TROMBOCITŲ AKTYVACIJA BAKTERINĖS AR VIRUSINĖS INFEKCIJOS METU

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA, MEDICINOS FAKULTETAS

VAIKŲ LIGŲ KLINIKA

Aistė Pociūtė

TROMBOCITŲ AKTYVACIJA BAKTERINĖS AR VIRUSINĖS INFEKCIJOS METU

Baigiamasis magistro darbas

Darbo vadovė dr. Lina Jankauskaitė Vaikų ligų klinika

Kaunas, 2020

Turinys

SANTRAUKA ... 3

SUMMARY ... 4

PADĖKA ... 5

INTERESŲ KONFLIKTAS ... 5

BIOETIKOS KOMITETO PRITARIMAS ... 5

SANTRUMPOS ... 6

SĄVOKOS ... 9

ĮVADAS ... 10

DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI ... 12

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13

1.1. Trombocitai: jų sandara ir morfologija ... 13

1.2. Trombocitų funkcijos ... 16

1.3 Trombocitų sąsaja su imuninėmis ląstelėmis ... 17

1.4 Trombocitų aktyvacija virusinės infekcijos metu ... 20

1.5. Trombocitų aktyvacija bakterinės infekcijos metu ... 22

1.6 Trombocitų aktyvacija sunkios bakterinės infekcijos ir sepsio metu ... 25

2. TYRIMO METODIKA ... 27

2.1 Mėginių ištyrimas imunofermentinės analizės tyrimo metodu ... 28

2.1.1 CXCL4 ELISA tyrimo protokolas [51] ... 29

2.1.2 CXCL7 ELISA tyrimo protokolas [52] ... 30

2.2 Statistinė duomenų analizė ... 31

3. REZULTATAI ... 32

3.1. Bendrosios studijos grupės charakteristikos ... 32

3.2. Standartiniai žymenys ... 32

3.3. Trombocitų aktyvacijos žymenys ... 33

3.4. Specifiniai trombocitų aktyvacijos žymenys ... 35

3.5. Sepsio prognozė ... 36

REZULTATŲ APTARIMAS ... 39

IŠVADOS ... 42

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 43

SANTRAUKA

Darbo pavadinimas: Trombocitų aktyvacija bakterinės ar virusinės infekcijos metu.

Darbo autorius: Aistė Pociūtė

Darbo mokslinė vadovė: dr. Lina Jankauskaitė

Darbo tikslas: Atlikti vaikų, kurie sirgo bakterine ar virusine infekcija, trombocitų aktyvacijos analizę, atsižvelgiant į trombocitų kiekio, tūrio pokyčius ir trombocitų išsiriamų chemokinų CXCL4 ir CXCL7 koncentracijos pokyčius.

Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti trombocitų kiekio, dydžio ir tūrio pokyčius bakterinės ir virusinės infekcijos metu. 2. Nustatyti chemokinų CXCL4, CXCL7 koncentracijos pokyčius bakterinės ir virusinės infekcijos metu. 3. Nustatyti chemokinų CXCL4, CXCL7 jautrumą ir specifiškumą, prognozuojant sunkią bakterinę infekciją ir sepsį.

Metodai: Atliktas prospektyvinis tyrimas LSMU KK Vaikų skubios pagalbos skyriuje (VSPS). Į tyrimą įtraukti 68 vaikai. Įtraukimo kriterijai: nuo 1 mėnesio iki 5 metų; atvykę į VSPS <12val. nuo febrilaus karščiavimo pradžios; vaikai su sisteminio uždegiminio atsako sindromo (SUAS) požymiais. Neįtraukimo kriterijai: >5 metai; atvykę į VSPS >12val. nuo febrilaus karščiavimo pradžios; neurologiniai raidos sutrikimai (autizmo spektro sutrikimas ir kt.); lėtinės ligos; jau vartojantys antibiotikus. Atlikti CRB, BKT. Iš BKT vertinti leukocitų (Leu), neutrofilų (neutr) trombocitų (PLT) bei PLT rodiklių (PCT, PDW, MPV, P-LCR ir išvestinių PNLR, PLT/MPV) vertės. CXCL4 ir CXCL7 ištirti ELISA metodu surinkus ir apdorojus mėginius pagal standartinį LSMUL KK laboratorijos protokolą.

Rezultatai: Įtraukti 68 vaikai, iš kurių 37 (54,41%) berniukai. Virusinė infekcija (VI) diagnozuota 42 (61,8%), nesunki bakterinė infekcija (BI) - 10 (14,7%), sunki bakterinė infekcija (SBI) 16 (23,5%) tiriamųjų (iš jų 4 - sepsis). BI metu buvo didesnės Leu ir neutr, o SBI - CRB vertės (atitinkamai p=0,0001, p=<0,0001, p=0,0017). PCT buvo aukštesnis SBI metu (p=0,0758). PNLR vertės didesnės SBI grupėje (p=0, 0157). Kitų SBI metu (išskyrus sepsį) PNLR vertės taip pat buvo aukštesnės (p=0,0085). PLT ir MPV turėjo tendenciją skirtis tarp grupių, tačiau statistinio patikimumo negauta (atitinkamai p=0,0730, p=0,0868). PLT, MPV, PDW ir P-LCR turėjo tendenciją būti aukštesni sepsio metu (atitinkamai p=0,4984, p=0,0559, p=0,0704, p=0,0740). PLT/MPV buvo žemesnis sepsio grupėje lyginant su visais kitais susirgimo atvejais (p=0,0898). Didžiausia CXCL7 koncentracija buvo sepsio grupėje (100,4±5,82pg/ml) ir tai reikšmingai skyrėsi nuo VI, BI ir kitų SBI (atitinkamai p=0,0024, p=0,0237, p=0,0169). Nustatyta, jog CXCL7 koncentracijai esant <95,04pg/ml, jautrumas ir specifiškumas nustatyti sepsį, lyginant su kitomis SUAS priežastimis buvo atitinkamai 81,25% ir 75% (AUC=0,91, p=0,005985),o CXCL7 koncentracijai, esant <81,20pg/ml tikėtinumo santykis nustatyti SBI buvo 2,05 (AUC=0,6436, p=0,08410). Aukštesni CXCL4 rodikliai nustatyti VI grupėje (35,40±4,47pg/ml), lyginant su sepsiu (p=0,0774). Tačiau šis rodiklis nebuvo pakankamai jautrus ir specifiška diferencijuoti sepsį Išvados: 1. PNLR reikšmės buvo statistiškai reikšmingai didesnės SBI grupėje. Pastebėjome tendencijas, jog PLT, PLT/MPV, PCT rodikliai buvo aukštesni SBI, o MPV - VI metu. Sepsio metu tendencingai aukštesnės buvo MVP, PDW, P-LCR vertės. PLT/MPV turėjo tendenciją būti aukštesnis infekcijų metu, kai sepsis nebuvo nustatytas. 2. CXCL7 koncentracija buvo statistiškai reikšmingai didesnė sepsio metu, o CXCL4 – virusinių infekcijų metu. 3. CXCL7 koncentracijai esant <95,04pg/ml, jautrumas ir specifiškumas nustatyti sepsį, lyginant su kitomis SUAS priežastimis, buvo atitinkamai 81,25% ir 75%

(AUC=0,91, p=0,005985). Tai leidžia daryti išvadą, jog chemokinas CXCL7 yra daug žadantis žymuo

ankstyvai sepsio ir SBI diagnostikai.

SUMMARY

The title of Master‘s thesis: Platelet activation in bacterial or viral infection The author of Master‘s thesis: Aistė Pociūtė

The Head of the thesis: Lina Jankauskaitė, MD, PhD

Aim: To perform a platelet activation analysis in children with bacterial or viral infection, taking into consideration due to changes in platelet count, volume, and changes of concentration of platelet-derived chemokines CXCL4 and CXCL7.

Objectives: 1. To investigate changes of platelet count, size and volume during bacterial and viral infection. 2. To determine the changes of the concentration of chemokines CXCL4 and CXCL7 during bacterial and viral infection. 3. To investigate sensitivity and specificity of the chemokines CXCL4, CXCL7 in predicting severe bacterial infection and sepsis.

Methods: A prospective study was performed at the LUHSH KK Paediatric Emergency Department (PED). Inclusion criteria: <5 years; arriving at PED <12hrs after the onset of fever; with the Systemic inflammatory response syndrome (SIRS). Exclusion criteria: >5 years; >12hrs from the onset of fever;

study refusal; neurological developmental disorders (e.g. autism spectrum disorder, etc.); chronic diseases;

antibiotics use on arrival. Blood and CRP samples were taken. Leucocytes (WBC), neutrophils (Neu), platelets (PLT) and PLT indices (MPV, PCT, PDW, P-LCR and PLT/MPV, PNLR) were analysed.

CXCL4 and CXCL7 were analysed via ELISA according to manufacturer’s instructions.

Results: 68 children were included, from them 37 (54.41%) were boys. Viral infection (VI) was diagnosed for 42 (61.8%), mild bacterial infection (BI) for 10 (14.7%), severe bacterial infection (SBI) for 16 (23.5%) patients (sepsis 4 of them). WBC and Neu values were higher in BI, CRP - in SBI (p=0.0001, p=<0.0001, p=0.0017 respectively). PCT was higher in SBI (p = 0.0758). PNLR values were higher in the SBI group (p=0.0157). PNLR values were also higher in other SBI group (except sepsis) (p=0.0085). PLT and MPV tended to differ between groups, but no statistical significant was obtained (p=0.0730, p=0.0868, respectively). PLT, MPV, PDW, and P-LCR tended to be higher during sepsis (p=0.4984, p=0.0559, p=0.0704, p=0.0740 respectively). PLT/MPV was lower in sepsis group compared to all other cases (p=0.0898). The highest expression of CXCL7 was observed in sepsis group (100.4±5.82pg/ml) with a significant difference compared to VI, BI or other SBI (p=0.0024, p=0.0237, p=0.0169 respectively). CXCL7 concentration <95.04pg/ml demonstrated sensitivity of 81.25% and specificity of 75% to distinguish sepsis compared to other causes of SUAS (AUC=0.91, p=0,005985). The likelihood ratio of 2.05 to predict SBI was when CXCL7 concentration <81.20pg/ml (AUC = 0.6436, p = 0.08410).

