinėmis ligomis ir būtent S. aureus bakterija buvo rasta kraujo tyrimuose [4]. Įvairių šio mikroorganizmo padermių (įskaitant ir meticilinui jautrias – MRSA) plitimas iki epideminio lygio skatina sveikatos priežiūros specialistų rūpestį visuomenės sveikata, todėl yra ieškoma naujų terapinių priemonių [5]. Vienas neįprastas būdas įveikti šios bakterijos sukeliamas infekcines ligas yra organizmo metabolinių kelių sutrikdymas. Kitas panašus būdas, yra įvairių bakterijų virulentiškumo faktorių slopinimas [5]. Manomas, pastarosios strategijos privalumas – leistų apsaugoti naujos kartos vaistus nuo klasikiniams antibiotikams būdingo įgyjamo rezistentiškumo problemos.

Darbo tikslas – nustatyti heterociklų, turinčių S ir N heteroatomų, metabolinį poveikį S. aureus folio rūgšties kaskadai.

12 Darbo uždaviniai:

1. Sintezuoti penkianarius heterociklus, turinčius S ir N heteroatomus (MR). 2. Nustatyti MR junginių tapatybę, fiziko-chemines savybes.

3. Atlikti sintetintų MR junginių metabolitų pokyčio tyrimą veikiant S. aureus. 4. Atlikti gautų junginių molekulinį modeliavimą in silico.

13

6. LITERATŪROS APŽVALGA

6.1 Masių spektrometrijos pritaikymas metabolomikoje

Metabolominiai eksperimentai gali būti atliekami tik tiksliai parengus tyrimo planą ir validavus duomenis tolimesnei analizei ir interpretacijoms. Tyrimas pradedamas kontrolinių ir eksperimentinių mėginių paruošimu prieš atliekant bandinių įleidimą į SC–MS sistemą. Praėjus SC–MS analizės laikui, iš gautų rezultatų yra identifikuojami metaboliniai „pirštų antspaudai“. Pastarieji duomenys yra apdorojami, naudojantis automatizuotais programiniais paketais, kuriais yra nustatomi chromatogramų ir MS spektrų smailės. Gauti metabolitus apibūdinantys duomenys yra įvertinami tinkamais statistiniais metodais. Galiausiai nustatyti charakteringi signalai, atsiskiriantys nuo prietaisų registruojamo triukšmo, yra apjungiami su masių spektrinės analizės ir paieškos duomenų bazėse duomenimis bei kitais matematiniais ir informaciniais programiniais įrankiais [6]. Visi šie kritiniai etapai yra pavaizduoti (1 pav.) ir plačiau aptarti tolimesniuose skirsniuose.

1 pav. Metabolominio tyrimo etapai:

14

6.1.1 Mėginių paruošimas SC – MS analizei

Ruošiant įvairius biologinius mėginius, pavyzdžiui, ląstelių ekstraktus ar biologinių skysčių bandinius, metabolitų ekstrakcija stipriai priklauso nuo analizuojamo pavyzdžio ir jo cheminių struktūrų savybių: taikomos skirtingos ekstrakcijos sąlygos tiek poliniams junginiams, tiek lipidams. Literatūros duomenimis [7–9] lengviausiai yra paruošiami šlapimo mėginiai, kurie tiesiog praskiedžiami ultra švariu vandeniu prieš atliekant injekcijas į SC–MS sistemą. Sudėtingiau yra paruošiami baltymų savo sudėtyje turintys bandiniai – kraujo plazma, cerebrospinalinis skystis ar kiti, nes ekstrakcijai atlikti yra reikalingi įvairūs organiniai tirpikliai. Dažniausiai yra naudojami metanolis, etanolis, acetonitrilas ar jų mišiniai [10,11]. Atliekant panašias procedūras yra paruošiamas ir ląstelių ekstraktų mėginys. Metabolitai tiek iš prokariotinių ląstelių, tiek iš eukariotinių ląstelių kultūrų yra išskiriami juos centrifuguojant su šaltu organiniu tirpikliu ar jų mišiniais. Supernatantai yra atskiriami nuo nusėdusių ląstelių liekanų, o ant pastarųjų vėl yra užpilamas šaltas tirpiklis ir sumaišomas. Po to atliekamas ląstelių ir jų membranų suardymas. Tiriamasis pavyzdys yra sonifikuojamas ultragarso vonelėje arba mechaniškai purtomas ir maišomas su specifiniais rutuliukais [12], kurie gali būti pagaminti iš stiklo, keramikos arba plieno [13]. Sudėtingiausiai yra paruošiami biologinių audinių mėginiai, nes turi būti greitai paimti ir užšaldyti. Šie bandiniai turi būti laikomi skystame azote iki laiko momento, kai bus gaminami tiriamieji pavyzdžiai tolimesnei metabolominei analizei. Kitas biologinio audinio mėginio paruošimo etapas yra paimto užšaldyto audinio homogenizavimas atšaldytame organiniame tirpiklyje, pavyzdžiui metanolyje. Šiai dienai yra sukurta įvairių biologinių audinių ekstrahavimo protokolų [14–17]. Dažnai yra taikomas Folch ekstrakcijos metodas [18], kai norima švariai atskirti ir tirti tik polinę metabolitų frakciją nuo netirpių lipidų arba analizuoti tiek polines, tiek nepolines junginių frakcijas [19,20]. Tolimesnė mėginio paruošimo eiga yra panaši į anksčiau aptartų pavyzdžių [6]. Tolimesnė metabolitų ekstrakcija priklauso nuo galimų sąlygų: ekstrahentu naudojamas šaltas organinis tirpiklis ar mišinys; mėginio centrifugavimas arba skiedimas mobiliąja faze, naudojama SC–MS analizėje; mėginio koncentravimas pasitelkiant liofilizavimo metodus arba išgarinant jį iki sauso likučio sumažinto atmosferos slėgio aplinkoje; sauso likučio tirpinimas tinkamame tirpiklyje ir paruošto galutinio bandinio įleidimas į SC–MS sistemą [5,13,16].

15 Tęsiant biologinio mėginio metabolominį tyrimą, kitas siekiamas tikslas yra pateikti pradinius neapdorotus duomenis matricos formatu, kuris yra lengvai suderinamas su vėlesne statistine ir biochemine analize. Šiame etape problemų sukelia tai, jog apdoroti duomenys yra patentuoti analitinės ir programinės įrangos gamintojo, todėl būna sunku suderinti su kitų gamintojų informaciniais ir statistiniais įrankiais [6]. Tai išsprendžiama atlikus matricos formato konversiją į universalių duomenų formatą, pavyzdžiui, mzXML arba

netCDF – bendra tinklo duomenų forma (ang. Network Common Data Form), kurią galima pasiekti per

internetinę prieigą (www.unidata.ucar.edu/software/netcdf/) [21,22]. Duomenų konversija turi būti atlikta dar prieš jų apdorojimą, kurio pagrindą sudaro šie pagal eiliškumą sekantys veiksmai – duomenų atrinkimas taikant įvairius matematinius filtrus, vieno tiriamojo metabolito nustatymas visoje jų gausoje, nustatytų duomenų suderinimas tarpusavyje ir normalizavimas, kuris gali būti pasirinktinai tiek absoliutus, tiek santykinis. Visos šios automatizuotos jonų detekcijos funkcijos yra atliekamos, naudojantis patentuotomis komercinėmis (Agilent) [23–25] arba nemokomomis ir/arba atviros prieigos programinės įrangos paketais (XCML) [3,26,27].

Metabolomikos studijose identiškai, kaip ir giminingose transkriptomikos ar proteomikos tyrimuose, statistinis įvertinimas pirmiausiai remiasi konkrečių metabolitų (metabolinių „pirštų antspaudų“) diferencialine (skirtumo/pokyčio) analize. Taikant šį statistinį metodą galima pusiau kiekybiškai įvertinti gautų metabolitų rezultatų ekspresiją (pertvarkyti sakinį) [6]. Pavyzdžiui, galima apskaičiuoti chromatografinių kreivių apribojamų plotų padidėjimą arba sumažėjimą ar įvertinti pakitusi MS spektrinių smailių intensyvumo santykį [9,28]. Apibendrinus įvairių metabolominių tyrimų rezultatus, tampa aišku, jog yra sudėtinga apdoroti ir palyginti duomenų rinkinius, sudarytus iš užfiksuotų kelių šimtų tūkstančių signalų, todėl į pagalbą yra pasitelkiami daugiamačiai statistiniai įrankiai (2 pav.) – pavyzdžiui, pagrindinių komponentų analizė (ang.,

principal component analysis, PCA) [29].

