LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Artūras Gagilas
Galvijų virusinės diarėjos ir galvijų infekcinio
rinotracheito diagnostiniai ir epidemiologiniai tyrimai
pieninių galvijų bandose
Bovine viral diarrhoea and bovine infectious
rhinotracheitis diagnostics and epidemiological analysis
in dairy cattle herds
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Prof. Dr. Algirdas Šalomskas
2 DARBAS ATLIKTAS VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Galvijų virusinės diarėjos ir galvijų infekcinio rinotracheito diagnostiniai ir epidemiologiniai tyrimai pieninių galvijų bandose“. 1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
2016-12-16- Artūras Gagilas
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
2016-12-16 Artūras Gagilas
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
2016-12-16 Algirdas Šalomskas
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE
2016-12-12 Saulius Petkevičius
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
3
Turinys
Santrauka ... 4 Summary ... 5 Santrumpos ... 6 Įvadas ... 7 1. Literatūros apžvalga ... 9 1.1 Galvijininkystės būklė Lietuvoje ... 91.2 Galvijų virusinės diarėja ... 10
1.3 Galvijų infekcinis rinotracheitas ... 15
2. Tyrimo metodai ir medžiaga ... 20
3. Tyrimų rezultatai ... 22
4. Rezultatų aptarimas ... 29
Išvados ... 32
Rekomendacijos ... 33
4
Santrauka
Galvijų virusinės diarėjos ir galvijų infekcinio rinotracheito diagnostiniai ir epidemiologiniai tyrimai pieninių galvijų bandose
Artūras Gagilas Magistro baigiamasis darbas
Šio darbo tikslas atlikti galvijų virusinės diarėjos ir galvijų infekcinio rinotracheito diagnostinius ir epidemiologinius tyrimus Lietuvos pieninių galvijų bandose. Darbo apimtis 39 lapai, juose 3 lentelės, 12 paveikslų, panaudota 101 literatūros šaltinis.
Tyrimai buvo atliekami 2015 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Veterinarinės patobiologijos katedroje ir Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto Virusologinių tyrimų laboratorijoje.
Tyrimui iš 30 ūkių surinkta ir išanalizuota 1857 mėginiai. Iš jų ištirta 905 galvijų serumo mėginių dėl GIR, 517 mėginiai dėl GVD antikūnų ir 435 mėginiai dėl GVD antigeno. Taip pat pasirinktame X ūkyje buvo atlikta GIR ir GVD retrospektyvi tyrimų, atliktų 2004 – 2014 metais NMVRVI Virusologinių tyrimų skyriuje, analizė. Tuo metu dėl GVD ir GIR iš viso buvo ištirti 192 kraujo serumo mėginiai. 2015 metais papildomai buvo atliktas galvijų rinotracheito (GIR) ir galvijų virusinės diarėjos (GVD) tyrimas iš kraujo serumo imunofermentinės analizės metodu (IFA), iš to paties ūkio X. Buvo paimti 40 mėginių.
Iš tirtųjų ūkių 63,3 proc. turėjo GHV-1 antikūnų turinčių galvijų, o GVD seroteigiamų galvijų buvo 53,3 proc. bandų. Vidutinis GHV-1 užsikrėtimo lygis buvo 20,7 proc. ir 43,4 proc. galvijų buvo seroteigiami GVD virusams. Daugiausia seroteigiamų GVD galvijų buvo 6 – 12 amžiaus grupėje, taip pat joje daugiausia persistentiškai infekuotų galvijų. GIR serologinė analizė pasirinktame ūkyje parodė, kad per 5 mėnesius gali užsikrėsti 40 proc. imlių gyvūnų. Vakcinacijos programa tiriamajame ūkyje padėjo ženkliai sumažinti galvijų sergamumą GIR ir GVD.
5
Summary
Bovine viral diarrhoea and bovine infectious rhinotracheitis diagnostics and epidemiological analysis in dairy cattle herds
Artūras Gagilas Master‘s thesis
The aim of this work was to carry out diagnostical and epidemiological analysis of bovine viral diarrhoea and infectious rhinotracheitis in Lithuanian dairy cattle herds. The work has 39 pages, including 3 tables, 12 images and 101 literature source.
Analysis was carried out in year 2015 at Lithuanian University of Health Sciences, Veterinary Academy, Department of Veterinary Pathobiology and National Food and Veterinary Risk Assessment Institute’s Virological research laboratory.
The analysis of 1857 blood serum samples were made from 30 farms taken. 905 of samples were taken for detection of IBR, 517 samples for detection of BVD antibodies and 435 samples for detection BVD antigens. There was also a retrospective analysis carried out of data taken from years 2004 to 2014 from chosen farm X in NFVRAI’s Virological research laboratory. 192 blood serum samples were analysed for BVD and IBR. In addition an analysis was made of 40 blood serum samples taken from farm X in year 2015. An ELISA method was used for assay of all aforementioned blood serum samples.
Of 30 farms 19 (63.3%) had cattle positive to BoHV-1, and BVD seropositive cattle were detected in 16 (53.3%) of these herds. The average level of IBR seropositivity was 20.7%, and 43,4% of cattle were seropositive for BVD virus. Most of the seropositive cattle were in 6 – 12 months age group. Also in the same group there were most of persistently infected cattle (1.54%). IBR serological analysis in farm X showed that in period of 5 months 40% of susceptible animals can get infected. Vaccination programme in farm X significantly reduced IBR and BVD morbidity.
6
Santrumpos
GHV-1 – galvijų pirmo tipo herpes virusas GIR – galvijų infekcinis rinotracheitas GVD – galvijų virusinė diarėja.
GVDV – galvijų virusinės diarėjos virusas IFA(ELISA) – imunofermentinė analizė
NMVRVI - Nacionalinis maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institutas
7
Įvadas
Lietuvos žemės ūkiui didelę reikšmę turi viena iš gyvulininkystės šakų – galvijininkystė. Jai didelę žalą daro galvijų infekcinės ligos, todėl svarbu greitai, tiksliai ir efektyviai diagnozuoti galvijų virusines ligas bei stabdyti jų plitimą Lietuvoje. Laiku nustatant virusines ligas galima išvengti mėsos, pieno ir kitos produkcijos nuostolių dėl gyvulių prieauglio ir bandų veislinio branduolio praradimo (1).
Galvijų virusinės ligos padaro didelius ekonominius nuostolius pienininkystės ūkiuose dėl sumažėjusio pieningumo, sutrikusios reprodukcijos bei dėl veršelių ir jaunų galvijų didelio gaištamumo. Vieni iš faktorių sukeliančių galvijų kvėpavimo takų ligų kompleksą, reprodukcijos sutrikimus ir produkcijos sumažėjimą yra stresas, nesubalansuota mityba, imuniteto nusilpimas, ir kontaktas su infekciniais patogenais. Dažniausiai sutinkami virusiniai galvijų ligų sukėlėjai yra galvijų infekcinis rinotracheitas (GIR), galvijų virusinė diarėja (GVD), galvijų respiracinis sincitinis virusas ir paragripas-3virusai (2, 3).
Galvijų virusinės diarėjos virusas (GVDV) yra paplitęs visame pasaulyje. Didžiausią žalą šie virusai daro pieninių galvijų bandose, nes sutrinka reprodukcija, virusai veikia imunosupresiškai, užkrėstose bandose padažnėja kitų ligų tikimybė. Įvairų tyrimų duomenimis nustatyta, kad GVD infekcija linkusi būti endemiška, ir daugelyje galvijų populiacijų persistentiškai infekuotų (PI) galvijų skaičius siekia 1–2 proc., ir apie 60 proc. serologiškai teigiami (4). Persistentiškai infekuoti galvijai yra pagrindinis viruso šaltinis, todėl šių gyvūnų identifikacija ir pašalinimas iš bandų yra svarbi kontrolės ir prevencijos dalis (5). Lietuvoje paskutiniu metu šių virusų paplitimas ir epidemiologiniai ypatumai nėra tyrinėti.
Galvijų herpes virusas 1 (GHV-1), yra labai paplitęs ir svarbus galvijų. Pirminės šio viruso infekcijos pasireiškia kaip galvijų infekcinis rinotraheitas (GIR), abortas, pūlingas vulvovaginitas, sisteminė naujagimių infekcija (6). GHV-1 virusas geba pereiti į latentinę būseną N.trigeminus arba sakraliniame nerviniame mazge (7). Gyvūnai su latentine GHV-1 infekcija gali būti kaip užkrato šaltinis imliems gyvūnams jeigu virusas būtų reaktyvuotas (8). Lietuvoje šių virusų epidemiologija gana išsamiai analizuota iki 2009 metų, tačiau dabartinė situacija pieninėse galvijų bandose nežinoma.
Efektyvi ligų diagnostika, profilaktika ir likvidacija, norint sumažinti Lietuvos galvijų ūkių nuostolius, gali būti taikoma tik tada kai gerai žinoma galvijų virusinių ligų epidemiologinė situacija
8 (1). Laiku nustačius virusines ligas išvengiama didelių ekonominių nuostolių, kurie susidaro susirgus galvijams, dėl jų sumažėjusio pieno ir mėsos produkcijai, netekus prieauglio.(9)
Darbo tikslas: Atlikti galvijų virusinės diarėjos ir galvijų infekcinio rinotracheito diagnostinius ir epidemiologinius tyrimus Lietuvos pieninių galvijų bandose.
Darbo uždaviniai:
1. Imunofermentinės analizės metodu nustatyti galvijų infekcinio rinotracheito ir galvijų virusinės diarėjos virusais užkrėstų pienininių galvijų bandų skaičių.
2. Ištirti galvijų infekcinio rinotracheito ir galvijų virusinės diarėjos serologinį paplitimą ir epidemiologinius ypatumus pieninių galvijų bandose.
3. Nustatyti persistentiškai infekuotų GVD virusais galvijų dalį įvairiose galvijų amžiaus grupėse.
4. Atlikti GIR ir GVD virusų infekcijų epidemiologinės situacijos retrospektyvią analizę pasirinktame pienininkystės X ūkyje.
