NAUJŲ IMIDAZOLIN-4-ONO JUNGINIŲ SINTEZĖ, SĄLYGŲ OPTIMIZAVIMAS, ANALIZĖ IR METABOLOMINIŲ POKYČIŲ TYRIMAS VEIKIANT S.AUREUS

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

ELIGIJUS KUPRIŪNAS

NAUJŲ IMIDAZOLIN-4-ONO JUNGINIŲ SINTEZĖ, SĄLYGŲ

OPTIMIZAVIMAS, ANALIZĖ IR METABOLOMINIŲ POKYČIŲ

TYRIMAS VEIKIANT S.AUREUS

Darbo vadovas prof. dr. Hiliaras Rodovičius

KAUNAS, 2016

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis _______ 2016 - ___ - ___

NAUJŲ IMIDAZOLIN-4-ONO JUNGINIŲ SINTEZĖ, SĄLYGŲ

OPTIMIZAVIMAS, ANALIZĖ IR METABOLOMINIŲ POKYČIŲ

TYRIMAS VEIKIANT S.AUREUS

Darbo vadovas

prof. dr. Hiliaras Rodovičius __________ 2016 - ___ - ___

Recenzentas Darbą atliko

Vardas, pavardė _______ magistrantas Eligijus Kupriūnas ________ 2016 - ___ - ___ 2016 - ___ - ___

KAUNAS,

TURINYS

6.1 Metabolomikos svarba sisteminėje mikrobiologijoje. ... 13

6.1.1 Metabolominiai metodai ... 14

6.1.2 Metabolinių kelių nustatymas. ... 15

6.2 Mikroorganizmų metabolomo sandara ... 16

6.3 Metabolomikos taikymas S. aureus fiziologiniuose tyrimuose. ... 18

6.3.1 Inovacijos mikrobiologinėje metabolomikoje ... 19

6.3.2 Staphylococcus aureus metabolomo tyrimai ... 19

6.4 S. aureus metabolomas ir metabolitinis atsakas į pasikeitusias aplinkos sąlygas. ... 20

6.4.1 Genetinis atsakas ... 21

6.4.2 Egzogeninių medžiagų atsakas ... 22

6.5 Potencialūs biologiniai S. aureus taikiniai. ... 23

7. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 27

7.1 Junginių sintezė ... 27

7.1.1 Naudotos medžiagos ir tirpikliai ... 27

7.1.2 Junginių sintezės metodikos ... 27

7.1.3 Reakcijos sąlygų optimizavimas ... 33

7.2 Junginių analizės metodai ... 33

7.2.1 FT–IR spektroskopija ... 34

7.2.3 UV spektrofotometrija ... 35

7.2.4 SC – tandeminės MS/MS spektrometrija ... 35

7.2.5 1H BMR spektroskopija ... 36

7.2.6 Lydymosi temperatūros nustatymas ... 36

7.3 Mikrobiologinio mėginio paruošimas... 37

7.3.1 Naudojamos medžiagos ... 37

7.3.2 Ląstelių kultivavimas, mėginių ėmimas ir intraceliuliarinių metabolitų ekstrakcija ... 37

7.4 Metabolominio tyrimo vertinimas SC – tandeminės MS/MS metodu ... 38

7.4.1 Metabolominio pokyčio įvertinimas ... 38

7.4.2 Šiluminio žemėlapio ir metabolinių kelių sudarymas ... 40

7.4.3 Statistinė analizė ... 41

7.5 Molekulinis modeliavimas ir in silico atranka. ... 41

7.5.1 Baltymo struktūros parinkimas ir paruošimas darbui. ... 41

7.5.2 Ligandų modeliavimas ir paruošimas darbui. ... 41

7.5.3 Prognozuojamo aktyvumo nustatymas. ... 41

8. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 43

8.1 Cheminė junginių sintezė ... 43

8.2 Junginių analizė ... 43

8.2.1 FT – IR spektroskopija ... 43

8.2.2 SC – MS analizė ... 44

8.2.3 1H BMR spektroskopija ... 46

8.3 Metabolinio tyrimo analizė ... 47

8.4 In silico analizė ir rezultatai ... 51

9. IŠVADOS ... 56

10. REKOMENDACIJOS ... 57

1. SANTRAUKA

Eligijaus Kupriūno magistro baigiamasis darbas „Naujų imidazolin-4-ono junginių sintezė, sąlygų optimizavimas, analizė ir metabolominių pokyčių tyrimas veikiant S. aureus“. Mokslinio darbo vadovas prof. dr. Hiliaras Rodovičius. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra – Kaunas.

Tyrimo tikslas: nustatyti naujų 2,5 – pakeistų imidazolin-4-ono heterociklinių junginių reliatyvų metabolinį poveikį S. aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC 25923) padermei.

Tyrimo uždaviniai:

1. Sintezuoti naujus 2,5 – pakeistus imidazolin-4-ono heterociklinius junginius. 2. Nustatyti sintezuotų junginių tapatybę, fiziko-chemines savybes.

3. Atlikti sintetintų junginių metabolominių pokyčių tyrimą veikiant S. aureus (ATCC 25923) padermę.

4. Atlikti gautų junginių molekulinį modeliavimą in silico.

Tyrimo metodai:. junginių sintezė atlikta vykdant modifikacijas imidazolin-4-ono žiedo 2-oje ir 5-oje padėtyse. Sintetintų junginių struktūra įrodyta ultravioletinės (UV) infraraudonosios (IR) spinduliuotės ir masių spektrometrijos metodais. Grynumas nustatytas efektyviosios skysčių chromatografijos su masių spektrometrija (ESC-MS) metodu. Lydymosi temperatūra nustatyta Koflerio prietaisu. In silico tyrimai atlikti panaudojant Schrodinger programinį paketą.

Tyrimo rezultatai: Susintetintų junginių grynumas yra 93-95 %. Ištirtas sintetintų junginių metabolitinis poveikis į S. aureus (ATCC 25923). Nustatyta, jog 81 % junginių mažina stafiloksantino ir dehidroskvaleno, tačiau 90,5 % didina izopentenil difosfato ir mevalonato difosfato kiekį lyginant su kontrole. Atlikus in silico tyrimą nustatytas, potencialus slopinimo mechanizmas. Sintetinti junginiai jungiasi su baltymo aktyviojo centro Asp, Arg, Lys aminorūgštimis.

Tyrimo išvados: Atlikta 21 junginio sintezė. Visuose junginiuose nustatytas ženklus dehidroskvaleno ir stafiloksantino kiekio sumažinimas lyginat su kontrole (sumažėja 23,41 ir 21,54 karto atitinkamai).Taip pat kaip ir tikėtasi rastas izopentenil difosfato ir mevalonato difosfato kiekio padidėjimas lyginant su kontrole. Atlikus in silico tyrimą stipriausia sąveika tarp baltymo ir junginio buvo EK14 ir EK20.

Tyrimo rekomendacijos: atlikti detalesnius metabolitų pokyčių tyrimus, identifikuojant visų metabolitų pokyčius ir nustatyti junginių tikslų veikimo mechanizmą.

2. SUMMARY

Master thesis of Eligijus Kupriūnas „Synthesis, reaction optimization, analysis and change of metabolomics profile analysis against S. aureus of new imidazolin-4-one derivatives “. Tutor: Hiliaras Rodovičius, professor, Ph.D. Lithuanian university of health sciences, faculty of Pharmacy, Department of Drug chemistry.

Aim of study: to perform synthesis of 2nd and 5th substituted imidazolin-4-one compounds and identify it metabolomic profile against S. aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC 25923).

Study objectives:

1. To synthesize selected imidazolin-4-one derivatives.

2. To determine compounds structure and physic-chemical properties. 3. Identify synthesize compounds metabolomic profile against S. aureus. 4. Render compounds in silico screening.

Study methods: synthesis of compounds was done by modifying 2nd and 5th positions of imidazolin-4-one ring. The identity of compounds was confirmed by means of UV, IR and MS spectral data. Purity analysis was performed LC-MS Q-TOF method. Melting points were determined by using Kofler bench. In silico studies was done using Schrodinger software.

Study results: purity of the synthesized compounds is 93-95%. The metabolic change of the synthesized compounds to S. aureus was analyzed. It was found that 81 % of the compounds reduced the amount of staphyloxantin and dehydrosqualene compared to the control, but 90.5 % of the compounds increased the amount of isopentenyl diphosphate and diphosphomevalonate compared to the control. The in

silico study provides a potential mechanism of inhibition. Synthetic compounds interact with the active center

of the protein Asp, Arg, Lys amino acids

Conclusions: Successfully performed the synthesis of 17 compounds. It was found that all compounds reduced of guanine dehydrosqualene and staphyloxantin was significant (decreased 23.4 ir 21.54 times respectively) compared to the control. As expected was found significant increased the amount of isopentenyl diphosphate and diphosphomevalonate compared to the control. After in silico test the strongest interaction between the protein and the compound was in EK14 and EK20.

Recomendations: do more in depth metabolomic change research, identifying all metabolites changes and identify compounds exact mechanism of action.

PADĖKA

Noriu padėkoti savo magistro darbo vadovui prof. dr. Hiliarui Rodovičiui už idėjas vykdant magistro darbo eksperimentinę dalį, pagalbą rašant teorinę dalį bei visus organizacinius aspektus.

Dėkoju LSMU FF Vaistų chemijos katedros asistentams Liudui Šlepikui ir Jonui Saliui, kurie dvejus magistratūros studijų metus padėjo man kryptingai, vykdant magistrinio darbo rengimą.

Dėkoju LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos instituto darbuotojui prof. dr. Alvydui Povilioniui bei laborantėms už nuoširdžią pagalbą ir mokslinę konsultaciją vykdant mikrobiologinį tyrimą.