2 pav. Pagrindinių komponenčių analizė:

16 Duomenys, apdoroti automatiniais smailių detektavimo programiniais įrankiais, yra sulyginami pagal vienodą jų mastą. Procesas yra grindžiamas pagal išreikštų komponentų dispersiją dvimatėje arba trimatėje erdvėje. Identifikuoti kintamieji metaboliniai „pirštų antspaudai“ yra sutelkiami į erdvės centrą ir paskirstomi pagal jų standartinius nuokrypius (SD). Tai suteikia vienodą intensyvumą nustatomiems signalams, išreikštiems pagal labai skirtinga jonų srovės gausą [23–25].

6.1.3 Metabolitų identifikavimas

Metabolito atpažinimas yra pradedamas nuo MS spektro analizės ir interpretacijos, nes svarbu užtikrinti, jog dominantis signalas iš tiesų atitinka monoizotopinę jono masę ir nėra stebimas jo izotopas, aduktas ar jono fragmentacijos produktas, susidaręs jonizacijos proceso metu. Po to seka užfiksuotų signalų grupavimas, kurie gali būti siejami su ieškomu metabolitu. Tai gali būti atliekama pagal specifinės masės skirtumo nustatymą, kurį atitinka jo izotopai, aduktai ir produkto jonai. Taip pat galima ieškoti stiprios koreliacijos tarp jonų porų intensyvumo tiek vieno mėginio, tiek visų jų keliose spektruose, kur yra pastebimi atitinkantys MS signalai [9,28].

6.2 S. aureus biologiniai taikiniai

Potencialiai yra nustatyta S. aureus biologiniai taikiniai į kuriuos taikoma naujai kuriamos vaistinės molekulės. Folio rūgštis – svarbi baltymų apykaitai, nukleorūgšties sintezei ir vystymosi procesams, todėl užblokavus vieną iš folio rūgšties kaskados fermentų – sutrikdomas S. aureus dalijimasis ir ji žūsta, o tai apsprendžia vaistinės medžiagos priešmikrobinį aktyvumą (1 lentelė). Visi galimi folio rūgšties metabolitai pateikti 1 priede.

17

1 lentelė: Pagrindiniai folio rūgšties biosintezės biologiniai taikiniai

Fermentas dalyvaujantis

folato biosintezėje Fermento katalizuojama reakcija Inhibitoriaus pavyzdys

Guanino ciklohidrolazė (GCYH 1) E.C. 3.5.4.16

GTP---> Dihidroneopterino-3-trifosfatas + formatas 8-okso-2-dGTP

Dihidroneopterino hidrolazė (DHNTPase) Dihidroneopterino aldolaze(DHNA) 9 - Metilguanosine (HPPK) 2 - Amino - 4 - hidroksi - 6 - hidroksimetildihidropteridinas pirofosfakinazė Hidroksietil - 8 - marcaptoguaninas Dihidropteroato sintazė (DHPS)

Dihidropterin - sulfatiazolo aduktas

Dihidrofolato sintetazė (DHFS) Dihidrofolato reduktazė (DHFR) Trimetoprimas N N_{H H} H H O O P O O H O P O OH O P O OH OH OH OH N H N O N H2 O N H H H O P O PO P OH O H O OH O O H O OH OH N N H N H2 N ₊ H O H O N H N H H H H O O P O OH O P O O H O P O OH O H OH H N NH O NH2 O N N H N N H O P O P O P O N H2 OH OH O H O OHO O OH OH N N H N N H O P O N H2 OH OH O H O OH +PPi N N H N N H O N H2 OH OH OH N H N H N N H N H₂ O OH OH OH N H N H N N H N H₂ O OH + O O H N N H N N O N H2 CH3 N N H N N H OH O N H2 + ATP N N H N N H O O N H2 P O P OH O O H O OH +AMP N N H N N O N H2 OH SH N N H N N H O P O P O N H2 OH O O OH OH N N H N N H O N H2 OH + NH2 O OH N N H N N H O N H2 NH O H O N NH NH S NH N S O NH2 O O N N H N N H NH O OH O N H2 + _ATP N N H N N H NH O O O N H2 P O H O OH L + Gl u N N H N N H N H O N H2 NH O O H O OH O + ADP ₊ Pi N NH N N H NH O N H2 O OHO O OH +NADPH N NH N H N H NH CH3 N H2 O OHO O OH+ N N NH2 N H2 OH OH OH

18

6.3 Folio rūgšties biosintezės keliai, jų slopinimas ir metabolitų nustatymas

Folio rūgštis (folatas) yra gyvybiškai svarbus vitaminas visiems augantiems organizmams. Redukuota šio vitamino forma – tetrahidrofolatas (FH4) citochemijos požiūriu yra laikomas kritiniu veiksniu, atsakingu

už timidino, glicino ir metionino biosintezę bei gyvybiškai svarbią DNR replikaciją [30–32]. Žinduoliai ir aukštesnieji eukariotai įvairias folato formas įgauna maitindamiesi ir vartodami papildomus sintetinius šaltinius. Tačiau, bakterijos ir primityvūs eukariotai šį vitaminą geba pasigaminti de novo sintezės būdu. Taigi, žvelgiant į šiuos aspektus, folio rūgšties biosintezėje dalyvaujantys fermentai yra puikūs priešmikrobiniai taikiniai, pagal kurių kristalografinę struktūrą gali būti vystomos naujos potencialios aktyvios molekulės tiek

in silico, tiek in vitro metodais. Šioje biocheminėje kaskadoje dalyvaujantys biologiniai katalizatoriai yra

žinomi ir jie validuoti kaip terapiniai taikiniai: dihidropteroato sintazė (DHPS) ir dihidrofolato reduktazė (DHFR). Pavyzdžiui, sulfametoksazolas ar dapsonas (abu DHPS slopikliai) ir trimetoprimas (DHFR slopiklis) vis dar išrašomi gydytojų(dažnai jų mišiniai, kaip sinergistiniai terapiniai agentai) gydant tokias ligas, kaip maliariją, pneumoniją ir S. aureus sukeltas įvairias infekcijas, nors jie jau vartojami daugiau kaip penkiasdešimtmetį [33].

6.3.1 Folio rūgšties apykaitos keliai

DHFR yra labai svarbus fermentas, kuris katalizuoja biochemines reakcijas folato sintezės kaskadoje. Taip pat šis katalizatorius yra svarbus sujungiant įvairius folio rūgšties sintezės arba kitus FH4 susidarymo

mechanizmus, vykstančius gyvoje ląstelėje. Tetrahidrofolio rūgštis ląstelėje atlieka kofaktoriaus funkciją vienos anglies pernešimo reakcijose (ang. one–carbon transfer reactions), kurios metu yra perkeliamos sunaudotos metilo ar formilo funkcinės grupės. Pastarojo tipo pernešimo reakcijos yra reikalingos purinų, aminorūgščių, S–adenozilmetionino (SAM) ir formil–metionino biologinėms sintezėms [34,35].

Vaistinių molekulių paieškos požiūriu DHFR yra svarbus taikinys dėl savo ribotos funkcijos ląstelei. Reakcijos, kurias katalizuoja šis fermentas, yra unikalios, todėl FH4 apykaitos sutrikdymas yra gyvybiškai

svarbi metabolinė vieta. DHFR slopinimas (inhibavimas) tiesiogiai veikia į naujų ląstelių dalijimosi ir replikacijos procesus, sukeldamas metabolinį badą dėl reikiamų prekursorių deficito [33,36,37].

Dauguma tiesioginių vieno anglies atomo pernešimo reakcijų, kuriose dalyvauja DHFR, yra atsarginės (antrinės) ir saugomos tik esant būtinybei. Kita vertus, pagrindiniai folio rūgšties ciklo biocheminiai

19 keliai tarp eukariotų ir prokariotų yra skirtingi, nes pastarųjų organizme, skirtingai nei žmonių, folatas yra sintetinamas tiesioginės biosintezės metu (pav. palygintas folio ciklas) iš pterino komponentų [38]. Aukštesniųjų eukariotų organizme pterinas yra panaudojamas tetrahidrobiopterino biosintezei, katalizuojant fermentui sepiapterino reduktazei [39]. Susidaręs produktas yra labai svarbus tinkamai nervinio signalo perdavimo funkcijai atlikti bei reikalingas palaikant cheminę smegenų homeostazę [40]. Taip pat pastebėta, jog mutacijos gene, koduojančiam šį baltymą, yra siejamos su fenilketonurija ir kitais metaboliniais sindromais [41].