9
1. Literatūros apžvalga
1.1 Galvijininkystės būklė Lietuvoje
Galvijininkystė yra ekonomiškai labai svarbi ūkio šaka Lietuvoje. Didžiausią dalį užima pieninių galvijų ūkiai. Nuo 2005 m. pastebimas mažėjantis registruojamų galvijų skaičius. Nuo 2005 m. iki 2015 m. I pusmečio ŪGR registruotų galvijų sumažėjo nuo 968 854 iki 756 932 (21,87 proc.), o karvių – nuo 455 828 iki 316 841, arba 30,49 proc. Pažymėtina, kad per 2012–2015 m. I pusmečius registruotų galvijų skaičius žymiai padidėjo, t. y. 46 473 galvijų, arba 6,54 proc.
Per 2014 m. laikotarpį (I ir II pusmečius) galvijų skaičius ir vidutinis bandos dydis sumažėjo atitinkamai 19 145 arba 2,55 proc., o bandos dydis – 1,70 proc. Analizuojant ilgesnį laikotarpį, stebima palaipsniui didėjanti galvijų vidutinės bandos dydžio tendencija. Nuo 2013 07 01 iki 2015 07 01 galvijų bandų skaičius sumažėjo nuo 77 273 iki 66 750, arba 13,62 proc., tačiau vidutinės bandos dydis padidėjo 20,89 proc.
Karvių bandų per 2012–2015 metų I pusmečių laikotarpį sumažėjo 17 444, t. y. siekė 23,51 proc., o vidutinė karvių banda padidėjo nuo 4,46 iki 5,58 gyvulio, arba 25,11 proc. Karvių laikytojų ir karvių skaičius per minėtą laikotarpį sumažėjo atitinkamai 16 988 (22,61 proc.) bei 13 883 (4,20 proc.). Analizuojant penkerių metų (2010–2015 m.) laikotarpio I pusmečio karvių skaičiaus rezultatus nustatyta, kad jų sumažėjo 40 817, arba 11,41 proc., o karvių bandų skaičius sumažėjo nuo 97 914 iki 56 749, arba 42,04 proc. (10)
Nors matomas galvijų laikytojų ir bendras pieninių galvijų skaičius mažėja, tačiau karvių produktyvumas auga. Produktyvūs gyvūnai yra jautresni aplinkos poveikiui, ir infekcinių ligų sukėlėjams, todėl infekcinės ligos daro didelę ekonominę žalą pieninių galvijų ūkiams (9).
10
1.2 Galvijų virusinės diarėja
Sukėlėjas
Galvijų virusinės diarėjos virusas, priklauso Flaviviridae šeimai, Pestivirus genčiai. GVDV pagal antigeninius ir genetinius skirtumus skirstomas į du genotipus ( GVDV-1 ir GVDV-2)(11). Viriono dydis siekia 60nm skermenį, yra sferiškos formos ir turi vienagrandį teigiamo sukio RNR genomą, kurio dydis 12.3kb (12). GVDV yra vienas iš svarbiausiu ekonomiškai nuostolingų galvijų ligų dėl savo poveikio reprodukcijai ir ūminės infekcijos imunosupresinio efekto (4). Dėl to galvijus auginančiose šalyse yra kuriamos kontrolės ir naikinimo programos.(13, 14).
Naujai užsikrėtę galvijai išskiria virusą ūmios infekcijos metu, tačiau labiausiai šią liga platina persistentiškai infekuoti (PI) galvijai. Persistentinis užsikrėtimas kyla dėl vaisiaus užkrėtimo, ankstyvame nėtumo laikotarpyje (15). Dauguma kontrolės programų yra skirtos PI galvijų eliminavimui, nes jie yra pagrindinis viruso šaltinis. Šios programos reikalauja efektyvių ir tikslių diagnostinių testų skirtų aptikti GVD virusą, antigeną (Ag) ar specifinius antikūnus (Ak). Gyvūnų, kurie niekada neturėjo kontakto su virusu testai dėl Ak, Ag, ir viruso bus neigiami. Gyvūnai arba vėlyvo nėštumo vaisiai, kurie patyrė ūmią infekciją, turi specifinių Ak, bet dažniausiai testai dėl viruso ir Ag bus neigiami.Tuo tarpu PI galvijai neturės specifinių Ak, bet testai dėl Ag ir viruso bus teigiami (14).
GVDV infekcija patekusi į vietos galvijų populiacija linkusi išlikti endmiška, nors infekcijos statusas bandoje gali gana sparčiai keistis, per 2−3 metus ji gali pasikeisti iš aktyviai infekuotos į iminitetą įgijusios ir vėl imlios virusui (16).
GVDV skiriamas į necitopatogeninį(ncp) ir citopatogeninį (cp) biotipą, pagal tai kokį efektą sukelia ląstelių kultūroms, o ne užkrėstam gyvūnui. Cp biotipas sukelia apoptozę, o ncp − ne(17). Ncp biotipo virusai yra ūmių infekcijų sukėlėjai ir gali būti perduoti per kūno skysčius – nosies ištakas, šlapimą, pieną, spermą, seiles, ašaras ir vaisiaus skysčius (18).
11 2 pav. Galvijų virusinės diarėjos viruso struktūra (19).
Patogenezė
Virusas į organizmą patenka kontaktuodamas su burnos, nosies arba lytinių takų gleivinę. GVDV dauginasi epitelinėse ląstelėse, ir patenka į tonziles. Iš čia virusas plinta į regioninius limfinius mazgus, kyla viremija. Virusas gali būti išsėjamas laisvai kraujyje arba prisijungęs su limfocitais ir monocitais. Didžiausią koncentraciją virusas pasiekia tonzilėse, užkrūčio liaukoje, storojoje žarnoje (20). Kaulų čiulpai ir žarnų gleivinė yra dažnai infekuojama, išsekinamos Pejerio plokštelės (21).
Epidemiologija
Lenkijoje nustatyta, kad 70,7 proc. bandų yra GVD teigiamos (22) ir 2.2 proc. galvijų yra PI.(23). Jungtinėje Karalystėje (Škotijoje) nustatyta, kad 87,3 proc. galvijų yra seroteigiami (24), PI galvijų skaičius svyruoja nuo 0,2 proc. iki 3,1 proc. (25). Žemutiniame Austrijos regione 92 proc. visų galvijų bandų yra laisvos nuo GVDV, o bandų su PI galvijais 0.16 proc. (26).
Lietuvoje 2001-2003 atlikus tyrimus nustatyta, kad 37,5 proc. tirtų gyvulių turėjo antikūnus GVD virusui. Iš jų 54,6 proc. GVD teigiamų priklausė karvių grupei, prieauglis sudarė 26,1 proc. gyvulių (27). Vėlesni tyrimai parodė, kad PI galvijų kiekis bandose svyruoja nuo 3,3 proc. iki 7,3 proc. (28). Pastarųjų metų padėtis Lietuvos ūkiuose nėra žinoma, nes nėra atlikta ilgalaikio GVD virusų infekcijos paplitimo tyrimo.
Klinika
Ūminės GVDV infekcijos dažniausiai pasitaiko jauniems gyvūnams, ir kliniškai pasireiškia karščiavimu, diarėja, kvėpavimo takų sutrikimu ir kartais staigia mirtimi (29). Ligos sunkumas priklauso nuo viruso padermės ir antrinių infekcijų (30).Yra nustatyta, kad 70-90 proc. GVDV infekcijų nesukelia akivaizdžių klinikinių požymių(31). Galimas nedidelis temperatūros pakilimas ir nežymi leukopenija (32). Inkubacinis periodas trunka 5-7 dienas, pasireiškia pireksija ir leukopenija. Viremija pasireiškia 4-5 po infekcijos ir trunka iki 15 dienų (33). GVDV protrūkio metu viduriavimas
12 gali pasireikšti tik nedidelei bandos daliai (34). Dažnesni infekcijos požymiai yra vangumas, anoreksija, ištakos iš akių ir nosies, sumažėjus pieno produkcija ir burnos ertmės pažeidimai (29). Ūmiai užsikrėtę galvijai, išskiria nedidelį viruso kiekį palyginus su persistentiškai infekuotais, antikūnai gaminasi 2-4 savaites po infekcijos (29, 33). GVDV pats gali sukelti kvėpavimo takų ligą, tačiau jo imunosupresinis poveikis gerokai labiau apsunkina būklę ir dažniausiai išsivysto antrinė infekcija (35).
Viruso įtaka reprodukcijai
Užsikrėtusių karvių veršingumo baigtis priklauso nuo infekcijos laiko. Karvėms užsikrėtusioms iki ovuliacijos arba pirmomis dienomis po apvaisinimo išauga tikimybė, kad apvaisinimas bus nesėkmingas arba embrionas žus ankstyvoje stadijoje (36) Išgyvenę vaisiai yra normalūs ir neužkrėsti. Tačiau, jeigu patelė užkrečiama 30−90 veršingumo dieną, tai sąlygos vaisiau infekciją, kuris gims persistentiškai infekuotas (PI) ir seroneigiamas. Infekcija sulaukus 150 dienų gali sukelti hidroencefaliją, cerebralinę hipoplaziją, akių, skeleto defektus tokius kaip artrogripozė ir hipotrichozė (29, 30, 33, 37). Taip pat dėl infekcijos gali pakisti kiaušidžių funkcija, gonadotropino ir progesterono sekrecija, dėl ko išsivysto nevaisingumas (38). Kai kurie neseniai atvesti PI veršeliai gali atrodyti sveiki, tačiau vėliau pastebimas augimo sulėtėjimas. Jie išlieka PI ir dažniausiai būna seroneigiami (35).
Buliai gali perduoti virusą per spermą trumpą laiką po užsikrėtimo, ir tai gali sąlygoti vaisingumo sumažėjimą. Viruso kiekis spermoje būna gana nedidelis tačiau tai gali būti potencialus viruso šaltinis bandoje (36).