Higher CXCL4 values were found in VI (35.40±4.47pg/ml) compared to sepsis (p=0.0774), however, it was not sensitive nor specific to predict sepsis.

Conclusions: 1. PNLR values were statistically significantly higher in the SBI group. We observed tendencies that PLT, PLT/MPV, PCT were higher in SBI, and MPV - in VI. MVP, PDW, P-LCR values tended to be higher in sepsis. PLT / MPV tended to be higher during infections when sepsis was not detected. 2. CXCL7 concentration were statistically significantly higher in sepsis. There was a tendency for chemokine CXCL4 values to be higher in viral infections. 3. When CXCL7 concentration was

<95.04pg/ml, the sensitivity and specificity to diagnose sepsis compared to other causes of SIRS was

81.25% and 75% respectively (AUC=0.91, p=0.005985). This suggests that CXCL7 could be a new

promising marker for early diagnosis of sepsis and SBI.

PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju savo baigiamojo magistrinio darbo vadovei dr. Linai Jankauskaitei už didžiulę pagalbą, paskatinimą, palaikymą ir neblėstančią kantrybę, ruošiant šį darbą. Taip pat dėkoju gyd. A.

Dagiui už pagalbą ir suteiktą prieigą ištirti mėginius. Prof. R. Kėvalui dėkoju už galimybę atlikti šį magistro darbą Vaikų ligų klinikoje.

INTERESŲ KONFLIKTAS

Interesų konflikto nėra.

BIOETIKOS KOMITETO PRITARIMAS

Baigiamojo magistrinio darbo tyrimui buvo išduotas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto

Bioetikos centro pritarimas. Išduoto pritarimo numeris – BEC-MF-225, išdavimo data – 2020-01-23.

SANTRUMPOS

1. AKS : arterinis kraujo spaudimas 2. AUC : plotas po kreive

3. °C : temperatūros matavimo vienetas Celsijaus temperatūros matavimo skalėje 4. amp : apsisukimai per minutę

5. BAL : bronchoalveolinis lavažas 6. BKT : bendras kraujo tyrimas

7. CD : ląstelės diferenciacijos klasteris 8. CD40L : CD40 ligandas

9. CRB : C reaktyvusis baltymas

10. CXCL4/PF-4 : trombocitų faktorius 4

11. CXCL7/NAP-2 : trombocitų faktorius 7/neutrofilus aktyvinantis peptidas 2 12. DENV : Dengės virusas

13. EMCV : encefalomiokardito virusas 14. EP : makrofagų paviršiaus receptoriai 15. fL – femtolitras (dm

)

16. G-CSF : granulocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius, 17. GPIb : glikoproteinas Ib

18. H1N1 : gripo A viruso potipis 19. HCV : hepatito C virusas 20. IFN : interferonas

21. IgG : imunoglobulinas G 22. IL-11 : interleukinas 11 23. IL-3 : interleukinas 3 24. IL-6 : interleukinas 6 25. IVA : gripo virusas A 26. k/min : kartai per minutę

27. K12 : nepatogeniška E. coli padermė K12

28. KPL : kapiliarų prisipildymo laikas

29. KR : komplemento receptoriai

30. L : litras

31. Leu : leukocitai

32. LIF : leukemiją slopinantis faktorius 33. Mac-1 : makrofagų receptorius 1 34. mg/l : miligramai litre

35. MPV : vidutinis trombocitų tūris

36. NET : neutrofilų ekstraląsteliniai spąstai 37. NK : natūralūs kileriai

38. O18:K1 : patogeniška E. coli padermė 018:K1

39. oSBI : kitos sunkios bakterinės infekcijos, atmetus sepsį 40. P : apskaičiuotasis reikšmingumo lygmuo

41. P-LCR - didelių trombocitų santykis

42. PaCO2 : parcialinis (dalinis) alveoliarinio anglies dvideginio slėgis 43. PAMPS : su patogenais susiję molekuliniai raštai

44. PCT – trombocitų užimamas tūris kraujyje 45. PDGF : trombocitų išskiriamas augimo faktorius 46. PDW - trombocitų pasiskirstymo plotis

47. PG : prostaglandinas 48. pg/ml : pikogramai litre 49. PGE-2 : prostaglandinas 2 50. PLT : trombocitų skaičius

51. PLT/MPV - trombocitų skaičiaus ir vidutinio trombocitų tūrio santykis 52. PNLR - neutrofilų ir limfocitų sandauga iš trombocitų skaičiaus

53. PSGL-1 : P-selektino glikoproteino ligandas 1 54. ROS : reaktyvios deguonies formos

55. RSV : respiracinis sincitinis virusas 56. SBI : sunki bakterinė infekcija

57. SCF : kamieninių ląstelių augimo faktorius 58. SUAS : sisteminio uždegiminio atsako sindromas 59. ŠSD : širdies susitraukimų dažnis

60. TLR : Transmembraniniai atpažinimo receptoriai 61. TNFα : tumoro nekrozės faktorius-alfa

62. TPO : trombopoetinas

63. TPO-R : trombopoetino receptorius

64. Trombocidinas : TC 65. TSP : trombospondinas

66. VEGF : kraujagyslių endotelio augimo faktorius 67. vWF : von Vilebrando faktorius

68. ŽIV : žmogaus imunodeficito virusas

69. µm : mikrometras

SĄVOKOS

1. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) – imunofermentinis analizės metodas, naudojamas nustatyti antikūnių ir antigeno buvimą mėginyje.

2. Epitopas - dar vadinamas antigeniniu determinantu yra antigeno dalis, kurią atpažįsta imuninė sistema. Neoepitopas yra epitopas, su kuriuo imuninė sistema dar nebuvo susidūrusi.

3. Neutrofilų ekstraląsteliniai spąstai (NET) - struktūros, kurios daugiausiai yra sudarytos iš neutrofilų deoksiribonukleorūgšties (DNR) ir baltymų. Šios struktūros geba greitai naikinti į organizmą patekusius patogenus.

4. SUAS – sisteminio uždegiminio atsako sindromas, kuriam būdingi ≥2 klinikiniai kriterijai iš toliau išvardintų: kūno temperatūra >38 °C ar <36°C; širdies susitraukimų dažnis >90 k/min (ar tachikardija, atsižvelgiant pagal amžių); kvėpavimo dažnis >20k/min (arba tachipnėja, atsižvelgiant pagal amžių); leukocitozė (vertinant pagal amžių).

5. Su patogenais susiję molekuliniai raštai (PAMPS) - mikrobinės kilmės junginiai, kurie sužadina apsauginį organizmo atsaką.

6. Reaktyvios deguonies rūšys (ROS) - nestabilios molekulės savo sudėtyje turinčios deguonies ir galinčios lengvai reaguoti su kitomis ląstelės molekulėmis. Reaktyvios deguonies rūšys yra laisvieji radikalai, dar vadinamas deguonies radikalu.

7. Virusas H1N1 - gripo viruso A potipis, kuris cirkuliuoja žmonių ir kiaulių populiacijose. Ši gripo A viruso atmaina 1918 metais sukėlė Ispaniškojo gripo pandemiją, kuri pražudė 50-100 milijonų.

žmonių visame pasaulyje.

ĮVADAS

Trombocitai – kraujo forminiai elementai, kurie neturi branduolio ir yra gaminami megakariocitų [1]. Ilgą laiką svarbiausia jų funkcija buvo laikoma tai, kad jie dalyvauja hemostazėje - kraujo krešėjimo ir žaizdų gijimo procesuose. Ši trombocitų funkcija vis dar yra laikoma svarbiausia, tačiau paskutiniu metu buvo atrasta, kad jie atlieka ir kitas ne mažiau svarbias funkcijas žmogaus organizme.

Sisteminis uždegiminio atsako sindromas (SUAS) yra nespecifinis procesas, kuris gali būti sukeltas tiek bakterinių, tiek virusinių patogenų. SUAS metu vykstantis klinikinis organizmo atsakas apima karščiavimą > 38°C, padidėjusį širdies susitraukimų dažnį >90k/min, kvėpavimo dažnio padidėjimą

> 20k/min arba PaCO2<32mmHg ir leukocitozę (>2 000/mm3), tačiau iš šių simptomų sunku spręsti apie infekcijos sukėlėjo kilmę. Ypač daug sunkumų kyla ankstyvojoje infekcinio proceso diagnostikoje.

Dažnai tuo metu vienintelis išreikštas klinikinis simptomas yra karščiavimas, tačiau jis nėra specifiškas tam tikram infekcijos sukėlėjui, todėl negali būti naudojamas, norint anksti išsiaiškinti mikroorganizmo, sukėlusio SUAS, kilmę. Ankstyvo kreipimosi į gydymo įstaigą metu (per pirmąsias 12 valandų nuo infekcijos pradžios) įprasti bendrojo kraujo tyrimo (BKT) rodikliai (C reaktyviojo baltymo (CRB) padidėjimas, leukocitozė) nėra pakankamai jautrūs, siekiant identifikuoti patogeną. Tai leidžia teigti, jog yra būtina naujų, greitų, patikimų ir pigių žymenų, padedančių nustatyti infekcijos sukėlėjo kilmę, paieška.

Siekiant greičiau nustatyti SUAS sukėlusio patogeno kilmę, buvo tiriamas trombocitų vaidmuo skirtingų infekcijų metu vykstančiose organizmo imuninėse reakcijose [1]. Dažniausiai infekcinių susirgimų metu kartu su kitais rodikliais (CRB, leukocitų (Leu) skaičiumi) yra stebimi trombocitų skaičius, dydis ir tūris. Įdomu tai, jog pastaraisiais metais buvo įrodyta ir trombocitų išskiriamų chemokinų bei citokinų reikšmė infekcinio proceso eigai. Atlikus tyrimus in vitro buvo pastebėta, jog trombocitų veikimo mechanizmas bakterinių ir virusinių ligų metu yra skirtingas. Įrodyta, kad trombocitai be savo nenuginčijamos svarbos hemostazėje atlieka esminį vaidmenį uždegiminiame bei imuniniame procesuose [2]. Jau žinomas ir priešvirusinis bei priešbakterinis trombocitų poveikis mikroorganizmams.

Mokslininkų gauti rezultatai leidžia daryti išvadą, jog ateityje trombocitai ir jų išskiriami chemokinai galėtų būti naudojami, kaip žymenys, padedantys patikimai ir greitai įvertinti infekcinio proceso kilmę.

Šio tyrimo metu buvo siekiama nustatyti trombocitų kiekio, dydžio ir tūrio pakitimus, esant

skirtingai SUAS etiologijai bei jų išraiškai (virusinei, bakterinei, sunkiai bakterinei). Taip pat buvo

siekiama ištirti trombocitų išskiriamus chemokinus - trombocitų faktorių 4 (CXCL4) ir trombocitų

faktorių 7 (CXCL7). Tikimasi, kad bus rastas ryšys tarp bakterinių ir virusinių infekcijų ir trombocitų

aktyvacijos. Tikimasi, kad rastas ryšys tarp infekcinio proceso ir trombocitų aktyvacijos ateityje galėtų

būti pritaikytas klinikinėje praktikoje, kaip patikimas žymuo, galintis padėti nustatyti infekcijos sukėlėjo

kilmę.

DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: atlikti vaikų, kurie sirgo bakterine ar virusine infekcija, trombocitų aktyvacijos analizę, atsižvelgiant į trombocitų kiekio, tūrio pokyčius ir trombocitų išsiriamų chemokinų CXCL4 ir CXCL7 koncentracijos pokyčius.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti trombocitų kiekio, dydžio ir tūrio pokyčius bakterinės ir virusinės infekcijos metu.

2. Nustatyti chemokinų CXCL4, CXCL7 koncentracijos pokyčius bakterinės ir virusinės infekcijos metu.

3. Nustatyti chemokinų CXCL4, CXCL7 jautrumą ir specifiškumą, prognozuojant sunkią

bakterinę infekciją ir sepsį.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Trombocitai: jų sandara ir morfologija

Trombocitai yra mažiausios kraujo apytakos ląstelės. Jie yra disko formos ir neturi branduolio [3]. Ramybės metu trombocitų skersmuo yra apie 2–3µm [4]. Vertinant trombocito sandarą (1 paveikslas) yra patogu jį suskirstyti į keturias pagrindines dalis - periferinę zoną, sol-gelio zoną, atliekančią trombocito citoskeleto funkciją, organelių zoną ir membranos sistemas [5].

1 paveikslas. Trombocito sandara [17]

Periferinė zona yra sudaryta iš gana lygios plazminės membranos ir glikokalikso, kuris yra

storesnis nei kitų kraujo forminių elementų [5]. Trombocitų viduje yra sol-gelio zona, kurią sudaro

skaidrus ir klampus matriksas. Šioje zonoje yra mikrotubulių, mikrofilamenų bei glikogeno. Įrodyta, kad

mikrotubulės palaiko diskoidinę žmogaus trombocitų formą [6]. Organelių zonoje yra trys pagrindiniai

sekrecinių organelių tipai: α-granulės, tankiosios granulės ir lizosomos (1 lentelė). Granulėse yra

sandėliuojami mediatoriai: krešėjimo ir angiogeniniai faktoriai, citokinai, chemokinai ir adhezijos

molekulės [7]. Esant tam tikroms sąlygoms, trombocitai gali pradėti gaminti ir kitus reikalingus

mediatorius. Kiekviename trombocite yra apie 50–80 α-granulių [7]. Šių granulių viduje yra adhezijos

glikoproteinai, Vilebrando ir krešėjimo faktoriai, įvairūs chemokinai tokie kaip CXCL4, kuris kitaip dar

vadinamas PF4, ir CXCL7 - taip pat žinomas, kaip NAP-2 [7]. Dauguma α-granulių dalyvauja kraujo

krešėjimo procese, tačiau taip pat atlieka svarbią funkciją įgimtame organizmo imunitete. Tankiosiose granulėse yra saugumos įvairios molekulės, kurios išsiskiria trombocitų aktyvacijos metu (serotoninas, CD63). Trečiojo tipo granulėse - trombocitų lizosomose - yra glikozidazės, rūgščių proteazės ir katijoniniai baltymai, pasižymintys baktericidiniu aktyvumu [7].

1 lentelė. Trombocitų sekrecinės granulės ir jų sudėtis [5; 7]

Skaičius trombocite

Diametras (nm)

Paviršiaus plotas trombocite

(µm

)

Granulių turinys

Funkcijos

α-granulės 50-80 200-500 14 vWF,

CXCL4, P-selektinas,

CXCL7

Hemostazė, uždegimas, angiogenezė,

miogenezė, organizmo apsauga.

Tankiosios

granulės 3-8 150 < 1 CD63,

serotoninas. Hemostazė, uždegimas.

Lizosomos < 3 200-250 < 1 Glikozidazės, rūgščių proteazės, katijoniniai

baltymai.

Endosominis virškinimas, bakteriocidinis

aktyvumas.

CD63 – ląstelės diferenciacijos klasteris 63; CXCL4 – trombocitų faktorius 4; CXCL7 – trombocitų faktorius 7; nm – nanometrai; vWF – Von Vilebrando faktorius; µm

mikrometrai kvadrate

Be trijų rūšių granulių organelių zonoje taip pat yra mitochondrijų, kurios užtikrina energijos gamybą, ir peroksisomų. Trombocitų membranų sistema sudaryta iš atvirosios kanalėlių sistemos ir tankiosios vamzdinės sistemos [5]. Atviroji kanalėlių sistema užtikrina plazmos komponentų pernašą į α- granules, padeda sekretuoti granulių turinį trombocitų aktyvacijos metu ir padeda trombocitams plisti po to, kai trombocitai prilimpa prie pažeistos kraujagyslės sienelės [8, 9].

Sveikų žmonių organizme normali trombocitų gyvavimo trukmė yra 7–10 dienų, kasdien jų yra pagaminama apie 100 milijardų trombocitų [3; 4]. Trombocitai yra gaminami iš megakariocitų. Jų gamyboje iš megakariocitų svarbią funkciją atlieka hormonas, glikoproteinas - trombopoetinas (TPO). Jis skatina megakariocitų aktyvumą kaulų čiulpuose ir reguliuoja trombocitų sintezę. TPO veikia visais trombopoezės etapais, kad sureguliuotų megakariocitų vystymąsi ir brendimą bei trombocitų išsiskyrimą.

Trombopoetinas daugiausia gaminamas kepenyse, tačiau taip pat dalis pagaminama kaulų čiulpuose ir

inkstuose [10]. Jis jungiasi su TPO receptoriais (TPO-R) kamieninių ląstelių, megakarioblastų,

megakariocitų ir trombocitų paviršiuje. Kartu su kitais kraujodaros citokinais ir augimo faktoriais, tokiais

kaip interleukinas (IL)-3, IL-6, IL-11, eritropoetinas, granuliocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius (G- CSF), leukemiją slopinantis faktorius (LIF) ir kamieninių ląstelių augimo faktorius (SCF), trombopoetinas skatina megakariocitų augimą ir diferenciaciją iš kaulų čiulpų ląstelių [10]. Vyksta trombocitų gamyba ir išsiskyrimas.

2 paveikslas. Trombopoezė [11]

1.2. Trombocitų funkcijos

Trombocitai yra specializuoti hemostazės efektoriai, atliekantys pagrindines funkcijas kraujagyslių trombozės metu ir žaizdų gijimo procese. Tačiau šiuo metu šios kraujo ląstelės yra vis labiau pripažįstamos ne tik, kaip pagrindinės ląstelės, kurios dalyvauja hemostazėje. Jau yra žinomas ir trombocitų vaidmuo kituose organizmo procesuose. Tai tokie procesai, kaip uždegimas, aterogenezė, navikinio proceso ir metastazių vystymasis [5].

Hemostazė užtikrina, kad organizmas po įvairaus stiprumo kraujagyslių pažeidimo būtų apsaugotas nuo galimo nukraujavimo. Pirminės hemostazės metu kraujavimas yra stabdomas, kai iš trombocitų yra suformuojamas krešulys. Šiame procese svarbiausią funkciją atlieka Vilebrando (vWF) faktorius, kuris jungiasi prie pažeisto kraujagyslės endotelio, skatina trombocitų agregaciją. Pirminėje hemostazėje taip pat dalyvauja kolagenas, kuris skatina trombocitų agregaciją. Antrinės hemostazės metu vyksta sudėtinga kraujo krešėjimo kaskada. Yra žinomi keli trombocitų aktyvacijos keliai, kurių metu gali vykti kraujo krešėjimo procesas (antrinė hemostazė). Tai - vidinis ir išorinis krešėjimo keliai. Jie abu pavaizduoti žemiau esančioje iliustracijoje (3 paveikslas).

3 paveikslas. Kraujo krešėjimo keliai [12]

Trombocitai dalyvauja ir keliuose organizmui nepalankiuose procesuose. Tai - navikinio proceso plitimas organizme ir aterosklerozė. Pavyzdžiui, kai kraujagyslių endotelis yra sveikas, trombocitų aktyvumas yra slopinamas mechanizmų, kurie veikia tiesiogiai arba skaidydami trombocitų agonistus [13]. Tuo tarpu, kai organizmo kraujagyslėse pradeda atsirasti pirmieji aterosklerotiniai pakitimai, sutrinka normali endotelio funkcija ir atsiranda antitromboziniai mechanizmai [13]. Manoma, kad uždegiminių ląstelių infiltraciją, kuri prisideda prie aterosklerotinės plokštelės formavimosi, yra skatinama trombocitų išskiriamų citokinų [14]. Navikinio proceso metu, naviko ląstelės atsiskiria nuo pirminio židinio ir patenka į kraujotaką. Tada jos iš karto suaktyvėja ir per pirmąsias minutes būna apsupamos suaktyvėjusių trombocitų [15, 17]. Trombocitai pradeda sekretuoti trombocitų išskiriamą augimo faktorių (PDGF), kraujagyslių endotelio augimo faktorių (VEGF) ir chemokinus, kurie slopina natūralių kilerių (NK) veikimą prieš naviko ląsteles. Galiausiai trombocitai, aktyvindami endotelio receptorius, padeda naviko ląstelėms sustoti prie kraujagyslės sienos ir palengvina jų prasiskverbimą į tolimojo organo subendotelinį matriksą [15]. Remiantis dabartinių tyrimų duomenimis, yra manoma, kad pirminiai navikai turi įtakos trombocitų gamybai per tiesioginį parakrininį signalo perdavimą į megakariocitus ir jų gebėjimą aktyvinti trombocitus [17].

1.3 Trombocitų sąsaja su imuninėmis ląstelėmis

Jau žinoma, kad trombocitai geba ne tik dalyvauti organizmo hemostazėje, tačiau ir ūminiame uždegime bei įgimtame imuniniame atsake. Naujausių tyrimų duomenimis trombocitai yra laikomi ląstelėmis, kurios pirmosios sugeba aptikti bakterinius, virusinius patogenus bei su jais susijusius pažeidimus ir pirmosios pradeda į juos reaguoti [1, 18]. Trombocitai cirkuliuoja kraujagyslių viduje, arti endotelio, todėl yra pirmosios ląstelės, kurios infekcijos vietoje būna įtraukiamos į kraujagyslės endotelį [18]. Tokia trombocitų funkcija lemia jų gebėjimu sąveikauti su kitomis imuninėmis ląstelėmis - neutrofilais, monocitais, makrofagais, dendritinėmis ląstelėmis.

Aktyvuoti trombocitai gali jungtis su leukocitais, juos nukreipti pažeidimo link, sustiprinti ir

palengvinti jų atliekamas imunines funkcijas. Yra žinoma daug sąveikų tarp leukocitų ir trombocitų,

tačiau jas visas galima suskirstyti į dvi plačias kategorijas - tai adhezinis trombocitų-leukocitų sąveikos

mechanizmas ir tirpių faktorių produkciją sąlygojanti sąveika [19]. Adhezinis trombocitų-leukocitų

sąveikos mechanizmas paremtas tuo, jog trombocitai savo paviršiuje talpina receptorius ir ląstelių

adhezijos molekules, kurie suriša leukocitus ir endotelio ląsteles [19]. Sąveikos metu susidaro trombocito-

neutrofilo kompleksas. Taip yra sustiprinamas neutrofilų veikimas, įskaitant fagocitozę, reaktyvių

deguonies formų (ROS) susidarymą, neutrofilų ekstraceliuliarinių spąstų (NET) susidarymą, trombocitų

adheziją, uždegiminių ląstelių migraciją ir neutrofilų degranuliaciją. Tokia sąveika vyksta per kelis receptorius, esančius trombocitų ir neutrofilų paviršiuje. Nustatyta sąveika tarp P-selektino, esančio ant trombocitų paviršiaus ir P-selektino glikoproteino ligando-1 (PSGL-1), kuris yra ant endotelio ląstelių ir neutrofilų. Tokiu būdu trombocitams pavyksta prisijungti prie uždegiminio endotelio, yra inicijuojamas ląstelinis uždegiminis atsakas, pritraukiant į uždegimo vietą monocitus, limfocitus ir neutrofilus. Kitas receptorius ląstelės diferenciacijos klasterio 40 ligandas (CD40L) taip pat yra ant trombocitų paviršiaus.

Po aktyvacijos jis jungiasi su ląstelės diferenciacijos klasteriu 40 (CD40), kuris yra ant neutrofilų paviršiaus. Tuo tarpu ant neutrofilų paviršiaus esantis makrofagų receptorius-1 (Mac-1) jungiasi su trombocitų paviršiuje esančiu glikoproteinu Ib (GPIb) ir taip skatina mikrovaskulinį uždegimą [19]. Mac- 1 jungiasi ir su žmogaus trombocitų receptoriumi αIIbβ3, tačiau tam būtina αIIbβ3 sąveika su fibrinogenu.

Tirpių faktorių produkciją sąlygojanti sąveika vyksta, kai iš trombocitų sekrecinių granulių išskiriamos tirpios medžiagos (chemokinai, citokinai), aktyvina arba padeda sugauti cirkuliuojančius leukocitus [19].

Šios medžiagos yra trombocitų sekrecinėse granulėse esantys chemokinai ir citokinai. Trombocitų transmembraniniai atpažinimo receptoriai-4 (TLR4) receptoriai geba aptikti kraujyje su patogenais susijusius molekulinius raštus (PAMPS), vyksta trombocitų aktyvacija. Kai trombocitai aktyvuojami per TLR4 receptorius, vyksta jų prisijungimas prie neutrofilų, kurie pirmiausia prilimpa prie kepenų sinusoidų ir plaučių kapiliarų, sukeldami neutrofilų aktyvaciją ir NET susidarymą [20]. Trombocitai gali išskirti mikrobicidinius baltymus, vadinamus trombocidinais (TC) [20]. Žinomas TC-1 ir TC-2 aktyvumas naikinant Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus ir Lactococcus lactis bakterijas [20]. Sąveikos metu iš sekrecinių granulių taip pat išsiskiria tirpūs mediatoriai: CXCL1,4,5,7,8,12, CCL2,3,5. Išsiskyrę mediatoriai dalyvauja trombocitų adhezijoje, kraujo krešėjime, uždegime, žaizdų gijime, naviko augime, angiogenezėje ir antimikrobininiame gynybiniame atsake. Gausiausias trombocitų granulėse esantis mediatorius yra CXCL7 [20]. CXCL7 gali sukelti neutrofilų adheziją endotelio ląstelėse ir neutrofilų migraciją [20]. Jis padeda leukocitams prasiveržti link infekcinio židinio ir endotelio [14, 21].

Taip pat trombocitai ir jų pirmtakai megakariocitai yra išskirtinis CXCL4 šaltinis [20]. Šis chemokinas

sukelia tvirtą neutrofilų sukibimą su endotelio ląstelėmis, suaktyvina monocitų funkcijas (įskaitant

fagocitozę, ir citokinų sekreciją). Iš trombocitų granulių išsiskyręs CXCL4 taip pat gali sukelti monocitų

diferenciaciją į makrofagus ir neleidžia jiems patirti spontaniškos apoptozės [20].

4 paveikslas. Trombocitų ir neutrofilų sąveika [20]

PSGL-1 – P-selektino glikoproteino ligandas 1 ; CD40 – ląstelių diferenciacijos klasteris 40 ; CD40L – ląstelių diferenciacijos klasterio 40 ligandas; Mac-1 – makrofagų receptorius 1 ; CXCL4 – trombocitų faktorius 4 ; CXCL7 – trombocitų faktorius 7;

P-sel – P-selektinas ; TLR2/4 – transmembraniniai atpažinimo receptoriai 2/4 ; GPIb – glikoproteinas Ib; αIIbβ3 – žmogaus trombocitų receptorius αIIbβ3 ; TC1+2 – trombocidinai 1 ir 2; t-PMP - trombino sukeltas trombocitų mikrobicidinis baltymas.

Ištyrus keletą odos uždegimo modelių, buvo pastebėta, jog trombocitai kartu su makrofagais būna

kraujagyslių išorėje ir makrofagų viduje sustiprina uždegime dalyvaujančių tarpininkų sintezę [22]. Nors

mechanizmai, kaip vyksta trombocitų sukelta monocitų ir makrofagų aktyvacija, nėra aiškūs, tačiau

manoma, kad tai priklauso nuo tiesioginės sąveikos su trombocitų receptoriais, tokiais kaip P-selektinas, ir

iš dalies nuo trombocitų sekretuojamų tirpių faktorių [22]. Trombocitai taip pat gali aktyvuoti makrofagus

išskirdami prostaglandinus (PG). Pastebėta, kad aktyvuoti trombocitai kartu su makrofagais gamina ir

išskiria PGE-2, kuris jungiasi su makrofagų paviršiuje esančiais receptoriais EP-1 ir EP-2. Kai įvyksta

makrofago aktyvacija per EP2 receptorių, didėja priešuždegiminį poveikį turinčio interleukino IL-10

sekrecija. Pastarasis jungiasi su IL-10 receptoriumi ir slopina uždegimą skatinančio tumoro nekrozės faktoriaus-alfa (TNFα) gamybą ir sekreciją [22].

1.4 Trombocitų aktyvacija virusinės infekcijos metu

Daugėja įrodymų, jog trombocitai vaidina svarbų vaidmenį bendroje organizmo gynyboje, tačiau yra dar specifiškesni virusinių infekcijų patogenezėje [23]. Jie veikia prieš virusinius patogenus per įvairius mechanizmus inicijuodami ir sustiprindami kitų imuninių ląstelių veiklą [1, 23].

Kai virusas patenka į organizmą, jis pradeda daugintis šeimininko ląstelėse. Kad virusinė infekcija sėkmingai išplistų organizme, svarbu, jog virusui pavyktų perduoti savo genetinę informaciją į ląstelės šeimininkės citoplazmą ar branduolį. Tuo metu įsijungia organizmo gynybiniai mechanizmai, kurių metu bandoma atpažinti patogeną ir užkirsti kelią infekcijos plitimui. Į organizmą patekus virusiniam infekcijos sukėlėjui, trombocitai pradeda reaguoti, vyksta jų aktyvacija. Savo paviršiuje trombocitai turi specifinius receptorius, kurie jiems palengvina viruso atpažinimą ir sudaro sąlygas sąveikauti tarpusavyje [1, 24]. Transmembraniniai atpažinimo receptoriai (TLR) yra atsakingi, kad infekcijos sukėlėjas būtų atpažintas ir prijungtas prie trombocito paviršiaus [24]. Tuo tarpu kiti - komplemento receptoriai (KR) gina organizmo ląsteles veikdami tiesiogiai ir netiesiogiai - jie geba sukelti ląstelių lizę, opsoniziją ir chemotaksį [24]. Ilgą laiką buvo manoma, kad tokia trombocitų-virusinių patogenų sąveika sukelia trombocitopeniją ir kokybinę trombocitų disfunkciją, kuri pasireiškia spontaniniu kraujavimu ir krešėjimo sutrikimais [25], tačiau dabar įrodyta, kad gali sukelti ir organizmui naudingą priešvirusinį atsaką.

Nustatyta, jog trombocitų aktyvacija užsikrėtus gripo viruso A (IVA) potipiu H1N1 yra labiau

išreikšta, lyginant su bakterinės pneumonijos atvejais, ir gali prisidėti prie gripo metu vykstančių

uždegiminių reakcijų [26]. Atlikus tyrimus su kraujo plazma buvo pastebėta, jog trombocitų ir monocitų

agregacija buvo didesnė gripu sirgusiems pacientams, užsikrėtusiems virusu H1N1 (21,4%±4,7%),

lyginant su pacientais, sergančiais bakterine pneumonija (10,9%±3,7%) ir kontrolinės grupės pacientais

(8,1%±4,5%, p<0,05) [26]. Ištyrus pelių, kurios buvo užkrėstos virusu H1N1, bronchoalveolinio lavažo

(BAL) ir kraujo plazmos mėginius, buvo nustatyta, jog sunkiais užsikrėtimo gripu atvejais trombocitai

suaktyvėja plaučiuose ir periferinėje kraujotakoje [27]. Manoma, kad IVA aktyvuoja trombocitus per

trombocitų aktyvacijos receptorių FcγRIIA [27]. Ištirta, jog gripo virusas gali aktyvuoti trombocitus ir

veikdamas per kitus receptorius, pavyzdžiui, transmembraninį atpažinimo receptorių-7 (TLR7). Neseniai

atliktas tyrimas parodė, kad trombocitų TLR7 tarpininkauja aktyvuojant trombocitus, kai organizmas

susiduria ir su kitais virusais, pavyzdžiui encefalomiokardito virusu (EMCV) [28]. Tokia sąveika lemia

granulių išsiskyrimą iš trombocitų ir P-selektino bei CD40L ekspresiją trombocituose [28-29]. Buvo tiriama trombocitų aktyvacija Dengės karštligės metu. Didelis Dengės viruso (DENV) kopijų skaičius tiesiogiai koreliavo su padidėjusia trombocitų aktyvacija ir padidėjusiu komplemento faktoriaus C3 ir IgG surišimu ant trombocitų paviršiaus [30]. Padidėjusi trombocitų aktyvacija nustatyta ir esant dideliam dengės viruso serotipo-2 (DENV2) kopijų skaičiui [30].

Trombocitai gali tiesiogiai atpažinti ir pašalinti virusinius patogenus, išlaisvindami savo sekrecinėse granulėse esančius imuninius mediatorius. Jie skatina leukocitų aktyvumą ir didina imuninio atsako intensyvumą [1, 31, 32]. Tiriant trombocitų poveikį žmogaus imunodeficito virusui (ŽIV), buvo nustatyta, jog trombocitai, kuriuose yra granulių, efektyviau slopina ŽIV-1 infekcijos plitimą nei degranuliuoti trombocitai [33]. Gausiausias chemokinas, kuris išskiria iš trombocitų α-granulių, yra CXCL4 [34], tačiau manoma, kad kiti chemokinai taip pat gali būti reikšmingi ŽIV viruso patogenezėje. Į tyrimą, kurį atliko Hao ir autoriai, buvo įtraukti pacientai sergantys ilgą laiką neprogresuojančia ŽIV infekcija. Ištyrus šių pacientų serumo ėminius, buvo pastebimas reikšmingas CXCL7 koncentracijos padidėjimas (p<0,05) [35]. Chemokinai yra svarbūs ir gripo viruso (IV) patogenezėje [1]. Atlikus tyrimą su pelėmis, kurios buvo užkrėstos H1N1 gripo virusu, buvo nustatytos didesnės chemokino CXCL4 koncentracijos jų kraujyje ir plaučiuose [1]. Tuo tarpu, kai pelių organizme trūko CXCL4, infekcijos metu išsivystęs plaučių uždegimas ir alveolių pažeidimas buvo labiau išreikšti, o mirtingumas - didesnis [1].

Įrodyta, kad CXCL4 yra svarbus nukreipiant neutrofilus pašalinti gripo A virusą [32].

Aktyvuoti trombocitai taip pat pasižymi tuo, jog gali vykdyti fagocitozę prieš virusinį patogeną (4 paveikslas). Virusinės infekcijos metu iš trombocitų granulių yra išskiriamas P-selektinas, kuris padidina trombocitų ir leukocitų sąveiką, bei skatina fagocitozę. Trombocitų fagocitozinį aktyvumą geriausiai įrodo trombocitų reakcija su žmogaus imunodeficito virusu (ŽIV) [24]. Paveikus trombocitus ŽIV ir atlikus morfologinį tyrimą, ŽIV antigenai buvo rasti į vakuoles panašiose struktūrose ir atvirojoje kanalėlių sistemoje [36]. Nustatyta, kad trombocitai geba fagocituoti ne tik ŽIV, tačiau ir hepatito C virusą (HCV), Dengės, gripo virusus [1, 29, 36]. Apibendrinant galima teigti, jog trombocitai geba atlikti visas pagrindines fagocitozės stadijas ir pašalinti iš organizmo viruso daleles.

Kullaya ir autorių tyrimas parodė, jog trombocitai gali slopinti respiracinio sincitinio viruso (RSV) sukeltą infekciją. Tai vyksta trombocitams skatinant interferono (IFN) gamybą iš leukocitų [23].

IFN svarbus RSV patogenezėje, nes gali reguliuoti viruso pašalinimo greitį ir tiesiogiai sukelti imunines

reakcijas, kurios siejamos su organizmo apsauga ir lengvesne susirgimo eiga [33]. INF antivirusinis

veikimas taip pat gali būti sustiprintas per chemokino CXCL7 veikimą [35].

4 paveikslas. Morfologinis trombocitų, paveiktų ŽIV dalelėmis, tyrimas [36]. A : ŽIV dalelės randamos mažose vakuolėse ir į endosomas panašiose struktūrose (padidinimas: × 36 800; × 55 200). B, C : ŽIV dalelės atvirojoje kanalėlių sistemoje (padidinimas: × 41 850). Paaiškinimai: pm: plazminė membrana; AKS: atviroji kanalėlių sistemą; ŽIV: žmogaus imunodeficito

virusas; mi: mitochondrijos

Įvertinus atliktų klinikinių tyrimų rezultatus, galima daryti išvadą, kad virusinės infekcijos metu vyksta trombocitų aktyvacija, kuri lemia, kad šios ląstelės užima svarbią vietą organizmo gynyboje nuo virusinės infekcijos sukėlėjų. Remiantis mokslininkų gautais rezultatais būtų galima teigti, jog trombocitai ateityje galėtų palengvinti virusinių infekcijų diagnostiką ir gydymą, tačiau trūksta tyrimų, kurie padėtų detaliau išsiaiškinti trombocitų vaidmenį ir aktyvacijos mechanizmą ūmių respiracinių virusinių infekcijų metu. Šie tyrimai reikalingi, kad būtų galima palengvinti ūminių virusinių respiracinių infekcijų diagnostiką.

1.5. Trombocitų aktyvacija bakterinės infekcijos metu

Trombocitai gali sąveikauti su įvairiomis bakterijų padermėmis. Ši trombocitų-bakterijų sąveika

gali būti tiesioginė ir netiesioginė. Tiesioginė sąveika vyksta dėl bakterijos paviršiaus baltymų ir

trombocitų receptorių jungimosi. Netiesioginė sąveika įvyksta tuomet, kai bakterijos jungiasi prie plazmos

baltymų, pavyzdžiui, von Vilebrando faktoriaus (vWF) arba fibrinogeno, kurie veikia, kaip trombocitų

receptorių ligandai ir vėliau gali jungtis prie atitinkamo trombocitų receptoriaus [20, 37]. Yra žinomas ir trečias trombocitų-bakterijų sąveikos mechanizmas - jis vyksta dėl bakterijų išskiriamų toksinų.

Tiesioginės sąveikos mechanizmas aiškinamas tuo, kad trombocitai ir bakterijos gali sąveikauti tiesiogiai per trombocitų paviršiuje esančius receptorius. Vienas tokių receptorių yra IFcγRIIa. Vidutiškai trombocitai turi apie 5000 kopijų šių receptorių, todėl yra reikšmingi antibakteriniame trombocitų atsake [38]. Bakterinės infekcijos metu CXCL4 išsilaisvina iš trombocitų α-granulių. Šiam chemokinui yra būdingas katijoninis (teigiamas) krūvis. Dėl šios priežasties CXCL4 jungiasi prie neigiamai įkrauto bakterijos paviršiaus ir atpažįsta anijonines molekules bakterijos paviršiuje (5 paveikslėlis) [39]. Kai prisijungia prie bakterijos paviršiaus, CXCL4 patiria konformacijos pokyčius. Susidaro neoepitopas, kurį atpažįsta susidarę antikūnai. Jie gali veikti daug skirtingų mikroorganizmų. Vyksta imunoglobulino G (IgG)-CXCL4 komplekso jungimasis su trombocitų aktyvacijos receptoriumi FcγRIIA [39]. Aktyvavus trombocitą, prasideda baktericidinių medžiagų išsiskyrimas iš trombocitų granulių. FcyRIIA sukeltas bakterijų naikinimas sąlygoja tolesnį αllbβ3 integrino stimuliavimą. Tai sukelia trombocitų agregaciją ir toliau skatina aktyvaciją. Bakterinis sukėlėjas galiausiai būna apsuptas aktyvuotais trombocitais [39].

5 paveikslas. Tiesioginis baktericidinis trombocitų veikimas [39]. CXCL4 jungiasi prie bakterijos paviršiaus. Vyksta

CXCL4 konformacijos pokyčiai, susidaro neoepitopas, kurį atpažįsta antikūnai. Jie gali veikti daug skirtingų mikroorganizmų.

Vyksta imunoglobulino G (IgG)-CXCL4 komplekso jungimasis su trombocitų aktyvacijos receptoriumi FcγRIIA ir bakterijų naikinimas.

Netiesioginė trombocitų-bakterijų sąveika vyksta dėl bakterijų jungimosi su plazmos baltymais.

Šioje sąveikoje svarbūs trombocitų glikoproteinai. Pavyzdžiui, trombocitų glikoproteinas GPIIb–IIIa yra receptorius fibrinogenui ir fibronektinui. Bakterijų ir trombocitų jungimąsi sąlygoja tai, jog kai kurios bakterijos, pavyzdžiui, Stafilokokai savo paviršiuje turi receptorius, kurie taip pat yra specifiški fibrinogenui ir fibronektinui. Per šių ligandų veikimą vyksta ir S.aureus ir kitų stafilokokų jungimasis su GPIIb–IIIa receptoriumi [38]. Taip pat bakterijų-trombocitų sąveika gali vykti per trombocitų paviršiuje esantį glikoproteiną GPIbα. Jis gali jungtis su keliais ligandais dėl savo panašumo į vWF. Sąveika vyksta su S.aureus ir H.pylori, kurie savo paviršiuje turi receptorius, specifiškus vWF.

Trečiasis mechanizmas veikia, kai bakterijų išskiriami toksinai, priklausomai nuo bakterijos etiologijos, gali suaktyvinti arba slopinti trombocitus. Trombocito atsakas į bakterinio patogeno išskiriamą toksiną gali turėti didelę reikšmę ligos eigai [39]. Pavyzdžiui, S. aureus išskiria toksiną α-toksiną, kuris skatina kraujo krešėjimą per V kraujo krešėjimo faktoriaus atpalaidavimą iš α-granulių [40].

Porphyromonas gingivalis sukelia tarpląstelinio kalcio padidėjimą trombocituose ir sukelia jų agregaciją [41]. Ši bakterija taip suaktyvina proteazės-aktyvuotus receptorius, kurie yra trombocitų paviršiuje [40].

Tokiu veikimo principu suaktyvėję trombocitai gali pašalinti bakterinį patogeną.

Kai trombocitai ir bakterijos sąveikauja, veikiant vienam iš trijų galimų sąveikos mechanizmų, trombocitai yra aktyvuojami. Prasideda bakterijų sukelta trombocitų agregacija ir tikslus uždegiminis atsakas, nukreiptas prieš bakteriją - iš trombocito granulių išsilaisvina chemokinai, vyksta leukocitų aktyvacija, formuojasi neutrofilų ekstraląsteliniai spąstai (NET). Skirtingų bakterinių infekcijų metu, trombocitų aktyvacija skiriasi. Buvo tiriama nepatogeniškų (K12) ir patogeniškų (O18:K1) Escherichia coli padermių įtaka trombocitų aktyvacijai, atliekant citometrinę P-selektino ir CD63 ekspresijos analizę [42]. Priklausomai nuo bakterijų koncentracijos, kontaktas su E. coli K12 lėmė P-selektino (24–51,3%), CD63 (15,9–24,3%) padidėjimą [42]. Tuo tarpu E. coli O18:K1 nepaveikė šių žymenų [42]. Kitas tyrimas įrodė, jog gramneigiamų (E.coli) ir gramteigiamų (Stafilokokų ir Streptokokų) mikroorganizmų sukeliama trombocitų aktyvacija vyksta dėl tų pačių receptorių aktyvavimo. Šis mechanizmas apima nuo IgG priklausomą FcγRIIA Src ir Syk kinazių aktyvaciją, kurią sustiprina αIIbβ3 įsitraukimas ir antriniai tarpininkai [43].

Ištirtas chemokino CXCL4 vaidmuo bakterinės infekcijos metu. Šis chemokinas pasižymi

apsauginiu poveikiu ūmaus plaučių pažeidimo, sukelto P. aeruginosa, metu [44]. Apsauginis

mechanizmas yra susijęs su CXCL4 gebėjimu aktyvuoti ir sustiprinti neutrofilų priešbakterinį veikimą.

Taip pat pastebėta, kad atvejais, kai trūksta chemokino CXCL4, bakterijų fagocitozė vyksta mažiau intensyviai ir tai įrodo, kad CXCL4 vaidina lemiamą reikšmę bakterijų pašalinime ūmios plaučių infekcijos, kurią sukelia P. aeruginosa, metu [44]. Manoma, kad CXCL4 atlieka plaučių apsauginę funkciją ir tuberkuliozės susirgimo atveju. Buvo pastebėta, jog padidėjusi chemokino CXCL4 koncentracija koreliuoja su plaučių tuberkuliozės mastu krūtinės rentgenogramoje [45]. Ištyrus 8 pacientus su minimaliais, 10 su vidutiniais ir 7 su ryškiais plaučių pakitimais, matomais rentgenogramoje, buvo pastėta, kad visi tuberkulioze sirgę asmenys turėjo statistiškai reikšmingai (p < 0,001) didesnę CXCL4 koncentraciją kraujo plazmoje [45]. CXCL4 veikia ir prieš kitus bakterinius patogenus, pavyzdžiui, E.coli, Stafilokokų šeimą, Neisseria gonorrhea ir H.pylori [20;46]. Išsiaiškinus, jog kitas chemokinas - CXCL7 taip pat sukelia chemotaksį ir gali padėti fagocitams kovoti prieš bakterinius mikroorganizmus, buvo tirtas jo vaidmuo Legionella pneumophila ir M. tuberculosis sukeltose infekcijose [47]. Nustatyta, kad CXCL7 sustiprino antimikrobinį aktyvumą prieš L. pneumophila, bet ne prieš M. tuberculosis [47]. CXCL7 taip pat slopino tarpląstelinį L. pneumophila dauginimąsi [47].

Remiantis atliktais tyrimais, galima daryti išvadą, kad yra įrodyta trombocitų aktyvaciją bakterinių infekcijų metų. Aktyvuoti trombocitai padeda organizmui gintis nuo bakterinių patogenų tiesiogiai arba sužadindami kitas organizmo imuninės sistemos ląsteles. Deja, tačiau šiuo metu yra turima mažai duomenų apie trombocitų vaidmenį infekcijų metu, kurias sukėlė dažniausiai pasitaikantys patogenai - Haemophilus influenza, Streptococcus pneumoniae.

1.6 Trombocitų aktyvacija sunkios bakterinės infekcijos ir sepsio metu

Nepaisant nenuginčijamos medicinos pažangos, sepsio diagnostika ir gydymas vis dar kelia daugybę sunkumų. Nors mirtingumas nuo sepsio ir sisteminio uždegiminio atsako yra sumažėjęs, tačiau išlieka nustatyta, jog daugiau nei 25–30% sepsinių pacientų patiria mirtinas išeitis dėl dauginio organų pažeidimo [48]. Kad būtų galima sumažinti mirtinų komplikacijų skaičių, būtina detaliai išsiaiškinti sepsio patogenezę ir pagerinti ankstyvos diagnostikos galimybes. Jau įrodyta neutrofilų rolė sesio metu vykstančiose procesuose, tačiau paskutiniais metais daug dėmesio skiriama, siekiant išsiaiškinti trombocitų vaidmenį sepsio, SUAS ir sunkios bakterinės infekcijos (SBI) patogenezėse.

Atlikus trombocitų aktyvacijos žymenų tyrimus, buvo įrodyta, kad SUAS (taip pat ir SBI ar

sepsio) metu taip vyksta trombocitų aktyvacija. Ištyrus sepsinių pacientų kraujo plazmą, nustatytas

trombocitų aktyvacijos žymenų CD62P, trombospondino (TSP), CD63, CD40L, β-tromboglobulino

koncentracijų bei β-tromboglobulino ir chemokino CXCL4 santykio padidėjimas [28]. Tiesioginė

aktyvuotų trombocitų sąveika su leukocitais arba endotelio ląstelėmis per paviršiuje ekspresuojamus

CD62P arba CD40L prisideda prie uždegiminio šeimininko atsako į sepsį ir skatina bakterijų klirensą bei organų pažeidimus [49]. Padidėjęs CD62P skatina trombocitų-neutrofilų agregatų susidarymą pelių, kurioms sukeltas sepsis, kraujyje, o sumažėjusi CD40L koncentracija lemia sumažėjusią tiesioginę trombocitų-leukocitų sąveiką ir slopina neutrofilų infiltraciją [49]. Kito tyrimo su pelėmis metu, kurį atliko Hook ir autoriai [48], buvo tiriama trombocitų aktyvacija, vertinant chemokinų CXCL4 ir CXCL7 koncentracijas. Tyrimo metu pelėms buvo dirbtinai sukeltas SUAS. Rasta padidėjusi CXCL4 ir CXCL7 koncentracija pradžioje ir praėjus 24 valandos po sukelto sisteminio uždegiminio atsako sindromo [48].

Jog trombocitų produkuojamas chemokinas CXCL4 gali būti laikomas trombocitų aktyvacijos žymenimi, įrodo ir kiti atlikti moksliniai tyrimai. Hwaiz ir autoriai [50] atliko tyrimą su pelėmis, kurioms buvo dirbtinai sukeltas polimikrobinis sepsis. Nustatyta, jog jų kraujo plazmoje CXCL4 koncentracija buvo padidėjusi, o trombocitų išeikvojimas sukėlė CXCL4 koncentracijos kraujo plazmoje sumažėjimą [50]. To paties tyrimo rezultatai parodė, jog CXCL4 sumažino plaučių edemos formavimąsi 65% ir sumažino sukelto plaučių audinio pažeidimą 67% pelių, kurios sirgo sepsiu [50]. Tokie rezultatai įrodo trombocitų aktyvacijos svarbą organizmo gynybiniame atsake sepsio metu ir patvirtina, jog chemokinas CXCL4 pasižymi apsauginiu poveikiu [49, 50].

Assinger ir autorių studija [49] tyrė kitų chemokinų ir citokinų reikšmę sepsio patogenezėje.

Šiam tyrimui taip pat buvo naudojamas pelės su žmogaus trombocitų FcγRIIA receptoriais. Pelėms buvo dirbtinai sukeltas sepsis. Nustatyta, jog sepsio metu susidarę imuniniai kompleksai sukelia trombocitų patekimą į plaučius [49]. Plaučiuose iš trombocitų tankiųjų granulių išsiskiria serotoninas, kuris aktyvina endotelio ląsteles, skatina neutrofilų ahdeziją ir ekstravazaciją.

Manoma, jog interleukinas IL-27 galėtų būti naudojamas, kaip diagnostinis žymuo vaikams, sergantiems sepsiu [38]. Sepsio metu aktyvuoti trombocitai yra šio interleukino šaltiniai, o sepsio metu susidaręs trombinas taip pat didina IL-27 sekreciją [38].

Daug sunkumų kyla ankstyvoje sepsio ir sunkios bakterinės (SBI) infekcijos diagnostikoje, ypač

tais atvejais, kai vienintelis pasireiškiantis klinikinis simptomas yra karščiavimas ir nėra kitų sepsiui/SBI

būdingų požymių. Kadangi karščiavimas nėra patikimas diagnostikos rodiklis diferencijuoti virusines,

bakterines, sunkias bakterines infekcijas ar sepsį, yra reikalinga ieškoti naujų, patikimų, nebrangių ir

greitų sepsio žymenų, kurie palengvintų ankstyvą sepsio diagnostiką, padėtų greičiau suteikti reikalingą

gydymą ir sumažinti mirtinų išeičių skaičių.

2. TYRIMO METODIKA

Atliktas prospektyvinis tyrimas LSMU KK Vaikų skubios pagalbos skyriuje (VSPS). Tyrimas buvo vykdomas pagal šią schemą:

Tėvų ir vaikų informavimas apie vykstantį tyrimą

Įtraukimo kriterijai: Neįtraukimo kriterijai:

● amžius nuo 1 mėnesio iki 5 metų;

● atvykę į VSPS per pirmąsias 12 val. nuo febrilaus karščiavimo

pradžios;

● vaikai, kuriems buvo būdingi sisteminio uždegiminio atsako

sindromo (SIRS) požymiai.

● vaikai vyresni nei 5 metai;

● atvykę į VSPS praėjus daugiau nei 12 val. nuo febrilaus karščiavimo

pradžios;

● nesutikę dalyvauti tyrime;

● vaikai su neurologiniais raidos spektro sutrikimais (pvz. autizmo spektro

sutrikimas ir kt.);

● Lėtinėmis ligomis sergantys vaikai;

● vaikai, kurie iki atvykimo į VSPS vartojo antibiotikus.

Atsitiktinai atrinkti vaikai, kurie kreipėsi į VSPS (n = 68)

● virusinė infekcija (n = 42)

● bakterinė infekcija (tonzilitas, adenoiditas, kitos nesunkios bakterinės infekcijos) (n

= 10)

● sunki bakterinė infekcija (SBI) (n = 16)

○ Iš SBI nustatytas sepsis (n = 4)

Mėginių paėmimas, BKT, CRB paėmimas ir analizė

Mėginiai nucentrifuguoti pagal Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno Klinikų laboratorijos protokolą. Kraujo serumas surenkamas, transportuojamas ir

užšaldomas - 80 °C temperatūroje

Mėginių analizė ELISA metodu

Mėginiai buvo paimti 2018-09-01 - 2019-12-01 laikotarpyje. Tiriamųjų konfidencialumas buvo užtikrintas, neįtraukiant į tyrimą jokios asmeninės informacijos. Į tyrimą atsitiktinai buvo įtraukti 68 vaikai, kurių tėvai/teisiniai globėjai sutiko dalyvauti tyrime ir vaikai atitiko įtraukimo kriterijus. Prieš paimant kraujo plazmos mėginius tyrimui, buvo surenkama tyrime sutikusių dalyvauti vaikų ligos anamnezė, vertinami gyvybiniai parametrai: širdies susitraukimo dažnis, arterinis kraujo spaudimas, įsotinimas deguonimi, kvėpavimo dažnis, temperatūrą.

Siekiant įvertinti trombocitų aktyvacijos žymenis kraujo plazmoje, esant skirtingai SUAS etiologijai (bakterinei, virusinei, sunkiai bakterinei), buvo paimti kraujo mėginiai vaikams, kurie atitiko įtraukimo kriterijus (žiūrėti schemą). Atliktas kraujo centrifugavimas - atskirta kraujo plazma. Surinkti mėginiai buvo sandėliuojami mėgintuvėliuose ir šaldomi - 80°C temperatūroje. 2020-02-18 surinkti kraujo plazmos mėginiai buvo analizuojami imunofermentinės analizės tyrimo metodu (ELISA) Lietuvos sveikatos mokslų universiteto fiziologijos ir farmakologijos tyrimų laboratorijoje.

2.1 Mėginių ištyrimas imunofermentinės analizės tyrimo metodu

Imunofermentinės analizės tyrimo metodas ELISA (angl. enzyme – linked immunosorbent assays) yra naudojamas nustatyti antigenų ir antikūnų buvimą biologiniame mėginyje. ELISA tyrimas įprastai yra atliekas 96 šulinėlių polistireno plokštelėse. Kiekviename šulinėlyje yra skirtingi biologiniai mėginiai. Šulinėliuose taip pat turi būti teigiamas kontrolinis ir neigiamas kontrolinis serumai. Antikūnai ar antigenai yra užfiksuojami atitinkamu antigenu arba antikūnu. Po kurio laiko plokštelė plaunama, kad pašalintų serumą ir nesusietus antikūnus ar antigenus. Norėdami aptikti surištus antikūnus ar antigenus, į kiekvieną šulinėlį pridedami antriniai antikūnai, kurie yra prijungti prie fermento, pavyzdžiui, peroksidazės ar šarminės fosfatazės. Po inkubacijos laikotarpio nesurišti antriniai antikūnai nuplaunami.

Kai pridedamas tinkamas substratas, fermentas reaguoja su juo, kad gautų spalvą. Spalvos intensyvumas

parodo antigeno ar antikūno kiekį.

Šio tyrimo metu buvo taikytas “Sumuštinio” ELISA metodas, kurio metu yra naudojami specifiniai antikūnai tam tikram antigeno kiekiui ir koncentracijai aptikti. Tiriamųjų kraujo plazmoje nustatyti trombocitų produkuojamų chemokinų CXCL4 ir CXCL7 koncentracijas, buvo naudojami komerciniai CXCL4 (Human PF4 ELISA Kit (CXCL4), abcam) ir CXCL7 (NAP-2/PPBP Human ELISA Kit, Thermo Fisher Scientific) rinkiniai ir jų instrukcijos. CXCL4, CXCL7 koncentracijos buvo nustatomas kolorimetriniu būdu, esant 450 nm bangos ilgiui mikro-plokštelės skaitytuvo Multiskan GO 1.00.40 pagalba (Thermo Fisher Scientific).

2.1.1 CXCL4 ELISA tyrimo protokolas [51]

● Atliekami serijiniai skiedimai, kad būtų paruošti standartiniai mėginiai. Standartiniuose mėginiuose CXCL4 koncentracija yra 0-1000pg/ml ribose.

6 paveikslas. Standartinių tirpalų paruošimas CXCL4 (PF4) ELISA tyrimui [51]

● Po 100 µL standartinių mėginių ir tiriamųjų mėginių supipetuojama į 96 šulinėlių plokštelę.

Plokštelė užklijuojama limpančia plėvele ir inkubuota 2,5 valandos kambario temperatūroje švelniai purtant (~ 500 apsisukimų per minutę (apm)).

● Po 2,5 valandos šulinėliai 4 kartus praplaunami plovimo tirpalu.

● Į kiekvieną šulinėlį įpilama po 100µL paruošto antikūnų tirpalo. Inkubuojama 1 valandą kambario temperatūroje švelniai purtant.

● Po valandos šulinėliai 4 kartus praplaunami plovimo tirpalu.

● Į kiekvieną šulinėlį pipetuojama po 100µL Streptavidino-HRP tirpalo ir inkubuojama 45 minutėms kambario temperatūroje švelniai purtant.

● Šulinėliai 4 kartus praplaunami plovimo tirpalu.

● Į kiekvieną šulinėlį pridedama po 100µL TMB substrato ir inkubuojama 30 minučių tamsoje, švelniai purtant.

● Reakcija sustabdyta „stop“ tirpalu.

● Stebėta spalvinė reakcija, kurios intensyvumas matuotas Multiskan GO 1.00.40 (Thermo Fisher Scientific) plokštelių skaitytuvu, esant 450nm bangos ilgiui.

● Atlikta duomenų analizė.

2.1.2 CXCL7 ELISA tyrimo protokolas [52]

● Atliekami serijiniai skiedimai, kad būtų paruošti standartiniai mėginiai. Standartiniuose mėginiuose CXCL7 koncentracija yra 0-2,5pg/ml ribose.

7 paveikslas. Standartinių tirpalų paruošimas CXCL7 (NAP-2) ELISA tyrimui [52]

● Po 50µL standartinių mėginių ir tiriamųjų mėginių supipetuojama į 96 šulinėlių plokštelę.

● Į kiekvieną šulinėlį išskyrus supipetuota po 50µL CXCL7 antikūno. Plokštelė užklijuojama limpančia plėvele ir inkubuota 40 minučių kambario temperatūroje švelniai purtant (~ 400 apsisukimų per minutę (apm)).

● Praėjus 40 minučių šulinėliai 3 kartus plaunami plovimo tirpalu.

● Pipetuojama po 100µL of TMB substrato į kiekvieną šulinėlį ir inkubuojama tamsoje 5 minutėms švelniai purtant (400apm).

● Reakcija sustabdyta „stop“ tirpalu.

● Stebėta spalvinė reakcija, kurios intensyvumas matuotas Multiskan GO 1.00.40 (Thermo Fisher Scientific) plokštelių skaitytuvu, esant 450nm bangos ilgiui.

● Atlikta duomenų analizė.

2.2 Statistinė duomenų analizė

Tiriamieji buvo suskirstyti į keturias grupes: pirma grupė – pacientai, kuriems nustatytos virusinės infekcijos; antra grupė – pacientai, kuriems nustatytos bakterinės infekcijos; trečia grupė - pacientai, kuriems buvo diagnozuota sunki bakterinė infekcija; ketvirta grupė - pacientai, kuriems buvo patvirtintas sepsis.

Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant Microsoft Excel ir SPSS 22.0 (IBM, JAV)) programas. Kiekybiniai požymiai buvo pateikti vidurkiais, kokybiniai – procentais. Buvo naudojami aprašomieji statistikos metodai - vidurkis, standartinis nuokrypis. Duomenų palyginimui buvo naudotas Mann–Whitney U kriterijus. Kokybinių požymių ryšys vertintas Fisher exact kriterijumi. Kiekybinių požymių koreliacijai naudotas Spearman koeficientas. Skirtingų grupių vidurkių palyginimui taikyta ANOVA (angl. ANalysis Of VAriance). Naudoti Dunn’s ir Kruskal-Wallis neparametriniai kriterijai nustatyti statistiškai reikšmingą skirtumą tarp grupių. Uždegiminių biomarkerių jautrumo ir specifiškumo palyginimui buvo naudota ROC (receiver operating characteristics curve) analizė.

Priklausomybės ir skirtumai tarp požymių buvo vertinami apskaičiuojant apskaičiuotąjį

reikšmingumo lygmenį (p reikšmę). Statistiškai reikšmingais rodikliais buvo laikoma, kai apskaičiuotasis

reikšmingumo lygmuo buvo <0,05.

3. REZULTATAI

3.1. Bendrosios studijos grupės charakteristikos

Iš viso į tyrimą buvo įtraukti 68 tiriamieji. 37 (54,41%) buvo vyriškos, 31 (45,59%) - moteriškos lyties. Tiriamųjų amžiaus mediana metais buvo 2 metai. Virusinė infekcija buvo diagnozuota daugiausiai tiriamųjų - 42 (61,8%). Nesunkios bakterinės infekcijos, tokios kaip tonzilitas, adenoiditas ir kt., buvo nustatytos dešimčiai (14,7%) tiriamųjų. Sunki bakterinė infekcija (SBI) (tokia kaip pneumonija, pielonefritas, bakterinis gastroenteritas, meningitas ar sepsis) buvo diagnozuota šešiolikai tiriamųjų (23,5

%), iš jų keturiems vaikams buvo nustatytas sepsis.

2 lentelė. Bendrosios tiriamųjų charakteristikos n = 68 Amžius vidurkis

metais

Etiologija

Pagal lytį:

V n = 37 M n = 31

2 (0-5)

Virusinė infekcija n = 42 Bakterinė infekcija n = 10 Sunki bakterinė infekcija (SBI) n = 16

○ Iš SBI nustatytas sepsis n = 4

n - tiriamųjų skaičius; skliaustuose nurodyta minimali ir maksimali amžiaus reikšmės metais; V - vyriška lytis; M - moteriška lytis; SBI - sunki bakterinė infekcija.

3.2. Standartiniai žymenys

Visiems tiriamiesiems buvo atlikta standartinių kraujo rodiklių analizė. Buvo vertinami bendrojo kraujo tyrimo ir C-reaktyvaus baltymo koncentracijos kraujyje rezultatai. Analizuojant bendruosius laboratorius rodiklius, buvo ieškoma ryšio tarp infekcijos etiologijos ir leukocitų, neutrofilų skaičiaus, CRB koncentracijos kraujyje. Leukocitų ir neutrofilų vertės buvo didesnės bakterinės infekcijos metu, o CRB – sunkios bakterinės infekcijos atvejais (atitinkamai p=0,0001, p<0,0001, p=0,0017) (3 lentelė).

3 lentelė. Standartinių kraujo žymenų palyginimas pagal infekcijos etiologiją

Laboratorinis

rodiklis Virusinė infekcija (n = 42)

Bakterinė infekcija

(n = 10)

SBI

(n = 16) p reikšmė Leu, x 10

/L 9,39 ± 4,14 17,35 ± 5,37 14,92 ± 7,91 0,0001 Neu, x 10

/L 5,16 ± 3,56 12,10 ± 4 11,01 ± 7,55 < 0,0001

CRB, mg/l 6,05 ± 8,19 16,96 ± 19,71 43,15 ± 59,86 0,0017

Rezultatai išreiškiami kaip vidutinis standartinis nuokrypis. Leu - leukocitai; Neu - neutrofilai; CRB - C-reaktyvusis baltymas;

L - litras; mg/l - miligramai litre; p - apskaičiuotasis reikšmingumo lygmuo; n - tiriamųjų skaičius.

Iš sunkios bakterinės infekcijos išskyrus sepsio atvejus ir tarpusavyje lyginant visas grupes (virusinė vs bakterinė vs SBI (bet ne sepsis), vs sepsis), statistiškai reikšmingas skirtumas išliko: leukocitų bei neutrofilų skaičius skyrėsi reikšmingai (atitinkamai p=0,001; p<0,0001) (4 lentelė). Tačiau lyginant sepsį su kitais susirgimo atvejais (vienoje atskiroje grupėje), statistiškai reikšmingas skirtumo nebuvo pastebėtas (5 lentelė).

4 lentelė. Standartiniai kraujo žymenys

Standartiniai žymenys

Virusinė infekcija (n = 42)

Bakterinė infekcija

(n = 10)

oSBI (n = 12)

Sepsis (n = 4)

p reikšmė

Leu, x 10

/L 9,39 ± 4,14 17,35 ± 5,37 16,02 ± 7,08 11,61 ± 10,49 0,001 Neu, x 10

/L 5,16 ± 3,56 12,10 ± 4 12,05 ± 7,05 7,88 ± 9,22 < 0,0001

oSBI : kitos sunkios bakterinės infekcijos, atmetus sepsį. Rezultatai išreiškiami kaip vidutinis standartinis nuokrypis. Leu - leukocitai; Neu - neutrofilai; L - litras; mg/l - miligramai litre; p - apskaičiuotasis reikšmingumo lygmuo; n - tiriamųjų skaičius.

5 lentelė. Neutrofilų ir leukocitų palyginimas sepsio metu ir atvejais, kai sepsio nebuvo

Trombocitų rodiklis

Sepsis (n = 4)

Sepsio nebuvo (n = 64)

p reikšmė

Leu, x 10

/L 11,61 ± 10,49 11,88 ± 6,012 0,2876

Neu, x 10

/L 7,880 ± 9,221 7,534 ± 5,494 0,3242

Rezultatai išreiškiami kaip vidutinis standartinis nuokrypis. Leu - leukocitai; Neu - neutrofilai; L - litras; mg/l - miligramai litre;

p - apskaičiuotasis reikšmingumo lygmuo; n - tiriamųjų skaičius.

3.3. Trombocitų aktyvacijos žymenys

Iš bendrojo kraujo tyrimo taip pat buvo vertinami tradiciniai trombocitų rodikliai - trombocitų

skaičius (PLT), trombocitų vidutinis tūris (MVP), trombocitų pasiskirstymo plotis (PDW), didelių

trombocitų santykis (P-LCR), trombocitų užimamas tūris kraujyje (PCT), bei išvestiniai rodikliai, tokie

kaip PLT/MPV (trombocitų skaičiaus ir trombocitų vidutinio tūrio santykis) ir PNLR (trombocitų ir

neutrofilų-limfocitų santykio sandauga). Iš pradžių rodikliai buvo vertinami trijose grupėse - atvejais su

virusine, bakterine ir sunkia bakterine infekcijomis (SBI). Statistiškai reikšmingai didesnės PNLR vertės

stebėtos SBI grupėje (p=0,0157) (6 lentelė). Iš SBI grupės išskyrus atvejus su sepsiu statistiškai

reikšmingas skirtumas buvo gautas, vertinant PNLR ( p=0,0085) (7 lentelė). PLT ir MPV turėjo tendenciją