Prokariotai neturi tetrahidrobiopterino biosintezės kelio, tačiau pteriną jie naudoja folio rūgšties de

novo sintezei kartu įtraukiant guanozino trifosfatą (GTP), para–aminobenzenkarboksirūgštį (pABA) ir

glutamatą. Naudojant septynis baltymus, folio rūgšties de novo biosintezę geba vykdyti ne tik bakterijos, bet ir pirmuonys bei žemesnieji eukariotai [33,35,36].

Biocheminis folato apykaitos kelias yra gausus biologinių taikinių ir tinkamas atlikti naujų priešstafilokokiškai veikiančių vaistinių molekulių atranką. Tai lemia selektyvus mikrobų folio rūgšties ciklą koduojančio genomo profilis [38].

6.3.1.1 Guanino ciklohidrolazė

Pterino biologinės sintezės kelias bakterijose yra inicijuojamas iš GTP molekulių, kurios metu vyksta žiedo atidarymo, persitvarkymo ir ciklizacijos reakcijos. Šių reakcijų sekos eigoje susidaro dihidroneopterino 3'–trifosfatas, o reakcijas katalizuoja guanino ciklohidrolazė I (GCYH I) [35,42,43]. Nagrinėjamas baltymas yra sudarytas iš labai didelių pentamerinių vamzdinių β–klosčių (ang. β–barrel), apsuptų α–spiralėmis, kurie prisideda trimis subvienetais prie aktyviojo centro sudarymo [41–43]. Fermentiniam aktyvumui taip pat yra reikalingas cinko katijonas, kuris koordinaciniais ryšiais sudaro sąveikas su dvejomis cisteino liekanomis, viena histidino aminorūgštimi bei vandens molekulėmis [41,42].

8 – oksoguanino dariniai konkurenciniu būdu slopina mikroorganizmo fermentą in vitro. Kompleksas tarp ligando ir baltymo susidaro pamėgdžiojant pereinamosios būsenos konfigūraciją (ang. by mimicking the

transition state configuration) [41]. Nustatyta, jog inhibitoriaus 8-okso-GTP guanino pakaitas įsiterpia į

baltymo įdubimą ir sudaro panašiai tuos pačius sąveikos taškus kaip ir pterinas su GCYH I. Guanino žiedas su polinėmis grupėmis aktyviajame centre sudaro vandenilinius ryšius. Be to, bazinė guanino liekana geba dalinai sąveikauti su rūgštinės kilmės liekanomis, o trifosfato liekana yra „jungimosi kišenės“ periferijoje [41,42].

20 6.3.1.2 Dihidroneopterino hidrolazė

Guanino cicklohidrolazei vykdant GTP molekulių katalizę, susidaro 7,8–dihidroneopterino trifosfatas (DHNTP), kuris toliau yra verčiamas į 7,8–dihidroneopteriną (DHNP). Pastarąją reakciją atlieka menkai dar ištirta ir charakterizuota pirofosfatazė, vadinama dihidroneopterino hidrolazė (DHNTH). Šio fermento aktyvumo įrodymai yra diskutuotini, todėl šio baltymo kaip terapinio taikinio yra atsisakyta [33,35,36].

6.3.1.3 Dihidroneopterino aldolazė

Visoms bakterijų rūšims folatų produkavimas yra gyvybiškai būtinas, todėl de novo sintezės kaskadoje svarbų vaidmenį užima fermentas dihidroneopterino aldolazė (DHNTA) [33]. Pastarasis baltymas kaip substratą naudoja 7,8–dihidroneopteriną, kurio molekulėje stereospecifiniu būdu nutraukia anglies– anglies (C–C) ryšį ir sudaro glicerolio aldehidą bei 6–hidroksimetil–7,8–dihidroneopteriną (HMDP). Šis aldolazės fermentas yra unikalus, nes katalizės metu nevyksta nei Šifo bazės formavimosi reakcija (būdinga I klasės aldolazėms), nei yra reikalingi cinko jonai (būdinga II klasės aldolazėms) [44]. Be to, remiantis studijų duomenimis DHNTA pasižymi grįžtamuoju epimeraziniu aktyvumu, kai 7,8–dihidromonopteriną (DHMP) konvertuoja iki pagrindinio savo substrato – DHNP [45]. DHNTA struktūroje yra nustatytos keturios antiparaleliai susisukusios β–klostės, su dvejomis išilgai besitęsiančiomis α–spiralėmis [38].

6.3.1.4 2–amino–4–hidroksi–6–hidroksimetildihidropteridino pirofosfokinazė

Fermentas 2–amino–4–hidroksi–6–hidroksimetildihidropteridino pirofosfokinazė (HPPK), panaudodama ATP fosforo rūgšties liekaną, katalizuoja pirofosfato grupės pernešimą ant DHNA pagaminto HMDP. Pastaroji pirofosfato kinazė yra nuodugniai ištirta ir pastebėta, jog skirtingai nei dauguma tipinių kinazių reakcijos katalizei panaudoja ne γ–fosfatą, bet ATP molekulės β–fosfatą. HPPK yra laikomas potencialiu terapiniu taikiniu, tačiau iki šios dienos nėra duomenų apie sėkmingus slopiklius, kurie veiktų in

21 6.3.1.5 Dihidropteroato sintazė

Fermentas dihidropteroato sintazė (DHPS) yra dimerinis triozofosfatinis (pav. rasti) izomerazės tipo (TIM) vamzdinis (ang. barrel) baltymas, sudarytas iš lygiagrečiai išsidėsčiusių aštuonių didelių β–klosčių, apsuptų aštuoniomis α–spiralėmis [47,48]. Šis baltymas atlieka kondensacijos tipo katalizę, kurios metu gaunamas 7,8–dihidropteroatas iš 6–hidroksimetil–7,8–dihidropterino pirofosfato ir pABA.

DHPS yra vienas pirmųjų atrastų sintetinių priešmikrobinių vaistų – sulfonamidų biologinis taikinys [47,49]. Pastarieji junginiai yra laikomi pABA analogai, kurių dauguma konkuruoja dėl DHPS aktyviojo centro kaip alternatyvūs substratai, sudarantys aklinus metabolinius produktus. Bakterinių DHPS genetinių sekų mutacijos yra atsakingos už rezistentiškumą prieš sulfonamidus. Taip pat pastarosios mutacijos struktūriškai nustatytos aplink pABA „jungimosi kišenę“ [49,50].

6.3.1.6 Dihidrofolato sintazė

Fermentinis dihidrofolato sintetazės (DHFS) aktyvumas yra būtinas tolimesniam folio rūgšties ciklo katalizatoriui – dihidrofolato reduktazei (DHFR), nes substratas dihidrofolio rūgštis (DHF) yra pagrindinis biocheminis šaltinis, iš kurio sintetinama FH4 rūgštis, atsakinga už normalią ląstelių dalijimosi veiklą. DHFS

pagrindinė funkcija yra prijungti vieną aminorūgšties L–glutamato liekaną prie katalizuojamo dihidropteroato, kai yra panaudojama ATP molekulės cheminė energija. Tolimesnis folato poliglutamilacijos (PGL) procesas gali vykti tik po DHFR katalizuotos redukcijos iki FH4. Šioje folio rūgšties ciklo dalyje PGL aktyvumą atlieka

folilpoliglutamato sintetazė (FPGS) [35,51].

6.3.1.7 Dihidrofolato reduktazė

Dihidrofolato reduktazė (DHFR) yra dažniausiai pasirenkamas taikinys, slopinant folio rūgšties ciklo metabolizmą. Ši biocheminė reakcija yra priklausoma nuo NADPH apykaitos ir pagrįsta dihidrofolato (FH2

arba DHF) (reiktų pasirinkti vieną santrumpą) redukcija iki FH4. Slopinamo fermento veiksmingumas yra

validuotas antiproliferaciškai dėl absoliutaus poreikio ląstelės metabolizmui. Kofaktorius NADP(H) apgaubia molekulės išorę, kol substratas – DHF ir kataliziškai susijęs nikotinamidas sudaro sąveika su greta esančia, bet

22 mažiau prieinama „jungimosi kišene“ [38]. Šis fermento molekulinės sąveikos mechanizmas su substratu buvo patvirtintas ankstesniais katalitiniais moksliniais tyrimais su E. coli [52].