Persistentiškai infekuoti galvijai
Persistentiškai infekuoti galvijai išskiria per savo gyvenimą išskiria didelį kiekį viruso, ir yra pagrindinis užkrato šaltinis (4). Persistentiškai infekuotos veislinės patelės atveda ir PI palikuonis, taip gali atsirasti šeimos linijos, palaikančios GVDV bandoje (29). Kliniškai šie gyvūnai dažniausiai atrodo sveiki, tačiau pastebimas mažesnis priesvoriai, lėtesnį augimą (39). Kūno temperatūra, kvėpavimo dažnis, pulsas yra normos ribose (40), tačiau pastebėta, kad PI galvijų skydliaukės hormono koncentracija yra gerokai žemesnė nei sveikų galvijų (41).PI galvijai lengviau užsikrečia antrinėmis infekcijomis, ir jų galima gyvenimo trukmė yra maža (39, 42). Tačiau nauji duomenys rodo, kad mažiausiai 28 proc. PI galvijų gali sulaukti virš 2 metų amžiaus (25).
13 Gleivinių liga
Gleivinių liga išsivysto tik PI galvijams pakartotinai užsikrėtus ir yra neišvengiamai mirtina. Liga siejama su citopatogeniniu GVDV biotipu, kuris kyla iš mutavusio necitopatogeninio viruso biotipo, kuris jau cirkuliuoja organizme (43). Šis cp virusas gali būti perduotas kitiems PI galvijams, jeigu jie yra infekuoti tokiu pačiu ncp virusu (44).
Liga trunka nuo kelių dienų iki savaičių, ir iš pradžių pasireiškia karščiavimu, vangumu, silpnumu, anoreksija. Gyvūnai silpsta, pasireiškia vandeningas, blogo kvapo, kartais su krauju viduriavimas. Išsivysto burnos, liežuvio, šnervių ir junginės gleivinių pažeidimai, kurie sukelia stiprų seilėtekį, ašarojimą, ištakas iš šnervių. Pažeidžiami vidiniai nagų paviršiai, kurie apsunkina gyvūno vaikščiojimą (34).
Diagnostika
Diagnostikoje viruso aptikimui gali būti naudojami GVDV specifiniai antikūnų (Ak) ir antigenų (Ag) testai. Pranešama, kad šie testai yra labai patikimi. tiriant pavienius ligos atvejus ar stengiantis pašalinti virusą iš bandos ar regiono, ar identifikuoti užsikrėtusius gyvulius, kurie epidemiologiškai pavojingi, todėl yra būtina tiksliai nustatyti GVD virusą arba specifinius Ag. Užsikrėtimas nustatomas viruso išskyrimo, Ag aptikimo IFA, IHC ir PGR metodais. (45, 46).
Ak aptikimas galvijams yra vertingas būdas nustatyti kiekvieno gyvūno imuninės sistemos būklę ir buvusį kontaktą su GVDV. Teigiamas nevakcinuoto gyvūno antikūnų tyrimo rezultatas parodo ne tik, gyvūno kontaktą su GVDV, bet taip pat, kad jis nėra PI. Teigiamas veršingos karvės testas rodo, kad ji gali nešioti PI vaisių. Tačiau neigiamas rezultatas, nebūtinai rodo ,kad gyvūnas nėra turėjęs kontakto su virusu, todėl reikiamas tolimesnis Ag testas patvirtinti ar gyvūnas nėra persistentiškai užsikrėtęs (47).
IFA Ag metodas yra paprastas ir greitas aptikti PI gyvūnus, ir tinkamas bandos tikrinimui (48, 49). Pastebėta, kad IFA metodo jautrumas siekia 67 – 100 proc. lyginant su viruso išskyrimo metodu (98.8 – 100 proc.) (50, 51).
Dažniausiai naudojami metodai specifinių GVDV Ak yra serumo neutralizacijos testas (SNT) ir Ak ELISA (45). Ankstyvieji Ak ELISA testai buvo nepatikimi, nes buvo problemų dėl tinkamo Ag pritvirtinimo prie plokštelių paviršiaus (52). Patobulinus testus, pasiektas aukštas specifiškumo (99 proc.) ir jautrumo (98 proc.) lygis (53). Šiais testais galima tirti įvairius mėginius įskaitant kraujo serumą, pieną, ir gali aptikti žindomų veršelių antikūnus gautus su krekenomis (54). Tai yra greita, ir nebrangi alternatyva SNT tyrimui (55).
14 Pastaraisiais metais rinkoje pasirodė greitieji testai galvijų virusinės diarėjos viruso antigenams nustatyti. Šiam testui naudojamas ausies iškarpos mėginys, arba serumas. Šie testai yra didelio jautrumo ir specifiškumo.
Galvijų bandose aukštas specifinių GVDV antikūnų paplitimas parodo, kad populiacija yra infekuota, t.y. turi PI gyvūnų, ir atvirkščiai jei dauguma testų rezultatų neigiami tikimybė, kad bandoje yra PI gyvūnų yra labai maža. Žemas antikūnų skaičius taip pat gali reikšti, kad jei bandoje pasireikštų infekcija, nuostoliai būtų labai dideli, nenaudojant apsaugos priemonių, ir atvirkščiai jeigu antikūnų titrai dideli, naudojant vakcinacijos programas nebūtų pasiektas didelis efektas prieš BVDV (47).
Kontrolė
Kadangi PI gyvūnai yra didžiausias viruso šaltinis, jie yra pagrindinis kontrolės ir eradikacijos programų taikinys. Testavimo ir skerdimo schemos yra sėkmingai taikomos Europoje: Austrijoje, Olandijoje, Norvegijoje, Danijoje, Švedijoje, Šveicarijoje, Slovėnijoje, Vokietijoje, Prancūzijoje, Airijoje ir Suomijoje (56-62). Bandos, kurios turi didžiausią tikimybe užsikrėsti, yra tiriamos bandos lygyje, ir virusų infekcijos plitimas stabdomas pašalinant PI galvijus. Taikant aukšto lygio biosaugumo priemones užkertamas kelias reinfekcijai. Lietuvoje kai kuriuose ūkiuose taip pat taikoma GVD vakcininė kontrolė. Tačiau statistiniai duomenys apie vakcinacijos programas ir jų efektyvumą nerenkami ir neanalizuojami.
15
1.3 Galvijų infekcinis rinotracheitas
Sukėlėjas
Galvijų infekcinis rinotracheitas (GIR), yra sukeliamas galvijų herpes viruso 1 (GHV-1).GHV-1 priklauso Herpesviridae šeimai Aphaherpesvirinae pošeimio, Varicellovirus genčiai. Viruso genomas sudarytas iš dvigrandrės DNR, 135 kb.(6) GHV-1 skirstomas į 1.1, 1.2a, 1.2b subtipus (63). 1 subtipo virusas yra infekcinio rinotracheito sukėlėjas ir yra dažnai randamas viršutiniuose kvėpavimo takuose ir abortuotose vaisiuose. Šis subtipas paplitęs Europoje, Šiaurės ir Pietų Amerikoje. Subtipas 2a dažniausiai kliniškai pasireiškia kvėpavimo ir lytiniuose takuose kaip GIR, infekcinis pustulinis vulvovaginitas (IPV) ir balanopostitas (IPB), ir abortais. Subtipas 2b taip pat susijęs su kvėpavimo liga, IPV ir IPB, bet ne su abortais (64).
GHV-1 į organizmą patenka per kvėpavimo arba lytinių takų gleivines, taip pat per junginės gleivinę (6). Pagrindinis perdavimo būdas yra tiesioginio kontakto būdu nosis į nosį. Tačiau perdavimas gali vykti ir oro lašeliniu būdu (65). Genitalinė infekcijai reikalingas tiesioginis kontaktas poravimosi metu. Taip pat viruso perdavimas gali įvykti ir sėklinant užkrėsta sperma (66).
16 Patogenezė
Virusas, įsiskverbęs į galvijų viršutinių kvėpavimo takų arba išorinių lytinių organų gleivinę, ima daugintis jos epitelio ląstelėse. Ląstelių branduoliuose formuojasi acidofiliniai intarpai. Plintant virusui, epitelio ląstelės ima nykti, vyksta distrofija, jos žūva ir atsidalina. Antrą infekcijos dieną nosies gleivinėje susidaro mikroerozijos, o ant išorinių lytinių organų vystosi mazgeliai ir pustulės (67). Po to kai suyra epitelinės ląstelės, neutrofilai virusus išnešioja į regioninius limfinius mazgus, kur vyksta tolesnis jų dauginimasis. Užsikrėtus oro – lašeliniu keliu, virusas antrykliniuose limfiniuose mazguose randamas jau po 36–40 val., o po 3–4 parų – kraujyje, parenchiminiuose organuose, antinksčiuose, čiobrialiaukėje, galvos smegenyse (68). GHV-1 replikacija vyksta viršutinių kvėpavimo ir lytinių takų gleivinių epitelyje. Infekuotomis vietinėmis nervų galūnėlėmis virusas transportuojamas į N. trigeminus arba sakralinį nervinį mazgą, kur lieka latentiniu užkratu (7, 69). Per kvėpavimo takus virusas patenka į plaučius, o tąsiam eksudatui užkimšus bronchus vystosi intersticinė plaučių, tarpusienio ir net poodinio audinio emfizema (68). Užsikrėtę gyvūnai tampą viruso nešiotojais visą gyvenimą. Dauguma seroteigiamų galvijų yra latentiškai infekuoti, ir viruso išskyrimas gali būti reaktyvuotas dėl streso arba gydimo kortikosteroidais (69).
Epidemiologija
Virusas plinta bandos viduje ir tarp bandų, horizontaliuoju perdavimu, tiesioginio ir netiesioginio kontakto būdu, su aerozoliniais lašeliais, lytiniu kontakto keliu ar per užšaldytą bulių spermą, nes ši yra laikoma palankiomis virusui sąlygom (69). Didelės bandos turi daugiau kontaktų perdavimui (70), mažesnėse bandose yra mažiau imlių gyvūnų, todėl GHV-1 infekcija būna žemiau epidemijos ribos (71). Didesnėse bandose besitęsiantis naujų imlių gyvūnų patekimas, skatina viruso cirkuliaciją (72). Naujų galvijų įvedimas ir maišymasis naujose bandose, yra sukeliantis stresą, ir gali sukelti latentinės infekcijos atsinaujinimą, kuri išplinta tarp imlių gyvūnų.(70).
Paplitimas įvairiose Europos šalyse:
Belgijoje 67 proc. mėsinių ir pieno ūkių bandų, 35,9 proc. galvijų (73).Anglijoje ir Velse 69,2 proc. pieninių galvijų bandų (74), Pietvakarių Anglijoje 43,1 proc. bandų ir 42,5 proc. galvijų(70), Andalūzija (Ispanija) 70,4 proc. bandų ir 45,7 proc. galvijų (75), Airijoje 77,4 proc. bandų (76), Estijoje 22 proc. bandų (72), Vengrijoje 79,3 proc. didelių bandų, ir 13,5 proc. mažų bandų(77).
Lietuvoje 2005 - 2009 metais atlikti tyrimai parodė, kad iki 4 mėnesių ir 1-2 metų galvijų grupėse, GHV-1 seroteigiamų skaičius svyravo nuo 4,26 proc. iki 6,69 proc.. Tačiau seroteigiamų galvijų skaičius vyresnio amžiaus grupėse stipriai išaugo. 2-3 metų grupėje nustatyta 18,26 proc., o
17 grupėje, kur amžius didesnis nei 7 metai seroteigiami galvijai sudarė 53,98 proc. (78). Tačiau naujesnių šiol ligos tyrimų Lietuvoje nėra atlikta ir situacija pienininkystės ūkiuose nežinoma.
4 pav. GHV-1 infekcijos paplitimas pagal galvijų amžiaus grupes (78). Klinika
Kvėpavimo takų infekcijos forma dažniausiai pastebima galvijams auginamiems ūkiuose, galvijams, kurie auginami ganyklos sąlygomis, ne taip dažnai.(69) Inkubacinis laikotarpis trunka 2-7 dienas. Jei liga ne komplikuojasi, eiga būna švelni, pasireiškia tik nediliu serozinio skysčio ištekėjimo iš nosies, ir nedideliu temperatūros pakilimu. Ūmios ligos atveju pasireiškia karščiavimas 40-42°C, kuris gali trukti kelias dienas. Šnervių gleivinės parausta, ir gali susidaryti paviršinės erozijos. Kai kuriems galvijams gali pasireikšti stiprus seilėtekis. Retais atvejais erozijos išsivysto ir burnos ertmėje (69).
Lytinių takų infekcija pasireiškia abiem lytim. Išsivysto pūslelės, erozijos arba opos, vulvos, makšties ar apyvarpės gleivinėje (79).Skiriamas vulvovaginitas karvėms, ir balanopostitas buliams. Infekcinis pustulinis vulvovaginitas (IPV), gali būti pastebimas per keletą dienų po poravimosi.Dažnas šlapinimasis ir uodegos kėlimas yra pirmieji klinikiniai požymiai. Pasireiškia vulvos hiperemija ir edema. Išsivysto mažos raudonos arba baltos opos, 0,5-3mm skersmens pustulės (79, 80).
GHV-1 buliam gali sukelti infekcinį pustulinį balanopostitą (IPB). Inkubacinis periodas trunka 2-3 dienas, pustulės atsiranda ant penio ir apyvarpės gleivinių. Jos gali tapti opomis, iš kurių skiriasi gleivingos, pūlingos išskyros. Šie pakitimai gali neleisti buliui atlikti lytinio akto (69).
Konjunktyvinė GHV-1 infekcija reta, ji gali pereiti į rageną, panoftalmitą. Dažniausiai pasireiškia kaip konjunktyvitas (69).
4.26 6.54 5.55 6.69 18.26 26.30 28.70 34.46 52.81 53.98 0 10 20 30 40 50 60 0 - 4 mėn 5 - 6 mėn 7 - 12 mėn 1 - 2 metai 2 - 3 metai 3 - 4 metai 4 - 5 metai 5 - 6 metai 6 - 7 metai > 7 metai P ro c.
18 Diagnostika
GHV-1 infekcija dažniausiai nustatoma iš užkrėtusiojo gyvūno organizmo atsaką į virusą, pavyzdžiui pagal antikūnus kraujo serume, arba pagal tiesioginį viruso aptikimą. Pagrindiniai serologiniai testai GHV-1 antikūnų aptikimui yra viruso neutralizacijos (VN) testas ir antikūnų ELISA(69). Ak aptinkami per 2-3 savaites nuo infekcijos pradžios. Motiniai antikūnai gali būti aptinkami iki 7 mėnesių, bet dažniausiai pranyksta po 4-5 mėnesių(81).Kolkas nėra žinomas būdas kaip atskirti pasyviai įgytus antikūnus nuo aktyviai įgytų dėl infekcijos(69).
Tiesioginis viruso identifikavimas gali būti naudojamas kai infekcija yra ūmioje fazėje. Dažniausiai viruso izoliacijai imami tepinėliai iš pažeidimų atsiradusių kvėpavimo ar lytiniuose takuose kuo ankščiau prasidėjus ligai. Transportavimo terpė, kurioje buvo patalpintas tepinėlis vėliau naudojama inokuliuoti ląstelių kultūras. GHV-1 viruso buvimas nustatomas pagal charakteringus ląstelių kultūros monosluoksnyje. Bet koks aptiktas citopatogenetinis sukėlėjas idententifikuojamas specifiniu antiserumu arba imunoperoksidazės ar imonofluorescensiniu dažymu patvirtinti tapatumą (69).
Kontrolė
Seroteigiamų galvijų skerdimas be lydinčios vakcinacijos yra sėkmingiausias metodas GHV-1 naikinimui. Tačiau šis metodas yra taikytinas tik bandose kur paplitimas yra palyginti mažas. Kad pasiekti nuo GHV-1 bandos statusą, pirmiausia reikėtų sukurti nuo GIR laisvą veislinę bazę, palaipsniui pašalinant seroteigiamus galvijus ir pakeičiaint juos seroneigiamais palikuoniais (82). Testavimo ir skerdimo strategija sėkmingai taikoma Suomijoje, Švedijoje, Norvegijoje, Danijoje, Austrijoje ir Šveicarijoje (82-86).
Alternatyvi strategija yra vakcinacija žymėtomis vakcinomis be gE antigeno, kartu su gE seroteigiamų galvijų šalinimu iš bandos. Kai gE seroteigiamų galvijų sumažėja iki 5 proc. likę seroteigiami gali būti skerdžiami (87, 88). Žymėtos vakcinos leidžia serologinei diferenciacijai tarp infekuotų gyvūnų ir vakcinuotų pagal tai, kokie antikūnai nustatomi galvijų kraujyje. Europoje dažnai naudojamos vakcinos gaminamos iš gE delecijos mutaciją turinčių virusų (89).
Lietuvoje GIR kontrolės priemonės pradėtos įgyvendinti 1993 metais. Pirmiausia jos buvo pradėtos taikyti veislininkystės įmonėse, laikančiose bulius. Ištyrus visus laikomus bulius dėl specifinių antikūnų, nustatyta, kad net 49,8 proc. jų tuo metu buvo seroteigiami. Ištyrus seroteigiamų bulių spermą, kuri buvo laikoma skysto azoto talpose rasta, kad 16,9 proc. spermos mėginių buvo užkrėsti GHV-1. Iki 1997 metų Lietuvos veislininkystės įmonėse pavyko likviduoti serologiškai teigiamus bulius ir užkrėstas spermos serijas (90).
19 Pienininkystės ūkiuose iki 2010 metų pabaigos GIR kontrolę vykdė 54 ūkiai. Dauguma ūkių tik periodiškai atlikinėjo GHV-1 serologinio paplitimo tyrimus. Stebėsenos ir likvidavimo programas atliko 28 ūkiai. Dėl didelio seroteigiamų galvijų skaičiaus dešimtyje ūkių buvo naudojama žymėta vakcina. Tik vienas procentas ūkių, kuriuose buvo laikomi kontroliuojami veisliniai galvijai, vykdė programas. Trys fermos iš jų turėjo laisvų nuo GIR statusą, ir tai sudarė tik 0,05 procento visų veislinių bandų (91).
20
2. Tyrimo metodai ir medžiaga
Tyrimo objektas.
2015 metais Lietuvoje buvo atliekami galvijų infekcinio rinotracheito (GIR) ir galvijų virusinės diarėjos tyrimai iš kraujo serumo imunofermentinės analizės metodu (IFA). Medžiaga serologiniams tyrimams buvo renkama iš įvairių Lietuvos galvijų ūkių. Mėginiai buvo atrenkami iš įvairaus amžiaus ir lyties galvijų atsitiktinės atrankos būdu. Buvo ištirti 30 atsitiktinai pasirinkti Lietuvos ūkiai. Iš viso serologiškai buvo ištirta 905 galvijų serumo mėginių dėl GIR, 517 mėginiai dėl GVD antikūnų ir 435 mėginiai dėl GVD antigeno.
Taip pat pasirinktame X ūkyje buvo atlikta GIR ir GVD retrospektyvi tyrimų, atliktų 2004 – 2014 metais NMVRVI Virusologinių tyrimų skyriuje, analizė. Tuo metu dėl GVD ir GIR iš viso buvo ištirti 192 kraujo serumo mėginiai. 2015 metais papildomai buvo atliktas galvijų rinotracheito (GIR) ir galvijų virusinės diarėjos (GVD) tyrimas iš kraujo serumo imunofermentinės analizės metodu (IFA). Kraujo mėginiai serologiniams tyrimams buvo imti iš pasirinkto ūkio X Lietuvos ūkio. Mėginiai buvo surinkti vienu metu iš įvairaus amžiaus grupių galvijų. Iš viso buvo paimti 40 mėginių. Tiriamųjų mėginių surinkimas. Kraujo mėginiai serologiniams IFA Ak tyrimams buvo imtas iš jungo venos į 10 ml vakuuminius mėgintuvėlius be antikoagulianto. Serumo atskyrimui mėginiai buvo 15 minučių centrifuguojami 1500 aps./min. greičiu. Mėginiai buvo sužymėti ir iki tyrimo laikomi minus 20°C temperatūroje.
Laboratoriniai tyrimai. Serologiniams galvijų kraujo serumo tyrimams dėl antikūnų prieš GVD ir GIR virusams buvo naudoti komerciniai standartizuoti IFA rinkiniai (LSIVet, Škotija). Rinkiniuose esančios mikroplokštelių šulinėliai padengti GVD arba GIR virusų antigenu. Tyrimai paremti tuo, kad serumas, kuriame yra virusui specifinių antikūnų, kontaktuodamas su tiriamojo viruso antigenu sudaro patvarų junginį – antigeno-antikūno kompleksą.
GVD IFA antikūnų tyrimo metodas. Naudotas IFA diagnostinis rinkinys skirtas nustatyti antikūnams specifiam viruso baltymui p80 kraujo serume. Metodas paremtas konkurencijos principu tarp galvijų antikūnų ir monokloninių anti-p80 antikūnų,sujungtų su peroksidaze. Serumo mėginiai skiedžiami ir inkubuojami plokštelės duobutėse. Jei mėginyje yra specifinių antikūnų jie sudaro galvijų antikūnų – p80 kompleksą. Tada plokštelė plaunama ir į duobutes pilamas monokloninių anti – p80 antikūnų ir peroksidazės konjugatas ir inkubuojama. Jeigu mėginyje buvo specifinių antikūnų p80 baltymui, susidaręs kompleksas neleidžia monokloninių antikūnų ir peroksidazės konjugatui jungtis prie antigeno epitopo. Jei mėginyje nebuvo konjugatas gali jungtis prie p80. Plokštelė po
21 inkubavimo vėl plaunama ir pilamas chromogeninis substratas (TMB), kuris sudaro mėlyną junginį, kuris tampa geltonu po blokavimo rūgštimi. Spalvos intensyvumas yra atvirkščiai proporcingas anti-p80 antikūnų koncentracijai tiriamame mėginyje. Vertinamas optinis duobutėse susidarusio junginio optinis tankis, naudojant spektrofotometrą, naudojant 450nm ilgio bangą.
GIR IFA atikūnų tyrimo metodas. Kraujo serumo tyrimui buvo naudojami du IFA diagnostiniai rinkiniai, skirti nustatanti antikūnus GHV-1 viruso gB ir gE glikoproteinams. Tiriami mėginiai atskiedžiami ir inkubuojami plokštelėje. Specifiniai GHV-1 serumo antikūnai sudaro antigeno-antikūno kompleksą ir lieka prisitvirtinę prie duobutėse. Atliekamas plovimas, ir į duobutes išpilstomas anti – galvijų antikūnų imunoglobulino ir peroksidazės konjugatas. Jei duobutėje susidarė antigeno−antikūno kompleksas, konjugatas prisiriša prie jo. Plokštelė praplaunama, į duobutes išpilstomas fermento substratas (TMB), kuris sudaro mėlyną junginį, kuris tampa geltonu po blokavimo rūgštimi. Spalvos intensyvumas yra proporcingas antikūnų koncentracijai tiriamame serumo mėginyje. Vertinamas optinis duobutėse susidarusio junginio optinis tankis, naudojant spektrofotometrą, naudojant 450nm ilgio bangą.
Tyrimo vieta. Tyrimai buvo atliekami 2014 - 2015 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Veterinarinės patobiologijos katedroje ir Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto Virusologinių tyrimų laboratorijoje.
Statistinis duomenų vertinimas.
Statistiniai apskaičiavimai atlikti LSMU Veterinarijos akademijos Veterinarinės patobiologijos katedroje. Statistinė duomenų analizė buvo atliekama kompiuterine programa „Graph Prism 3.0TM“. Apskaičiuotas Studento patikimumo koeficientas ir duomenys laikyti patikimais, kai p< 0,05.
GHV-1 viruso serologinio paplitimo galvijų populiacijoje pasikliautinis intervalas (PI) ir paplitimo procento skirtumų patikimumas, esant 95 proc. tikimybei, apskaičiuotas „EpiTools epidemiological calculators“ programa pagal formulę
kur PI – pasikliautinasis intervalas; p – eigiamų mėginių dalis (proporcija); Z – pasikliautinumo koeficientas 0,95; σ - standartinė paklaida.
Visi tyrimai buvo atlikti laikantis 2012 m. spalio 3 d. Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo Nr. XI-2271
22
3. Tyrimų rezultatai
GIR ir GVD virusų paplitimo tyrimai, atlikti 2015 metais trisdešimtyje Lietuvos pienininkystės ūkių parodė, kad devyniolikoje (63,3 proc.) iš jų rasti GHV-1 užsikrėtusių galvijų. Šešiolikoje (53,3 proc.) ūkių buvo rasta GVD antikūnų turinčių galvijų. Lyginant su vidutinių GIR užsikrėtimo lygiu (20,7 proc., PI 18,31-23,3 proc.), statistiškai ženkliai daugiau seroteigiamų galvijų rasta Pasvalio (51,6 proc.), Radviliškio (39,3 proc.) ir Šakių (33 proc.) rajonuose. Tuo tarpu vidutinis GVD seroteigiamų galvijų skaičius buvo 23,2 proc. (PI 19,6-26,9 proc.). Daugiausia seroteigiamų galvijų nustatyta Pasvalio (54,5 proc.), Pakruojo (51,9 proc.) ir Marijampolės (37,5 proc.) rajonuose (1 lentelė).
1 lentelė. GIR ir GVD virusų infekcijos serologinis paplitimas pienininkystės ūkiuose. Eil.
Nr.
Rajonas Tirta
mėg. n
Teigiami GIR Tirta
mėg., n Teigiami GVD n % PI n % PI 1. Alytaus 106 13 12,3 6,1-18,6 103 4 3,8* 0,1-7,5 2. Anykščių 36 4 11,1* 8,4-21,4 6 0 0 0-0 3. Elektrėnų 20 0 0* 0-0 11 0 0 0-0 4. Jonavos 30 8 26,7 10,9-42,5 10 10 100* 100-100 5. Kauno 66 10 15,2 6,5-23,9 37 5 13,5 2,2-23,8 6. Marijampolės 73 16 21,9 12,4-31,4 56 21 37,5* 24,8-50,2 7. Pakruojo 20 1 5,0 0-14,6 27 14 51,9* 33,1-70,8 8. Panevėžio 51 16 31,4 18,7-44,1 9 3 33,3 2,5-64,1 9. Pasvalio 64 33 51,6* 39,4-63,8 33 18 54,5* 37,5-71,5 10. Radviliškio 28 11 39,3* 21,2-57,4 6 0 0 0-0 11. Raseinių 44 7 15,9 5,1-26,7 22 7 31,8 12,3-51,3 12. Rietavo 32 1 3,1* 0-9,1 5 0 0 0-0 13. Šakių 112 37 33* 24,3-41,7 55 6 10,9* 2,7-19,1 14. Šiaulių 99 14 14,1 7,2-21,0 75 11 14,6 6,6-22,6 15. Šilutės 20 0 0* 0-0 4 0 0 0-0 16. Kiti 104 16 15,4 8,5-22,3 54 20 37,0* 24,1-49,9 Iš viso 905 187 20,7 18,1-23,3 513 119 23,2 19,6-26,9 Pastaba: * reiškia P<0,05
23 GIR ir GVD seroteigiamų galvijų dalis įvairiose amžiaus grupėse pasiskirstę labai skirtingai (5 pav.). GIR seroteigiamų mėginių skaičius visose amžiaus grupėse kito nežymiai (P>0,05). Tuo tarpu GVD seroteigiamų galvijų daugiausia buvo 6 – 12 mėnesių grupėje, mažiausiai 12 – 24 mėnesių grupėje (P<0,05).
5 pav. GIR ir GVD seroteigiamų galvijų pasiskirstymas amžiaus grupėse 2015 metais. GIR antikūnų pasiskirstymas amžiaus grupėse labiausiai išsiskiria 6 – 12 mėnesių grupėje. Seroteigiamų gB antikūnams galvijų buvo nustatyta net 29,6 proc. daugiau nei tiriant dėl gE tipo antikūnų (P<0,05). Amžiui didėjant skirtumas mažėja abiejų tipų antikūnų mėginių skaičiui artėjant prie 20 proc. ribos ir skirtumas tarp tipų sumažėja iki 5,8 proc. trijų ir daugiau metų grupėje (6pav.).
6 pav. GIR antikūnų pasiskirstymas pagal tipą amžiaus grupėse 2015 metais.
22,09% 21,47% 20,51% 19,84% 7,69% 26,02% 6,20% 9,76% 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% iki 6 mėn. 6-12 mėn. 12-24 mėn. 3+ metai GIR GVD 13,79% 6,74% 13,11% 17,96% 26,32% 36,36% 28,57% 23,75% 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% iki 6 mėn. 6-12 mėn. 12-24 mėn. 3+ metai gE gB
24 Pagal gautus duomenis aptinkamų GVD antigenams teigiamų mėginių kiekis yra labai mažas, palyginus su antikūnais. Tiek antigenų tiek antikūnų kiekis padidėja 6 – 12 mėnesių amžiaus grupėje (P<0,05). Teigiamų GVD antikūnams mėginių skaičius vyresnio amžiaus grupėse mažėjo (7 pav.). GVD Ag teigiamų galvijų vidutiniškai buvo 0,46 proc. (PI 0 – 1,1 proc.). Daugiausia tokių galvijų buvo 6 – 12 mėn. amžiaus grupėje (1,54 proc., PI 0-4,53 proc.).
7 pav. GVD antigenų ir antikūnų pasiskirstymas amžiaus grupėse (2015 metai).
Detalesni GIR ir GVD virusų infekcijos epidemiologiniai tyrimai buvo atlikti pasirinktame X ūkyje.
Ūkio X galvijų bandos apibūdinimas. Tyrimams mėginiai buvo paimti iš vieno Lietuvos ūkio. Ūkyje laikoma apie 1100 galvijų, iš jų apie 600 melžiamų karvių. Galvijai laikomi 3 fermose (padaliniuose). Tarp fermų yra 2,5 – 3,3 km atstumas. Dėl judėjimo tarp fermų tvarkos galvijai kontaktuoja tarpusavyje, todėl ūkyje visus galvijus reikia laikyti viena banda. Pastatų išsidėstymo schema ir galvijų judėjimas parodytas 5 paveiksle.
0,00% 1,54% 0,00% 0,79% 23,53% 34,81% 16,83% 15,42% 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% iki 6 mėn. 6-12 mėn. 12-24 mėn. 3+ metai Ag Ak
25 8 pav. Pastatų išsidėstymo schema ir galvijų judėjimas.
Galvijai ganomi prie fermų esančiose ganyklose, kurių bendras plotas yra apie 550 ha, prie kiekvieno padalinio fermų yra apie 180 ha ganyklų. Ganykliniu laikotarpiu padalinių galvijai neturi kontaktų su kitų padalinių galvijais. Galvijai bandoje detaliau pradėti tirti 2004 metais. Pagal ūkį aptarnaujančio veterinarijos gydytojo duomenis pagrindinės galvijų sveikatingumo problemos yra apsivaisinimo sutrikimai, ūmūs lyties organų uždegimai, mastitai, veršelių viduriavimas ir padažnėjęs veršelių gaišimas. Iki 2005 metų vidurio dėl GIR ir GVD buvo ištirti visų trijų ūkio fermų įvairaus amžiaus galvijai. Tyrimų rezultatai pateikti 9 paveiksle.
9 pav. Galvijų serologinių tyrimų rezultatai ūkio fermose 2005 m.
Diagramoje pateikti duomenys rodo, kad GHV-1 virusas nėra labai paplitęs bandoje, vidutiniškai tik 11 procentų visų tirtų galvijų turėjo antikūnų GHV-1 virusui. Daugiausia užsikrėtusių galvijų buvo A fermoje. Dauguma visų galvijų visose fermose turėjo antikūnų prieš GVD virusą – 94 procentai. 30 5,3 15 11,2 90 94,7 95 94 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 A B C Iš viso p ro c. GIR GVD
26 Seroteigiamų GIR virusams galvijų daugiausia buvo iki 6 mėn. ir vyresnių nei 18 mėnesių grupėse, 20 ir 27,5 proc. atitinkamai. Seroteigiamų GVD virusams galvijų skaičius visose grupėse svyravo nuo 90 iki 100 proc. ir skirtumai tarp grupių buvo statistiškai nereikšmingi (7 pav.).
10 pav. Antikūnų prieš GIR ir GVD virusus pasiskirstymas įvairaus amžiaus galvijų grupėse.
GIR seroteigiamų galvijų skaičiaus dinamikos tyrimas ūkio B fermoje parodė, kad per 5 mėnesius virusai išplito ir seroteigiamų galvijų skaičius pasiekė 40 proc. (8 pav.).
11 pav. GIR plitimo dinamika B fermoje.
Atsižvelgus į šių tyrimų rezultatus ir iškilusį GIR pavojų, ūkyje nuo 2005 metų pabaigos iki 2008 pabaigos buvo taikyta galvijų vakcinacija nuo GIR ir GVD. Vakcinacijos schema pateikta 2 lentelėje. 20 0 27,5 90 100 95 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0-6 mėn. 6-18 mėn. >18 mėn. p ro c. GIR GVD 0 0 40 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 2004 05 2005 01 2005 05 p ro c. GIR
27 2 lentelė. Galvijų vakcinacijos schema X ūkyje
Veikla Mėnesiai 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1. IGR vakcinacija (suaugę galvijai) X X X X Prieauglis nuo 3 mėn. amžiaus X X X X 2. GVD vakcinacija: visos karvės ir telyčios X X X X
Vakcinacijai nuo GIR buvo naudojama gyva žymėtoji vakcina “Bayovac IBR – Marker vivum”. Visais atvejais buvo vakcinuojama pagal vakcinos naudojimo instrukciją. Visi vakcinuoti galvijai buvo revakcinuojami kas 6 mėnesius.
Vakcinacijai nuo GVD buvo naudojama inaktyvuotų virusų vakcina „Pregsure BVD“. Buvo atliekama telyčių ir karvių pradinė dvikartinė vakcinacija likus ne mažiau kaip 30 dienų iki sėklinimo. Revakcinuojama buvo vieną kartą per metus prieš sėklinimą.
Ūkio galvijų vakcinacijos poveikis seroteigiamų galvijų dinamikai pateiktas 12 paveiksle. Paveiksle pateikti duomenys rodo, kad 2009 metais kontrolinio tyrimo metu nebuvo nustatyta GIR teigiamų galvijų, GVD seroteigiamų galvijų sumažėjo 8,7 karto (P<0,05). 2014 metais atliktų tyrimų metu nebuvo rasta nė vieno GIR ir GVD seroteigiamo galvijo, tačiau iš 17 tirtų mėginių 1 (5,8 proc. ) atveju tiriamojo galvijo kraujyje buvo nustatytas GVD antigenas. Vėlesnių, 2015 metų tyrimų metu vėl buvo nustatyti GVD ir GIR seroteigiami galvijai.
12 pav. GIR ir GVD seroteigiamų galvijų procentinė dinamika. Vakcinacija nuo GIR ir GVD pradėta 2006 metų pradžioje ir baigta 2008 metų pabaigoje.
11,2% 0,0% 0,0% 2,8% 94,0% 10,8% 0,0% 1,4% 5,6% 0,0% 5,8% 0,0% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 2005 2009 2014 2015 GIR GVD Ak GVD Ag
28 Galvijų sveikatingumo 2014 ir 2015 metų rodikliai ūkyje x pateikti 3 lentelėje. Didžiausias skirtumas lyginant šių metų rodiklius, yra kritusių veršelių iki 6 mėnesių. 2014 metais kritusių veršelių skaičius (12,89proc.) buvo 1,97 karto didesnis nei 2015 metais (6,54 proc.). Kiti rodikliai nesiskyrė (P>0,05).
3 lentelė. Galvijų sveikatingumo rodikliai
Rodiklis 2014 2015 P
Skaičius Proc. Skaičius Proc.
Gimė veršelių 614 100 647 100 -
Iš jų gimė negyvi 33 5,37 35 5,41 >0,05
Abortuoti 2 0,33 1 0,15 >0,05
Laikoma veršelių iki 6 mėn.
287 100 260 100 -
Iš jų krito iki 6 mėn. 37 12,89 17 6,54 0,0129
Laikoma karvių 572 100 583 100 -
29
4. Rezultatų aptarimas
Analizuodami virusinių ligų paplitimą pienininkystės ūkiuose, nustatėme, kad 63,3 proc. ūkių buvo GHV-1 antikūnų turinčių galvijų, o GVD seroteigiamų galvijų buvo 53,3 proc. bandų. Vidutinis GHV-1 užsikrėtimo lygis mūsų tyrimo duomenimis buvo 20,7 proc. (p<0,05), palyginus su 2006 - 2007 metų tyrimų duomenimis Lietuvoje (30,5 proc.), šis rodiklis sumažėjo (92). Lyginant su šios publikacijos GVD tyrimų duomenimis, seroteigiamų galvijų tuo metu buvo ženkliai daugiau (43,4 proc.), nei 2015 metais 23,2 proc. (p<0,05). Taigi, abiejų virusų atžvilgiu sergamumo situacija pagerėjo, tačiau vis dar išlieka rajonų kur užsikrėtimo lygis yra aukštas. Todėl galime teigti, kad tiek GIR tiek ir GVD virusų infekcija Lietuvoje išlieka endeminės.
Kaimyninėse ES šalyse GHV – 1 virusai, sukeliantys GIR taip pat paplitę. Pavyzdžiui, Lenkijoje seroteigiamų GHV-1 virusams galvijų rasta 53 proc. tirtų pieninių bandų (93). GVD virusų serologinis paplitimas Lenkijos pienininkystės ūkiuose, kur net 70,7 proc. bandų nustatomi seroteigiami galvijai, yra didesnis, nei Lietuvoje (22). Tuo tarpu Latvijoje 2013 – 2014 metais 19 proc. bandų buvo nustatyti GVD seroteigiami galvijai. Tas pats tyrimas parodė, kad GHV-1 virusais užsikrėstų bandų taip pat buvo mažiau, nei Lietuvoje, t.y. 15 proc. (94).
Šiaurės Lietuvos ūkiuose didžiausias užsikrėtimo lygis GIR siekė 51,6 proc. Remiantis 2008 metų tyrimų duomenimis, užsikrėtimas kai kur išaugo net 16,2 proc. (92). Daugiausia GVD seroteigiamų galvijų taip pat nustatyta šiauriniuose rajonuose – iki 54,5 proc. Labiausiai užsikrėtusiame ūkyje, lyginant su ankstesniais tyrimais, užsikrėtimas sumažėjo 15,8 proc. (92). Pietvakarių Lietuvos ūkiuose, didžiausias GIR užsikrėtimas 2015 metais buvo 33 proc. (P<0,05), kuris rodo 16 proc. padidėjimą, tuo tarpu GVD užsikrėtimas (21,8proc.) sumažėjo per pusę (10,9 proc. P<0,05), lyginant su ankstesniais tyrimais (92). Tokie nepastovūs rezultatai gali rodyti nenuoseklų prevencijos priemonių taikymą ūkiuose.
GIR 2015 metų tyrimų duomenimis seroteigiamų galvijų dalis įvairiose amžiaus grupėse reikšmingai nekito didėjant galvijų amžiui (22,1 proc. – 19,8 proc., P>0,05). Tuo tarpu ankstesnis tyrimas, atliktas 2005 – 2009 metais Lietuvos galvijų populiacijoje, parodė, kad GIR seroteigiamų galvijų dalis didėjant amžiui didėjo nuo 4,26 proc. –iki 53,98 proc. (78).
GIR serologiniame tyrime buvo naudojami du metodai, nustatyti dviem skirtingiems viruso glikoproteinams – gE ir gB. Šie skirtingi tyrimo metodai naudojami atskirti vakcinuotiems nuo GIR galvijams nuo nevakcinuotų.. Žymėtos vakcinos nuo GIR, kurios naudojamos Lietuvoje, yra gaminamos iš viruso, kuris nesukelia gE gamybos organizme. Todėl vakcinuotų nuo GIR galvijų
30 tyrimams naudojamas vadinamasis gE IFA antikūnų nustatymo metodas (82). Mūsų tyrimų duomenimis, GIR gE ir gB antikūnų pasiskirstymas labiausiai skyrėsi 6 – 12 mėnesių grupėje, kurioje gB seroteigiamų individų buvo ženkliai daugiau, nei gE (P<0,05). Amžiui didėjant šis skirtumas mažėja abiejų tipų antikūnų mėginių skaičiui artėjant prie 20 proc. ribos. Seroteigiamų galvijų skaičius tarp vakcinuotų (gE teigiamų) ir nevakcinuotų (gB teigiamų) populiacijų statistiškai nebesiskyrė vyresnių nei trijų metų amžiaus grupėje. Toks pasiskirstymas gali rodyti, kad 6 – 12 mėnesių amžiaus grupėje GHV-1 virusai nevakcinuotoje bandoje greitai plinta, o vakcinacija efektyviai apsaugo nuo šių virusų infekcijos.
Mūsų tyrimų duomenimis daugiausia GVD seroteigiamų galvijų taip pat buvo 6 – 12 mėnesių amžiaus grupėje. Tai galima būtų paaiškinti tuo, kad šioje grupėje buvo ir GVD antigenui teigiamų individų, net 1,54 proc., o vidutiniškai visoje populiacijoje Ag teigiamų individų radome 0,46 proc. Literatūros duomenimis (14), tokie galvijai yra persistentiškai infekuoti (PI), nuolat į aplinką išskiria GVD virusus ir apkrečia imlius seroneigiamus individus. Tai ir paaiškina ženklų GVD seroteigiamų galvijų padidėjimą šioje amžiaus grupėje. Lietuvoje anksčiau atlikti PI galvijų paplitimo tyrimai parodė, kad tokių galvijų 2004 metais buvo 0,5 proc.(27). Todėl galime daryti išvadą, kad PI galvijų skaičius nekinta ir tokie galvijai pagrindinis GVD virusų rezervuaras bandose.
Atlikus detalesnę retrospektyvinę epidemiologinę analizę pasirinktajame X ūkyje, nustatėme, kad GHV-1 virusas nebuvo labai paplitęs bandoje, vidutiniškai tik 11 proc. visų tirtų galvijų turėjo antikūnų šiam virusui. Tačiau dauguma ūkio galvijų turėjo antikūnų prieš GVD virusą – net 94 proc. Tai gerokai viršijo GVD vidutinį serologinį paplitimą, kuris Lietuvoje tuo metu tuo metu buvo 37,5 proc.(27, 92).
Mūsų atlikta X ūkio serologinių tyrimų analizė parodė, kad GIR buvo paplitęs nevienodai skirtingose amžiaus grupėse. Antikūnų tiek prieš GIR tiek ir prieš GVD virusus buvimas pas veršelius iki 6 mėnesių amžiaus rodo pasyvų imunitetą (95). Telyčių grupėje serologiškai GIR antikūnų nenustatyta. Tai rodo, kad GHV-1 virusai ūkyje greičiau plinta karvių grupėje, kai jos tvartuose laikomos palaidos didelėmis grupėmis ir dėl to dažnai kontaktuoja. Dar didesnė tikimybė šiems virusams greitai plisti karvių grupėje atsiranda po karvių veršiavimuose, nes šis stresas dažnai reaktyvuoja GHV-1 infekciją ir virusais užkrečiamos seroneigiamos karvės (96). Didelis GVD seroteigiamų galvijų skaičius iki 6 mėn. veršelių grupėje mūsų nuomone rodo pasyvų krekeninį imunitetą, kuris gali trukti iki 6 mėn. (95). Tačiau nustatytas didesnis nei 90 proc. seroteigiamų prieš GVD virusą telyčių skaičius rodo, kad bandoje yra persistentiškai infekuotų galvijų – virusų nešiotojų (14).
31 Mūsų duomenimis, X ūkio B fermoje iki 2004 metų pabaigos galvijai buvo laikomi izoliuotai ir neturėjo kontaktų su kitų fermų galvijais. Tačiau 2005 metų pradžioje į šią fermą buvo pradėtos vežti veršingos telyčios iš C fermos. Matyt į šią fermą pateko ir GHV-1 seroteigiami galvijai, kuriems po apsiveršiavimo aktyvavosi GIR virusai ir greitai išplito imlių galvijų grupėje (97). Taigi, šis tyrimas parodė, kad nesiimant jokių profilaktinių priemonių GIR gali greitai plisti imlių galvijų populiacijoje.
Atlikus virusinių ligų epidemiologinę analizę X ūkyje, nustatėme, kad vykdant vakcinacijos programą iki 2009 metų GHV-1 virusų plitimas buvo sustabdytas ir GIR seroteigiamų galvijų nebuvo nustatoma Per tą patį laikotarpį GVD seroteigiamų galvijų sumažėjo net 8,7 karto (P<0,05). 2014 metų duomenimis nebuvo aptikta nei vieno galvijo turinčio antikūnų išskyrus vieną atvejį, kai galvijo kraujyje buvo nustatytas GVD antigenas. Tai rodo, kad ūkyje atsirado viruso nešiotojų, kas galėjo turėti įtakos tų pačių metų veršelių iki 6 mėnesių amžiaus kritimų skaičiaus padidėjimui iki 12,89 proc., o tai 1,97 karto viršijo 2015 metų veršelių gaišimo rodiklius (6,54proc.), nors visos šalies mastu vidutinis galvijų gaišimas yra 4,59 proc. (98). Tuo tarpu kitoseES šalyse atlikti panašūs tyrimai rodo, kad veršelių, nugaišusių iki 6 mėnesių amžiaus dalis yra mažesnė nei mūsų tirtame ūkyje. Pavyzdžiui, Prancūzijoje šis skaičius siekia 3,7 proc., o Italijoje iki 12 mėnesių amžiaus nugaišta 4,9 proc. galvijų (99, 100).
Gimusių negyvų veršelių skaičius tiriamajame ūkyje tyrimo metu nekito ir buvo nuo 5,37 iki 5,41 proc. ir 2015 metais atliktų tyrimų duomenimis buvo labai artimas Lietuvoje kritusių veršelių vidutiniam skaičiui – 5,3 proc.(101). Todėl galima teigti, kad GVD nešiotojų atsiradimas ūkyje nespėjo paveikti veršingų telyčių sveikatos, tačiau turėjo įtakos veršelių mirtingumo skaičiaus padidėjimui.
32
Išvados
1. Galvijų infekcinio rinotracheito ir galvijų virusinės diarėjos virusai yra labai išplitę Lietuvos pienininkystės ūkiuose. Net 63,3 proc. ūkių buvo GHV-1 antikūnų turinčių galvijų, o GVD seroteigiamų galvijų buvo 53,3 proc. bandų.
2. GHV-1 virusais 2015 metais vidutiniškai buvo užsikrėtę 20,7 proc. Lietuvos pieninių galvijų ir 43,4 proc. galvijų buvo seroteigiami GVD virusams. Lyginant su anksčiau atliktais tyrimai, pieninių galvijų bandose šių virusų plitimas lėtėja, tačiau šios infekcijos Lietuvoje išlieka endeminėmis.
3. Daugiausia GVD seroteigiamų galvijų buvo 6 – 12 mėnesių amžiaus grupėje. Šioje galvijų grupėje randama ir daugiausiai persistentiškai infekuotų (PI) galvijų.
4. GIR virusų serologinė plitimo analizė mūsų pasirinktame ūkyje rodo, kad šie virusai bandoje per 5 mėnesius gali užkrėsti 40 proc. imlių galvijų.
5. Vakcinacijos programa tiriamajame ūkyje padėjo ženkliai sumažinti galvijų sergamumą GIR ir GVD.
33
Rekomendacijos
1. Atsižvelgiant į tyrimų rezultatus, kurie rodo didelį vakcinacijos efektyvumą ūkyje X, rekomenduojama IGR ir GVD kontrolės programas vykdyti ir kitiems galvijininkystės ūkiams.
2. Ūkiuose, kuriuose vykdomos infekcinių ligų vakcinacijos programos, kontrolinius serologinius tyrimus rekomenduotume atlikti reguliariai ir ne rečiau, kaip vieną kartą per metus.
3. Rekomenduojame toliau vykdyti IGR ir GVD stebėsenos tyrimus Lietuvos galvijininkystės ūkiuose.
34
Literatūros sąrašas
1. Milius J, Lukauskas K, Tamošiūnas V. Išlaidos galvijų virusinių ligų tyrimams Lietuvoje 2000–2004 metais. Veterinarija ir zootechnika. 2005;31(53):37-42.
2. Galyean M, Perino L, Duff G. Interaction of cattle health/immunity and nutrition. Journal of animal science. 1999;77(5):1120-34.
3. Parish J, Troxel T, Kreider D, Post N, Widel P. Effect of Respiratory Disease Vaccination Program on Immune Response in Beef Calves. Arkansas. 2002:55.
4. Houe H. Epidemiological features and economical importance of bovine virus diarrhoea virus (BVDV) infections. Veterinary microbiology. 1999;64(2):89-107.
5. Brock K, Grooms D, Ridpath J, Bolin S. Changes in levels of viremia in cattle persistently infected with bovine viral diarrhea virus. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 1998;10(1):22-6.
6. Muylkens B, Thiry J, Kirten P, Schynts F, Thiry E. Bovine herpesvirus 1 infection and infectious bovine rhinotracheitis. Veterinary research. 2007;38(2):181-209.
7. Jones C. Alphaherpesvirus latency: its role in disease and survival of the virus in nature. Advances in virus research. 1998;51:81-133.
8. Engels M, Ackermann M. Pathogenesis of ruminant herpesvirus infections. Vet Microbiol. 1996;53(1-2):3-15.
9. ÓZSVÁRI L. Economic analysis of decisions with respect to dairy cow health management. Doctoral (PhD) dissertation SZIU-FVS, Gödöllő. 2004;145.
10. Lietuvo žemės ūkis Faktai ir skaičiai: Valstybės įmonė Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centras; 2015 [cited 2016-11-16]. Available from: https://www.vic.lt/publication.php?id=20246.
11. Vilcek S, Durkovic B, Kolesarova M, Paton DJ. Genetic diversity of BVDV: Consequences for classification and molecular epidemiology. Preventive Veterinary Medicine. 2005;72(1–2):31-5.
12. Family - Flaviviridae. In: King AMQ, Adams MJ, Carstens EB, Lefkowitz EJ, editors. Virus Taxonomy. San Diego: Elsevier; 2012. p. 1003-20.
13. Houe H, Lindberg A, Moennig V. Test Strategies in Bovine Viral Diarrhea Virus Control and Eradication Campaigns in Europe. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 2006;18(5):427-36.
14. Lindberg ALE, Alenius S. Principles for eradication of bovine viral diarrhoea virus (BVDV) infections in cattle populations. Veterinary Microbiology. 1999;64(2–3):197-222.
15. Grooms DL. Reproductive consequences of infection with bovine viral diarrhea virus. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 2004;20(1):5-19.
16. Viltrop A, Alaots J, PÄRn M, Must K. Natural Changes in the Spread of Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV) Among Estonian Cattle. Journal of Veterinary Medicine, Series B. 2002;49(6):263-9.
17. Gamlen T, Richards KH, Mankouri J, Hudson L, McCauley J, Harris M, et al. Expression of the NS3 protease of cytopathogenic bovine viral diarrhea virus results in the induction of apoptosis but does not block activation of the beta interferon promoter. Journal of General Virology. 2010;91(1):133-44.
18. Meyling A, Houe H, Jensen A. Epidemiology of bovine virus diarrhoea virus. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 1990;9(1):75-93.
19. Virion ViralZone[Internet]: Swiss Institute of bioinformatics; 2010 [2016-11-16]. Available from: http://viralzone.expasy.org/all_by_species/179.html.
20. Bruschke CJ, Weerdmeester K, Van Oirschot JT, Van Rijn PA. Distribution of bovine virus diarrhoea virus in tissues and white blood cells of cattle during acute infection. Veterinary Microbiology. 1998;64(1):23-32.
35 21. Spagnuolo M, Kennedy S, Foster J, Moffett D, Adair B. Bovine viral diarrhoea virus infection in bone marrow of experimentally infected calves. Journal of comparative pathology. 1997;116(1):97-100.
22. Kuta A, Polak MP, Larska M, Żmudziński JF. Monitoring of bovine viral diarrhoea virus (BVDV) infection in Polish dairy herds using bulk tank milk samples. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy. 2013;57(2):149-56.
23. Kuta A, Polak M, Larska M, Żmudziński J. Predominance of bovine viral diarrhea virus 1b and 1d subtypes during eight years of survey in Poland. Veterinary microbiology. 2013;166(3):639-44.
24. Humphry R, Brlisauer F, McKendrick I, Nettleton P, Gunn G. Prevalence of antibodies to bovine viral diarrhoea virus in bulk tank milk and associated risk factors in Scottish dairy herds. Veterinary Record-English Edition. 2012;171(18):445.
25. Booth R, Brownlie J. Establishing a pilot bovine viral diarrhoea virus eradication scheme in Somerset. Veterinary Record-English Edition. 2012;170(3):73.
26. Rossmanith W, Deinhofer M, Janacek R, Trampler R, Wilhelm E. Voluntary and compulsory eradication of bovine viral diarrhoea virus in Lower Austria. Veterinary microbiology. 2010;142(1):143-9.
27. Kliučinskas R, Lukauskas K, Milius J, Mauricas M. Galvijų virusinės diarėjos paplitimas Lietuvoje ir kontrolės priemonių efektyvumas nustatant persistentiškai infekuotus galvijus. Veterinarija ir zootechnika. 2004;28(50):5-11.
28. Šalomskas A, Mockeliūnienė V, Jacevičius E, Lelešius R, Mockeliūnas R, Kliučinskas R, et al. Galvijų infekcinio rinotracheito ir virusinės diarėjos diagnostikos ir prevencijos problemos. 2006.
29. Baker JC. The clinical manifestations of bovine viral diarrhea infection. The Veterinary clinics of North America Food animal practice. 1995;11(3):425-45.
30. Brownlie J. The pathogenesis of bovine virus. Rev sci tech Off int, Epiz. 1990;9(1):43-59.
31. Ames T. The causative agent of BVD: its epidemiology and pathogenesis. Veterinary medicine (USA). 1986.
32. Moerman A, Straver P, De Jong M, Quak J, Baanvinger T, Van Oirschot J. Clinical consequences of a bovine virus diarrhoea virus infection in a dairy herd: a longitudinal study. Veterinary Quarterly. 1994;16(2):115-9.
33. Duffell S, Harkness J. Bovine virus diarrhoea-mucosal disease infection in cattle. Veterinary Record. 1985;117(10):240-5.
34. Brownlie J. Clinical aspects of the bovine virus diarrhoea/mucosal disease complex in cattle. practice. 1985;7(6):195-202.
35. Health TWOfA. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2015
2015 [2015-11-01]. Available from:
http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.04.08_BVD.pdf.
36. McGowan M, Kirkland P. Early reproductive loss due to bovinepestivirus infection. British Veterinary Journal. 1995;151(3):263-70.
37. Moennig V, Liess B. Pathogenesis of intrauterine infections with bovine viral diarrhea virus. The Veterinary clinics of North America Food animal practice. 1995;11(3):477-87.
38. Fray M, Mann G, Bleach E, Knight P, Clarke M, Charleston B. Modulation of sex hormone secretion in cows by acute infection with bovine viral diarrhoea virus. Reproduction. 2002;123(2):281-9.
39. Voges H, Young S, Nash M. Direct adverse effects of persistent BVDv infection in dairy heifers–a retrospective case control study. VetScript. 2006;19(8):22-5.
40. Constable P, Hull B, Wicks J, Myer W. Femoral and tibial fractures in a newborn calf after transplacental infection with bovine viral diarrhoea virus. The Veterinary record. 1993;132(15):383-5.
36 41. Larsson B, Traven M, Hultén C, Segerstad C, Belák K, Alenius S. Serum concentrations of thyroid hormones in calves with a transient or persistent infection with bovine viral diarrhoea virus. Research in Veterinary Science. 1995;58(2):186-9.
42. Houe H. Survivorship of animals persistently infected with bovine virus diarrhoea virus (BVDV). Preventive Veterinary Medicine. 1993;15(4):275-83.
43. Brownlie J, Clarke M, Howard C. Experimental production of fatal mucosal disease in cattle. The Veterinary Record. 1984;114(22):535-6.
44. Brownlie J. Pathogenesis of mucosal disease and molecular aspects of bovine virus diarrhoea virus. Veterinary microbiology. 1990;23(1):371-82.
45. Dubovi EJ. Laboratory diagnosis of bovine viral diarrhea virus. Biologicals. 2013;41(1):8-13.
46. Saliki JT, Dubovi EJ. Laboratory diagnosis of bovine viral diarrhea virus infections. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 2004;20(1):69-83.
47. Lanyon SR, Hill FI, Reichel MP, Brownlie J. Bovine viral diarrhoea: pathogenesis and diagnosis. The Veterinary Journal. 2014;199(2):201-9.
48. Horner GW, Tham K-M, Orr D, Ralston J, Rowe S, Houghton T. Comparison of an antigen capture enzyme-linked assay with reverse transcription — polymerase chain reaction and cell culture immunoperoxidase tests for the diagnosis of ruminant pestivirus infections. Veterinary Microbiology. 1995;43(1):75-84.
49. Shannon AD, Richards SG, Kirkland PD, Moyle A. An antigen-capture ELISA detects pestivirus antigens in blood and tissues of immunotolerant carrier cattle. Journal of Virological Methods. 1991;34(1):1-12.
50. Saliki JT, Huchzermeier R, Dubovi EJ. Evaluation of a new sandwich ELISA kit that uses serum for detection of cattle persistently infected with BVD virus. Annals of the New York Academy of Sciences. 2000;916(1):358-63.
51. Brinkhof J, Zimmer G, Westenbrink F. Comparative study on four enzyme-linked immunosorbent assays and a cocultivation assay for the detection of antigens associated with the bovine viral diarrhoea virus in persistently infected cattle. Veterinary Microbiology. 1996;50(1–2):1-6.
52. Cho HJ, Masri SA, Deregt D, Yeo S-G, Thomas E. Sensitivity and specificity of an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of bovine viral diarrhea virus antibody in cattle. Canadian Journal of Veterinary Research. 1991;55(1):56.
53. Beaudeau F, Belloc C, Seegers H, Assié S, Sellal E, Joly A. Evaluation of a blocking ELISA for the detection of bovine viral diarrhoea virus (BVDV) antibodies in serum and milk. Veterinary Microbiology. 2001;80(4):329-37.
54. Fux R, Wolf G. Transient elimination of circulating bovine viral diarrhoea virus by colostral antibodies in persistently infected calves: a pitfall for BVDV-eradication programs? Veterinary microbiology. 2012;161(1):13-9.
55. Nettleton PF, Entrican G. Ruminant pestiviruses. British Veterinary Journal. 1995;151(6):615-42.
56. Rossmanith W, Janacek R, Wilhelm E. Control of BVDV-infection on common grassland—The key for successful BVDV-eradication in Lower Austria. Preventive Veterinary Medicine. 2005;72(1–2):133-7.
57. Mars MH, Van Maanen C. Diagnostic assays applied in BVDV control in The Netherlands. Preventive Veterinary Medicine. 2005;72(1–2):43-8.
58. Sandvik T. Progress of control and prevention programs for bovine viral diarrhea virus in Europe. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 2004;20(1):151-69.
59. Greiser-Wilke I, Grummer B, Moennig V. Bovine viral diarrhoea eradication and control programmes in Europe. Biologicals. 2003;31(2):113-8.
60. Hult L, Lindberg A. Experiences from BVDV control in Sweden. Preventive Veterinary Medicine. 2005;72(1–2):143-8.
