LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
LINAS REMEIKIS
Naujų 3,5-pakeistų
3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono darinių su cikloheksanono ir
ciklopentanono pakaitais sintezė ir antibakterinio
ir priešgrybelinio aktyvumo tyrimas
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Prof. habil. dr. Eduardas Tarasevičius Konsltantas: Prof. habil. dr. Alvydas Pavilonis
KAUNAS, 2013
Turinys
Santrumpos...3 Santrauka...4 SUMMARY………...………...…..5 Įvadas...7 1. Tyrimų apžvalga...11 2. Eksperimentinė dalis...202.1. 3-amino-4-tiazolidinono darinių sintezė ir indentifikavimas...20 2.1.1. 3-pakeistų 3-amino-4-tiazolidinonodarinių sintezė...22 2.1.2. 5-pakeistų-3-(cikloheksilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onų sintezė...24 2.1.3. 5-pakeistų-3-(ciklopentilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onų sintezė...26
2.2.3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono darinių priešmikrobinio aktyvumo įvertinimas...28
2.2.1. N-aminorodanino darinių prognozė naudojant PASSonline metodiką...28
2.2.2. 3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono darinių priešmikrobinis tyrimas in vitro metodu...28
3. Rezultatų aptarimas... 33
3.1. 3-aminorodanino darinių sintezė...33
3.2.Susintezuotų 3-amino rodanino darinių priešmikrobinio aktyvumo nustatymas...39
3.3. Susintetintų junginių aktyvumo įvertinimas...46
Išvados... 53
Literatūros sąrašas... 54
SANTRUMPOS
DMSO – dimetilsulfoksidas
MSK – mažiausia slopinančioji koncentracija PSO – Pasaulinė Sveikatos Organizacija ESC – efektyvioji skysčių chromatografija NF – nitrofurantoinas
3-AR – 3-amino rodaninas
PC – plonasluoksnė chromatografija ES – Europos sąjunga
TFA – trifluoracto rūgštis
S. aureus – Staphylococcus aureus E. coli – Escherichia coli
B. subtilis – Bacillus subtilis
K. pneumoniae – Klebsiella pneumoniae B. cereus – Bacillus cereus
P. aeruginosa – Pseudomonas aeruginosa P. mirabilis – Proteus mirabilis
Santrauka
Naujų 3,5-pakeistų 3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono darinių su cikloheksanono ir ciklopentanono pakaitais sintezė ir antibaktrinio ir priešgrybelinio aktyvumo tyrimas. Lino Remeikio magistro baigiamasis darbas. Mokslinis vadovas: prof. habil. dr. Eduardas Tarasevičius, konsultantas: prof. habil. dr. Alvydas Pavilonis; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas.
Darbo tikslas - susintetinti naujus antibakterinius ir priešgrybelinius 3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono darinius su pakaitais, esančiais 3 ir 5 padėtyse ir nustatyti N-3 padėtyje esančių pakaitų įtaką junginių priešmikrobiniam aktyvumui.
Tyrimo metodai – junginių priešmikrobinis aktyvumas buvo prognozuojamas naudojant PASSonline programą. Antimikrobinis aktyvumas buvo tiriamas in vitro būdu dvigubo serijinio praskiedimo būdu, naudojant standų Miulerio – Hintono agarą.
Tyrimo rezultatai – Atlikus prognozes naudojant PASSonline programą, gauti rezultatai nerodė didelio antibakterinio ar priešgrybelinio aktyvumo. Atlikus tyrimus in
vitro, pastebėta, jog aktyviausi junginiai N-3 padėtyje turi alifatinius ciklinius ketonus
LRT-1; LRT-21 ar C-5 nitrofuraldehido radikalą LRT-3; LRT-23. Įvedus kitus elektronų donorinius pakaitus į penktą padėtį, kai N-3 blokuota, aktyvumas labai sumažėjo. Aktyviausi junginiai savo sudėtyje turi N-3 blokuotą padėtį alifatiniais cikliniais ketonais ir C-5 įvestą nitrofuraldehidą – LRT-3 ir LRT-23. Didelis aktyvumas yra prieš S.aureus,
B.subtilis, K.pneumoniae, B.cereus, E.faecalis, C.albicans, kur MSK svyruoja ribose
1,5625 – 6,25 μg/ml.
Išvados – atlikus tyrimus in vitro, nustatyta, jog aktyviausi junginiai: LRT-3 ir LRT-23, savo sudėtyje turi 5-nitrofuraldehidą ir ciklinį alifatinį ketoną N-3 padėtyje. Taip pat nustatyta, jog įvedus atitinkamus ciklus į N-3, o C-5 palikus neblokuotą, aktyvumas padidėja.
SUMMARY
Synthesis of new 3,5-substituted 3-amino-2-thioxo-4-thiazolidinone derivatives with cyclohexanone and cyclopentanone substitutes and evaluation of antimicrobial activity. L. Remeikis Master thesis. Scientific supervisor Prof., Habil. Dr. Eduardas Tarasevičius, prof. habil. dr. Alvydas Pavilonis; Lithuania University of Health Sciece.
The Aim of Research – to synthesise new 3-amino-2-thioxo-4-thiazolidinone derivatives and evaluate impact of aliphatic cyclic ketone substitutes at N-3 position for antimicrobial activity.
Methods – Activity prognosis of new compounds was evaluated using
PASSonline program. Antimicrobial activity was testes in vitro, using double serial
diliuotn method using Miuler-Hinton agar.
Results. Prognosis with PASSonline showed weak activity againt bacteria and fungi. The results of tests in vitro showed that compound LRT-1 and LRT-12 with aliphatic cyclic ketones at N – 3 position characterized medium activity and compounds with 5-nitrofuraldehyde radical at C-5 position (with N-3 position blocked) LRT-3 and LRT-23 showed high activity against S.aureus, B.subtilis, K.pneumoniae, B.cereus,
E.faecalis, C.albicans (MSK 1,5625 – 6,25 μg/ml). Other electrone donating substutes at
C-5 position (with N-3 blocked) show very weak activity.
Conclusions – tests in vitro showed that the most active compounds: LRT-3 and LRT-23 had 5-nitrofuraldehyde fragment in C-5 position and alyphatic cyclic ketone in N-3 position. Test result also showed that cyclic radicals in N-3 position, while C-5 is free, adds more activity.
Padėka
Nuoširdžiai dėkoju prof. habil. dr. Eduardui Tarasevičiui, prof. habil. dr. A. Paviloniui, recenzentui doc. dr. V. Brusokui, vaistų chemijos katedros vedėjui prof. H. Rodovičiui, doc. V. Petrikaitei.
Įvadas
Darbo aktualumas
. Per pastaruosius 70 metų antibiotikai buvo kritinis ginklas kovai prieš infekcines ligas, sukeltas įvairių bakterijų. Pirmasis vaistas – antibiotikas – atsirado XX a. pradžioje. Nuo tada prasidėjo antibiotkų era. Išsivysčiusiose šalyse kovai su bakterijomis ir jų sukeltomis infekcijomis yra pasitelkiami antibiotikai, tačiau nuolatinis jų vartojimas paverčia juo nebeveiksmingai, nes bakterijos įgyja rezistentiškumą. Šiuo metu didžiausią susirūpinimą kelia tai, jog dauguma bakterijų tampa rezistentiškos visiems prieinamiems antibiotikams. Šių bakterijų sukeliamos ligos tampa rimta problema. Bakterijų rezistentiškumas kelia problemas ir susirūpinimą ne tik Amerikoje ir Europoje, bet ir visame pasaulyje. Antibiotikams atsparių bakterijų sukeltų infekcijų skaičius kelia nerimą ne tik ES, bet ir visam pasauliui [2,3]. Nepaisant to antibiotikams atsparios bakterijos sukelia daug visuomės sveikatos problemų. Šios infekcijos sukelia kančias, negalavimus ir mirtį, o tai priveda prie didelių finansinių išteklių, kuriuos reikia skirti tiek sveikatos, tiek socialiniams skyriams [2,3,4]. Žaizdų infekcijos, gonorėja, tuberkuliozė, pneumonia, sepsis ir kitos infekcijos tampa vis sunkiau išgydomos su dabar rinkoje esančiais antibiotikis. Pagal 2009 – 2010 metų duomenis, didžiausias MRSA paplitimas yra Vakarų ir Pietų Europoje, kur paplitimo dažnis didesnis nei 50 %. 2011 metų duomenimis K. pneumoniae tampa vis pavojingesne. Yra duomenų, jog K.pneumoniae gana atspari trečios kartos cefalosporinams, fluorchinolonams ir
aminoglikozidmas, taipogi pagal 2011 metų duomenis – K. pneumoniae rodo atsparumą paskutinės eilės antibiotikams, tokiems kaip karbapenemams. Vienos iš labiausiai atsparių infekcijų sukėlėjų yra Gramneigiamos Acinetobackter ir tam tikros Klebsiella padermės ir Pseudomonas rūšys. Rezistentiškumo protrūkis pastebėtas ir E. coli. Viena iš problemų rūšių yra ta, jog bakterijos, kurios sukelia infekcijas, yra gana lanksčios ir turi kelis kelius antibiotikų ir kitų antimikrobinių vaistų atsparumui įgyti [4,5,6,7,9,10]. Šiuo metu apie 70 % visų bakterijų, kurios yra patogeniškos ir sukelia infekcijas ligoninėse, yra atsparios bent vienam vaistui, kuris yra naudojamas [2,3]. Didelį nerimą kelia padidėjęs bakterijų – stafilokokų ir pneumokokų (S. pneumoniae) atsparumas. Neseniai atlikais tyrimais nustatyta, jog 25 % bakterinės pneumonijos atvejų buvo rezistentiški
penicilinui. Taigi, vis didėjančiam patogeninių bakterijų atsparumui antibiotikams ir kitiems priešmikrobiniams vaistams, vis didesnis dėmesys skiriamas nuolatiniai naujų vaistų sintezei. PSO duomenimis šiuo metu rinkoje esantys vaistai praranda savo efektyvumą, o naujų antimikrobinių vaistų plėtojimas yra atmetamas [9,10,11].