DHFR slopikliai yra folato substrato mimetikai, o jų fiziko–cheminės, ikiklinikinės ir klinikinės savybės yra ištirtos ir apžvelgtos [38]. Šiai dienai terapiškai yra naudojami 8 folio ciklą slopinantys junginiais [36,38].

Priešmikrobinės medžiagos, kurios geba slopinti DHFR fermentą, yra priskiriamos ne klasikinių slopiklių klasei ir yra priklausančios nuo gebėjimo prasiskverbti į ląsteles dėl vykstančių difuzijos procesų. Pastaruoju metu, susidomėjimas šiuo fermentu yra išaugęs, kadangi tai rodo ir didėjantis rentgeno kristalografinių struktūrų skaičius baltymų duomenų bazėje – „Protein Databank“. 2013 metų pabaigoje buvo priskaičiuojama daugiau kaip 160 kristalografinių struktūrų, priklausančių prokariotams. Pakartojus DHFR fermento paiešką minėtoje baltymų bazėje 2016 metų pradžioje, palyginimui aptikta 224 kristalografinis, išskirtos iš įvairaus tipo bakterijų (S. aureus, E. coli, M. tuberculosi). DHFR baltymų struktūrinė analizė parodė, jog „jungimosi kišenė“ yra pakankamai gili bei optimaliai užpildyta vandenilinių ryšių donorų ir akceptorių, su kuriais idealiai prisitaiko ir sąveikauja heterociklinis pterino arba dihidropirimidino žiedas. Taip pat yra pastebėta, jog kišenėje esančios aminorūgščių liekanos geba greitai apsiversti ir pakeisti savo erdvinę orientaciją [37]. Įvairių tyrimų metu buvo parodyta, jog mutacijos geno lokuse, kuriame koduojamas DHFR fermentas, yra rezistentiškumo priežastis prieš naudojamą trimetoprimą. Nustatyta, kad S. aureus atsparumą prieš pastarąjį vaistą gali įgyti, įvykus vienos aminorūgšties pokyčiui 98 padėtyje esančiam fenilalaninui į tiroziną [53,54]. Išskyrus įvairius rezistentiškus bakterinius štamus, buvo pastebėta, jog mutacinė grupė, sukelianti šį fenomeną prieš folio rūgšties slopiklius, yra šalia pterino dokinimo vietos [38].

6.4 Penkianarių heterociklų apžvalga

Atlikta daug atradimų su įvairiais triazolų junginiais, kurie parodo jų didelį priešmikrobinį potencialą. Tyrimų metu buvo nustatyta, jog junginiai, kurių pagrindą sudaro šios molekulės, pasižymi stipriu aktyvumu prieš rezistentiškas padermes, pavyzdžiui, mažiausia slopinančioji koncentracija (MRSA), kurių neveikia klinikoje vartojami antibiotikai [55].

Heterocikliniai 1,2,3 – triazolo junginiai yra išsamiai studijuojami dėl jų potencialaus pritaikymo medicinoje ir lengvos bei ekonomiškai naudingos sintezės [55–61].

Didelis d4mesis skiriamas preišbakteriniams tyrimams, nes 1,2,3 – triazolo žiedas yra laikomas 1,2,4 – triazolo, oksazolo ir izoksazolo bei kitų heterociklinių molekulių bioizosteru. Atliekant struktūros –

23 aktyvumo ryšio tyrimus šis žiedas dažnai yra įvedamas į jau egzistuojančių antibakterinių molekulių struktūrą arba panaudojamas, kaip jungiančioji grupė tarp kelių biologiškai aktyvių molekulinių pakaitų. Tai leidžia sintezuoti naujas farmakologiškai aktyvias hibridines molekules, kurios gali būti panaudotos bandant įveikti iškilusią rezistentiškumo problemą [56,59,62–64].

Klinikinėje praktikoje sulfonamidai, kaip efektyvūs antibakteriniai preparatai, prieš įvairius žmogaus infekcinių ligų sukėlėjus, yra jau vartojami daugiau nei 70 metų. Dauguma mokslininkų vis dar vykdo daug studijų su šiomis molekulėmis, įvairiai modifikuodami jų struktūrą ir keisdami aktyvumą. Naujų sulfonamidų paieškos procesas vyksta dėl naujų štamų atsiradimo, kurie pasireiškia stipriu rezistentiškumu klasikiniams antibiotikams ir sukelia įvairias hospitalines infekcijas. Publikuotas tyrimas atskleidė, jog tyrėjų sintezuoti nauji sulfanilamidų dariniai su 1,2,3 – triazolo pakaitu pasižymėjo vidutiniu priešmikrobiniu aktyvumu in vitro [61]. Susintezuoti šie triazolai, pavyzdžiui, 2,4 – dichlorbenzilo ir 2,4 – difluorobenzilo dariniai, kurie atitinkamai pavaizduoti 79a ir 79b (3pav.) pasižymėjo stipriausiomis antimikrobinėmis savybėmis prieš S.

aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC 25923). Taip pat aptarti junginiai pasižymėjo panašiomis

priešmikrobinėmis savybėmis ir prieš kitas bakterines padermes: E. coli (JM 109), B. Subtilis (ATCC 6633),

P. aeruginosa, S. typhi, S. dysenteriae ir meticilinui rezistentišką S. aureus (N 315). MSK koncentracija

svyravo nuo 32 iki 128 µg/ml, o palyginta buvo su chloromicinu, kurio MSK buvo atitinkamai nuo 2 iki 8 µg/ml. Tiriant struktūros – aktyvumo sąryšį, buvo pastebėta, jog antimikrobiniam aktyvumui yra labai svarbus alkilinės grandinės ilgis ir atliktos substitucijos benzilo fragmente, tačiau svarbiausias veiksnys, tai įvestas 1,2,3 – triazolo žiedas, kuris padidino bakterinių padermių slopinimo efektyvumą ir manoma, jog veikė kaip sulfonamido prekursorius in vitro. Šie pastebėjimai leidžia daryti išvadą, jog 1,2,3 – triazolo ir sulfanilamido dariniai gali būti pritaikyti naujų mikrobinių medžiagų kūrimo ir vystymo procese [55,59,61].

24

3 pav. Tirazolai ir sulfanilamidai priešbakteriniu aktyvumu pasižyminčios vaistinės medžiagos:

Triazolai – 2,4 – dichlorbenzilo (79 a), 2,4 – difluorobenzilo (79 b) ir sulfanilamidai Sulfanilamidiniai 1,2,3 – triazolo dariniai su piperazino fragmentu

Sulfanilamidiniai 1,2,3 – triazolo dariniai su piperazino fragmentu 80a ir 80b mikrobiologinių tyrimų metu parodė vidutinį aktyvumą in vitro, lyginant su standartiniu vaistu sulfanilamidu, prieš tirtas bakterines padermes, tarp jų įskaitant ir S. aureus (3 pav). Studijų metu su įvairiais mikrobiniais štamais nustatyta, jog 1,2,3 – triazolo darinys 80a pasižymėjo didesniu antibakteriniu aktyvumu lyginant su panašiu junginiu 80b. Šie rezultatai leidžia daryti išvadą, jog sulfonamido įvedimas į 1,2,3 – triazolo struktūrą lemia šių junginių bakteriocidinį efektą [55,61].

Polihidroksilinių angliavandenių įvedimas į naujų vaistų paiešką, vystymą ir kūrimą yra plačiai taikomas dėl gebėjimo pagerinti molekulių tirpumą vandenyje, padidinti biologinį praeinamumą bei įvairiai keisti jų farmakokinetines savybes. Mokslininkų susintetinti D–gliukozės dariniai su 1,2,3 – triazolo žiedu bei prailginti įvairaus ilgio alkiline grandinėle ir aralkiline grupe su substituotais fenilo žiedais [55]. Antimikrobiniai struktūros – aktyvumo ryšio tyrimai parodė, jog tirpumas vandenyje, benzeno žiedo pakaitai ir alkilinės grandinės ilgis 1,2,3 – triazolo žiede yra pagrindiniai veiksniai, lemiantys farmakodinamines ir terapines naujų molekulių savybes (4 pav.). Pavyzdžiui, junginys 88 prieš S. aureus, turintis 4 – chlorobenzilo pakaitą, pasižymėjo panašiu antimikrobiniu aktyvumu, kaip ir kontrolei naudotas chloromicinas [60].