Dėkoju LSMU FF Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros vedėjui prof. dr. Liudui Ivanauskui ir doktorantui Mindaugui Marksai už pagalbą atliekant magistro tiriamąją dalį.

prof. dr. Hiliaras Rodovičius Liudas Šlepikas prof. dr. Alvydas Povilionis

3. SANTRUMPOS

S. aureus Auksinis stafilokokas (lot. Staphylococcus aureus)

DMSO Dimetilsulfoksidas

UV Ultravioletinė spinduliuotė Rf Paviršiaus šiurkštumo faktorius IR Infraraudonoji spinduliuotė

FT–IR Furjė transformacijos infraraudonųjų spinduliuotė MS Masių spektrometrija

SC–MS Skysčių chromatografija – masių spektrometrija MRSA Meticilinui rezistentiškas S. aureus

PCA Pagrindinė komponentų analizė (ang., principal component analysis) CFU Kolonijas sudarančios vienetai

4. SĄVOKOS

Epigenetika – biochemijos mokslo šaka tirianti įvairių veiksnių įtaką kintančiai genų ekspresijai. Fragmentacija (angl. fragmentation) – medžiagos ar molekulės dalijimąsi į mažus subvienetus.

Jonizacija – fizinis procesas, kurio metu atomas arba molekulė paverčiama jonu, keičiant santykį tarp protonų ir elektronų skaičių.

m/z dydis – dydis, kuris atspindi santykį tarp masės ir krūvio jonizuotoje formoje.

Sonifikacija – procesas, kurio metu taikant ultragarso energija organinės medžiagos suskaidomos į radikalus. Supernatantas – skaidrus skystis, kuris gaunamas po centrifugavimo.

Transkirptomika – biochemijos mokslo šaka, tirianti medžiagų apykaitos procesus visų transkripcinių faktorių pernešimo lygmeniu.

5. ĮVADAS

Genomikos, proteomikos, transkriptomikos ir metabolomikos mokslo šakas lingvistiniu požiūriu sieja galūnė „-omika“, kuri kildinama iš lotyniško žodelio „omne“, pažodiniu vertimu reiškiančio „viskas, visuma,

vientisas“. Šie naujadarai faktiškai vartojami tam, kad pabrėžtų jau egzistuojančių fundamentinių gamtos

mokslų tyrimo mastą. Tai yra, tiriamas ne vienas genas ar baltymas, jo funkcija, bet bandoma suprasti visų genų ar baltymų ryšį, jų vientisą funkciją visai organizmo medžiagų apykaitai. Tyrėjai besispecializuojantys pastarųjų mokslo šakų studijose susiduria su labai dideliais kiekiais informacijos, todėl yra taikomi bioinformatiniai įrankiai ir programiniai paketai. Duomenų analizė ir interpretacija leidžia geriau suprasti ląstelių universalumą ir funkcionalumą. Taip pat gautas žinias pritaikyti biotechnologijoje ar naujų vaistų paieškos procesuose [1–3].

Sistematikos (sisteminės biologijos) vienas iš uždavinių yra geriau suprasti visus biologinius mechanizmus, pasireiškiančius skirtinguose hierarchiniuose lygmenyse. Tai reiškia, jog organizmas gali būti nagrinėjamas pavienės ląstelės lygmeniu: tiriama ne tik proteomo ar metabolomo kokybinė ir kiekybinė sudėtis, bet ir jų dinamika bei lokalizacija subceliuliariniuose kompartamentuose. Dabar dienai yra vykdomi įvairūs genominiai, proteominiai, metabolominiai tyrimai, o iš gautos informacijos yra sprendžiamos fundamentinės problemos. Viena tokių yra ryšio nustatymas tarp ląstelės sudėties ir fenotipo bei jo adaptacijos prie besikeičiančių aplinkos sąlygų. Gerai yra žinoma, jog metabolizmas reguliuojamas per genų ekspresiją bei per post-transkripcines ir post-transliacines modifikacijas. Vykstantys tokie pokyčiai individualiose ląstelėse yra išskirtiniai dėl genetinių ir fiziologinių skirtumų. Be to, taip yra apsprendžiamas fenotipas. Nuolatos besikeičiantis mikroorganizmų genotipas ir fenotipas sukelia rimtus iššūkius prieš pavojingas hospitalines infekcijas. Viena tokių rūšių yra S. aureus, kurios padermės yra tapusios atsparios meticilinui, vankomicinui ir chinolonams [4].

Greiti S. aureus adaptaciniai procesai į stresines aplinkos sąlygas, pavyzdžiui, gydymą antibiotikais ar pakitusias mitybines aplinkos sąlygas, skatina mokslininkų susidomėjimą šia rūšimi. Naujų prieš-bakterinių biologinių taikinių paieška gali būti vykdoma žinant biocheminį ryšį tarp virulentiškumo faktorių ir metabolomo sudėties bei lokalizacijos. Analitiniai metabolomikos tyrimai dažniausiai yra atliekami masių spektrometrijos metodu kartu naudojant įvairias išskirstymo technikas: dujų ar skysčių chromatografiją, elektroforezę [2].

Darbo tikslas – nustatyti naujų 2,5 – pakeistų imidazolin-4-ono heterociklinių junginių reliatyvų metabolinį poveikį S. aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC 25923) padermei.

Darbo uždaviniai:

1. Sintezuoti naujus 2,5 – pakeistus imidazolin-4-ono heterociklinius junginius. 2. Nustatyti sintezuotų junginių tapatybę, fiziko-chemines savybes.

3. Atlikti sintetintų junginių metabolominių pokyčių tyrimą veikiant S. aureus (ATCC 25923) padermę.

4. Atlikti gautų junginių molekulinį modeliavimą in silico.

Raktiniai žodžiai: metabolomika, S. aureus, SC-MS/MS QTOF, stafiloksantinas

6. LITERATŪROS APŽVALGA

6.1 Metabolomikos svarba sisteminėje mikrobiologijoje.

Pagrindinis sisteminės biologijos tikslas yra sugebėti paaiškinti fiziologinius procesus, kurie priklauso bei yra suderinti su ląstelės metabolitų apykaita. Tyrimai, nagrinėjantys bakterijų metabolizmą, yra perspektyvi sritis, leidžianti plačiau ištirti ląstelės medžiagų apykaitą, jos ryšius tarp individualių organizmo rūšių. Reliatyviai mikroorganizmai yra paprastos sandaros, tačiau jų autentiškas fiziologinis bruožas – subalansuotas gebėjimas išgyventi, pakitusiomis aplinkos sąlygomis. Pastarąją savybę lemia jų metabolinis potencialas. Atsižvelgiant į šias savybes, mikrobiologiniai modeliai yra lengvai kultivuojami bei genetiškai modifikuojami. Be to, fermentų katalizuojami metaboliniai keliai, jų ryšiai yra pakankamai lengvai nustatomi, sudaromi ir sistematiškai palyginami [5].

Nuoseklūs pasiekimai bakterijų metabolomo tyrimuose tapo sparčiausiai besivystančia sisteminės biologijos šaka. Vis tik atsižvelgiant į visumą šioje srityje neišvengta ir problemų. Pagrindinė jų – riboti srauto balanso analizės (ang. flux balance analysis – FBA) skaičiavimo metodai. Proveržis pasiektas tik nustačius, jog E. coli (kita vertus, ne dauguma kitų mikroorganizmų) dažniausiai augimo fazėje geba maksimaliai padidinti ir sunaudoti įvairius ląstelinius anglies šaltinius. Tai leido Jeremy S. Edwards padaryti išvadą, jog metabolitų srautas yra optimaliai efektyvus [6]. Po šio tyrimo buvo iškelta daugiau klausimų: kokiais mechanizmais metabolitų srautas yra valdomas? Kaip filogenetinės sistematikos požiūriu skiriasi šie mechanizmai tarp genetiškai artimų padermių ar rūšių? Kaip yra koordinuojamas metabolitų srautas, jog ląstelėje tinkamai būtų paskirstyti metaboliniai resursai [5]?

Pastarųjų problemų sprendimui buvo pradėti plėtoti ir vystyti metabolominiai tyrimo metodai, kuriais yra išsamiai ir visapusiškai nustatomas (-i) metabolitas (-ai). Kartu su metabolominiais tyrimais yra atliekami ir genominiai, kuriais komplementariai padedama nustatyti metabolitus ir reakcijas, kuriose jie dalyvauja. Šie duomenys yra pritaikomi sudarinėjant metabolinių kelių žemėlapius. Kita vertus, metabolitų koncentracijos nustatymas ląstelėje yra atliekamas pagal surinktus metabolominius, proteominius ir transkriptominius duomenis [5].

Fluksomikos pritaikymo tikslas yra išmatuoti ląstelinį fermentų katalizuojamų reakcijų greitį. Nustatytos metabolitų koncentracijos ir gauti srauto analizės duomenys, gali būti perdengti ir sulyginti su

metaboliniais keliais. Tai pritaikius galima sukurti naujus kiekybinius integracinius mikrobiologinius modelius, kuriais galima palyginti tarprūšinius metabolinius skirtumus [5].

6.1.1 Metabolominiai metodai

Keseler vykdyti tyrimai su protrofiniais mikrobais (konkrečiau E. coli K12, E. coli O157:H7 ir E. coli CFT073) atskleidė, kad didžioji dalis metabolomo yra sudaryta iš maždaug 700 mažos molekulinės masės

junginių, kurie dalyvauja centriniame ląstelėse metabolizme ir pagrindiniuose biocheminiuose apykaitos keliuose [5,7]. Vis tik minėtas skaičius neatspindi individualios rūšies realaus metabolomo sandaros, kuris yra gerokai didesnis. Be pagrindinių metabolitų yra nustatomi antriniai metabolitai ir įvairūs lipidai, būtini normaliai ląstelės gyvybiniai veiklai. Pavyzdžiui, prokariotų, grybų ir eukariotų ląstelėse yra sintetinami ir kaupiami panašūs steroliai, kurie reikalingi ląstelės membranos veiklai. Bakterijų ląstelių plazmolemoje yra aptinkami pentacikliai triterpenoidai – hopanoidai, o atitinkamai grybų ir eukariotų plazminėje membranoje nustatomi – keturcikliai steroidai – ergosteroliai ir cholesteroliai [5,8,9]. Kitas svarbus aspektas, lemiantis nedidelį identifikuojamą metabolitų skaičių – tai analitinių instrumentų jautrumo stoka [5]. Dalis metabolitų ląstelėje egzistuoja, kaip tarpinės medžiagos, būtinos pagrindinių ląstelės metabolitų biosintezei. Remiantis moksliniais duomenimis, galima teigti, kad mažos molekulinės masės tarpinių junginių koncentracija yra labai žema bei gali skirtis tarpusavyje nuo pagrindinių metabolitų iki 10 000 kartų [10].