Per pastaruosius du dešimtmečius invazinės grybelinės infekcijos tapo vis svarbesnės vien dėl to, jog didėja rizika populiacijoje jomis užsikrėsti. Ši populiacija apima užsikrėtusius ŽIV infekcija, taip pat tie, kuriems buvo atlikta organų ar kamieninių ląstelių transplantacija, pacientai su piktybiniais navikais, nudegimais. Be to, didesnį susirūpinimą kelią padidėjusios grybelinės infekcijos. Paskaičuota, jog grybelinėmis infekcijomis suserga virš milijardo žmonių kiekvienais metais ir 2011 metų prognozėmis šis dažnis vis didės. Grybelinės infekcijos gali apimti bet kurią kūno dalį, kaip antai odą, nagus, kvėpavimo takus, urogenitalinus takus, virškinimo traktą, arba infekcijos gali būti sisteminės. Kiekvienas iš mūsų gali susirgti grybelinėmis infekcijomis, tačiau didesnę riziką turi senyvo amžiaus žmonės, sunkiai sergantys, ir žmonės su nusilpusiu imunitetu dėl tokių ligų kaip ŽIV/AIDS ar vartojantys imunosupresantus [2,3,8]. Nepaisant to, yra kelios grybelių rūšys, kurios yra patogeniškos žmogui – Candida (ypač C. albicans) yra organizmas, kuris sukelia daugiausia infekcinių susirgimų. Padidėjęs antibiotikų ir imunosupresantų, tokių kaip kortikosteroidai, vartojimas yra pagrindiniai faktoriai, prisidedantys prie didesnio grybelinių infekcijų susirgimo dažnio. Grybelinės infekcijos gali varijuoti nuo sunkios iki mirtinos. Daugėjant grybelinių infekcijų, atitinkamai didėja priešgrybelinių vaistų vartojimas. Staigus sergančiųjų grybelinėmis infekcijomis pacientų šuolis rodo, jog grybeliai tampa atsparūs antibiotikams ir naujų priešgrybelinių vaistų kūrimas atsilieka nuo jų poreikio. Palyginti nedidelis priešgrybelinių preparatų pasirinkimas ar jau esančių vaistų neveiksmingumas, šių preparatų toksiškumas, ribotas veikimo spektras, polinkis sukelti atsparių padermių vystymąsi rodo naujų, veiksmingų vaistų, kuriais būtų galima gydyti grybelines infekcijas, poreikį [8,16].
Dėl visų paminėtų priežasčių vis didesnis dėmesys yra skiriamas naujų priešmikrobinių ir priešgrybelinių vaistų kūrimui.
Heterociklai yra neatskiriama gyvybės proceso dalis. Gyvybiškai svarbus susidomėjimas heterociklais farmacijoje dažnai susijęs su jų reikšme. Daugiau nei 90% naujų vaistų , savo sudėtyje turi heterociklą, kuris turi sąsają tarp chemijos ir biologijos,
todėl atsiranda naujos vaistų įžvalgos, atradimai ir taikymas. Heterocikliniai junginiai pasižymi gana dideliu biologiniu aktyvumu, tokiu kaip antibiotiniu, priešgrybelinu, uždegiminiu, antivirusiniu, priešvėžiniu, prieštraukuliniu, antihelmintiniu, antihistamininiu. Tarp beveik 20 milijonų cheminių junginių daugiau nei du trečdaliai yra pilnai ar dalinai aromatiniai ir apie pusę šių junginių yra heterociklai. Tarp visų šių junginių daugiausiai dėmesio skiriama turintiems sieros ir azoto atomus savo sudėtyje [14].
Tiazolai rodo platų biologinį aktyvumą ir randami daugelyje stipriai veikiančiose biologiškai aktyviose molekulėse. Iki šiol įvairios tiazolų modifikacijos įrodė padidėjusi aktyvumą ir mažesnį toksiškumą. Per pastaruosius metus buvo pastebėtas įdomus biologinis aktyvumas susietas su tiazolo dariniais. Pastaruoju metu buvo pastebėtas tiazolų taikymas vaistų kūrime, kurie skirti gydyti alergijas, hipertenziją, uždegimą, šizofreniją, bakterines infekcijas, ŽIV infekcijas, veikia kaip hipnotikai ir neseniai pastebėta, jog dariniai su tiazolais naudojami kaip fibrinogeno receptorių antagonistai su antitrombiniu aktyvumu ir kaip nauji bakterijų DNR girazės B inhibitoriai. Nauji 4 – tiazolidinono dariniai tiriami kaip potencialūs priešmikrobiniai, priešvirusiniai ir kraujagyslių sistemą veikiantys, ir priešvėžiniai vaistai [13,14,15,16,18].
Taigi nuo antibiotikų eros pradžios praėjo nemažai laiko ir jau galime pastebėti, jog nemažai bakterijų ar grybelių padermių tampa rezistentiškos jau rinkoje esantiems vaistams, todėl didelis dėmesys skiriamas naujų vaistų paieškai ir sintezei. Todėl buvo vėl atkreiptas dėmesys į tiazolo darinius, nes šie pasižymi įvairiu biologiniu aktyvumu.
Darbo tikslas
– susintetinti naujus antibakterinius ir priešgrybelinius 3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono darinius su pakaitais, esančiais 3 ir 5 padėtyse ir nustatyti N-3 padėtyje esančių pakaitų įtaką junginių priešmikrobiniam aktyvumui.Tyrimo problema – didėjantis mikrobų atsparumas vaistams, mažėjantis vaistų efektyvumas, naujų vaistų paieška.
Tyrimo metodas – in vitro tyrimas
Uždaviniai:
1. Literatūros ir tyrimų apžvalga;
2. Susintetinti 3-pakeistus 3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono darinius;
3. Susintetinti 5-pakeistus-3-(cikloheksilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onus ir 5-pakeistus-3-(ciklopentilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-5-pakeistus-3-(cikloheksilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onus; 4. Įvertinti 3- ir 5- pakeistų 3-amino-2-tiokoso-4-tiazolidinono darinių antibakterinį
ir priešgrybelinį aktyvumą:
Panaudojant PASSonline sistemą;
Serijinio praskiedimo skystosiose terpėse in vitro metodas.
5. Nustatyti ir palyginti gautų naujų 3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono darinių antibakterinio ir priešgrybelinio aktyvimo ryšį su chemine struktūra pagal gautus eksperimentinius duomenis.
1. Tyrimų apžvalga
Mirtingumas, sukeltas infekcinių ligų, yra 5-oje vietoje viso pasaulio mastu. Kvėpavimo takų infekcijos pirmauja pagal sukeltas mirtis: apie 4 milijonus mirčių per metus. Pastaruoju metu didelį susirūpinimą kelia ir sparčiai didėjantis mikrobų atsparumas įvairiems antibiotikams ir kitiems antimikrobiniams vaistams ir tai sukelia daug klausimų ir problemų ypač tose pasaulio vietose, kur antros ir trečios eilės antibiotikai, kurie dar veiksmingi gydyti infekcijas, neprieinami. Nepaisant naujų antibiotikų, veiksmingų prieš rezistentiškas bakterijų padermes poreikio, tyrimai šioje srityje mažėja. Naujos infekcinės ligos ir nuoalant didėjantis mikrobų rezistentiškumas įvairiems rinkoje esantiems vaistams tampa vis didesne problema ir rimtu įšukiu [2,3]. Dėl to yra didelė paklausa naujiems vaistams su skirtinga ir unikalia struktūra, ir nauju veikimo mechanizmu, kuris skirtųsi nuo dabartinių vaistų. Bakterijų rezitentiškumas gali būti dviejų tipų: genotipiškas (bakterija turi tam tikrą rezistentiškumo elementą) ir fenotipiškas (bakterija gali išgyventi ir augti laboratorijoje virš tam tikro kiekio antibiotiko) ar kliniškas (bakterija gali daugintis žmoguje esant tam tikroms vaisto koncentracijoms terapijos metu). Vaistai, naudojami infekcijoms gydyti, turėtų būti aktyvūs prieš daugelį patogenų, kurie sukelia infekcijas. Nepaisant infekciją sukeliančio patogeno sunaikinimo, antibiotikų vartojimas duotų pranašumą bakterijai, kuri natūraliai gali atlaikyti pasirinktą antibiotiką [5,7,9,10].
St. pneumoniae yra vienas svarbiausių infekcijos sukelėjų, kuris sukelia apatinių
kvėpavimo takų infekcijas (tiek suaugusiems, tiek vaikams), tokias kaip pneumonija, kuri gali būti mirtina. Šis infekcijų sukelėjas taip pat sukelia vidurinį otitą vaikams ir sukelia sunkų meningitą senyviems žmonėms ir vaikams. Penicilinas ir kiti β-laktaminiai antibiotikai buvo pirmo pasirinkimo vaistai nuo pat 1940. Nepaisant to, per du pastaruosius dešimtmečius buvo pranešama apie penicilino jautrumo mažėjimą. Pagal pastarųjų metų duomenis penicilinui nejautrių Streptococcus pneumoniae padermių skaičius vakarų europoje siekė virš 25 %, o didžiausias rezistentiškumas pastebėtas Prancūzijoje – virš 50 %. Iš šių padermių dauguma buvo atsparios ir eritromicinui. E. coli yra viena dažniausių Gram- bakterijų, kurios daugiausia sukelia infekcijas, susijusias su šlapimo takais; ji siejama su peritonitu; sukelia sinergistines žaizdų infekcijas ir yra viena
iš dažniausiai maistu plintančių patogenų. Plataus veikimo penicilinai, tokie kaip amoksicilinas, buvo pirmo pasirinkimo vaistai, gydyti šias infekcijas, tačiau atsiradus rezistentiškumui, šie vaistai tapo nebe efektyvūs. 2007 metų duomenimis rezistentiškų aminopenicilinam E.coli buvo virš 30 % daugumoje Europos šalių [2,3] (1-asis paveikslėlis).