25

4 pav. Priešmikrobiniu aktyvumu pasižymintis junginys, kuris savo struktūroje turi 1,2,3 – triazolo žiedą.

Keletas tyrėjų grupių nustatė, jog dalis mono–1,2,4–triazolo darinių pasižymi antibakteriniu aktyvumu [57]. Po šių studijų buvo pradėta stipriai domėtis šiais naujo tipo antibiotikais, kurie sudaryti iš kumarinams būdingų 1,2–benzopirano fragmentų. Tolimesni tyrimai atskleidė, jog pastarosios molekulės yra struktūriškai panašios į klinikoje vartojamus priešinfekcinius chinolonus su benzopiridono pakaitu. Mikrobiologiniu tyrimų metu buvo nustatyta, jog sintezuotos naujos molekulės su kumarino pagrindu ir mono– 1,2,4–triazolo pakaitu pasižymėjo panašiu ar netgi geresniu poveikiu prieš dauguma bakterinių padermių lyginant su referenciniais vaistais – enoksacinu ir chloromicinu [55].

Oksikonazolas yra išoriškai vartojamas priešgrybelinis vaistas, kuris visiškai nepasižymi priešbakteriniu aktyvumu. Vis tik struktūros – aktyvumo tyrimų metu buvo nustatyta, jog apribojus šios molekulės laisvą azoliletilo grandinės judėjimą šešianariu heterociklu ir pakeitus 1,2,4 – triazolo pakaitą bioizosteriniu fragmentu – imidazolo žiedu, junginiai įgijo potencialu antibakterinį aktyvumą, tačiau priešingai nei vienas iš jų nepasižymėjo priešgrybeliniu aktyvumu. Pavyzdžiui, pavaizduoti junginiai 94a ir 94b (5 pav.) pasižymėjo ekvivalentišku aktyvumu prieš S. aureus lyginant su klinikoje vartojamu vaistu gentamicinu, kurio MSK yra lygi 6.25 µg/mL [55,56].

26

5 pav. Junginys, turintis savo struktūroje 1,2,4 – triazolo pakaitą pasižymi priešbakteriniu aktyvumu: 1,2,4 – triazolo pakaits didina priešbakterinį aktyvumą ir mažina oksikonazolas priegrybelinį aktyvumą.

Panašiu priešbakteriniu aktyvumu pasižyminčiu vaistinių molekulių sudėtyje yra ir kitų penkianarių heterociklų: tiazolų, tiadiazolų, tiatriazolų ir tetrazolų [63–71]. Pavyzdžiui, studijų metu nustatyta, jog įvairūs rodaninai ir jų analogai (66, 69) gali stipriai slopinti S. aureus, o MSK yra lygi 2 µg/ml. Molekulė pavaizduota 6 paveikslėlyje 70 yra vystoma Bristol – Myers Squibb mokslininkų.

6 pav. Junginiai, pasižymintys priešbakteriniu aktyvumu:

27 Tyrimų metu buvo nustatyta, jog ji veikia į fermento peptidoglikano biosintezės kelią, slopindama baltymo MurB aktyvumą [64,70]. Kitas tyrimas – po išsamių struktūros–aktyvumo tyrimų, kai nustatyta, jog sintezuoti 1,3,4–tiadiazolo dariniai pasižymėjo panašiu ar netgi geresniu aktyvumu nei cefalosporinų klasės antibiotikas – cefaleksinas. Nustatyta šių junginių MSK prieš S. aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC 25923) buvo nuo 17 iki 24 µg/ml, o cefaleksino 22 µg/ml [63]. Be to, vidutiniu aktyvumu prieš S. aureus subsp.

aureus Rosenbach (ATCC 25923) pasižymi junginiai, kurie savo struktūroje turi tiatriazolų ir tetrazolų

pakaitus. Po mikrobiologinių tyrimų nustatyta, jog didžiosios dalies junginių, kondensuotų su DNR bazėmis: adeninu ar guaninu, stebima MSK yra apie 375 – 500 µg/ml [62,72].

28

7. METODAI

7.1 Junginių sintezė

Visi sintezuoti penkianariai heterociklai sintezuojami ciklizacijos reakcijos metodu. Sintetinių MR junginių sintezė vykdoma viena ir dviem pakopomis. Visos reakcijos buvo atliktos oro atmosferos aplinkoje ir šildant iki 100° C temperatūros ant magnetinės maišyklės. Atliekamoms reakcijoms, komerciškai įsigyti reagentai ir bevandeniai tirpikliai buvo naudoti be papildomų gryninimo procedūrų. Reakcijos monitoravimas buvo atliekamas, taikant plonasluoksnės chromatografijos analizę, užnešant nedidelį kiekį mėginių ant silikagelinės Merck plokštelės. Gauti produktai buvo koncentruojami naudojant vakuuminį rotacinį distiliatorių, sumažinant atmosferos slėgį iki apytikriai 200 mbar, taip pašalinant reikiamą ar likusį tirpiklio kiekį. Susidarę kristalai buvo nufiltruoti naudojant vakuumą, o filtratas surinktas į Biuchnerio kolbą. Kristalai atskirti nuo filtro ir perkristalizuoti iš tinkamo tirpiklio. Sunkiai perkristalizuojami junginiai buvo gryninami taikant sparčiosios "flash" kolonėlinės chromatografijos metodikas. Visos išeigos pateikiamos išgrynintų susintetintų junginių. Pasiektas junginių grynumas apytikriai 90 % ir didesnis. Junginiai analizuoti PLC, IR, UV ir SC - MS/MS metodais. Visų junginių sintezės schemos pavaizduotos 4 priede. Sintezuojama 12 penkianarių heterociklų, kurie savo struktūroje turi S ir N heteroatomus: vienas 1,2 – diazolas, trys – 1, 3, 4 – tiadiazolai, du – , 2, 4 – triazolai, penki – 1, 3 – tiazolai ir vienas 1, 2, 3, 4 – tiatriazolas (7 pav).

29

7 pav. Bendra heterociklų, turinčių S ir N heteroatomų schema:

1,2 – diazolas (MR – 8), 1, 3, 4 – tiadiazolai (MR – 2, MR – 5, MR – 7), 1, 2, 4 – triazolai (MR – 1, MR – 6), 1, 3 – tiazolai (MR – 3, MR – 4, MR – 10, MR – 11, MR – 12) ir 1, 2, 3, 4 – tiatriazolas (MR – 9).

1. 3–amino–1H–1,2,4–triazol–5–karboksilo rūgštis (MR–1). Sintezuotas remiantis mokslinio straipsnio metodika [73]: išeiga 77.3%, oranžiniai kristalai (krist. vandens), Tlyd = 182–183 oC, UV λmax = 260 nm,

,Rf = 0, 756. Taip pat tapatumui nustatyti yra naudojamas FT–IR ir MS analize: ʋ_{𝑚𝑎𝑥/𝑐𝑚}−1 3319, 1338 (O = C – OH), 2987 ( - OH), 1677, 1487 (C = N), 1614 (H – N – H), 1257 (C – N), 1116 (C – NH2). MS (ESI): C3H4N4O2 [M-H] - teor. = 127.026149, rasta C3H4N4O2 [M-H] - = 126.8917.