Metabolominių metodų vystymąsi riboja tik naudojamų instrumentų jautrumas ir metabolinio mėginio metodikų ribotumas, todėl vis dažniau yra pritaikoma kietafazė ekstrakcija (KFE). Šiai dienai metabolomikos laboratorijose SC–MS metodais vyksta rutininiai pagrindinių metabolitų nustatymo darbai, įskaitant aminorūgštis, nukleotidus ir kofaktorius [5,11–15]. Taip pat yra atliekami papildomo tyrimai su dujų chromatografija–tandemine masių spektrometrija (DC–MS) ir branduolių magnetiniu rezonansu, kuriais yra identifikuojamos mažai besijonizuojančios molekulės. Kita vertus, šių molekulių nustatymas SC–MS metodais yra sudėtingas [16,17]. Be to, naudingos metabolominės informacijos gaunama ir kapiliarinės elektroforezės – masių spektrometrijos (KE–MS) tyrimų metu. Pavyzdžiui, 2007 metais tyrėjas iš Japonijos Keio Universiteto – Y. Ohashi nustatė KE–MS metodu, kokį metabolominį poveikį sukelia sumažintos histidino atsargos E. coli ląstelėms. Buvo pastebėta, jog vos sutrikdoma histidino biosintezė, tarpiniai metabolitai pilnai susikaupia greičiau nei per valandą [18].

Taigi, akivaizdu, jog metabolominiai tyrimai ir individualaus metabolomo sudėties nustatymas yra daugialypis procesas. Pagrindiniai eigos etapai yra: ląstelių kultivavimas, metabolizmo slopinimas, metabolomo ekstrakcija, mėginio koncentravimas, metabolitų detekcija (dažniausiai naudojama SC–MS, tačiau galimi ir kiti metodai) ir duomenų analizė. Apibendrinant, galima suprasti, jog metabolitų koncentracijos pokyčiai ląstelėje vyksta per labai trumpą laiką. Pavyzdžiui, mikroorganizmuose medžiagų apykaita gali vykti sekundžių laikotarpyje, todėl norint išvengti tyrimo artefaktų , būtina imtis visų specialų atsargumo priemonių nuo ląstelių kultivavimo iki metabolizmo slopinimo etapo [5,19].

6.1.2 Metabolinių kelių nustatymas.

Pastarųjų dešimtmečių genetikų sekvenavimo darbai leido nustatyti įvairius mikrobinius genomus, jų sandarą, tačiau iki pat šios dienos yra nesuprasta dauguma genų funkcijų. Kita problema, kad nemažai katalizinių biotransformacinių reakcijų ląstelėse vyksta dėl filogenetiškai neidentifikuotu baltymų (ang.

unknown gene products). Šie teiginiai leidžia suprasti, kodėl yra sudėtinga kurti ypatingai tikslius prognozinius in silico genominio masto modelius, kurie paaiškintų ląstelėse vykstančius medžiagų apykaitos procesus. Taigi,

pagrindinis ir ilgalaikis metabolomikos mokslo tikslas yra sugebėti nustatyti egzistuojantį ryšį tarp genų funkcijų ir metabolomo bei jų filogenetinį pasiskirstymą [20–22].

Metaboliniai pokyčiai laboratorijose lengviausiai stebimi su genetiškai modifikuotomis rūšimis (ang.

knockout strains), kurių genų ekspresija yra eksperimentiškai apribota, nes proteominės ir metabolominės

analizės metodais galima identifikuoti substrato ir metabolito pokyčius [23]. Pavyzdžiui, tyrėjų grupė iš Princtono Universiteto atliko palyginamuosius metabolominius tyrimus su S. cerevisiae, panaudodami „Orbitrap“ MS. Šios studijos metu buvo išvesta mielių padermė, kuriose – išjungtas (ang. knockout) YKL215C genas. Tirtuose MS spektruose buvo pastebėtas jono, kurio m/z reikšmė lygi 128.0351, koncentracijos padidėjimas. Interpretuojant duomenis buvo prieita nuomonės, jog identifikuotas junginys yra oksoprolinas, kas leido daryti išvadą, jog geno YKL215C delecija sukėlė oksoprolinazės deficitą [24].

Taip pat metabolitų stebėjimo tyrimai leidžia geriau suprasti jau žinomų metabolinių kelių funkcinį aktyvumą. Pavyzdžiui, bioenergetiškai įdomiame organizme – acetobutilinė klostridija (lot. Clostridium

acetobutylicum, C. acetobutylicum) įrodytas citrato (TCA) buvimas pakeitė požiūrį apie šią padermę, nes

genome nėra rastas trikarboksirūgšties genas, kuris koduotų atitinkamą fermentą. Tai leidžia daryti išvadą, jog

išsiskiriančio TCA ciklo įrodymo duomenų, kurie buvo gauti radioizotopinės analizės metu [25]. Panašūs tyrimai padeda geriau suprasti metabolinius kelius tiek genomikos , tiek fluksomikos požiūriu. Publikuotas K.

L. Olszewski mokslinės grupės tyrimas žurnale „Nature“ aptaria maliarijos sukėlėjo pjautuvinės plazmodijos

(lot. Plasmodium falciparum, P. falciparum) TCA ciklo išskirtinumą, nes jis nuo α–ketoglutarato išsiskiria dvejomis kryptimis (V). Tyrėjai naudodami glutaminą, kuris turėjo 13C radioizotopiškai žymėtą anglį, pastebėjo, kad iš α–ketoglutarato susidaro sukcinatas ir izocitratas, kurie atitinkamai kinta iki malato ir acetil– kofermento A (acetil–CoA) [26]. Šie rezultatai leidžia daryti išvadą, jog TCA ciklas oksireduktacijos požiūriu yra neutralus, nes tolimesnė anglies apykaita vyksta dvejomis kryptimis. Dabar tyrėjai ieško šiame cikle dalyvaujančio fermento, kuris atskelia TCA cheminius ryšius. Šis hipotetinis baltymas galėtų būti svarbus biologinis taikinys naujų prieš–maliarinių vaistų paieškoje [5].

Vis dėlto metaboliniuose tyrimuose sudėtingiausias uždavinys yra identifikuoti naujus substratus, jų veikimo kelius, sąryšius su metabolitais ir validuoti tiek baltymo, tiek mažos molekulės teisingą struktūrą. Idealiausiai būtų galima tai atlikti tikimybiniu metodu pagal jau žinomus MS/MS duomenis, tačiau tik maža dalis tyrimų yra statistiškai patikimi [27]. Kita vertus, dažniausiai metabolominių duomenų analizės metu yra patvirtinamos struktūrinės cheminių junginių tapatybės. Pavyzdžiui, Berklio Universitete vadovaujant K.S.

Kim tokiu principu buvo atliktas naujas katabolinis pirimidino kelio nustatymas E. coli padermėje [28,29].

6.2 Mikroorganizmų metabolomo sandara

Priklausomai nuo organizmo sistematinio diversiškumo, metabolomo kokybinė ir kiekybinė sudėtis gali stipriai varijuoti. Metabolomikos vystymosi pradžioje, tyrėjai O. Fiehn (2002) ir R. Mungur (2005) atskirai padėjo didelius pamatus šiai mokslo šakai, nes sugebėjo identifikuoti apytikriai 200 tūkstančių pirminių ir antrinių metabolitų bei aptikti ląstelėje vykstančius jų pokyčius [30–32]. Kita vertus, lygiagrečiai atlikti J.

Forster (2003) tyrimai su vienu paprasčiausios sandaros eukariotu – alaus mieliagrybiu (lot. Saccharomyces cerevisiae) atskleidė, jog pastarasis organizmas turi daugiau kaip 600 metabolitų [33]. Iki šios dienos

(2016.05.29) mielių metabolomo duomenų bazėje (prieiga per internetą: http://www.ymdb.ca) yra publikuoti 2027 metabolitai, o įvairių atskyrų tyrimų metu su S. cerevisiae yra identifikuojama tik kelios dešimtis naujų metabolitų [34–40]. Mokslinė visuomenė dėl publikuotų prieštaringų ir kontraversiškų rezultatų išlaiko vis dar atvirą klausimą apie mikroorganizmų metabolomo dydį, metabolitų varijavimą tiek chemine sudėtimi, tiek savo koncentracija ląstelės viduje [30].