Be to, atlikus tyrimus buvo pastebėta, jog rezistentiškumas trečios kartos cefalosporinams buvo virš 60 %.
Staphylococcus aureus yra viena iš labiausiai virulentiškų žmogui patogenų, kurio
priežastimi tampa kaulų, sąnarių ir minkštųjų audinių infekcijos. Šis patogensas taip pat sukelia kraujotakos infekcijas ir endokarditą. Nuo pat pirmųjų rezistentiškų stafilokokiniams penicilinams padermių atsiradimo, meticilinui atsparios St. aureus (MRSA) plačiai paplito po pasaulį [3,10,27]. Nuo pat 1980 metų MRSA tarp St. aureus išplito nuo 0 iki beveik 70 % (2-asis paveikslėlis). Didėjančios MRSA padermės gana jautrios vankomicinui ir kitiems glikopeptidams, tačiau pastebėta jog atsiranda vankomicino jautrumo mažėjimas. Pamažu didėjanti tendencija pastebima Europoje, kur MRSA viršija 40 % - Jungtinės Karalystės, Airija, Graikija, Italija, Malta ir portugalija. Per pastaruosius ketverius metus didžiausias MRSA plitimas pastebėtas Vokietijoje 8 – 19 % ir Austrijoje 5 – 11 % [3,9].
1 pav. E.coli rezistentiškumas fluorochinolonams Europoje.
Nors ir ne tokie virulentiški kaip kiti patogenai, enterokokai yra palyginti dažnos šlapimo takų infekcijos sukėlėjai ir dažnai prisideda prie intra-abdominalinių infekcijų. Šie patogenai sukelia endokarditą ir yra oportunistiniai patogenai pacientams su nusilpusiu imunitetu, kuriems jie sukelia sepsį, meningitą ir kaulų infekcijas. Dėl savo sugebėjimo įgyti rezistentiškumą vaistmas, šie patogenai buvo patys pirmieji, kurie rodė visišką atsparumą trečios kartos glikopeptidų antibiotikams – vankomicinui ir teikoplaninui.
Invazinės grybelinės infekcijos taip pat sukėlė didelį susidomėjimą, nes vis didesnis skaičius populiacijos skaičius yra ties rizikos riba. Candida grybelių rūšis yra ketvirta pagal sukeliamas hospitaliai įgytas kraujotakos infekcijas. Šių grybelių sukeliamos kandidiazės yra svarbi sergamumo ir mirtingumo priežastis. Jungtinėse Amerikos Valstijose Candida grybelių rūšis yra reitinguojama kaip ketvirta priežastis, sukelianti kraujotakos infekcijas įgytas ligoninėje su dažnumu 1.5/10000 pacientų arba 8 infekcijos per 10000 iš ligoninės paleistų pacientų. Lyginant su Europoje atliktais tyrimais – dažnis yra šiek tiek mažesins 0.5 – 0.7 atvejai per 10000 pacientų arba 2 – 5 infekcijos per 10000 paleistų pacientų. Už daugiau nei 95 % visų Candida sukeltų kraujotakos infekcijų atsakingos penkios rūšys: C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis,
C. tropicalis ir C. krusei. Iš šių rūšių C. albicans yra kandidemijos vyraujanti priežstis.
1990 – ųjų pradžioje platus flukonazolo vartojimas gydyti ŽIV infekuotus pacientus su pasikartojančia burnos ir ryklės kandidoze privedė prie tam tikrų Candida rūšių
2 pav. Meticilinui atsparių St.
Aureus (MRSA) padermių
rezistentiškumo azolams [2,3,8]. Šis fenomenas privedė prie diskusijų, jog platus flukonazolo vartojimas platesnėje pacientų populiacijoje gali privesti prie panašios
Candida rūšių atrankos ir padermių atsparumo azolams. Candida glabrata tapo antru
dažniausiai sukeliančiu kraujotakos infekcijas patogenu. Šoktelėjęs susidomėjimas C.
glabrata įvyko po tyrimų, kurie atskleidė, jog 5 – 10 % kraujotakos infekcijas sukelianti
rūšis yra atspari flukonazolui. Dėl būdingo rezistentiškumo flukonazolui C. krusei ir C.
tropicalis taip pat yra mažiau jautrios ir amfotericinui B, tačiau jautrios praplėsto spektro
triazolams – posakonazolui, ravukonazolui, vorikonazolui [3,5,8].
Kovai su grybelinėmis infekcijos pasitelkiami azolų dariniai. Pirmasis vaistas kovai su grybelinėmis infekcijomis buvo griseofluvinas. Po šio vaisto sekė amfotericinas, kuris vis dar yra „auksinis standartas“ gydant sunkias sistemines mikozes. Vietiškai vartojami priešgrybeliniai vaistai mikonazolas ir klotrimazolas buvo pristatyti 1969. Tarp 15 skirtingų parduodamų vaistų visame pasaulyje, azolai yra plačiausiai vartojami ir labiausiai studijuojama junginių klasė. Klinikoje naudojami azolai, savo sudėtyje turi du ar tris azoto atomus – imidazolai ir triazolai. Nepaisant ketokonazolo, imidazolų naudojimas yra ribotas gydant išorines mikozes, o triazolai turi platų veikimo spektrą, todėl naudojami gydant tiek išorines, tiek sistemines mikozes. Priešgrybeliniai triazolai atsirado kaip pirmos eilės vaistai profilaktikai ir gydyti daugumai sisteminių mikozių. Flukonazolas vaidina ypatingą vaidmenį profilaktikoje, empyrinėje terapijoje ir gydant tiek paviršutiniškas, tiek invazines infekcijas. Amfotericinas B vis dar išlieka pasirinkimo vaistu invazinės apsergiliozės pirminei terapijai. Vienintelė alternatyva – itrakonazolas [2,4,8,11].
Yra daugybė įvairių biologiškai aktyvių molekulių, kurios turi įvairius heteroatomus, tokius kaip azotas, siera, deguonis, traukiančių mokslininkų dėmesį vien dėl savo biologinio aktyvumo. Tiazolidinonai yra organinių junginių klasė, pasižyminti keliomis biologiškai aktyviomis savybėmis. 1,3-tiazolidin-4-onai savo sudėtyje 1 padėtyje turi sieros atomą, o 3 padėtyje esti azoto atomas ir karbonilo grupė 4 padėtyje. Įvairūs pakaitai gali būti įvedami į 2, 3, 5 padėtis. Tiazolidinonai yra biologiškai svarbūs kaip aktyvūs „pamatai“, kurie turi beveik visų tipų biologinius aktyvumus [14,15,17,19,20]. Dėl šios savybės, šie junginiai patraukė mokslininkų dėmesį ir buvo vėl susidomėta tiazolidinonų skeletu dėl jo įvairialypio biologinio aktyvumo. Įvairių pakaitų
įvedimas į šias padėtis lemia jungnių biologinį aktyvumą. Tiriant benzilidentiazolidinonus buvo rasti pagrindiniai reikalavimai antibakteriniam aktyvumui: NH grupė 3 padėtyje, heteroatomas 1 padėtyje ir 5 padėtyje esantis fenilo radikalas su įvairiais pakaitais. 4 – tiazolidinono pagrindas yra labai universalus ir esti daugelyje klinikoje vartojamų vaistų. Šis pagrindas pasižymi antituberkulioziniu, antimikrobiniu, priešuždegiminiu ir antivirusiniu poveikiu, ypač prieš-ŽIV [14,15,16,17]. Tiazolidinonai su C – 2 ir N – 3 pakeistomis padėtimis turi įvairų inhibicijos laipsnį prieš bakterijas ir grybelius. Maždaug visos 4-tiazolidinone esančios padėtys buvo ištirtos, kad būtų pagerintas antibakterinis ir priešgrybelinis aktyvumas. Atliekant specifinio absorbcijos dažnio tyrimus buvo nustatyta, jog tiazolidinono dariniai rodė didesnį aktyvumą prieš gramneigiamas (Gram-) bakterijas lyginant su gramtegiamomis (Gram+) bakterijų kultūromis. Atlikus tyrimus su įvairių pakaitų įvedimu į C – 2 padėtį buvo nustatyta, jog šioje padėtyje esantys radiklai nesuteikia antibakterinio veikimo, tačiau junginiai pasižymi insekticindiniu poveikiu. Antibakterinis poveikis stirpiai priklauso nuo pakaitų prigimties C-2 ir N-3 padėtyse. Pavyzdžiui, junginys 3-(1,5-dimetill-3-okso-2-fenil-2,3-dihidro-1H-pirazol-4-yl)-2-(2-hidroksi-3,5-dijodofenil)-tiazolidin-4-onas (3 pav.), turintis antipiriną N-3 padėtyje ir 3-jodo pakeistą fenilo žiedą C-2 padėtyje rodo inhibicijos zoną 27, 24, 25 mm prieš E.coli, B.subtilis ir S.typhi atitinkamai [16,17,18,19].
N N N S O O H I I O CH3 CH3
Pakeistas 5-arilideno fragmentas vaidina svarbų vaidmenį sustiprinant antibakterinį aktyvumą. Pastaruoju metu buvo nustatyta, jog įvairūs 5-ariliden-4-tiokso-tiazolidinonų dariniai (4 pav.) buvo įvertinti dėl savo antimikrobinio ir citotoksinio poveikio. Daugybė ištirtų šių junginių buvo aktyvūs prieš gramteigiamą bakteriją
B.subtilis. Tuo tarpu tiazolidin-2,4-dionai buvo neaktyvūs prieš visus tirtus
mikroorganizmus, tačiau pakeitus karbonilo grupę į tiokarbonilo, aktyvumas stipriai 3 pav. 3-(1,5-dimetill-3-okso-2-fenil-2,3-dihidro-1H- pirazol-4-yl)-2-(2-hidroksi-3,5-dijodofenil)-tiazolidin-4-onas kaip potencialus antibakterinis junginys.
padidėjo. Studijos parodė, jog bioizosterinis tiokarbonilo grupės pakeitimas vietoj karbonilo tiazolidinono žiede padidino antimikrobinį aktyvumą. Dėl savo antibakterinių savybių, ypač prieš padermes, atsparias daugumai vaistų, 5-ariliden-4-tiokso-tiazolidinon-2-onai gali būti kaip startinis taškas tolimesnei optimizacijai [15,16,17,18].
N S N H S O Cl N
Rodaninas ir jo dariniai turi platų biologinio aktyvumo spektrą: priešbakterinis, priešgrybelinis, antidiabetinis, antituberkuliotinis, priešvėžinis, hipnotinis, antiparazitinis ir antihelmintinis. Be to, buvo nustatyta, jog rodanino dariniai turi aktyvumą iš prieš MRSA. Kai kurie nauji rodanino dariniai rodo stiprų slopinantį poveikį prieš gram- bakterijas su MIC 1-32 μg/ml. [22,23,27].
Tyrinėjant rodanino darinius buvo nustatyta, jog jie pasižymi įvairiu biologiniu aktyvumu: antibakteriniu ir priešgrybeliniu, priešvirusiniu, antihelmintiniu, pesticidiniu, analgetiniu, sedatyviniu ir antipilepsiniu, ir antioksidantiniu [22,25,27,30,34]. Literatūroje duomenų apie N-aminorodaniną, kaip priešgrybelinį ar antibakterinį junginį, nėra daug, tačiau randamuose yra minima, jog šis darinys pasižymi daugiau priešgrybeliniu poveikiu nei antibakteriniu. 3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinonas, arba N-aminorodaninas, yra rodanino darinys - tai yra heterociklas 1 ir 2 padėtyje turintis sieros atomus, 3 padėtyje amino atomą su šonine amino grupe, 4 deguonies atomą. Įvairios tyrimų studijos buvo atliekamos su rodanino dariniais ir įrodytos jų antimikrobinės savybės. Taip buvo atlikti keli tyrimai su N-aminorodininu ir jo dariniais su viena pakeista amino grupė 3-padėtyje ir nustatytas jų priešmikrobinis aktyvumas, kuris pasireiškė N,dimetilaminorodanine. Nepaisant panašumų tarp rodanino ir aminorodanino ir plataus rodanino biologinio aktyvumo diapozono buvo kuriami nauji N-aminorodanino dariniai. Buvo nustatyta, jog 3 padėtyje esanti laisva amino grupė yra
4 pav. 5-ariliden-4-tiokso-tiazolidinonas kaip antibaketinis ir citotoksinias junginys.
svarbi stipresniam inhibuojamajam poveikiui. Įvairių pakaitų įvedimas į trečią padėtį gali blokuoti jos įtaką aktyvumui [33,34].
Cikloheksanons yra alifatinis ciklinis ketonas. Literatūroje randama duomenų, jog cikloheksono fragmentas yra struktūriškai svarbus junginiams, pasižymintiems priešuždegiminiu, analgeziniu, vietiniu anestetiniu, antihistamininiu, antibakteriniu, priešgrybeliniu, antivirusiniu ir antioksidaciniu poveikiu. Yra duomenų, jog įvedus pakaitus į cikoheksanono C-2 ir C-6 padėtis pakaitus arba ciklopentanono C-2 ir C-5 padėtis, pasireiškia šių junginių antioksidacinis poveikis[36,41]. Neseniai atlikti tyrimai ir junginių sintezė su cikloheksanono dariniais atskleidė, jog, įvedus įvairius aromatinius pakaitus į 2 ir 6 padėtis, asiranda priešbakterinis, priešvėžinis poveikis, ypač nauji veiksmingi ŽIV-1 integrazės inhibitoriai ir taip pat gama-sekretazės inhibitoriai, o cickloheksanono ir ciklopentanono dariniai naudojami kaip skeletas kitų aktyvių junginių sintezei. Cikloheksanono dariniai yra svarbūs kaip tarpininkai sintetinant aktyvius, priešgrybeliniu poveikiu pasižyminčius ciklopentanono darinius [35,36]. Be to, tam tikri dariniai, turintys cikloheksanono fragmentą savo sudėtyje, pasižymi ir antioksidaciniu veikimu. Kaip naudingi prekursoriai potencialiai bioaktyviems pirimidino dariniams, α,α‘ – bis pakeisti benzilideno cikloalkanonai susilaukė nemažai dėmesio. Per pastaruosius metus, optiškai nelinijiniai aktyvūs bis benziliden ketonai taip pat buvo sintezuojami. Sukuriti α,α‘ – bis pakeisti dariniai buvo tiriami prieš S. aureus, B. subtilis, E. coli, P.
aeruginosa. Taip pat buvo tiriamas ir priešgrybelinis poveikis prieš A. niger, C. albicans.
Atliktos dokinimo studijos prieš antivirusinį poveikį. Gautas junginys α,α‘-bis(p-dimetilaminobenziliden)-γ-metilcikloheksanonas (5 pav.) buvo tiriamas agaro plokšteliu metodu, lyginant jį su standartiniais vaistais – Ampicilinu ir Ampotericinu B [41]. Gautas junginys pasižymėjo vidutiniu aktyvumu 15-17 mm koncentracijoje 100 μg/0.1 ml lyginant su standartiniais vaistais 30-38 mm [35,36,37,38,40].
7 pav. Nitrofurantoinas. O N C H3 CH3 N C H3 CH3 CH3
Atlikus 1-/ naftilaldehido kondensacijos reakciją su cikloheksanonu buvo gautas 2-((Naftalen-1-/-2-il)metilen)cikloheksanonas (6 pav.), kuris naudojamas tiek antimikrobinių, tiek antioksidacinių junginių sintezei, panaudojant jį kaip fragmentą reakcijoms su įvairiais heterociklais. Ištyrus junginius agaro difuzijos metodu, pastebėta, jog daugelis junginių, turinčių naftilcikloheksanono fragmentą pasižymi vidutiniu arba dideliu aktyvumu prieš B. subtilis, S. aureus, E.coli, C. albicans, A. Niger lyginant su gentamicinu, ampicilinu, chloramfenikoliu (MIK >50 μg/ml) ir amoksicilinu (MIK >100 μg/ml, tačiau pastebėtas junginių mažas aktyvumas prieš grybelių kultūras lyginant su flukonazolu [37,40,42].
O
Neseniai atliktais tyrimais buvo nustatytas cikloheksanono poveikis E.coli biotransformacijos aktyvumui.
Nitrofurantoinas (7 pav.) azolo darinys, savo sudėtyje turintis nitrofurano fragmentą.
5 pav. α,α‘-bis(p-dimetilaminobenziliden)-γ-metilcikloheksanonas
6 pav. 2-((Naftalen-2-il)metilen)cikloheksanono fragmentas.
N NH O O N O N+ O -O
1 lentelė. Nitrofurantoino antibakterinis aktyvumas, MIK μg/ml.
Atsiradus antibiotikų rezistentiškumui, buvo vėl susidomėta šiuo vaistu. Kaip jau minėta anksčiau, azolo dariniai pasižymi gana dideliu priešmikrobiniu aktyvumu, o sudėtyje esantis nitrofruano fragmentas sustiprina poveikį. Šis vaistas daugiausia pasižymi veikimu prieš gram neigiamus ir gramteigiamus šlapimo takų patogenus. Tačiau buvo rasta ir rezistentiškų jam bakterijų vaikų ir suaugusių išmatose ir nitrofurantoinas yra susijęs su padidėjusia rizika visuotinai įgytai , su antibiotiku susjusiai Clostridium difficile sukeltai diarėjai. Buvo tirta ir mažiausia inhibuojanti koncentracija [43] (1 lentelė). Bakterija MIK, μg/ml 1.S.aureus 2.E.coli 3.Salmonela typhosa 4.Aerobacter aerogenes 5.Pseudomonas aeruginosa 6.Shigelia flexneri 7.Proteus mirabilis 8.Hemophilus vaginalis 1. 12,5 2. 6,2 3. 6,2 4. 100 5. >200 6. 12,5 7. 200 8. 1,5
Vaistai, su nitro grupe, bakterijose yra redukuojama nitroreduktazių į laisvus metabolitų radikalus, kuriems ir yra būdingas biologinis aktyvumas. Buvo atlikti tyrimai su nitrofurantoinu pieš Clostridium difficile. Šiuose tyrimuose buvo įrodyta, jog nitroreduktazes gaminanti Clostridium rūšis sugebėjo tapti rezistentiška nitrofurantoinui [43].
2. Eksperimentinė dalis.
2.1. 3-amino rodanino darinių sintezė ir indentifikavimas
.Identifikavimas naudojant ESC ir PC. Identifikavimas nustatytas naudojant gradientinę ESC su UV-Vis detektoriumi. Buvo panaudotos dvi metodikos, keičiant gradientų santykius, tiksliam junginių nustatymui. Junginiams LRT-1, LRT-2, LRT-3, LRT-4, LRT-5 buvo naudojama tirpiklių sistema 70% : 30% acetonitrilo ir trifluoracto r. atitinkamai. Kitiems junginiams LRT-21, LRT-22, LRT-23, LRT-24, LRT-25 buvo pasirinktas atvirkštinis santykis 30% : 70% acetonitrilo ir TFA atitinkmai. Gradientinės analizės laikas truko 21 min. Naudojamos gradientinės ESC kolonėlės parametrai - ACE 5x18, 250x4,6mm; naudotas gradientas 0.1 N acetonitrilas (grynas), tėkmės greitis 1.20. Gradientas pasirinktas eksperimentiškai.
Reakcijų eiga, medžiagų grynumas ir identifikavimas buvo sekamas plonasluoksne chromatografija, naudojant aliuminio oksido plokšteles (Silufol 150x150mm, AVALIER) ir žinomas sistemas: Toluenas:Acetonas 4:1 (Sigma-Aldrich), Izopronolis:Toluenas:NH3OH 6:3:1. Sistemos parinktos eksperimentiškai. Šiose
sistemose aiškiai atsiskiria medžiagų priemaišos ir skirtingų medžiagų Rf reikšmės. Junginių dėmės stebimos UV šviesa.
Lydymosi temperatūros nustatymas. Lydymosi temperatūros buvo nustatomos eksperimentiškai naudojant Koflerio lydymosi temperatūros nustatymo aparatą su mikroskopu. Lydymosi temperatūra nustatoma ant objektinio stiklelio uždėjus mažą kiekį tiriamosios medžiagos. Prieš naudojimą objektinis stiklelis nuvalomas acetonu ir išdžiovinamas ir uždedamas ant kito stiklelio viršaus. Sutriname tiriamąją medžiagą judindami viršutinį stiklelį, kad neliktų didesnių medžiagos kristalų. Tada tiriamoji medžiaga, esanti ant objektinių stiklelių, dedama ant kaitinimo elemento, kuriame įtvirtintas termometras. Medžiagos pokyčiai stebimi pro okuliarą. Medžiagos lydymosi temperatūra fiksuojama, kai kristalai pradeda įgauti lašo formą, o pabaiga fiksuojama, kai visi kristalai būna išsilydę.
Gauto junginio masė (gr.)
Pradinių medžiagų suma (gr.) x 100 %
nMVF a
Susintetinų junginių išeigos skaičiavimas ( 1 formulė):
η =
Reakcijos laiko nustatymas. Reakcijos laikas fiksuojamas nuo reakcijos pradžios iki tol, kol reakcijos mišinyje iškrenta nuosėdos. Jei reakcijos eigoje neiškrenta nuosėdos, reakcijos pabaigos laikas nusakoma atlikus plonasluoksnę chromatografiją.
Elementinė sieros analizė Šionigerio metodu. Pasveriamas tikslus analizuojamosios medžiagos kiekis (0,003 - 0,005 g.). Svėrimai atliekami analitinėse svarstyklėse ant specialaus bepelenio popierinio filtro. Kiekvienos medžiagos sveriama po 3 kartus. Pasvėrę medžiagas, sulankstome filtrus.
Paruošiame kolbas su šlifais. Į kolbas pripilame po 4 ml distiliuoto vandens ir įlašinama po 4 lašus 30 % perhidrolio. Sulankstytas bepelenis filtras įdedamas tarp platininės vielos gabaliukų, kurie pritvirtinti prie kolbos kamščių. Kolbos pripildomos deguonies ir bepelenis filtras padegamas, kol filtras dega, užkemšame kolbą kamščiu. Laukiame kol filrtas visiškai sudega. Po to kolbos sudedamos į purtyklę ir purtomos 30 min., kol išsisklaido kolboje esantis rūkas. Kolbos sienelės ir kamštis su vieliniu krepšeliu perplaunami 16 ml acetone. Tirpalas titruojamas 0,005 M bario chlorido tirpalu, įlašinus indikatorių: 3 lašai 0,2 % vandenilio torino tirpalo ir 2 lašai 0,0125 % vandenilio metileno mėlio tirpalo. Titruojame tol, kol spalva pereina iš melsvai žalsvos į žalsvai rožinę.
Sieros procentinis kiekis apskaičiuojamas pagal 2-ąją formulę:
S%=
Kur: n – sieros atomų skaičius molekulėje; M – bario chlorato molekulinė masė;
V – titravimui sunaudotas bario chlorato kiekis ml; F – faktorius;
a – astvertas tiriamojo junginio kiekis mg
1 formulė.
2 lentelė. 3-pakeistų 3-amino rodanino darinių charakteristikos.
2.1.1 3-pakeistų 3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono darinių sintezė.
Į 1,48 g (0,01 mol) 3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono kolboje pilame 10 ml absoliutaus etanolio, dedame 1,5 g (0,016 mol) cikloheksanono, įlašiname 1 lašą konc. HNO3. Reakcijos mišinys smulkinamas ultragarso vonelėje 1-2 minutes. Po to reakcijos
mišinį kaitiname 1val. 70-80 0C temperatūroje arba 40 min. ties 400 W mikrobangų krosnelėje. Reakcijos mišinys atšaldomas, iškrenta kreminės spalvos nuosėdos. Susidarę kristalai filtruojami pro stiklo filtrą vakumu, perplaunami etanoliu ir eteriu, džioviname kaitinimo spintoje. Kristaliname iš etanolio arba izopronolio.
Į 1,48 g (0,01 mol) 3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono kolboje pilame 10 ml absoliutaus etanolio, dedame 1,5 g (0,016 mol) ciklopentanono, įlašiname 1 lašą konc. HNO3. Reakcijos mišinys įdedamas į ultragarso vonelę 1-2 min. Reakcijos mišinys
kaitinamas ant kaitinimo plytelės 1 val. 70-80 o
C arba 40 min. 400W mikrobangų krosnelėje. Atvėsiname iki 5-10 o
C, susidato gelsvos spalvos kristalai, filtruojame pro stiklo filtrą vakumu, perplauname etanoliu ir eteriu, džioviname kaitinimo spintoje.
Abiem atvejais reakcijos eiga, medžiagų identifikavimas ir grynumas buvo stebimas plonasluoksne chromatograma ant aliuminio oksido plokštelės, naudojant sistemą Acetonas:Toluenas santykiu 4:1.
Atlikus šią sintezę buvo gauti junginai LRT-1 (3-(cikloheksilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidinonas) ir LRT-21 (3-(ciklopentilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidininonas).
S N N S O R Jung. Nr R Išeiga (%)/rekacijos laikas (min.) Lyd. temp. o C S% Mol. formulė (Mr) UV (nm) LRT - 1 78/40 136-140 27,37 27,16 C9H12N2OS2 228,32 293,6 LRT -21 72/40 116-119 24,4 24,21 C8H10N2OS2 213,29 292,5 2 lentelė. 3-pakeistų 3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono darinių charakteristikos
2.1.2.
5-pakeistų-3-(cikloheksilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onų sintezė.
Į 50 ml kolbą įberiame 0,0015 mol LRT-1 (3-(ciklohesilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-ono), 0,0015 mol norimo aldehido ir 0,1 g amonio acetato. Į rekacijos mišinį įpilame 6 ml ledinės acto rūgšties. Viriname ant kaitinimo plytelės ~120
o
C 10 min. Reakcijos eigoje iškrenta būdingos spalvos kristalai, priklausomai nuo pasirinkto aldehido. Reakcijos mišinį filtruojame kartšą pre stiklo filtrą, perplauname izopropanoliu ir eteriu. Džioviname kaitinimo spintoje. Reakciją taip pat atliekame ir mikrobangų krosnelėje, naudodami tuos pačius tirpiklius. Reakcija atliekama 400 W 10 minučių. Junginys LRT-3 buvo sintezuojamas ant kaitinimo plytelės kambario temperatūroje. Reakcija truko 1 val. 20 min.
Atlikus reakcijas gauti junginiai: 5-p-dietilaminobenziliden-3-(cikloheksilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas (LRT-2); 5-nitrofurfuril-3-(ciklohesilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas (LRT-3); 5-(4-Bromofenil)-2-furaliden-3-(cikloheksilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas (LRT-4); 5-p-etilbenziliden-3-(cikloheksilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas (LRT-5);
LRT-2, LRT-3, LRT-4, kristlinami iš tolueno ir DMSO mišinio; LRT-5 kristalinamas iš etanolio ar izopropanolio. Junginių charakteristikos nurodytos 3 lentelėje.
S N N S O R Jung. Nr. R Išeiga (%)/rekaci jos laikas (min.) Lyd. temp. o C S% Mol. formulė (Mr) UV (nm) LRT-2 N C H3 CH3 54/10 206-210 13,70 13,52 C20H25N3O S2 387,54 323,3 LRT-3 O N+ O -O 53/80 266-270 16,48 16,25 C14H13N3O4 S2 351,38 413,8 LRT-4 O Br 48/10 271-274 9,97 9,51 C20H17N2O2 S2Br 461,37 448,7 3 lentelė. 5 pakeisti 3-(N-ciklohesiliden)-amino rodanino dariniai
LRT-5 C H3 64/10 171-175 16,44 16,35 C18H20N2O S2 344,47 381,4
2.1.3.
5-pakeistų-3-(ciklopentilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onų sintezė.
Į 50 ml kolbą įdedame 0,0015 mol LRT-21 (3-(ciklopentilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-ono), 0,0022 mol norimo aldehido, 0,1 g amonio acetato ir įpilame 6 ml ledinės acto rūgšties. Reakcijos mišinį įdedame į ultragarso vonelę tam, kad reakcijos mišinys būtų susmulkintas. Smulkinimą atliekame 1-2 min. Viriname ant kaitinimo plytelės 15 min. ties 120 oC. Reakcijos eigoje susidaro kristalai, kurie filtruojami karštai per stiklo filtrą, perprlaunami izopropanoliu ir eteriu. Džiovinami kaitinimo spintoje. Reakciją taip pat atliekame ir mikrobangų krosnele, naudodami tuos pačius tirpiklius ir tą patį katalizatrių ekvivalentiškais kiekiais. Reakciją vykdome 400 W 10 min. Junginys LRT-23 buvo sintezuojamas ant kaitinimo plytelės esant kambio temperatūrai. Reakcija truko 2 valandas. LRT-22, LRT-23, LRT-24 kristalinami iš tolueno ir DMSO mišinio, LRT-25 kristalinamas iš etanolio.
Šios sintezės metu gauti junginiai 5-p-dietilaminobenziliden-3-(ciklopentilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas (LRT-22); 5-nitrofurfuril-3-(ciklopentilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas (LRT-23); 5-(4-Bromofenil)-2-furaliden-3-(ciklopentilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas (LRT-24); 5-p-etilbenziliden-3-(ciklopentilidenamino)-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas (LRT-25). Junginių charakterisikos nurodytos 4 lentelėje.
Jung. Nr. R 1 Išeiga (%)/ rekacijos laikas (min.) Lyd. temp. o C S% Mol. formulė (Mr) UV λmax (nm) LRT-22 N C H3 CH3 72/10 200-204 16,46 16,32 C19H23N3O S2 373,51 413,8 LRT-23 O N+ O -O 48/120 209-213 13,78 12,56 C13H11N3O4 S2 337,36 446,3 LRT-24 O Br 46/10 280-284 9,47 7,65 C19H15N2O2 S2Br 447,35 486,1 LRT-25 C H3 75/10 143-147 18,30 18,12 C16H18N2O S2 318,44 382,6 4 lentelė. 5-pakeistų 3-(N-ciklopentiliden)-amino rodanino darinių
charakteristikos. S N S O N R1
2.2. 3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono darinių priešmikrobinio aktyvumo
įvertinimas
2.2.1. N-aminorodanino darinių prognozė naudojant PASSonline metodiką Susintetintų organinių junginių biologinio aktyvumo prognozės buvo atliktos naudojantis PASSonline (Prediction of Activity Spectra for Substances) programą.
2.2.2. 3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono darinių priešmikrobinis tyrimas in
vitro metodu.
Buvo tirtas susintetinių junginių priešmikrobinis aktyvumas in vitro prieš šias bakterijų ir grybelių kultūras:
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Escherichia coli ATCC 25922
Bacillus subtillis ATCC 6633
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
Candida albicans ATCC 60193
Bacillus cereus NCIMB 50014
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Proteus mirabilis ATCC 12453
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Šios bakterijų ir grybų kultūros buvo auginamos 10 ml talpos mėginuvėliuose ant nuožulnaus agaro. Kas dieną buvo persėjamos į naują agarą ir inkubuojamos 24 val 35-37
oC temperatūroje. Pagamintos bakterijų ir grybelių kultūrų suspensijos izotoniniame
natrio chlorido tirpale laikomos šaldytuve (2-8 oC temperatūroje).
Susintetintų junginių mibrobiologinis tyrimas vyko vienu etapu: nustatant MSK – mažiausią slopinančią koncentraciją. Viso tyrimo metu buvo nustatomos sintetinių junginių mikrobostatinės (MSK) koncentracijos.
Sintetinių junginių bakteriostatinės ir fungistatinės koncentracijos nustatymas. Mikrobostatinės junginių koncentracijos buvo nustatotomos serijinio praskiedimo būdų standžioje terpėje (Müller-Hinton agar, CM0337, Oxoid LTD., Basingstoke, Hampshire,
England).
Etaloninių mikroorganizmų kultūrų ruošimas. Etaloninės bakterijų S. aureus,
E. coli, B. subtilis, K. pneumoniae, B. Cereus, Ps. aeruginosa, P. mirabilis, Enterococcus faecalis kultūros buvo sėjamos steriliomis kilpelėmis nuožulniame agare. Po to bakterijų
kultūros buvo auginamos inkubuojant jas 20-24 val. 35-37 oC temperatūroje. Iš išaugintų
bakterijų kultūrų buvo ruošiamos bakterijų suspensijos izotoniniame (0,9 proc.) natrio chlorido tirpale, naudojant sterilias kilpeles ir standartizuojamos McFarland‘o standartiniu indikatoriumi („Standart indikator McFarland“), kuris matuoja mėgintuvėlyje esančios suspensijos drumstumą. Bakterijų suspensija yra laikoma standartizuota, kai indikatoriaus reikšmė lygi 0,5 (tai reiškia, jog 1 ml bakterijų suspensijos yra 1,5x108 bakterijų ląstelių).
Etaloninė grybelių C. albicans kultūros buvo auginamos nuožulniame Saburo agare, inkubuojant 20-24 val 30 oC temperatūroje. Grybelių suspensija gaminama iš išaugintų grybelių kultūrų fiziologiniame tirpale, standartizuojant McFarland‘o standartiniu indikatoriumi. Bakterijų kultūrų suspensija laikoma standartizuota, kai indikatorius yra lygus 0,5 ( reiškia, jog 1 ml suspensijos yra 1,5 x 108 bakterijų ląstelių).
Tiriamųjų junginių paruošimas mikrobiologiniam tyrimui. Susintetintų junginių mikrobiologinis tyrimas atliekamas atitinkamą junginį skiedžiant su Miulerio – Hintono agaru. Pagrindiniai ir palyginamieji junginiai ( 8000 μg/ml ) paruošti tirpinant juos DMSO, kadangi nauji sintetiniai junginiai sunkiai tirpsta daugelyje tirpiklių. Buvo paruošta 5 ml tirpalo su kiekvienu junginiu, tirpinant DMSO (5 lentelė). Taip pat DMSO pasižymi priešmikrobiniu aktyvumu, todėl turi būti nustatoma mažiausia koncenctracija, kuri neturi priešmikrobinio poveikio. Atliekamas kontorlinis bandymas su DMSO nustatant koncetraciją, kurioje nepasireiškia priešmikrobinis veikimas. Šiai kontrolei buvo pasirinkta 0,5 ml gryno DMSO ir praskiesta su Miulerio - Hintono agaru iki 10 ml. Taip pat buvo pagamintos pagrindinių junginių tirpalų koncentracijos 4000 μg/ml, 2000 μg/ml ir 1000 μg/ml. Buvo pagamintas pagrindinis tirpalas 8000 μg/ml. Iš šio tirpalo
m (mg)=
Reikalingas medžiagos
kiekis (mg) x 100
Gautas medžiagos grynumas %
3 formulė
Kiekis (mg) =
Tūris (ml) x koncentracija (μg/ml) Bandinio stiprumas (μg/mg)
4 formulė
buvo paimta ribinės koncentracijos (400 μg/ml) 0,5 ml praskiesta Miulerio-Hintono agaru iki 10 ml ir supiltas į Petri lėkštelę. Tai pirmasis juniginių praskiedimas. Atvėsus agarui buvo sėjamo bakterijų ir grybelių kultūros. Tas pats atlikta ir su DMSO bei standartais – 3-aminorodaninu (95 % švarumo) ir nitrofurantoinu (Mecobenzon, NITROFURANTOIN (anhydrat), 98 %). Kitą dieną stebimas mikrobų augimas agare. Atlikus bandymą su ribine koncentracija, buvo imamos likusios koncentracijos jas atitinkamai skiedžiant su DMSO. Viskas atliekama steriliomis sąlygomis.
Dauguma gautų organinių junginių, naudojamų skiedimui su agaru, nėra 100 % švarūs. Kad būtų pagaminta tinkama koncentraciją, reikia žinoti kiekvienos medžiagos tikslų grynumą. Taip pagaminame standartizuotus tirpalus. Pagal grynumą skaičiuojame medžiagos kiekį, reikalingą 8000 μg/ml tirpalui pagaminti. Naudojamės formule (3 formulė)
Taip pat galime paskaičiuoti medžiagos kiekį, reikalingą atitinkamai koncentracijai (4 formulė):
Paruošus praskiestus junginius su agaru Petri lėkštelėse, steriliomis kilpelėmis, užtikrinant sterilias sąlygas, buvo užnešamos bakterijų kultūros ir inkubuojamos 24 val. 36-37 oC temperatūroje. Kitą dieną buvo tikrinamos bakteriostatinės/fungistatinės koncenctracijos (6 lantelė). Tyrimai buvo atliekami tris kartus (n=3) ir kiekvieną kartą gauti atsikartojantys rezultatai.
Jung. 1 ml tirpalo/mg medžiagos 5 ml tirpalo/mg medžiagos Grynumas % Masė/1 ml (mg) Masė (mg)/5ml LRT-1 8 40 97,47 8,21 41,04 LRT-2 8 40 82,85 9,66 48,28 LRT-3 8 40 90,32 8,86 44,29 LRT-4 8 40 71,76 11,15 55,74 LRT-5 8 40 88,36 9,05 45,27 LRT-21 8 40 81,19 9,85 49,27 LRT-22 8 40 95,89 8,34 41,71 LRT-23 8 40 72,50 11,03 55,17 5 lentelė. Medžiagų kiekis, reikalingas skiedimams su DMSO.
6 lentelė. Junginių bakteriostatinės/fungistatinės koncentracijos Mikrobiologinis aktyvumas, μg/ml Bakteriostatinė/fungistatinė koncentracija Jungi nys S.aure us ATC C 25923 B.subti li s ATCC 6633 K .pneumoni ae A TC C 13883 E.c oli ATCC 25922 B.c ere us NCIMB 50014 P.mirabil is ATCC 1245 3 Ent.feac ali s ATCC 29212 P.ae rugi nosa ATCC 27853 C .albi cans ATCC 60193 LRT-1 25 200 200 200 50 200 200 200 25 LRT-2 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 LRT-3 3,125 1,5625 100 50 1,5625 100 6,25 100 6,25 LRT-4 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 LRT-5 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 200 LRT-21 25 200 >400 >400 50 100 >400 100 25 LRT-22 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 LRT-23 1,5625 50 1,5625 25 1,5625 100 6,25 >400 6,25 LRT-24 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 LRT-25 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 >400 200 NF 12,5 12,5 50 12,5 12,5 200 12,5 >400 200 3-ARh 25 >400 >400 >400 200 >400 >400 200 100
3. Rezultatų aptarimas
Kaip jau apžvelgta tyrimų apžvalgoje, tiazolidinono dariniai pasižymi priešbakteriniu ir priešgrybeliniu poveikiu. Šiomis savybėmis pasižymi ir rodaninas bei jo dariniai, tokie kaip N-aminorodaninas su laisva amino grupe trečioje padėtyje.
3.1. 3-aminorodanino darinių sintezė.
Pradinis junginys, 3-aminorodaninias, naudojamas tolimesnių organinių junginių sintezei kaip fragmentas, buvo sintezuotas pagal pasiūlytą prof. E. Tarasevičiaus metodiką. Reakcija atliekama 0,2 mol hidrazinhidrato maišant su 30 ml metanolio, tirpalas šaldomas ledo vonioje iki 0 oC. Į atšaldytą tirpalą, maišant magnetine maišykle,
lėtai lašinamas tirpalas, kurį sudaro 6 ml anglies disulfido 20-yje ml eterio. Lašinant nuolat stebima temperatūra, neleidžiant jai pakilti daugiau nei 8 oC. Sulašinus visą
hidrazinhidrato tirpalą metanolyje, iškrenta baltos spalvos nuosėdos, kurios maišomos magnetine maišykle 20 minučių, esant 5 oC temperatūrai. Gautos nuosėdos filtruojamos
vakuumu, perplaunamos eteriu ir džiovinamos džiovinimo spintoje. Gautos druskos lydymosi temperatūra 120-122 0C. Tada 8,5 (0,09 mol) gr. monochloroacto rūgšties ištirpinama 25 ml distiliuoto vandens, neutralizuojant natrio karbonatu, pH tikrinamas universaliuoju lakmuso popierėliu. Gautas tirpalas šaldomas iki 0 oC, veikiant magnetinei maišyklei, mažais kiekiais dedama gauta druska ir stebima temperatūra, neleidžiant pakilti daugiau nei 4 0C. Paliekame maišyti 30 min. Gautas tirpalas skiedžiamas du kartus po 25 ml distiliuoto vandens ir paliekamas stovėti kambario temperatūroje dvi valandas. Tuo tarpu 70 ml 6N vandenilio chlorido rūgšties šildome iki virimo ir į ją lėtai pilamas išlaikytas tirpalas. Kaitiname iki 90-95 0
C, atšaldžius iškrenta 3-amino rodanino kristalai Kristalinamas iš ledinės acto rūgšties. Gauto junginio grynumas buvo sekamas plonasluoksne chromatografija naudojant chloroformo ir acetono sistemą.
maišymas, HCl temp.
8 pav. N-amino rodanino sintezė.
OH O Cl
Atliekant reakcijas su alifatiniais cikliniais ketonais, susintetinti 3-pakeisti-N-aminorodanino dariniai LRT-1; LRT-21. Reakcijos buvo atliekamos naudojant katalizatorių konc. HNO3 dėl šios rūgšties stipresnio katalizinio aktyvumo. Kadangi
3-amino rodadnino N-3 padėtyje esanti 3-amino grupė yra gana silpnas nukleofilas, buvo pilamas labai mažas konc. azoto rūgšties kiekis (1-2 lašai), kad reakcija nebūtų per reaktyvi, nes per didelis kiekis katalizatoriaus gali sustabdyti reakciją, nes aminas būdamas baze gali reaguoti su katalizatoriumi ir susidaro amonio (RNH3+) jonas. Šiuo
atvejus katalizatoriaus dedame keliomis molekulėmis mažiau nei N-aminorodanino. Katalizatoriaus, šiuo atveju konc. azoto rūgšties, dedame tam, kad būtų paskata reakcijai pradėti vykti, t.y. suteikiamas „šuolio startas“, ir tam, kad rekacijos mechanizmo eigoje būtų pašalintos vandens molelukės. Tačiau įdėjus stipresnio katalizatoriaus (kaip šiuo atveju) susidato ir didesnis kiekis amonio jono (RNH3+), todėl reakcijos išeiga susidaro
apie 70-75 %. Reakcijos buvo atliekamos ir naudojant mikrobangų krosnelę. Reakcijos laikas nepakito, tačiau gaunami produktai buvo grynesni su didesne išeiga (70-80 %). Reakcijos išeiga skaičiuojama pagal
H2N-NH2 + CS2 + C H3 OH N S NH2 O S
Vykdant aldolinės kondesacijos reakcijas su įvairiais aldehidais į C-5 padėtį buvo gaunami įvairūs 5-pakeisti N-aminorodanino dariniai (LRT-2; LRT-3; LRT-4; LRT-5; LRT-22; LRT-23; LRT-24; LRT-25). Aldehidų įvedimui į C-5 padėtį naudojama Knovenagelio kondensavimo reakcija. Atliekant aukštoje temperatūroje, t.y. tirpiklio virimo temperatūroje, reakcijos vyksta greičiau. Vidutinis reackijos laikas 10 min. Naujo junginio susidarymą įrodo tai, jog virinant reakcijos mišinyje iškrenta nuosėdos. Kaip reakcijos katalizatorius naudojamas bazinis aminas, šiuo atveju, amonio acetatas, kuris pagal atliktus eksperimentus yra reaktyvesnis nei natrio acetatas, tačiau naudojant amonio acetatą išsiskiria vanduo, o naudojant natrio acetatą patartina naudoti ir acto rūgšties anhidridą. N S S O NH2 O S N N S O LRT-1 S N N S O LRT-21
LRT-4 S N N S O S N N S O O N+ O -O O H O N+ O -O S N N S O O Br S N N S O C H3 CH3 H O LRT-2 LRT-3 LRT-5 N C H3 CH3 O H S N N S O N C H3 CH3 O H O Br
LRT-25 LRT-22 LRT-24 LRT-23 S N N S O N C H3 CH3 O H S N N S O C H3 S N N S O O N+ O -O O O H N+ O -O N S S O N O Br O O H Br S N N S O N C H3 C H3 C H3 H O
Reakcijos metu naudojami aldehidai tiek su elektronų donorinėmis, tiek su elektronų akceptorinėmis grupės didelės reikšmės laikui neturėjo, bet temperatūra turėjo gana žymų poveikį. Tačiau pabandžius atlikti Knovenagelio kondensacijos reakciją su 5-nitrofurfuraliu, kaip elektronų akceptoriniu aldehidu, į C-5 padėtį kambario temperatūroje, reakcijos laikas svyravo nuo 1 val. 20 min. iki 2 val. ir gautų junginių reakcijos išeiga palyginti buvo nedidelė (20-30 %). Pagal duomenis rastus literatūroje, jungiant elektronų donorinį pakaitą p-dimetilaminobenzaldehidą į C-5 padėtį, gauto junginio kristalai būna būdingos raudonos spalvos, tačiau pastebėta, kad jungiant ir kitus elektronų donorinius pakaitus į C-5 padėtį, gauti junginiai būna raudonos spalvos, o įvedus elektronų akceptorinius pakaitus į C-5 padėtį, junginių spalva vyruoja nuo oranžinės iki geltonos spalvos. Atliekant reakcijas buvo pastebėta, jog įdėjus tiek alifatinių ciklinių ketonų, tiek aldehidų 1,5 karto daugiau į reakcijos mišinį, reakcija įvyksta greičiau, tačiau padidėja priemaišų. Visų gautų junginių išeigos palyginti nedidelės. Manome, jog tam įtakos turėjo ir tai, jog susidarius junginiui jis buvo filtroujamas karštai pro stiklo filtrą tam, kad būtų išvengta didesnio kiekio priemaišų.
Pastebėta, jog pakaitai, esantys N-3 padėtyje turi įtakos reakcijos eigai ir reakcijos produktui. Įvedus cikloheksanono pakaitą reakcijos mišinys eigoje pakeisdavo spalvą ir po kelių minučių iškrisdavo nuosėdos, o esant ciklopentanono pakaitui reakcijos metu susidaręs junginys būdavo dervos pavidalu ir filtruojant reikdavo išplauti keliomis porcijomis etanoliu arba izopropanoliu.
Gautų junginių LRT-1 ir LRT-2 spalva svyravo nuo kreminės ir šviesiai geltonos atitinkamai. Šių junginių tirpumas palyginti geras: tirpsta daugelyje organinių tirpiklių. Įvedus cikloheksanono pakaitą į N-3 padėtį lydimosi temperatūra padidėjo per 38-42 laipsnius pagal Celcijų, o cikloheksanoną pakeits ciklopentanonu lydimosi temperatūra pakito nežymiai – 19-21 o
C.
Junginių LRT-2; LRT-3; LRT-4; LRT-5; LRT-22; LRT-23; LRT-24; LRT-25 reakcijos atliekamos greitai ir lengvai. Spalva buvo nuo raudonos iki geltonos.. Įvedus įvairius aldehidus į 5 padėtį stipriai padidėjo lydimosi temperatūra, kuri daugumos junginių yra virš 200 laipsnių pagal Celcijų. Be to, su pakaitais, esančiais C-5 padėtyje, pasunkejo junginių tirpumas. Visi junginiai išskyrus LRT-5 ir LRT-25, netirpūs daugelyje organinių tirpiklių, geriausiai tirpsta toluene, ledinėje acto rūgštyje ir DMSO
kaitinant, o jungiai su p-etilbenazldehido pakaitu gana gerai tirpūs daugelyje organinių tirpiklių kaitinant.
Reakcijos eiga, priemaišų buvimas ir naujų junginių nustatymas buvo stebimas plonasluoksne chromatografija. Buvo naudojamos standartinės aliuminio oksido plokštelės. Naudojama sistema Toluenas:Acetonas 4:1.
3.2. Susintezuotų 3-amino rodanino darinių priešmikrobinio
aktyvumo nustatymas.
Atliekant gautų sintetinių junginių priešmikrobinį aktyvumą buvo nuspręsta pasinaudoti PASSonline (Prediction of Activity Spectra of Substances) programa. Šiuo metodu galima nuspėti bendrą biologinį, į vaistą panašaus organinio junginio, potencialą. PASS programa suteikia spėjimus apie daugelio junginių biologinį aktyvumą, paremtą organinio junginio struktūra.
PASSonline programa buvo naudojama 10 susintetinų priešgrybelinam ir
antibateriniam junginių poveikiui nuspėti. Naudojant šią programą rodomos dvi tikimybės Pa – nuspėjamas molekulės aktyvumas ir Pi – nuspėjamas molekulės neaktyvumas. Pa reikšmės gali būti interpretuojamos taip(1,44):
1. Pa > 0,7. Yra nemaža tikimybė, jog junginių aktyvumas gali būti nustatytas eksperimentiškai, tačiau daugumai atveju susintetino organinio junginio struktūra yra panaši į kitus farmacinius preparatus;
2. 0,5 > Pa > 0,7. Tikimybė, jog junginys pasižymi sistemoje rodom aktyvumu, yra mažesnė, tačiau struktūra yra skirtingas nuo kitų farmacinių preparatų
3. Pa < 0,5. Tikimybė nustatyti sistemoje rodomą aktyvumą yra labai maža, nes tiriamojio junginio struktūra yra gana skirtinga nuo esančių sistemoje.
Buvo atlikta 10 junginių analizė PASSonline programa (9 pav.). Nepaisant to, jog pagal literatūros duomenis apie galimą šių junginių aktyvumą, buvo gaunami ir duomenys ne tik rodantys poveikį, bet galimus veikimo mechanizmus prieš bakterijas ir grybelius. Susintetintų organinių junginių aktyvumo vertinimas buvo atliekamas atsižvelgiant ir į prognozuojamą veikimo mechanizmą.
0 2 4 6 8 10 12 Jun gi ni ų sk ai či us Antibakterinis veikimas 6 3 2 1 0 0 0 0 Priešgrybelinis veikimas 10 9 4 3 1 0 0 0
Pa>Pi Pa>2 Pa>3 Pa>4 Pa>5 Pa>6 Pa>7 Pa>8
Atlikus susintetintų organinių juginių prognozę pasitelkiant PASSonline programą buvo gauti duomenys, rodantys, jog didžioji dalis junginių turi didelį antivėžinį aktyvumą (0,7<Pa<1,0), nes pagal metodą nurodomas veikimo mechanizmas kaip Mcl–1 antagonistai. Bet to, pastebėta, jog nurodomas ir kitas, su šiuo darbu nesusijęs, rezultatas – PfA-M1 aminopeptidazės inhibitorinis poveikis. Tai būdinga antimaliariniems vaistams. Įdomu tai, jog lyginant šiuos du poveikius su antibakteriniu ir piešgrybeliniu poveikiu, pirmieji turi racionaliai didesnę tikimybę nei tiriamas antimikrobinis aktyvumas, kuris svyruoja ribose 0,1<Pa<0,6 (9 pav.). Kad būtų iki galo išsiaiškintas tikrasis susintetintų junginių poveikis ir PASSonline programos spėjimo tikslumas, reiktų atlikti antivėžinius ir antimaliarinius tyrimus.
Analizuojant gautus duomenis apie antibakterinį ir priešgrybelinį aktyvumą, pastebėta, jog dauguma junginių pasižymi stipresniu priešgrybeliniu poveikiu nei antibakteriniu. Įdomu pabrėžti tai, jog kai kuriems jungiams prognozės neparodė antibakterinio poveikio, o priešgrybelinas aktyvumas nuspėtas 9 iš 10 junginių. Prognozuojant anibakterinį aktyvumą pastebėta, jog šių junginių Pa ribos palyginti mažos – svyruoja ribose: 0,1<Pa<0,5. Tik vienam iš šešių junginių, kuriems prognozuotas antibakerinis aktyvumas, Pa reikšmė buvo tarp 0,4<Pa<0,5. Kaip jau minėta, 9 paveikslėlis. Bendras priešmikrobinis ir priešgrybelinis aktyvumas, naudojant
S N N S O 7 lentelė. priešgrybelinis aktyvumas prognozuotas 9 iš 10 junginių, kurių Pa yra ribose 0,1<Pa<0,6. Net trijų junginių Pa svyruoja ribose 0,4<Pa<0,6. Tik du junginiai patenka į Pa>0,5. Pastebėta, jog struktūros panašumai duoda beveik tas pačias prognozes. Iš visų prognozuotų junginių didžiausią Pa turi jungiai, kurių sudėtyje yra furano žiedo fragmentas. Manoma, jog visiškai pasikliauti PASSonline duomenimis negalima, todėl vienas iš šio darbo uždavinių ir buvo eksperimentiškai nustatyti susintetinų junginių antimikrobinį aktyvumą in vitro metodu. Taip pat įdomu palyginti, ar junginiams, kuriems nebuvo prognozuotas antibakterinis ir priešgrybelinis aktyvumas ir jungiams, kurių Pa reikšmės palyginti žemos, atitiks PASSonline programos prognozes.
Jung. Struktūra Antibakteirnis(Pab; Pib)/Priešgrybelinis(Pag;Pig) poveikiai Pab Pib Pag Pig LRT-1 0,178 0,138 0,289 0,086 LRT-2 - - 0,210 0,130 S N N S O N C H3 CH3
7 lentelės tęsinys. LRT-3 0,398 0,030 0,587 0,020 LRT-4 - - 0,222 0,123 LRT-5 - - 0,311 0,077 S N N S O O N+ O -O S N N S O O Br S N N S O C H3
7 lentelės tęsinys. LRT-21 0,178 0,138 0,289 0,086 LRT-22 - - 0,190 0,143 LRT-23 0,449 0,022 0,572 0,021 N S N S O S N N S O N C H3 C H3 S N N S O O N+ O -O
LRT-24 N S N S O O Br 0,216 0,104 0,414 0,047 LRT-25 0,171 0,144 0,293 0,084 S N N S O C H3
Tam, kad būtų visiškai patvirtinta PASSonline programos prognozė, buvo atlikti priešmikrobiniai tyrimai in vitro, nustatant mažiausiąją slopinančiąją koncentraciją (MSK) μg/ml.
Tyrimui buvo pasirinktos 8 bakterijų ir 1 grybelių rūšys: 1. Gram teigiamos:
a. S.aureus (sudaranti kokus) b. B.subtilis (lazdelių pavidalo) c. Enterococcus faecalis 2. Gram neigiamos:
a. K.pneumoniae (sudaranti kapsulę) b. E.coli (lazdelės formos)
c. B.cereus (lazdelės formos) d. P.aeruginosa (kokobacila) e. P.mirabilis
3. Grybelių rūšis:
a. C.albicans
Pasirenkat šias padermes buvo atsižvelgta į struktūros skirtumus. Atliekant tyrimus norima sužinoti skirtingų junginių poveikį skirtingą struktūrą turinčioms padėrmėms. Todėl buvo pasirenkamos šios padermės atsižvelgiant į skirtingas struktūras. Nors didesnioji tyrimu dalis skirta ištirti, ar susintenti junginiai turi aktyvumą bakterijoms, buvo tiriamas poveikis ir prieš vieną grybelių rūšį - C.albicans.
Šioje tyrimų dalyje buvo tiriama tik mažiausioji slopinančioji koncentracija (MSK) μg/ml, nes tiriama, ar jungiai, su įveistais būdingais radikalais, turi aktyvumą prieš bakterijų ir grybelių paderemes ir nustatyti kokioj mažiausioj koncentracijoj galimas aktyvumas.
3.3. Susintetintų junginių aktyvumo įvertinimas
. Kaip jau minėta, aktyvumas buvo vertinamas lyginant gautus sintetinius junginius su dviems standartais – 3-aminorodaninu ir nitrofurantoinu. Šiems tyrimams buvo susintezuotas N-amino rodaninas, išvalytas ir patikrintas su ESC, grynumas 95 %, nitrofurantoinas – Mecobenzon NITROFURANTOIN, 98 % švarumo. Atlikus prognozes su PASSonline programa, pastebėta, jog junginių aktyvumas priklauso ir nuo struktūros pobūdžio. Iš 3 lentelėje pateiktų duomenų galime spręsti, jog junginiai su tais pačiais pakaitais veikia vienas bakterijas, kitų ne. Atlikus tyrimus pastebėta, jog pakaitai, esantys C-5 labai įtakoja junginio aktyvumą prieš tam tikras padermes. Nors N-3 padėtyje, pasak literatūros, esanti laisva amino grupė sustiprina junginių aktyvumą, tačiau įvedus atitinkamus pakaitus pasikeičia ir pats junginio aktyvumas. Kaip pastebėta, jei pakaitas, įvestas į C-5 padėtį, yra elektornų donoras, kaip antai, junginiai 2, 22, LRT-4, LRT-2LRT-4, LRT-5, LRT-25 aktyvumas palyginti mažas – MSK >400 μg/ml, tačiau junginiai su p-etilbenzaldehido, kaip elektronų donoru, radikalu C-5 padėtyje turi aktyvumą prieš C.albicans, kuris lyginant su kitais tokio pobūdžio radikalais, suteikia junginiui didesnį aktyvumą – MSK = 200 μg/ml. Įdomu tai, kad įvedus cikoheksanono ar ciklopentanono radikalą į N-3 padėtį, aktyvumas pasikeitė nežymiai, tačiau atsirado didesnis aktyvumas prieš tam tikras bakterijų padermes: B.subtilis, E.coli, B.cereus,P.mirabilis, P.aeruginosa, C.albicans. Įvedus cikloheksanoną į N-3 padėtį MSK prieš
B.subtilis, E.coli pasikeitė nuo >400 μg/ml iki 200 μg/ml, prieš B.cereus ir C.albicans nuo 200 iki 50 μg/ml ir nuo 100 iki 25 μg/ml atitinkami. Cikloheksanoną pakeitus ciklopentanonu MSK prieš B.subtilis pasikeitė nuo >400 iki 200 μg/ml, P.mirabilis ir
P.aeruginosa pasikeitė nuo 200 iki 100 μg/ml ir C.albicans nuo 100 iki 25 μg/ml. Būtina
pastebėti, jog nuo pakaito N-3 padėtyje atsirado tam tikras specifiškumas prieš
K.pneumoniae, E.coli ir E.faecalis. Esant cikloheksanono pakaitui N-3 padėtyje atsiranda
veikimo specifiškumas prieš K.pneumoniae, E.coli ir E.faecalis, o ciklopentanono pakaitas prieš šias bakterijas įtakos aktyvumo sustiprėjimui neturi, nes MSK >400 μg/ml lyginant junginį su cikloheksanono pakaitu. Taip pat šie junginiai buvo lyginami su nitrofurantoinu kaip standartu, tačiau junginiai LRT-2 nei LRT-22 tokiu stipriu antibakteriniu aktyvumu nepasižymėjo MSK >400 μg/ml. Nitrofurantoino MSK prieš