2. 1,3,4–tiadiazol–2–aminas (MR–2). Sintezuotas remiantis mokslinio straipsnio metodika [74]: išeiga 57%, balti kristalai (krist. vandens), Tlyd 188–190 oC, UV λmax = 220 nm, , Rf = 0, 747 Taip pat tapatumui

nustatyti yra naudojamas FT–IR ir MS analize: ʋ_{𝑚𝑎𝑥/𝑐𝑚}−1 3366, 3304 (N – H), 3101 (C – N), 1603 (H – N – H), 1541, 1521 (C = N), 1222 (C – N), 1068 (C – NH2), 531 (C – S – C). MS (ESI): C2H3N3S [M-H]-

30 3. 4–metil–1,3–tiazol–2–aminas (MR– 3). Sintezuotas remiantis mokslinio straipsnio metodika (3 priedas) [75]: išeiga 75%, balti kristalai (krist. vandens), Tlyd = 44 – 47 °C, UV λmax = 217 nm, , Rf = 0, 886 Taip

pat tapatumui nustatyti yra naudojamas FT–IR ir MS analize: ʋ_{𝑚𝑎𝑥/𝑐𝑚}−1 3434, 835 (- NH2), 3274 (= C –

H), 3073 (– C – H), 1625 (C = N), 1516 (C – C), 995, 973 (C = H), 696, 604 (C – S). MS (ESI): C4H6N2S

[M-H] - teor. = 113.017892, o rasta C4H6N2S [M-H] - = 113.0192.

4. 4–fenil–1,3–tiazol–2–aminas (MR–4). Sintezuotas remiantis mokslinio straipsnio metodika (3 priedas) [76]: išeiga 50 %, Balti kristalai (krist. metanolio), Tlyd = 150 – 151 oC, UV λmax = 220 nm, , Rf = 0, 726

Taip pat tapatumui nustatyti yra naudojamas FT–IR ir MS analize: ʋ_{𝑚𝑎𝑥/𝑐𝑚}−1 3230, 817, 1076 (C – NH₂), 3181, 3123, 2828 (= CH), 1615 (C6H6), 1546 (N – H), 1217 (C – C – N), 1192 (C = S), 735 (S – C). MS

(ESI): C9H8N2S [M-H] - teor. = 175.033542, o rasta C9H8N2S [M-H] - = 177.0488.

5. N,N–bis–(1,3,4–tiadiazolo–2)–formamidinas (MR–5). Sintezuotas remiantis mokslinio straipsnio metodika (3 priedas) [74]: išeiga 85 %, geltoni kristlalai (krist. eterio), Tlyd = 245 – 246 oC, UV λmax = 210

nm, , Rf = 0, 852. Taip pat tapatumui nustatyti yra naudojamas FT–IR ir MS analize: ʋ_{𝑚𝑎𝑥/𝑐𝑚}−1 2844 (C – H), 2324, 678 (S – C), 2053, 1632 (N = C), 1632, 1567 (N – H), 1416, 1218(C – N), 439 (C – N – C). MS (ESI): C5H4N6S2 [M-H] - teor. = 210.986608, o rasta C5H4N6S2 [M-H] - = 211.0152.

6. 5–merkaptometil–1,2,4–triazoltiolas (MR–6). Sintezuotas remiantis mokslinio straipsnio metodika (3 priedas) [77]: išeiga 54 %, balti kristalai (krist. etanolio ir chloroformo mišinio), Tlyd = 220 – 221 oC, UV λmax = 220 nm, , Rf = 0, 756 Taip pat tapatumui nustatyti yra naudojamas FT–IR ir MS analize: ʋ_{𝑚𝑎𝑥/𝑐𝑚}−1 3090, 986 (= CH), 2503 (NH), 1467 (H – C – H), 1278, 1222 (C – N), 1099 (C = S), 801 (CH = CH2), 773,

668 (C – S), 415 (C – N – C). MS (ESI): C3H5N3S2 [M-H] - teor. = 145.985211, o rasta C3H5N3S2 [M-H] -

= 145.9877.

7. 2,5–dimerkapto–1,3,4–tiadiazolas (MR–7). Sintezuotas remiantis mokslinio straipsnio metodika [78]: išeiga 90 %, balti kristalai (krist. vandens), Tlyd = 169 – 169,5 °C, UV λmax = 220 nm, , Rf = 0, 852 Taip

pat tapatumui nustatyti yra naudojamas FT–IR ir MS analize: ʋ_{𝑚𝑎𝑥/𝑐𝑚}−13053 ( –NH2), 2915, 2848, 939 ( = C – H), 2472 (S – H), 1503 (N – H), 1258, 1119, 1074(C – N), 710, 656 (C – S). MS (ESI): C2H2N2S3

31 8. 2–tiokso–4–imidazolinonas (MR–8). Sintezuotas remiantis mokslinio straipsnio metodika (3 priedas) [79]: išeiga 93 %, gelsvi kristalai (krist. vandens), Tlyd = 229 - 230oC, UV λmax = 220 nm, Rf = 0, 756 Taip

pat tapatumui nustatyti yra naudojamas FT–IR ir MS analize: ʋ_{𝑚𝑎𝑥/𝑐𝑚}−1 3348 (N–H),1716 (OH), 1716 (C=O), 1546 (N–H), 1274 (C – N), 1228(C – C – N), 1135 (C = S), 623 (N – C = O), 596 (C = O), 542 (C – C = O). MS (ESI): C3H4N2OS[M-H] - teor. = 114.997156, o rasta C3H4N2OS[M-H] - =114.9796.

9. N–fenil–1,2,3,4–tiatriazol–5–aminas (MR–9). Sintezuotas remiantis mokslinio straipsnio metodika (3 priedas) [80]: išeiga 89%, rožiniai kristalai (krist. eterio), Tlyd = 143 -144 oC, UV λmax = 330 nm, Rf = 0,

636. Taip pat tapatumui nustatyti yra naudojamas FT–IR ir MS analize: ʋ_{𝑚𝑎𝑥/𝑐𝑚}−1 2938, 1568 (N – H), 1615, 1456, 725 (C6H6), 1295 (C – H), 1097 (C – N), 750, 602 (C – S), 681 (HC = CH), 504 (S – C = N).

MS (ESI): C7H6N4S2 [M-H] - teor. = 177.02404, o rasta C7H6N4S2 [M-H] - = 177.0073.

10. N–(4–okso–4,5–dihidro–1,3–tiazol–2–il) guanidinas (MR–10). Sintezuotas remiantis mokslinio straipsnio metodika (3 priedas) [81]: išeiga 85%, bespalvai kristalai (krist. vandens), Tlyd = 255 - 257 oC,

UV λmax = 267 nm, , Rf = 0, 765 Taip pat tapatumui nustatyti yra naudojamas FT–IR ir MS analize:

ʋ_{𝑚𝑎𝑥/𝑐𝑚}−1 3387 (H – N – N), 3308, 1462 (N – H), 3053 (= CH), 1651, 1596 (C = O), 1433 (C – N), 745 (C – S), 487 (C – N – C). MS (ESI): C4H6N4OS[M-H] - teor. = 157.018954, o rasta C4H6N4OS[M-H] - =

159,578

11. (4–okso–2–sulfaniliden–1,3–tiazolidin–3–il) acto rūgštis (M–11). Sintezuotas remiantis mokslinio straipsnio metodika (3 priedas) [82]: išeiga 81%, raudonai rudi kristalai (krist. vandens), Tlyd = 145 - 148 o_{C, UV}

λmax = 220 nm, Rf = 0, 781Taip pat tapatumui nustatyti yra naudojamas FT–IR ir MS analize:

ʋ_{𝑚𝑎𝑥/𝑐𝑚}−1 2916, 1324 (O = C – OH), 1729 (C = O), 1406 ( C – N), 1210 (C – C – N), 1188 (C = S), 519 (C – N – C). MS (ESI): C5H5NO3S2 [M-H] - teor. = 189.963807, o rasta C5H5NO3S2 [M-H] - = 189.8878.

12. (2,4–diokso–1,3–tiazolidin–5–il) acto rūgštis (MR–12). Sintezuotas remiantis mokslinio straipsnio metodika (3 priedas) [83]: išeiga 75%, balti kristalai (krist. vandens), Tlyd = 167 – 169 oC, UV λmax = 255

nm, Rf = 0, 686 Taip pat tapatumui nustatyti yra naudojamas FT–IR ir MS analize: ʋ_{𝑚𝑎𝑥/𝑐𝑚}−1 3147, 3047 (N – C = O), 2986 (N – H), 2794 (S – H), 2503 (C – H), 1554 (C = O), 14 03 (O = C – OH). MS (ESI): C5H5NO4S [M-H] - teor. = 173.986651, o rasta C5H5NO4S [M-H] - = 173.9753.