Tolimesniu tyrimu metu buvo sukurta daugiau kaip 20 tikimybinių in silico genomo masto modelių, kuriais prognozuojamas bakterijų metabolizmas. 2009 metais sistemiškai M. Durot išanalizavo publikuotus pastarųjų studijų tyrimus ir nustatė, jog apytikriai 600 metabolitų yra priskiriama individualiai bakterijų rūšiai [41]. Vis tik šių tyrimų metu svarbesnis nustatytas faktas yra tas, jog genominiai tyrimai ir gautų duomenų interpretacija apie metabolominio modelio charakteristikas nesutapo su atliktais skaičiavimais. Pavyzdžiui, tyrimuose su gram–teigiamomis bakterijomis, šieno lazdelėmis (lot. Bacillus subtilis, B. subtilis), prognozuotas metabolitų skaičius buvo nuo 988 iki 1138, tačiau pavyko identifikuoti tik 537 mažos molekulinės masės metaboliniai junginiai [42–44]. Taip pat 2005–2011 metų laikotarpyje buvo atlikti genomo masto S. aureus metabolinių kelių tikimybiniai skaičiavimai. Duomenų analizės ir interpretacijos laikotarpiu buvo priskirta daugiau kaip 700 galimų metabolinių reakcijų bei trijų atskirų in silico studijų metu įvertintas numanomas metabolitų skaičius – 422, 571 ir 712 [45–47]. Be to, 2009 metais trylikos S. aureus padermių palyginamųjų tyrimų metu D. S. Lee su komanda pasiūlė naują rekonstrukcijos skaičiavimo metodą bei išplėstą metabolomo sandaros vaizdą, kurį sudaro apie 1250 metabolinių reakcijų bei 1400 metabolitų [48]. Remdamasis šiais tyrimais, A. Feist atliko tyrimus su pneumoniją sukeliančia Klebsiele (lot. Klebsiella pneumoniae, K.

pneumoniae), nustatydamas 1658 metabolitų. Mokslininkas padarė išvadą, jog metabolomo sudėtimi S. aureus

ir K. pneumoniae galimai yra vieni sudėtingiausių mikroorganizmų [48,49]. Palyginimui, mikoplazmose – M.

pneumonia (lot. Mycoplasma pneumonia) ir M. genitalium (lot. Mycoplasma genitalium), turinčiose labai

mažus genomus, prognozuojamų metabolitų skaičius atitinkamai yra 150 ir 270 [50,51]. Apibendrinant dauguma tyrimų, galima pastebėti, jog pagrindinė metabolomikos problema yra per maža analitinių duomenų integracija į prognozuojamus genominius - metabolominius in silico modelius. Dažniausiai lemiantys faktoriai yra instrumentinės analizės prietaisų jautrumo stoka, atskiriant mažos koncentracijos metabolitus nuo prietaiso skleidžiamo triukšmo bei metabolominio mėginio paruošimo metu vykstantys cheminiai pokyčiai [52–58].

Teisingas metabolitų įvertinimas struktūriniu ir kiekybiniu bei variaciniu genominiu ir evoliuciniu požiūriu yra sudėtingas uždavinys, nes tai priklauso nuo daug faktorių: pradedant darbo su bakterinėmis ląstelių kultūromis aplinkos sąlygų iki laiko momento, kada yra ruošiamas metabolominis mėginys [30]. Dažniausiai šie veiksniai aiškinami tuo, jog yra epigenetiškai pasireiškiančių medžiagų apykaitos kelių. Įprastomis sąlygomis šie genai yra ne ekspresuojami, tačiau ląstelė veikia besikeičiančiomis sąlygomis, todėl metabolominių studijų metu yra nustatomi metabolitų skaičiaus skirtumai tarp apskaičiuotų jų kiekio pagal in

silico modelį ir realiai patvirtinamų instrumentinės analizės metu [34]. Kita vertus, analitinių prietaisų jautrumo

trūkumas, reikiamų standartų naudojimas, detekcijos ribos, būtinos kiekybiniam įvertinimui, apsunkina visų galimų ląstelės metabolitų pasiskirstymo nustatymą. Individualių metabolitų nustatymas yra atliekamas pagal

tikslinės metabolominės analizės (ang. targeted metabolomic analysis) metodikas. Šiai dienai tikslinės metabolominės analizės duomenų yra dar mažai, kuriuose būtų nustatytos ne reliatyvios, bet absoliučios metabolitų koncentracijos ląstelėje. Sisteminės metabolomikos požiūriu didžioji dalis tyrimų buvo atlikti 2007 – 2013 metų laikotarpiu. Pavyzdžiui, 2009 metais B.D. Bennett iš Princtono Universiteto nustatė, absoliučias metabolitų koncentracijas E. coli ląstelėje [10]. Kitą panašų tyrimą po poros metų publikavo M. Liebeke tirdamas S. aureus metabolitų pasiskirstymą [59]. Apibendrinant šiuos išsamius kiekybinius E. coli ir S. aureus tyrimų duomenis, akivaizdu, jog tyrėjai mikroorganizmus eksponentinėje augimo fazėje kultivavo gausiai padidintomis gliukozės kiekio sąlygomis. Abejais atvejais buvo nustatyta, jog pagrindinis metabolitas yra glutamatas, kurio koncentracija atitinkamai E. coli ir S. aureus lygi 9.6 × 10-2 moll-1 ir 1.6 × 10-1 moll-1 [10,59]. Kita vertus, SC–MS analizės metu mažiausia jonų srauto gausa E. coli ląstelėje buvo aptikta, nustatant nukleozidų ir kofaktorių koncentracijas. Pavyzdžiui, patvirtintas ląstelinis E. coli adenozino lygis – 1.3 × 10-7

moll-1 [10].

Apibendrinus minėtų tyrimų duomenis, galima pastebėti, jog ląstelėje metabolitų koncentracija labai stipriai svyruoja. Lyginant pagrindinius ir sunkiau aptinkamus metabolitus, apytikris jų koncentracijų skirtumas ląstelėje yra penki kartai. Taigi, šie duomenys, leidžia daryti išvadą, jog bakterijų metabolominiuose tyrimuose yra reikalinga labai jautri ir didelės skiriamosios raiškos analitinė įranga [10,30,34–37,45,59].

6.3 Metabolomikos taikymas S. aureus fiziologiniuose tyrimuose.

S. aureus yra universalus žmogaus patogenas, sukeliantis daug sunkių infekcijų, kaip endokarditas ar

sepsis [30,60]. Bakterijos siekdamos išgyventi, turi įveikti priešiškas aplinkos sąlygas. Pagrindinis mechanizmas padedantis išlikti šiems gyviams yra gleivinių, odos ar žaizdų kolonizacija. Staphylococci genties mikroorganizmai naudoja įvairius virulentiškumo faktorius ir reguliacinius mechanizmus, kurie kovoja prieš organizmo apsauginius barjerus ir imuninę sistemą. Šie veiksniai leidžia patogenui adaptuotis prie naujos kolonizuotos aplinkos [61].

Pagrindinis aspektas, leidžiantis ląstelėmis prisitaikyti prie minėtų sąlygų, yra jos fiziologinė būklė. Tai reiškia, kad renkant, analizuojant ir interpretuojant, metabolominę informaciją apie šiuos S. aureus pokyčius gali padėti nustatyti jos kompleksišką ir sudėtingą patogenezę [30]. Vis dėlto iki šios dienos dar trūksta išsamių kokybinių ir kiekybinių metabolominių tyrimų duomenų. Be to, S. aureus metabolomas nėra taip gerai suprastas kaip jo proteomas ir transkriptomas [4,62].

6.3.1 Inovacijos mikrobiologinėje metabolomikoje

Nuo pat biochemijos vystymosi pradžios įvairūs instrumentai ir metodai yra reikalingi metabolitų kokybiniai ir kiekybiniai analizei atlikti [63]. Vis dėlto tik neseniai įvykęs technologinis proveržis masių spektrometrijoje ir branduolių magnetinio rezonanso spektroskopijoje leido sukurti naujas ir inovacinius metodikas, kuriomis vienu metu galima aptikti nuo kelių šimtų ar net tūkstančių metabolitų [64]. Taigi, technologinis vystymasis leido pradėti tirti ląstelę metabolominiu požiūriu [1,3,5,30,63,65–73].

Moksliniai visuomenei bendrai sutarus, jog biologiškai patikimiau į ląsteles yra žiūrėti kaip į heterogenetinius tyrimo objektus, todėl būtini pavienių ląstelių metabolizmo tyrimai. Vis tik pagrindinė problema pavienių ląstelių metabolomo nustatyme yra chemometrinių technologijų ribotumas. Science žurnale publikuotame straipsnyje aptariamos dabar inžinierių kuriamos naujos kartos metabolinio vaizdavimo technologijos, kurių dėka būtų galima mikroskopinėje erdvėje stebėti ir matuoti specifinio vieno metabolito pokyčius ląstelėje [74]. Pora tokių tyrimų pavyzdžių duomenų jau yra publikuota.

Atvaizduojamoji masių spektrometrija (IMS) yra besivystanti technologija, kuri gali būti taikoma mikrobinėje metabolomikoje, kai kartografavimo metodu yra sudaromas Euklidinėje ir Minkovskio erdvėse x ir y koordinacinis žemėlapis. Jis parodo metabolitų pasiskirstymą mikrobinėje ląstelėje [75]. Vis dėlto, nors IMS technologija yra brangi, jos pritaikymas yra labai platus, kai naudojamos įvairios modifikacijos. Pavyzdžiui, panaudojus atvaizduojama antrinės jono masės spektrometrija (SIMS IMS), daugiamatiškai galima išmatuoti bakterijų metabolizmą ir cheminius pokyčius subląstelinėse erdvėse ir vienaląsčiuose organizmuose. Kita technologija pritaikoma mikrokolonijų elgesio ir sąveikos su aplinka tyrimuose yra IMS su ant matricos vykstančia desorbcija/jonizacija, panaudojant sužadinamąjį lazerio spindulį ir lėkio trukmės detekcijas (MALDI–TOF IMS). MALDI–TOF su desorbcinės nanoelektropurkštuvinės jonizacijos (nano– DESI) IMS buvo pritaikyta aiškinantis ekstraceliuliarinių metabolitų apykaitos procesus bei sąveikas mikrobų formuojamose kolonijose [76,77].

Aptartos analitinės metodikos yra svarbios, nes taikomos metabolominių studijų tyrimuose. Įvairiai modifikuojant ir optimizuojant analitinių instrumentų parametrus, galima atlikti įvairaus spektro ir pobūdžio metabolominę analizę: parinktinės atrankos (ang. untargeted metabolomics) arba tikslinės paieškos (ang.

targeted metabolomics) metodu identifikuoti hidrofilinius arba lipofilinius metabolitus, jų pokyčius,

lokalizaciją ląstelės kompartamentuose. Pavyzdžiui, A.M. Beltramini atliko S. aureus 8325 padermių (naudota tiek laukinio tipo (ang. wild type), tiek genetiškai modifikuota) palyginamuosius tyrimus dvejuose skirtingose mitybinėse terpėse (kompleksinėje ir chemiškai žinomos sudėties) [78]. Tyrimo objektais buvo pasirinkti serino/treonino kinazės ir fosfatazės (atitinkamai žymimos pknB/ΔpknB ir stp/Δstp). Gauti rezultatai parodė, kad mutantų štamai, kuriems trūksta pknB ir stp arba stp tapo jautresni į ląstelės sienelės sintezę veikiančių antibiotikų (cefalosporinų ir karbapenemo) poveikiui. Šie metabolominiai tyrimai leidžia daryti išvadą apie grįžtamojo tipo fosforilinančių/defosforilinančių baltymų svarbą įvairiems ląstelės procesams [79].

Ląstelės diferenciacijos proceso reguliacija, signalo transdukcija ir metabolizmas priklauso nuo konkrečių fosforilinančių baltymų giminingumo [80]. Įvairūs fosforilinantys serino/treonino ir tirozino baltymai buvo nustatyti S. aureus štamuose. Be to, pastarieji fermentai yra priskiriami centrinės anglies metabolizmo keliui [78]. Metabolominės ir transkriptominės fosforilinančių baltymų studijos su S. aureus 8325 ir jos modifikuota izogenine ΔpknB padermėmis leidžia geriau suprasti, kokią įtaką ląstelei daro pknB fermentas. Normaliomis kultivavimo sąlygomis kompleksinėje terpėje pknB delecija keičia purinų ir pirimidinų ekspresiją, ląstelės sienelės metabolizmą, autolizę ir glutamino sintezę [81]. 2009 metais atliktos infekcinės studijos su modifikuotomis S. aureus padermėmis (tiek su ΔpknB, tiek su Δstp) parodė aiškų ryšį tarp virulentiškumo veiksnių ir mutavusių kinazių aktyvumo (mutacijos tipas delecija). Tyrimas buvo atliktas su pelėmis ir leido padaryti išvadą, kad ΔpknB ir Δstp atlieka labai svarbią funkciją S. aureus patogenezėje [78,82].

Apibendrinant šiuos publikuotus tyrimus [78–82], galima teigti, jog yra reikalingi tolimesni genetiškai mutavusių S. aureus štamų genominiai, proteominiai ir metabolominiai tyrimai, kad būtų geriau suprasta šio organizmo fiziologija bei šios žinios pritaikytos naujų priešstafilokokinių vaistinių medžiagų paieškoje.

6.4 S. aureus metabolomas ir metabolitinis atsakas į pasikeitusias aplinkos sąlygas.

Naujai išvystyti analitinės chemijos instrumentai dabar tyrėjams leidžia nustatyti labai mažo intensyvumo metabolitų jonų srautus, panaudojus labai jautrius masių spektrometrijos metodus. Metabolomo

sandara tyrinėjama įvairiausiomis perspektyvomis ir sąlygomis [30]. Vienas iš metabolomikos tikslų yra bandyti suprasti patogeninių bakterijų medžiagų apykaitos procesų adaptaciją ir nustatyti ryšį tarp patogeniškumo ir metabolizmo [83–85]. Be to, naujausių tyrimų duomenys su genetiškai modifikuotomis „knockout“ S. aureus padermėmis rodo jų fiziologinius pokyčius. Taigi, metabolomikos pritaikymas gali leisti nustatyti metabolomo giminingumą virulentiškumo faktoriams ir patogeniškumui [30,45,59,83–85]. Apibendrinant, šiuos tyrimus, didelis dėmesys privalo būti skirtas pavojingam žmogaus patogenui S. aureus, kurio padermės sukelia pavojingas hospitalines infekcijas. Taip pat reikia gerai suprasti, kaip šios gram– teigiamos bakterijos geba reaguoti į epigenetiškai pakitusias aplinkos sąlygas.

6.4.1 Genetinis atsakas

Per pastarąjį dešimtmetį buvo atlikta nemažai tyrimų, kurių metu stengtasi suprasti, kaip kinta S.

aureus metabolizmas po įvairių sukeltų genetinių mutacijų [86–90]. Pavyzdžiui, egzometabolomo nustatymui

ir metabolominio pokyčio tyrimams buvo išvestos naujos RN6390 padermės iš S. aureus NCTC8325 kultūros. Genetinę modifikaciją lėmė vieno geno, koduojančio TCA ciklo fermentą, delecija. Egzometabolomo sudėtis buvo nustatinėjama 1_{H BMR metodu. Buvo bandoma nustatyti TCA funkcinę reikšmę S. aureus RN6390}

padermės augimui ir virulentiškumo potencialui [86–88,90]. Vėlesnių tyrimų metu buvo išaiškinta, jog delecija sukėlė sukcinato dehidrogenazės (Δsdh) stygių S. aureus ląstelėse. Tai lėmė, jog buvo pastebėtas sukcininės rūgšties padidėjimas bei daug smulkių taškelių (ang. pinpoints) mutavusių štamų augimo. TCA ciklo sutrikdymas nulėmė, šių mikroorganizmų taškelių išryškėjimą, nes S. aureus ląstelės nebesugebėjo suformuoti biologinės plėvelės ir gaminti energijos atsargas aerobiniu būdu [87]. Taip pat, kaip ir ankstesnių tyrimų metu (pavyzdžiui, S. aureus RN6390 kultūrose su akonitazės geno delecija) buvo nustatyta, jog sumažėjo aminorūgščių suvartojimas Δsdh mutantų padermėse, kaip atsakas į sutrikdytą TCA ciklo veiklą [30,87,90].

2011 metų tyrimo metu buvo įrodyta pentozės fosfato biocheminio kelio svarba S. aureus RN4220 ląstelėms ir įtaka virulentiškumui bei bioplevelės formavimuisi [30,91]. Y. Zhu iš Nebraskos Universiteto su grupe mokslininkų išjungė ribozės atsako reguliatoriaus geną (transkripcijos faktorius, priskiriamas RpiR klasei). Tai lėmė pentozofosfatinio kelio baltymų genų ekspresijos pokyčius. Galiausiai buvo nustatyta, jog sukeltas genetinis stresas pakeitė centrinio fermento gliukozės–6–fosfato dehidrogenazės aktyvumą, o vėliau ir bioplevelės formavimą bei hemolizinį aktyvumą [91].

6.4.2 Egzogeninių medžiagų atsakas

Tęsiant mintį apie S. aureus metabolomo ir besikeičiančios aplinkos ryšio supratimą, kitas svarbus veiksnys yra egzogeninės medžiagos. Aplinkoje nuolatos yra įvairių medžiagų, pradedant elementariomis gyvybinėmis molekulėmis – deguonimi, vandeniu, mineralų klasteriais bei baigiant sudėtingais organiniais bei biologiniais junginiais. Seniai žinoma biologinė aksioma, jog visos gyvybės formos konkuruoja dėl aplinkoje esančių gyvybiškai komfortiškų nišų. Vis dėlto mikroorganizmų lygmeniu ši konkurencija skatina prokariotus greitai adaptuotis prie esamos aplinkos. Tai lemia bakterijų genomo – proteomo – metabolomo pokyčius. Ne išimtis yra ir S. aureus rūšies bakterijos, kurios reaguodamos į cheminę aplinkos kaita greitai prisitaiko. Mokslininkų grupės simuliuodamos pakitusias išgyvenimo sąlygas gali tirti tiesiogiai S. aureus bendruosius biologinius mechanizmus ir suprasti, kaip ši gyvybės forma reaguoja į sukeltus stresorius [1–3,5,30,44,63,65– 73,92–96].

Vienas iš dažniausiai naudojamų stresinių faktorių mikroorganizmų metabolominiuose tyrimuose yra maistinių medžiagų apribojimas. In vitro studijų metu svarbiausias kintamasis objektas yra kultivavimo terpė, nes cheminė kompozicija gali turėti įtakos endometabolomo sudėčiai [45,59,78]. Pavyzdžiui, M. Liebeke atliktas tyrimas atskleidė, kad S. aureus padermės 8325 metabolomo sudėtis priklauso nuo mitybinės terpės. Pastebėta, kad lyginant dvi terpes tarpusavyje S. aureus metabolomo sudėtis skyrėsi. Naudotas lizogeninis buljonas ir chemiškai apibūdinta augimo terpė, kurioje nebuvo nukleotidų. Pirmojoje terpėje kultivuotų štamų metabolinės analizės rezultatas – didesnės guanozino trifosfato ir trehalozės–6–fosfato ląstelinės koncentracijos [78].

Taip pat nustatyta, kad mikroorganizmai badavimo laikotarpiu iš eksponentinės augimo fazės pereina į stacionarią augimo fazę. Metabolominės ir proteominės analizės metu buvo nustatyta, kad šis pokytis vyksta dažniausiai dėl apribotų gliukozės atsargų [30,59]. Pagal gautus duomenis, akivaizdu, jog S. aureus subsp.

aureus COL (MRSA), kultivuotos chemiškai apibūdintoje augimo terpėje, metabolitų ir baltymų pokyčiai vyko

per apibrėžta laiko momentą. DC–MS, SC–MS ir 1_{H BMR „metabolinių pėdsakų“ (ang. metabolic} footprinting) analizės metodais buvo identifikuoti 94 S. aureus metabolitai. Metabolominiai rezultatai buvo

palyginti su proteominės analizės duomenimis. Pastarosios metu buvo atrinkta daugiau nei 500 baltymų 2D– gelelektroforezės metodu. Įdomu tai, kad proteominiai ir metabolominiai rezultatai puikiai koreliavo, kurie apsprendžia centrinius metabolinius kelius. Kita vertus, ne visus pasirinktus biocheminius kelius pavyko statistiškai patvirtinti. Proteominės analizės metu nustatyti baltymų pokyčiai buvo nuo 2 iki 10 kartų, o

metabolominės – daugiau nei 100 kartų lyginant eksponentinę ir stacionarią augimo fazes. Šis publikuotas tyrimas buvo pats pirmasis, kada visapusiškai kiekybiškai ištirtas S. aureus subsp. aureus COL (MRSA) metabolomas, jo sudėtis [59].

6.5 Potencialūs biologiniai S. aureus taikiniai.

Svarbus S. aureus virulentiškumo faktorius yra auksinių karotinoidų grupės pigmentas stafiloksantinas (STXa) [97]. Šis glikolipidas turi daug nesočiųjų dvigubų cheminių jungčių, todėl gali reaguoti su neutrofilų ir makrofagų pagamintomis reaktyviomis deguonies formomis (ROS). STXa _atlikdamas

antioksidanto funkciją apsaugo S. aureus nuo įgimto žmogaus imuniteto. Pastarasis virulentiškumo faktorius tyrimų metu buvo parodytas, kaip ypatingai svarbus užkrečiamumo komponentas. Nustatyta, kad bakterijos,

1 pav. Stafiloksantino biosintezės kelias:

Schemoje pateiktas biosintezės kelias, per kurį S. aureus padermėse sintezuojamas stafiloksantinas. Biosintezė panaši į eukariotų ir grybų sterolių sintezę, skiriasi tik preskvaleno

kurios stokoja šio karotinoido, nesugeba sukelti infekcijos bei yra lengvai susekamos ir numarinamos neutrofilų. Šios studijos buvo atliktos su sisteminiais infekciniais modeliais ir pelių oda [98,99].

Nustatytas stafiloksantino sintezės kelias leidžia ieškoti naujų biologinių taikinių prieš stafilokokines infekcijas. S. aureus šį faktorių sintezuoja pirmiausiai kondensuojant dvejas farnezilo difosfato (FPP) molekules iki skvaleno prekursoriaus (cholesterolio biosintezės kelias) preskvaleno difosfato. Šį procesą katalizuoja fermentas dehidroskvaleno sintazė (dar literatūroje vartojamas diapofitoeno sintazė arba CrtM). Stafiloksantino sintezė yra panaši į žinduolių ląstelėse vykstančią cholesterolio biosintezę, todėl studijų metu buvo iškelta hipotezė, jog žinomi skvaleno sintazės slopikliai (pastarieji kuriami ir vystomi cholesterolio kiekio mažinimui) gali taip pat paveikti ir CrtM [99,100]. Kiti potencialūs taikiniai pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė. Potencialūs biologiniai S. aureus taikiniai, per kuriuos biologiškai aktyvios medžiagos slopina metabolizmą

ID Stafilokoko baltymas Metabolinis kelias Taikinys Organizmas

P63892 ddl; D-alanil-alanino sintetazė

A

D-alanino metabolizmas D-alanil-D-alanino ligazė Staphylococcus aureus

P99075 fbaA; fruktozės - bisfosfato

aldolazė

Glikolizė/gliukoneogenezė Triozefosfato izomerazė Homo sapiens

Q2G2M0 4 - oksolokrotonato tautomerazė (numanomas)

Dioksino skilimas 4-oksolokrotonato tautomerazė Pseudomonas putida

Q2G069 murB, UDP-N -

acetilenolpirvoilgliukozamino reduktazė

Nukleozidų metabolizmas UDP-alaktopiranozes mutazė, Escherichia coli K12

Q2FZP6 murE;

UDP-N- acetilmuramoilalanil-D-gliutamato–L- lizino ligazė

Nukleozidų metabolizmas UDP-N-lacetilmuramilalanil-D- glutamato–2,6-diaminopimelato ligazė ;

Escherichia coli K12

Q7A3U0 narG, respiracinė nitratų reduktazės α-grandinė

Dvi komponentė sistema Respiracinė nitratų reduktazės 1 alfa grandinės

Escherichia coli K12

P66706 rpoA,

DNR-tiesioginis

RNR polimerazė α-grandinė

Purino metabolizmas DNR-tiesioginis RNR polimerazės α-grandinė DNR-tiesioginis RNR polimerazės β-grandinė DNR-tiesioginis RNR polimerazės β-subvienetas Escherichia coli K12

ID Stafilokoko baltymas Metabolinis kelias Taikinys Organizmas P63638 murI; glutamato rakemazė D-Glutamino ir D-glutamato

metabolizmas

Kinureninazė Pseudomonas

fluorescens

P63982 polC, DNA polimerazės III,

α-grandinės polC-tipas

DNR replikacija Timidilato kinazė Mycobacterium

tuberculosis

P64108 fabZ;

(3R)-hidroksimiristil-ACP dehidratazė

Riebiųjų rūgščių biosintezė (3R)-hidroksimiristoil-[acil-baltymo-nešėjo] dehidratazė

Helicobacter pylori

Q2G029 2,3-Bisfosfoglicerato-independento fosfoglicerato mutazė

Glicino, serino ir treonino metabolizmas

2-Dehidro-3-deoksifosfoktonato aldolazė

Aquifex aeolicus

Q2G0Q7 Dihidropteroato sintazė Folato biosintezė Dihidropteroato sintazė Bacillus anthracis

Q2G0Q5

2-Amino-4-hidroksi-6-hidroksimetildi- hidropteridino pirofosfokinazė

Folato biosintezė

2-Amino-4-hidroksi-6-hidroksimetildihidropteridino pirofosfokinazė

Haemophilus influenzae

Q2G0Q6 Dihidroneopterino aldolazė Folato biosintezė Dihidroneopterino aldolazė Staphylococcus aureus

P67719 ureA; ureazės γ-subvienetas Purino metabolizmas Timidilato sintazė Escherichia coli K12

7. TYRIMO METODIKA IR METODAI

7.1 Junginių sintezė

7.1.1 Naudotos medžiagos ir tirpikliai

4-chlorbenzaldehidas (97 proc.), 4-fluorbenzaldehidas (98 proc.), 4-hidroksibenzaldehidas (98 proc.), 4-nitrobenzaldehidas (98 proc.), benzilaminas (99 proc.), aktyvuota anglis, kalio acetatas (≥99 proc.), bromacto rūgšties metilo esteris (97 proc.), alilizotiocianatas (95 proc.) amonio acetatas (≥98 proc.), hidrazino hidratas (78–82 proc.), jodmetanas (≥99 proc.), monochloracto rūgštis (≥99 proc.), 2-propanolis (99,5 proc.), acetonitrilas (≥99,9 proc.), acetonas (≥99,8 proc.), benzenas, butanolis (99,8 proc.), dioksanas (99,8 proc.), DMF, dimetilsulfoksidas (≥99,5 proc.) dimetilsulfoksidas-d6, anglies tetrachloridas (≥99,5 proc.), dietilo eteris (≥99 proc.), heksanas (95 proc.), ledinė acto rūgštis (≥99,7 proc.), metanolis (≥99.9 proc.), n-butanolis (≥99,9 proc.), n-propanolis (99,7 proc.) įsigyti iš „Sigma-Aldrich GmbH“ (Buchs, Šveicarija), etanolis (96,3 proc.) iš „Stumbras“ (Kaunas, Lietuva). Visi naudoti tirpikliai yra ESC analitinio švarumo.

7.1.2 Junginių sintezės metodikos

Nauji imidazolin-4-ono junginiai gauti pakopinės sintezės metu. Pirmiausiai, 0,01 mol atitinkamos aminorūgšties (glicino) ir 0,011 mol amonio tiocianato acto rūgšties ir jos anhidrido aplinkoje yra gaunamas 1–acetil–2–tioksoimidazolin–4–ono (1) žiedas ciklokondensacijos būdu. Reakcija vykdoma refliuksinantis 1 valandą nuo spalvos pasikeitimo su grįžtamuoju šaldytuvu. Reakcijos mišinys yra vėsinamas kambario temperatūroje, koncentruojamas sumažinto atmosferos slėgio aplinkoje roto vakuuminiu būdu. Susidarę kristalai yra nufiltruojami, praplaunami iš vandens, chloroformo, eterio. Džiovinami 60o_{C temperatūroje}

džiovinimo spintoje. Gautas produktas yra perkristalinamas iš 1-propanolio.

Kitas etapas yra 1–acetil–2–tioksoimidazolin–4–ono (1) hidrolizė iki 2–tioksoimidazolin–4–ono (2). 0.01 mol (1) yra šildomas 10 % koncentracijos HCl tirpale santykiu 1:10. Reakcija vykdoma 1 valandą su grįžtamuoju šaldytuvu iki refliuksinimosi. Tirpalas yra atvėsinamas kambario temperatūroje, į jį pridedama aktyvintos anglies santykiu 1:3. Tada heterogeninis mišinys yra užkaitinamas iki virimo ir karštas filtruojamas.

Nufiltruoti kristalai praplaunami vandeniu, etanoliu, surenkami ir džiovinami 60o_{C. Gautas produktas}

perkristalinamas iš etanolio.

Trečias sintezės etapas yra atliekamas iš (2) sintezuoto junginio gaunant pakeistus 5–ariliden–2– tioksoimidazolin–4–ono (3) darinius. 0,01 mol (2) sumaišomas su 0,02 mol atitinkamu aromatiniu benzaldehidu 40 ml acto rūgšties. Taip pat į mišinį yra pridedama 0,001 mol amonio acetato ir reakcija vykdoma 90 minučių nuo refliuksinimosi pradžios. Reakcijos mišinys yra ataušinamas ir koncentruojamas sumažinto atmosferos slėgio aplinkoje roto vakuuminiu būdu. Susidarę kristalai yra nufiltruojami, praplaunami chloroformu ir eteriu bei džiovinami 60o_{C. Gautas (3) produktas Knovenagelio kondensacijos metodu}

perkristalinamas iš izopropanolio.

Toliau (3) junginių grupė yra modifikuojama antroje padėtyje su įvairiais organiniais halogenidais iki lengvai paliekančių grupių. 0.01 mol (3) su organiniu halogenidu 0.04 mol (CH3I) ir paruoštu 10 ml natrio

metilatu yra maišomas 30 minučių kambario temperatūroje iki kol susidaro puri geltona masė. Pastarieji yra nufiltruojami ir praplaunami chloroformu bei eteriu bei džiovinami 60o_{C. Gautas (4) produktas yra}

perkristalinamas iš etanolio arba acetonitrilo.

Paskutinė vykdoma reakcija yra nukleofilinė substitucija, kuomet yra pakeičiama lengvai paliekanti grupė atitinkamu aminu arba aminorūgštimi. 0.01 mol (4) su 0.04 mol amino/aminorūgšties ištirpinami etanolyje, pridedama 0.05 mol katalizatoriaus – kalio acetato. Reakcijos mišinys yra užkaitinamas iki refliuksinimosi, tada atvėsinamas. Toliau reakcija vykdoma 4–6 valandas ultragarso aplinkoje. Po reakcijos į

2 pav. Bendra sintezės reakcijų schema, modifikuojant junginius penktoje padėtyje:

Atliekama pakopinė cheminė sintezė – vykdomos ciklokondensacijos, hidrolizės ir Knovenagelio kondensacijos reakcijos. R1 žymi pakeistus arilideninius pakaitus.

mišinį pilama distiliuoto vandens iki kol išsėda kristalai. Jie yra nufiltruojami ir praplaunami acetonu ir eteriu. Kristalai džiovinami 60o_{C. Gautas (5) produktas yra perkristalinamas iš acetono.}

N-etil-2-{[(5Z)-5-(4-etilbenziliden)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]sulfanil}acetamidas (EK-1): Išeiga 84%, gelsvi kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd = 157-159 oC, λmax = 304 nm (UV), Rf = 0.52. Struktūrinė

tapatybė patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1754 (C = O), 1599 (N – H), 1754 (CONH), 1578 (CH

aromatinis); 1H BMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.83 (s, 1H, CH), 7.42 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH), 7.27 (d, J = 8.2

Hz, 2H, ArH), 3.41 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH2), 2.67 (q, J = 7.6 Hz, 2H, CH2), 1.84 – 1.69 (m, 2H, CH2), 1.52 –

1.40 (m, 2H,CH2), 1.23 (t, J = 7.6 Hz, 3H,CH3), 0.93 (t, J = 7.4 Hz, 3H,CH3); MS (ESI+): C16H19N3O2S, apsk.

[M+H]+ = 318.1270 Da, rasta [M+H]+ = 318.1267 Da.

{[(5Z)-5-(4-etilbenziliden)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]sulfanil}acetonitrilas (EK-2): Išeiga 78%, gelsvi kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd = 154-156 oC, λmax = 301 nm (UV), Rf = 0.71. Struktūrinė tapatybė

patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1794 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH), 1432 (CH aromatinis);

MS (ESI+): C14H13N3OS, apsk. [M+H]+ = 271.0774 Da, rasta [M+H]+ = 271.0764 Da.

(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)-2-tioksoimidazolidin-4-onas (EK-3): Išeiga 57%, gelsvi kristalai (krist. iš izopropanolio), Tlyd = 160-12 oC, λmax = 309 nm (UV), Rf = 0.39. Struktūrinė tapatybė patvirtinta FT-IR, MS:

υmax cm-1 (FT–IR) 1781 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH), 1605 (CH aromatinis);; MS (ESI+):

C12H12N2OS, apsk. [M+H]+ = 233.0743 Da, rasta [M+H]+ = 233.0741 Da.

metil-{[(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)- 4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]sulfanil}acetatas (EK-4): Išeiga 67%, gelsvi kristalai (krist. iš acetonitrilo), Tlyd = 138-140 oC, λmax = 324 nm (UV), Rf = 0.56. Struktūrinė

tapatybė patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1799 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH), 1605 (CH

aromatinis); 1H BMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.75 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.98 (s, 1H), 4.34 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 2.66 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.20 (t, J = 7.6 Hz, 3H); MS (ESI+): C15H16N2O3S, apsk.

[M+H]+ = 305.0954 Da, rasta [M+H]+ = 305.0951 Da.

(5Z)-5-[(4-etilfenil)metilidene]-2-(propilamino)-1,5-dihidro-4H-imidazol-4-onas (EK-5): Išeiga 89%, pilki kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd = 157-159 oC, λmax = 303 nm (UV), Rf = 0.52. Struktūrinė tapatybė

patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1800 (C = O), 1594 (N – H), 1724 (CONH), 1600 (CH aromatinis);

MS (ESI+_{): C}

15H19N3O, apsk. [M+H]+ = 258.1601 Da, rasta [M+H]+ = 258.1609 Da.

2-{[(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]sulfanil}acetamidas (EK-6): Išeiga 92%, gelsvi kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd = 147-150 oC, λmax = 326 nm (UV), Rf = 0.47. Struktūrinė tapatybė

patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1794 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH), 1605 (CH aromatinis); 1_{H BMR (400 MHz, CDCl}

3) δ 7.83 (s, 1H, CH), 7.42 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH), 7.27 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH),

3.41 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH2), 2.67 (q, J = 7.6 Hz, 2H, CH2), 1.84 – 1.69 (m, 2H, CH2), 1.52 – 1.40 (m, 2H,

CH2), 1.23 (t, J = 7.6 Hz, 3H,CH3), 0.93 (t, J = 7.4 Hz, 3H,CH3); MS (ESI+): C14H15N3O2S, apsk. [M+H]+ =

290.0958 Da, rasta [M+H]+ = 290.0966 Da.

{[(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]amino}acto rūgštis (EK-7): Išeiga 62%, baltai gelsvi kristalai (krist. iš acetono), Tlyd = 234-241oC, λmax = 312 nm (UV), Rf = 0.58. Struktūrinė tapatybė

patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1800 (C = O), 1594 (N – H), 1724 (CONH), 1600 (CH aromatinis);

1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.82 (s, 1H, OH karboksilinis), 7.91 (s, J = 7.8 Hz, 2H, CH ariliniai, NH), 7.21 (d, J = 7.8 Hz, 2H, CH ariliniai), 6.32 (s, J = 5.0 Hz, 1H, CH alkilinis), 4.06 (s, 2H, CH2 alkilinis), 2.59

(q, J = 7.6 Hz, 4H, CH2 alkilinis), 1.18 (q, J = 7.4 Hz, 6H, CH3 alkilinis).MS (ESI+): C14H15N3O3, apsk. [M+H]+

= 274.1186 Da, rasta [M+H]+ _{= 274.11 Da.}

{[(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]sulfanilo}acto rūgštis (EK-8): Išeiga 71%, geltoni kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd = 157-159 oC, λmax = 331 nm (UV), Rf = 0.53. Struktūrinė tapatybė

patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1768 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH), 1605 (CH aromatinis);

MS (ESI+): C14H14N2O3S, apsk. [M+H]+ = 291.0798 Da, rasta [M+H]+ = 291.0792 Da.

{[(5Z)-5-(4-fluorobenzilidene)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]sulfanilo}acetonitrilas (EK-9): Išeiga 81%, geltoni kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd = 177-181 oC, λmax = 322 nm (UV), Rf = 0.42. Struktūrinė tapatybė

patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1755 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH), 1605 (CH aromatinis); 1_{H BMR (400 MHz, CDCl}

3) δ 7.83 (s, 1H, CH), 7.42 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH), 7.27 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH),

3.41 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH2), 2.67 (q, J = 7.6 Hz, 2H, CH2), 1.84 – 1.69 (m, 2H, CH2), 1.52 – 1.40 (m, 2H,

CH2), 1.23 (t, J = 7.6 Hz, 3H,CH3), 0.93 (t, J = 7.4 Hz, 3H,CH3); MS (ESI+): C12H8FN3OS, apsk. [M+H]+ =

(5Z)-5-(4-etillbenzilidene)-2-(etilsulfanil)-1,5-dihidro-4H-imidazol-4-onas (EK-10): Išeiga 57%, gelsvi kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd = 175-177 oC, λmax = 334 nm (UV), Rf = 0.35. Struktūrinė tapatybė patvirtinta

FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1784 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH), 1432 (CH aromatinis); MS (ESI+):

C14H16N2OS, apsk. [M+H]+ = 261.1056 Da, rasta [M+H]+ = 261.1062 Da.

(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)-2-(prop-2-en-1-ilamino)-1,5-dihidro-4H-imidazol-4-onas (EK-11): Išeiga 15%, balti kristalai (krist. iš acetonitrilo), Tlyd = 164-167 oC, λmax = 289 nm (UV), Rf = 0.77. Struktūrinė tapatybė

patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1800 (C = O), 1594 (N – H), 1724 (CONH), 1600 (CH aromatinis);

MS (ESI+): C15H17N3O, apsk. [M+H]+ = 256.1444 Da, rasta [M+H]+ = 256.1448 Da.

(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)-2-[(2-hydroksietil)amino]-1,5-dihidro-4H-imidazol-4-onas (EK-12): Išeiga 81%, pilki kristalai (krist. iš metanolio), Tlyd = 191-193 oC, λmax = 309 nm (UV), Rf = 0.51. Struktūrinė tapatybė

patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1796 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH), 1605 (CH aromatinis);

MS (ESI+): C14H17N3O2, apsk. [M+H]+ = 260.1394 Da, rasta [M+H]+ = 260.1387 Da.

(5Z)-2-(etilamino)-5-(4-etilbenzilidene)-1,5-dihidro-4H-imidazol-4-onas (EK-13): Išeiga 85%, balsvai pilki kristalai (krist. iš propanolio), Tlyd = 198-199 oC, λmax = 302 nm (UV), Rf = 0.52. Struktūrinė tapatybė

patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1791 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH), 1432 (CH aromatinis);

MS (ESI+_{): C}

14H17N3O, apsk. [M+H]+ = 243.3043 Da, rasta [M+H]+ = 243.3051 Da.

2-{[(5Z)-5-(4-chlorobenzilidene)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]amino}-3-metilbutano rūgštis (EK-14): Išeiga 75%, balti kristalai (krist. iš acetono), Tlyd = 249-259 oC, λmax = 311 nm (UV), Rf = 0.42.

Struktūrinė tapatybė patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1794 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH),

1605 (CH aromatinis); 1H BMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.03 (s, 1H), 8.03 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 7.8

Hz, 2H), 6.96 (s, 1H), 4.06 (s, 2H), 3.81 (s, 3H), 2.69 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.26 (t, J = 7.6 Hz, 3H); MS (ESI+): C15H16ClN3O3, apsk. [M+H]+ = 322.0953 Da, rasta [M+H]+ = 322.0952 Da.

(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)-2-[(2H-tetrazol-5-il-metil)amino]-1,5-dihidro-4H-imidazol-4-onas (EK-15): Išeiga 90%, pilki kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd = 177-179 oC, λmax = 359 nm (UV), Rf = 0.75. Struktūrinė

tapatybė patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1800 (C = O), 1594 (N – H), 1724 (CONH), 1600 (CH

aromatinis); MS (ESI+_{): C}

14H15N7O, apsk. [M+H]+ = 298.1411 Da, rasta [M+H]+ = 298.142 Da.

1,3-diazaspiro[4.5]dekano-2,4-ditionas (EK-16): Išeiga 67%, rausvi kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd =

127-129 oC, λmax = 343 nm (UV), Rf = 0.47. Struktūrinė tapatybė patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1767

(C=O), 1574 (N–H), 1739 (CONH), 1404 (CH aromatinis); MS (ESI+): C8H12N2S2, apsk. [M+H]+ = 201.0515

Da, rasta [M+H]+ = 201.0511 Da.

6,10-difenil-2-tiokso-1,3-diazaspiro[4.5]dekano-4,8-dionas (EK-17): Išeiga 87%, geltoni kristalai (krist. iš izopropanolio), Tlyd = 174-176 oC, λmax = 304 nm (UV), Rf = 0.65. Struktūrinė tapatybė patvirtinta FT-IR, MS:

υmax cm-1 (FT–IR) 1794 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH), 1605 (CH aromatinis); MS (ESI+):

C20H18N2O2S, apsk. [M+H]+ = 351.1162 Da, rasta [M+H]+ = 351.1158 Da.

(5Z)-5-(4-fluorobenzilidene)-2-tioksoimidazolidin-4-onas (EK-18): Išeiga 80%, gelsvi kristalai (krist. iš izopropanolio), Tlyd = 110-112 oC, λmax = 311 nm (UV), Rf = 0.42. Struktūrinė tapatybė patvirtinta FT-IR, MS:

υmax cm-1 (FT–IR) 1794 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH), 1432 (CH aromatinis); MS (ESI+):

C10H7FN2OS, apsk. [M+H]+ = 223.0336 Da, rasta [M+H]+ = 223.0341 Da.

(5Z)-5-(4-nitrobenzilidene)-2-tioksoimidazolidin-4-onas (EK-19): Išeiga 81%, gelsvi kristalai (krist. iš acetono), Tlyd = 104-106 oC, λmax = 317 nm (UV), Rf = 0.8. Struktūrinė tapatybė patvirtinta FT-IR, MS: υmax

cm-1 (FT–IR) 1754 (C = O), 1599 (N – H), 1754 (CONH), 1578 (CH aromatinis); MS (ESI+): C10H7N3O3S,

apsk. [M+H]+ = 250.0281 Da, rasta [M+H]+ = 250.0288 Da.

2-{[(5Z)-5-(4-chlorobenzilidene)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]amino}-3-sulfanilpropano rūgštis (EK-20): Išeiga 78%, baltai gelsvi kristalai (krist. iš acetono), Tlyd = 242-251 oC, λmax = 292 nm (UV), Rf =

0.61. Struktūrinė tapatybė patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1794 (C = O), 1624 (N – H), 1724

(CONH), 1605 (CH aromatinis); 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.82 (s, 1H, OH), 7.91 (s, J = 7.8 Hz, 2H, CH, NH), 7.21 (d, J = 7.8 Hz, 2H, CH), 6.32 (s, J = 5.0 Hz, 1H, CH), 4.06 (s, 2H, CH2 alkilinis), 2.59 (q, J =

7.6 Hz, 4H, CH2), 1.18 (q, J = 7.4 Hz, 6H, CH3). MS (ESI+): C13H12ClN3O3S, apsk. [M+H]+ = 326.0361 Da,

S-[(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il] etanoetioatas (EK-21): Išeiga 55%, geltoni kristalai (krist. iš acetonitrilo), Tlyd = 151-154 oC, λmax = 344 nm (UV), Rf = 0.54. Struktūrinė tapatybė

patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1767 (C=O), 1574 (N – H), 1739 (CONH), 1404 (CH aromatinis);

MS (ESI+): C14H14N2O2S, apsk. [M+H]+ = 275.0849 Da, rasta [M+H]+ = 275.0846 Da.

7.1.3 Reakcijos sąlygų optimizavimas

Po atliktos Knovenagelio kondensacijos reakcijos į penktąją imidazolin-4-ono žiedo, yra pradedama modifikuoti antroji heterociklo padėtis. Nukleofilinės substitucijos reakcija vykdoma įvedant aminorūgštis per lengvai atskylančia metiltio funkcine grupe. Atitinkamai naudoti įvairūs katalizatoriai ir tirpikliai reakcijos sąlygų optimizavimui: TEA, DIEA, piridinas, amonio acetatas, natrio acetatas, kalio acetatas bei acetonas, acetonitrilas, metanolis, vanduo, NaOH. Visi reakcijos mišiniai buvo šildomi iki refliuksinimosi 48 valandoms arba reakcija vykdoma ultragarso aplinkoje 4 valandas.

7.2 Junginių analizės metodai

3 pav. Bendra sintezės reakcijų schema, modifikuojant junginius penktoje padėtyje:

Antroje padėtyje yra modifikuojama tiokso grupė, sudarant lengvai paliekančią metiltio grupę, kuri lengvai atskyla nukleofilinės substitucijos reakcijų metu su

Junginių reakcijos greičio monitoravimui ir pirminiam grynumo patikrinimui buvo pasitelkti plonasluoksnės chromatografijos, FT–IR spektroskopijos metodai bei nustatyta lydymosi temperatūra. Junginių struktūrinė ir priemaišų nustatymo analizei buvo taikytos FT–IR spektroskopijos, UV spektrofotometrijos bei SC–MS/MS spektrometrijos metodai.

7.2.1 FT–IR spektroskopija

Sintetintų EK junginių IR spektrai užrašyti PerkinElmer UATR Two spektrometru. Atliekant FT–IR spektro analizę, naudojamas dydis bangos skaičius n (cm–1_{), kuris proporcingas bangos dažniui. FT–IR}

spektroskope interferavusi IR spinduliuotė nukreipiama tik į bandinį, todėl EK medžiagos milteliai užnešami plonu sluoksniu ant prietaiso deimanto ir užrašomas jo FT–IR spektras 450–4000cm-1 _{bangos skaičiaus}

intervale. Stebimos smailės gaunamos registruojant visos molekulės vibracinius pokyčius, todėl nustatomos EK medžiagos funkcinės grupės bei pirštų antspaudų regionas palyginamas su pradinių sintezės reagentų spektrais. Tai atliekama 450–1300 cm-1 _{bangos skaičiaus regione. Be to, po spektro užregistravimo yra}

atliekamos gamintojų rekomenduojamos smailių ATR korekcijos.

7.2.2 Plonasluoksnė chromatografija

Atliekant EK junginių sintezę, pirminiam tapatumo nustatymui naudojamas paprastas, greitas ir labai universalus plataus spektro medžiagų tyrimas – plonasluoksnė chromatografija. PLC naudojamas silicio gelio plokštelė ant kurio starto linijos užlašinami su mikrokapiliarais keli μl tiriamojo EK junginio ir sintezės metu naudojami reagentai. Kiekvieno tiriamojo lašo dėmė išdžiovinama ir tik tada dedamas sekantis lašas. Chramatografinė kamera užpildoma judančiąja fazė, kuri priklauso nuo kiekvieno EK junginio savybių. Eksperimentiškai parinkus tinkamą judančią fazę, tiriamojo junginio komponentai per sorbento sluoksnį juda skirtingu greičiu. Pasibaigus tirpiklio keliui – plokštelė išimama iš kameros ir džiovinama. Tiriamosios zonos identifikuojamos stebint apšvietus UV spinduliuote. Junginys nustatomas apskaičiuojant Rf vertes ir lyginant

jas su standartais.

Rf apskaičiuojama pagal šią formulę:

R

=

𝒂 𝒉

a – nueitas tiriamosios medžiagos kelias; h – tirpiklių sistemos nueitas kelias.

7.2.3 UV spektrofotometrija

EK tiriamųjų junginių spektrai buvo užrašyti naudojantis Agilent Technologies Cary 8454 UV-VIS. Atsveriamas 1mg EK junginys ir ištirpinamas 1 ml metanolio Gautas koncentruotas tirpalas, jis papildomai praskiedžiamas: paimamas 10 µl tirpalo ir skiedžiamas 1ml metanolio, gaunamas 10 µg/ml EK tirpalas. Metanolis pilamas į kiuvetę, dedamas į EK spektrofotometrą ir užrašomas jo sugerties spektras, kuris yra atimamas. Tada tiriamas EK junginys - 10 µg/ml tirpalas matuojamas tuo pačiu principu – užrašomas EK junginio UV sugerties spektras, matuojant UV absorbciją esant 200-600 nm bangos ilgiams.

7.2.4 SC – tandeminės MS/MS spektrometrija

Susintetinti EK junginiai buvo analizuojami naudojant Agilent Technologies 6530 Accurate-Mass Q-TOF SC/MS prietaisą (parametrai nurodyti 1, 2 ir 3 lentelėse). Mėginiai buvo paruošiami pagal tą pačią metodiką, kaip ir atliekant UV spektrofotometrijos analizę. Pagaminti EK mėginių tirpalai buvo filtruojami ir įleidžiami į efektyvųjį skysčių chromatografą Agilent Technologies Infinity 1260 chromatografinei ir masių spektrometrinei analizei. Palyginamasis masių spektras pagal elementinę izotopų distribuciją apskaičiuotas ir sudarytas su Agilent MassHunter Workstation Data Analysis Core moduliu.

2 lentelė. Skysčių chromatografijos junginių išskirstymo parametrai metabolominio pokyčio tyrimo įvertinimui.

Parametrai Agilent 1260 Infinity SC sistema

Chromatografinė kolonėlė

Agilent Zorbax Rapid Resolution High Definition (RRHD) Eclipse Plus C18 2.1 × 100 mm, 1.8-µm,

(p/n 959757-902)

Kolonėlės temperatūra 40o_{C junginių grynumo tyrimams}

Injekavimo tūris 10 µL junginių grynumo tyrimui su Agilent 6530 Q–TOF Injekavimo greitis 200 µL/min