32

7.2 Analizės metodai

Junginių reakcijos greičio monitoravimui ir pirminiam grynumo patikrinimui buvo pasitelkti plonasluoksnės chromatografijos, FT–IR spektroskopijos metodai bei nustatyta lydymosi temperatūra. Junginių struktūrinė ir priemaišų nustatymo analizei buvo taikytos FT–IR spektroskopijos, UV spektrofotometrijos bei SC–MS spektrometrijos metodai.

7.2.1 Plonasluoksnė chromatografija (PLC)

Atliekant MR junginių sintezę, pirminiam tapatumo nustatymui naudojamas paprastas, greitas ir labai universalus plataus spektro medžiagų tyrimas – plonasluoksnė chromatografija. PLC naudojamas silicio gelio plokštelė ant kurio starto linijos užlašinami su mikrokapiliarais keli μl tiriamojo MR junginio ir sintezės metu naudojami reagentai. Kiekvieno tiriamojo lašo dėmė išdžiovinama ir tik tada dedamas sekantis lašas. Chromatografinė kamera užpildoma judančiąja fazė, kuri priklauso nuo kiekvieno MR junginio savybių. Eksperimentiškai parinkus tinkamą judančią fazę, tiriamojo junginio komponentai per sorbento sluoksnį juda skirtingu greičiu. Pasibaigus tirpiklio keliui – plokštelė išimama iš kameros ir džiovinama. Tiriamosios zonos identifikuojamos stebint apšvietus UV spinduliuote. Junginys nustatomas apskaičiuojant Rf vertes ir lyginant

jas su standartais.

Rf apskaičiuojama pagal šią formulę:

R

=a/h

7.2.2 FT–IR spektroskopija

Sintetintų MR junginių IR spektrai užrašyti PerkinElmer UATR Two spektrometru. Atliekant i FT-IR spektro analizę, naudojamas ne bangos ilgis ir ne dažnis, o pastarajam proporcingas dydis – bangos skaičius n (cm–1). FT-IR spektrometre interferavusi spinduliuotė nukreipiama tik į bandinį, todėl MR medžiagos milteliai užnešami plonu sluoksniu ant prietaiso deimanto ir užrašomas jo IR spektras 450-4000cm-1 _{bangos ilgyje.}

Gautose smailėse gaunamos registruojant visos molekulės vibracijas ir nustatomos MR medžiagos funkcinės grupės.

33

7.2.3 UV spektrofotometrija

MR tiriamųjų junginių spektrai buvo užrašyti naudojantis Agilent Technologies Cary 8454 UV-VIS. Atsveriamas 1mg MR junginys ir ištirpinamas 1 ml metanolio. Gautas koncentruotas tirpalas, jis papildomai praskiedžiamas: paimamas 10 µl tirpalo ir skiedžiamas 1ml metanolio ir gaunamas 10 µg/ml MR tirpalas. Metanolis pilamas į kiuvetę, dedamas į UV spektroskopą ir užrašomas jo sugerties spektras, kuris yra atimamas. Tada tiriamas MR junginys - 10 µg/ml tirpalas matuojamas tuo pačiu principu – užrašomas MR junginio UV sugerties spektras, matuojant UV absorbciją esant prie 200-600 nm bangos ilgiams.

7.2.4 SC–MS spektrometrija

Susintetinti MR junginiai buvo analizuojami naudojant Agilent Technologies 6530 Accurate-Mass Q-TOF SC/MS prietaisą (parametrai nurodyti 2 lentelėje). Mėginiai buvo paruošiami pagal tą pačią metodiką, kaip ir atliekant UV spektrofotometrijos analizę. Pagaminti MR mėginių tirpalai buvo filtruojami ir tiriami.

7.2.5 Lydymosi temperatūra

Susintetintų cheminių junginių tapatumas nustatomas remiantis lydymosi temperatūros intervalu. Cheminiai junginiai nustatomi Koflerio lydymosi temperatūros nustatymo aparatu. Prietaisas sudarytas iš mikroskopo, kaitinimo elemento ir termometro. Nedidelis kiekis MR junginio uždedamas ant objektyvinio stiklelio, tačiau prieš tai jis nuvalomas su acetonu ir išdžiovinamas. Ant stiklelio su mėginiu yra dedamas kitas nuvalytas ir išdžiovintas stiklelis, jie tarpusavyje suspaudžiami ir medžiaga sutrinama, kad neliktų stambių

34

7.3 Mikrobiologinio mėginio paruošimas

7.3.1 Naudojamos medžiagos

Visi tirpalai turi būti paruošti naudojant ultrašvarų vandenį (UŠV, ir analitiškai grynus reagentus). Visi reagentai buvo pagaminti ir laikomi kambario temperatūroje (išskyrus, tuos atvejus, kai laikymui buvo būtinos kitos aplinkos sąlygos). S. aureus (ATCC 25923) kultūra auginama Mueller Hinton terpėje. Buvo naudojamas ypač švarus metanolis (99,99%). Tyrimo metu buvo reikalingas šaltas metanolis, todėl jis buvo šaldomas šaldytuve – 20° C. MR junginių tirpalai buvo gaminami naudojant dimetilsulfide (DMSO), kurio grynumas 99,5 % (nr.20688).

7.3.2 Ląstelių mėginių ėmimas ir intraceliuliarių metabolitų ekstrakcija

Mikrobiologiniai mėginiai buvo paruošiami remiantis Ting Lei, Yu Y bei Liu Y mokslininkų paruoštais protokolais [14–16]:

1. Įnokuliuojama (įvedama) 12 x 109 kolonijas sudarančių vienetųCFU ml-1 S. aureus (ATCC 25923) mikroorganizmų kultūrą į paruoštą Mueller Hinton terpę ir paruoštą kultūrą inkubuojama 37oC, 24val.

2. MR junginiai buvo ištirpinami DMSO, gaunant 10 mM koncentraciją. Koncentruotas tirpalas vėl skiedžiamas iki 10uM koncentracijos. Kontrolei pasirinkti trimetoprimo, norsulfazolio ir fiziologiniai tirpalai.

3. Naudojantis DEN-1 Mc-Farland densitometru, kol nustatoma nuo 1,0 optinio tankio reikšmė esant 600 nm spinduliuotei (ODλ=600 nm) gauta kultūra praskiedžiama fiziologiniu tirpalu iki 1,0 x 109 kolonijas sudarančių vienetų (CFU) ml-1. Gauta 1,0 ml bakterinės suspensija buvo sumaišytos su 1μl MR tiriamųjų junginių tirpalais (galutine 10 μmol koncentracija) ir analogiškai pakartota ir su kontroliniais tirpalais. Mišiniai buvo aerobiškai kultivuojami 37 °C 20-24 val.

4. Pasibaigus inkubacijai, bakterijos yra lizuojamos. MR junginiai bei kontrolės buvo praskiedžiami 1 ml -20 °C CH3OH. Po to, mikroorganizmų kultūra buvo lizuojama veikiant

35 ultragarsu 30 min ir 1 val.. Baltymų gautinis nusodinimas pasiekiamas mėginius šaldant 1 val., esant – 20°C.

5. Mėginiai 30min centrifuguojami 600 rpm greičiu, o lizatas filtruojamas per 0.22 µm PTFE membraninio filtro.

6. Mėginiai iki analizės laikomi esant -20 temperatūrai.

7.4 Metabolinio tyrimo įvertinimas SC–MS spektrometrijos metodu

2 lentelė. Optimizuotos metabolinio profiliavimo tyrimo sąlygos naudojant SC

Parametrai Agilent 1260 Infinity SC sistema

Chromatografinė kolonėlė

Agilent Zorbax Rapid Resolution High Definition (RRHD) Eclipse Plus C18

2.1 × 100 mm, 1.8-µm, (p/n 959757-902) Kolonėlės

temperatūra

50o_{C metabolitų profiliavimo tyrimams}

Injekavimo tūris 1 µl metabolinio profiliavimo tyrimui su Agilent 6530 Q–TOF Injekavimo greitis 200 µl/min

Mobili faze (+ jonizacija)

Metabolinio profiliavimo tyrimai:

A: Vanduo, turintis 0.1 % amonio acetato (99.999%) B: Metanolis, turintis 0.1 % amonio acetato (99.999%) Tekmės greitis 0,35 ml/min metabolinio profiliavimo tyrimams

Gradienas (+ jonizacija)

Metabolinio profiliavimo tyrimams 0 min 1 min 20 min 31 min 32 min 40 min A: 90 A: 90 A: 10 A: 10 A: 90 A: 90 B: 10 B: 10 B: 90 B: 90 B: 10 B: 10

Detektorius Agilent 1260 Infinity DMD, bangos ilgio diapazonas 200–550 nm, po 2 nm,

smailės plotis <0.0031 min (atsako laikas 0.031 s), (80 Hz)

A: 254/4 nm B: 474/4 nm C: 550/4 nm D: 215/4 nm E: 360/4 nm F: 200/4 nm G: 310/4 nm H: 410/4 nm Analizės trukmė (stop time)

40 minučių metabolinio profiliavimo tyrimams

36 Optimizuotos junginių metabolinio profiliavimo sąlygos naudojant Q-TOF MS tokios pačios, kaip junginių grynumo tyrime.

Programinė įranga duomenų analizei (1 schema): • Agilent MassHunter Qualitative Analysis (Qual) B.07.00; • Agilent MassHunter Profinder B.06.00, sp. 1;

• Agilent Mass Profiler (MP) B.07.01;

• Agilent MassHunter Molecular Structure Correlator (MSC) B.07.00; SC–MS metabolinio tyrimo eiga:

8 Pav. Didelės raiškos Q – TOF SC – MS metabolominio profiliavimo tyrimui buvo pasirinktos S. aureus rūšies bakterijos, esančios ankstyvoje stacionarioje fazėje

7.5 Molekulinis modeliavimas ir in silico atranka

7.5.1 Baltymo struktūros parinkimas ir paruošimas darbui

Naudojantis molekulinio modeliavimo in silico metodu, vykdoma sintetinių penkianarių junginių, kurių pagrinde yra N ir S atomai, ligandų atranka. S. aureus DnrG baltymo trimatės struktūros modelis atsisiųstas iš RCSB baltymų duomenų bazės (PDB kodas: 4EDG). Ši trimatė struktūra buvo pasirinkta dėl aukštos rentgeno spindulių difrakcijos rezoliucijos: 2.0 Å ir aiškiai matomo aktyviojo fermento centro. Baltymo struktūra paruošta papildant trūkstamus vandenilių atomus, pašalinant vandens molekules ir atkuriamos pažeistos baltymo struktūros dalys: šoninės grandinės ir kilpos. Baltymo energijos minimizavimas atliktas panaudojant OPLS3 jėgos lauką, esant RMSD 0,30 reikšmei.

37

7.5.2 Ligandų modeliavimas ir paruošimas darbui

Virtualios bibliotekos kūrimas atliekamas ReagentPreparation moduliu. Junginių modeliavimas atliekamas 2D sketcher moduliu. Panaudojus modeliavimui skirtą CombiGlide modulį sukurti sintetinių penkianarį junginių, kurių pagrinde yra N ir S atomai. Naudojantis LigPrep moduliu sukurtos trimatės ligandų struktūros ir jų energijos minimizacija atlikta pagal OPLS3 jėgos lauką. Ligandų jonizacijos būsenos generuotos Epic moduliu, jonizuojant visus galimas konfarmacijas, esant pH 6.8-7.4 intervalui.

7.5.3 Numanomo aktyvumo nustatymas

Spėjamam aktyvumui nustatyti naudojamas GlideDocking modulis. Trimatėje struktūroje nustatoma baltymo aktyvioji sritis ir vykdomas jos nuskaitymas. Po to erdvėje modeliuojami sudaryti ligandų modeliai. Jie išdėstomi skirtingomis pozomis, kaskart įvertinant galimas sąveikas tarp ligando ir baltymo. Modeliuotų ligandų energijos kiekis užrašomas „GScore“ rezultato lange.

8. REZULTATAI

8.1 Junginių analizės rezultatai

8.1.1 Plonasluoksnė chromatografija

Visos tinkamos sistemos parinktos eksperimentiškai (3 lentelė). Šiuose sistemose aiškiai išsiskiria priemaišų dėmės.

38

3 lentelė. MR junginių PLC metodu patikrintas tapatumas, parinkta tinkamą sistemą

Susintezuoto junginio kodas Tirpiklių sistemos ir jų santykis Rf reikšmės

MR – 1 1. benzenas : 2 etanolis

tretinis azotas patvirtinamas jodo garuose

0.756

MR – 2 2 etanolis : 1 benzenas

tretinis azotas patvirtinamas jodo garuose

0.747

MR – 3 4 chloroformas : 1 etilacetatas tretinis azotas patvirtinamas jodo garuose

0.886

MR – 4 4 chloroformas : 1 etilacetatas tretinis azotas patvirtinamas jodo garuose

0.726

MR – 5 3 chloroformas : 1 metanolis

tretinis azotas patvirtinamas jodo garuose

0.852

MR – 6 2 etilacetatas : 1 heksanas

tretinis azotas patvirtinamas jodo garuose

0.756

MR – 7 1 heksanas : 1 etilacetatas

tretinis azotas patvirtinamas jodo garuose

0.852

MR – 8 1 heptanas : 2 etilacetatas 0.756

MR – 9 1 heptanas : 2 etilacetatas

tretinis azotas patvirtinamas jodo garuose

0.636

MR – 10 3 benzenas : 2 etanolis

tretinis azotas patvirtinamas jodo garuose

0.765

MR – 11 2 etilacetatas : 1 heptanas 0.781

MR – 12 2 etilacetatas : 1 heptanas 0.686

8.1.2 FT–IR spektroskopija

Visi MR junginių patvirtinimas naudojamas FT – IR spektrai. Sintetintų MR junginių spektrai analizuojami pagal funkcinių grupių duomenų bazes. Junginio tapatumas nustatomas lyginant reagentų IR spektrus su sintetinto junginio (8 pav.). MR – 3 junginys charakteringa amino grupė, kuri atsiranda iš tiošlapalo. Abiejuose spektruose amino funkcinės grupių smailės tame pačiame regione (3434, 835 ir 3370). Svarbi funkcinė grupė – chloaracetono Cl atomas (566,89). Svarbu, kad MR – 3 junginyje šis pikas neatsirado, nes tai

39 patvirtina, kad reakcija įvyko ir ciklas susidarė. Kiti MR junginiai analizuojami analogiškai, o spektrai pateikti 1 priede.

9 Pav. FT–IR spektro analizė:

Junginys MR - 3 (4-metil-1,3-tiazol-2-aminas) FT–IR: ʋ𝑚𝑎𝑥/𝑐𝑚−1 3434, 835 (- NH2), 3274 (= C – H), 3073 (– C – H), 1625 (C = N), 1516 (C – C), 995, 973 (C = H), 696, 604 (C – S).

8.1.3 UV spektrofotometrija

Kiekvieno susintetinto MR junginio grynumas tikrinamas nustačius UV maksimumą (10 pav.). Pagal molekulinę masę kiekvienas individualus junginys turi savitą sulaikymo laiką, kuris išreiškiamas DAD chromatogramoje. MR – 2 junginio sulaikymo laikas – 3,7min, tad šitame regione ieškomas ir UV maksimumas. Šiuo atveju UV λmax = 220 nm. Šis rodiklis – tai atskaitos taškas naudojant grynumo patikrinimo

tyrime SC – MS. Kiti sintetinti MR junginių UV spektrai pateikti 4 priede. S

N NH₂

40

10 Pav. DAD chromatograma ir UV spektras:

Junginys 1,3,4 – tiadiazol – 2 – aminas (MR – 2) UV λmax = 224nm ir DAD sulaikymo laikas – 3,7 min.

8.1.4 SC – MS analizė

Susintetintų MR tapatumas patvirtinama naudojant SC-MS metodas. Kiekvienas sintetintas MR junginys turi individualią molekulinę masę, kuri apskaičiuojama pagal molekulinę formulę (analizuojamo MR – 1 junginio molekulinė formulė yra C3H4N4O2). Atlikus analitinį analizės metodą – SC – MS, kuriuo metu

buvo padaryta ESI chromatograma. Ši chromatograma parodo tikslią molekulinę masę: [M-H] - _{= 126.8917,}

kuri lyginama su teorine: [M-H] - _{= 127.026149 (11 pav.). Remiantis rezultatais matyti, kad masių spektre yra}

norimas sintetintas MR – 1 junginys. Kiti MR junginių masių spektrai pateikiami 5 priede.

11 Pav. Masių spektras: