LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS FAKULTETAS
MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDRA
EGLĖ KAZAKEVIČIENĖ
FUSARIUM SPP. ĮTAKA MIKOTOKSINŲ KAUPIMUISI
GRŪDUOSE SANDĖLIAVIMO METU
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: doc. dr. Violeta Baliukonienė
2 PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO
SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Fusarium spp. įtaka mikotoksinų kaupimuisi grūduose sandėliavimo metu“:
1. Yra atliktas mano pačios:
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje:
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
Eglė Kazakevičienė
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ
LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Eglė Kazakevičienė
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
doc. dr. Violeta Baliukonienė
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
prof. dr. Mindaugas Malakauskas
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
3
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5 SANTRAUKA ... 6 SUMMARY ... 8 ĮVADAS...10 1. LITERATŪROS APŽVALGA... 121.1. Grūdų užsikrėtimo mikromicetais šaltiniai ir keliai ... 12
1.2. Veiksniai lemiantys mikromicetų vystymąsi ant grūdų sandėliavimo metu ... 13
1.2.1. Saugyklų paruošimas grūdų sandėliavimui ... 15
1.2.2. Aplinkos veiksnių įtaka sandėliuojamų grūdų kokybei ... 18
1.2.2.1. Fiziniai veiksniai ... 18
1.2.2.2. Cheminiai veiksniai ... 19
1.2.2.3. Biologiniai veiksniai ... 20
1.3. Grūdus pažeidžiančių mikromicetų morfologiniai, fiziologiniai ir adaptaciniai savitumai ... 20
1.4. Grūduose aptinkami mikotoksinai ... 24
1.4.1. Fusarium spp. produkuojami mikotoksinai ... 25
1.4.1.1. Deoksinivalenolis (DON)... 26
1.4.1.2. Zearalenonas (ZON) ... 27
1.4.1.3. T–2 toksinas. ... 28
1.5. Profilaktinės priemonės prieš Fusarium spp. paplitimą grūduose ... 29
2.TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS... 31
2.1 Tyrimo objektai ... 31
2.2 Tyrimo metodai ... 34
2.2.1. Kiekybinis kviečių ir miežių užkrėstumas mikromicetų pradais ... 34
2.2.2 Išorinis procentinis grūdų užterštumas mikromicetais ... 34
2.2.3 Vidinis (giluminis) grūdų užkrėstumas mikromicetais ... 35
2.2.4 Mikotoksinų T-2, DON, ZON nustatymas grūduose ... 36
2.2.5 Statistinis duomenų įvertinimas ... 37
3. TYRIMO REZULTATAI ... 38
3.1 Kiekybinis grūdų užterštumas mikromicetų pradais ... 38
3.2 Išorinis, vidinis grūdų užkrėstumas mikromicetų gentimis ...39
3.3 Mikotoksinų koncentracijos kviečiuose ir miežiuose...44
4
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 48
IŠVADOS ... 50
LITERATŪRA ... 51
5
SANTRUMPOS
ALT – altenuenas
AME – alternariolo monometildibromdifenilmetanao eteris AOH – alternariolis
a
w – vandens aktyvumas B1 – aflatoksinas B1 B2 – aflatoksinas B2 CO2 – anglies dvideginis DAS – diacetoksiscirpenolis DNR – deoksiribonukleorūgštis DON – deoksinivalenolisELISA – imunofermentinės analizės metodas EFSA – Europos maisto saugos tarnyba FAO – Maisto ir Žemės ūkio organizacija G1 – aflatoksinas G1
G2 – aflatoksinas G2 HT – 2 – toksinas HT-2 IgA – imunoglobulinas A Kg – kilogramai
KSV – kolonijas sudarantys vienetai MAS – monoacetoksiscirpenolis M1 – aflatoksinas M1 NIV – nivalenolis OTA – ochratoksinas A O2 – deguonis PA – penitrem A RNR – ribonukleino rūgštis SO2 – sieros dioksidas
TEA – tetramiko rūgšties dariniai TPD – toleruojama paros dozė T–2 – T–2 toksinas
ZON – zearalenonas μg – mikrogramai
6
SANTRAUKA
Autorius: Eglė Kazakevičienė.
Darbo tema – Fusarium spp. įtaka mikotoksinų kaupimuisi grūduose sandėliavimo metu. Darbo vadovas: doc. dr. Violeta Baliukonienė.
Raktiniai žodžiai: grūdai, Fusarium spp., deoksinivalenolis, zearalenonas, T–2 toksinas. Atlikimo vieta: darbas atliktas Maisto saugos ir kokybės katedroje, Veterinarijos akademija, Lietuvos sveikatos mokslų universitetas. Tyrimas buvo atliekamas 2011–2013 metų laikotarpiu.
Darbo apimtis: 62 psl., 23 paveikslai, 1 schema, 4 lentelės.
Darbo objektas: tyrimams mėginiai imti iš sandėlių X ir XX, esančių Vilkaviškio rajone, iš viso paimta 30 miežių ir 30 kviečių mėginių.
Darbo tikslas: nustatyti Fusarium spp. kitimą grūduose ir fuzariotoksinų dinamiką sandėliavimo metu bei įvertinti profilaktinių priemonių efektyvumą prieš Fusarium spp. plitimą grūduose.
Tyrimo uždaviniai:
nustatyti sandėliavimo metu grūdų (kviečių ir miežių) užsikrėtimą mikromicetais; įvertinti fuzariotoksinų (deoksinivalenolio, zearalenono, T–2 toksino) paplitimą
grūduose sandėliavimo metu;
įvertinti profilaktinių priemonių efektyvumą X ir XX ūkiuose prieš Fusarium spp. plitimą grūduose.
Rezultatai ir aptarimas. Atlikus kiekybinį kviečių ir miežių užterštumą mikromicetų pradais, buvo nustatyta, kad didžiausias „Ūla“ veislės miežių užterštumas buvo nustatytas 2013 metų kovo mėnesį 113±10,4*103 KSV/g. Veislėje “Luokė” didžiausias užterštumas mikromicetų pradais buvo nustatytas 2012 metų kovo mėnesį –109±19,9*103
KSV/g. Didžiausias kviečių veislės „Triso“ užkrėstumas taip pat buvo nustatytas 2012 metų kovo mėnesį – 204±7,8*103
KSV/g, veislės „Munk“ didžiausias užterštumas buvo nustatytas taip pat 2012 metų kovo mėn. 128±10,8*103
KSV/g.
Lyginant sandėliuose X ir XX laikomus miežius „Ūla“ ir „Luokė“ Fusarium spp. paplitimas buvo: miežių „Ūla“ didžiausias vidinis užkrėstumas mikromicetų pradais siekė 80±0,0 proc. veislės „Luokė“ taip pat 80±0,0 proc. Didžiausias išorinis fuzarioze užkrėstumas veislėje “Ūla” siekė 73±0,44 proc. (sausio mėn. 2012 m.) ir 73±3,33 proc. (rugpjūčio mėn. 2012 m.), o veislėje „Luokė“ – 70±5,77 proc. (rugpjūčio mėn. 2012 m.) ir 70±11,55 proc. (rugsėjo mėn. 2012 m.).
Lyginant gautus tyrimų rezultatus, mėginių imtų iš sandėlių X ir XX kviečių veislių „Triso“ ir „Munk“, buvo nustatyta, kad fuzarioze labiau užkrėsti buvo „Munk“ veislės kviečiai. Didžiausias
7 vidinis (giluminis) užkrėstumas siekė 77±8,82 proc., o išorinis – 93±26,67 proc., tuo tarpu veilsės „Triso“ didžiausias vidinis užkrėstumas siekė 60±5,77 proc., o išorinis – 87±21,86 proc.
Didžiausia DON koncentracija kviečiuose buvo 2011 metų rugsėjo mėn., ji siekė 1200 μg/kg. Ši koncentracija buvo nustatyta kviečių veislėje „Triso“ (XX sandėlys). Didžiausia T–2 toksino koncentracija buvo nustatyta miežių veislėje „Luokė“ (X sandėlys) – 200 μg/kg. ZON didžiausia koncentracija buvo nustatyta kviečių veislėje „Triso“ (XX sandėlys) – 870 μg/kg.
Bendra išvada. Kaip rodo gauti rezultatai, Fusarium spp. paplitimas sandėliuojamuose grūduose turi didelę įtaką fuzariotoksinų atsiradimui ir kaupimuisi, o Fusarium spp. plisti sandėliuojamuose grūduose, didžiausios įtakos turėjo grūdų drėgnis, priemaišos, šalia laikomos kultūros, sandėlių bendra būklė.
8
SUMMARY
Author: Eglė Kazakevičienė
The theme: Fusarium spp. influence on mycotoxins accumulation in the grain during storage. The supervisor of the work: doc. dr. Violeta Baliukonienė.
Keywords: grain, Fusarium spp., deoxynivalenol, zearalenone, T–2 toxin.
The place: work was completed in Food safety and quality department, Veterinary academy, Lithuanian University of Health science. Research was preformed 2011–2013 in pursuance Fusarium spp.
Scope of work: 62 pages, 23 pictures, 1 diagram, 4 tables.
The Object of the work: testing samples taken from granaries located in the X and XX Vilkaviškis district, taken 30 wheat and 30 barley samples.
The aim of the work: changes in the grain and dynamics of fusariotoxins while granaring and to evaluate effectiveness of preventive measures against spreading of Fusarium spp. in grain.
Reasearch objects:
to assess fungi contamination in grain (wheat and barley) while granaring;
to evaluate prevalence of fusariotoxins (deoxynivalenol, zearalenone, T–2 toxin ) in the grain while granaring;
to evaluate effectiveness of preventive measures in X farms against spreading of Fusarium spp. in the grain.
The results and their discussion: carried out quantitative wheat and barley contamination with fungi rudiment, found that ultimate „Ūla“ species barley contamination determined in 2013 March 113±10,4*103 KSV/g.
Ultimate „Luokė“ species barley contamination with fungi rudiment determined 2012 March 109±19,9*103
KSV/g.
Ultimate contamination of wheat species „Triso“ as well was determined 2012 March 204±7,8*103
KSV/g, mean while ultimate contamination of species „Munk“ was determined 2012 March 128±10,8*103KSV/g.
Compared spreading in barley of Fusarium spp. in granaries X and XX species „Ūla“ and „Luokė“ prevalence found: ultimate contamination with fungi rudiment in barley „Ūla“ range 80±0,0 %, species „Luokė“ 80±0,0 %. Ultimate external contamination of fusariosis in species „Ūla“ range 73±0,44 % (2012 January) and 73±3,33 % (2012 September), species „Luokė“ 70±5,77 % (2012 August) and 70±11,55 % (2012 September).
9 Compared wheat species „Triso“ and „Munk“ samples taken from farms X and XX research results found that contamination with Fusarium spp. was higher in wheat species „Munk“. Ultimate internal contamination range 77±8,82 %, external 93±26,67%, mean while species „Triso“ ultimate internal contamination 60±5,77 % , external 87±21,86 %.
The highest DON concentration in wheat was found in september 2011, range 1200 μg/kg. This concentration determined in wheat species „Triso“ granary XX. Highest T–2 toxin concentration determined barley species „Luokė“ granary X – 200 μg/kg. The highest ZON concentration in wheat was found in wheat species „Triso“ XX granary – 870 μg/kg.
The conclusion: As the results show, prevalence of Fusarium spp. in granaries grain has great impact to the emergence and accumulation of mycotoxins, spread of Fusarium spp. in warehouse grain impacted by grain dampness, impurity, near stored crops and general condition of granaries.
10
ĮVADAS
Pastaraisiais metais tiek Lietuvos, tiek viso pasaulio ūkininkus vis kamuoja klausimas, kaip apsaugoti grūdus nuo mikroskopinių grybų, dar kitaip vadinamų mikromicetų, kurie gamina ypač nuodingus cheminius junginius – mikotoksinus (Skurdenienė ir kt., 2007; Rasch et al., 2010; Mayer et al., 2008), ir kaip grūdus išlaikyti sveikus visą sandėliavimo laikotarpį. Tai ypač tapo aktuali problema pastaraisiais metais mūsų ūkininkams, kai oro sąlygos tapo vis labiau permainingos ir to pasekoje, vis labiau ėmė vyrauti mikromicetai ir jų produkuojami mikotoksinai.
Mikotoksinai toksiškai veikia įvairias žinduolių rūšis ( Mayer et al., 2008). Gali sukelti alergijas, nevaisingumą, pažeisti skrandžio ir žarnų gleivines, inkstų ir centrinę nervų sistemą, turi kancerogeninį, teratogeninį, urogenitalinį poveikį, gali sumažinti atsparumą infekcinėms ligoms (Skurdenienė ir kt., 2007; Rasch et al., 2010). Įvairių tyrimų duomenimis mikotoksinai į organizmą gali patekti ne tik per maistą ar pašarus, bet ir per kvėpavimo sistemą (Mayer, 2008). Manoma, kad 25 proc. pasaulio maistinėms kultūroms įtakos turi mikotoksinus gaminantys grybai. Pagal FAO skaičiavimus nuostoliai siekia 1000 milijonų maistinių kultūrų tonų per metus (Rasch et al., 2010).
Svarbiausi ir labiausiai tiriami įvairių Europos šalių mokslo įstaigose yra Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Claviceps, Pyrenophora genčių mikromicetai (Skurdenienė ir kt., 2007). Reali toksinų gamyba, kartu ir pašarų, bei maisto produktų užteršimas, priklauso nuo išorinės aplinkos veiksnių, tokių kaip substrato (terpės) sudėties, struktūros, drėgmės, temperatūros (Skurdenienė ir kt., 2007).
Pastaruoju laikotarpiu ypač didelis dėmesys yra skiriamas Fusarium spp. genties mikromicetams. Šios genties grybai sukelia javų fuzariozę, kuri dažniau pasitaiko kviečiuose, bet taip pat gali būti užkrėsti ir miežiai, rugiai, avižos, kvietrugiai, kukurūzai. Fusarium genties grybai gali produkuoti šiuos žmogaus ir gyvūno organizmui žalingus metabolitus – mikotoksinus: deoksinivalenolį (DON), zearalenoną (ZON), T–2 toksiną, nivalenolį, fumoniziną.
Pagrnidninės Fusarium genties rūšys išskiriančios mikotoksinus yra šios: F. avenaceum, F. graminearum, F. culmorum, iš kurių, mūsų krašte pasitaikantys mikotoksinai yra deoksinivalenolis, zearalenonas ir T–2 toksinas (Summerell et al., 2010).
Veikiant Fusarium spp. pažeistą grūdą, jo kokybė labai suprastėja: pasikeičia aminorūgščių sudėtis, sumažėja grūdo stikliškumas ir saiko masė (Magan, Aldred, 2007).
Mikroskopinių grybų pagrindinė savybė ta, kad jie sugeba prisitaikyti prie bet kokių aplinkos sąlygų. Taip iš laukų užkrėsti javai yra pargabenami į sandėlius, kur toliau mikroskopiniai grybai vystosi, ir kai kurie iš jų, gamina mikotoksinus, kurie gali sukelti žmonių ir gyvulių ligas – mikotoksikozes.
11 Siekiant išvengti mikromicetų, reikėtų pirmiausiai pradėti nuo pačios sėklos, šiuo metu selekcininkai išvedinėja naujas javų veisles, kurios būtų atsparios ligoms. Taip pat taikyti atitinkamai parinktus fungicidus, tačiau ir jie ne visada užtikrina efektyvumą. Labai svarbu yra ir pati dirva, jei javai bus sėjami į ražieną, tai taip pat yra didelė galimybė, kad grūdai gali užsikrėsti mikroskopiniais grybais. Vienas iš svarbių veiksnių yra parazitai, kurie gali pažeisti varpą, o pažeistą vietą daug lengviau apkrėsti mikromicetais. Turi būti tinkamos grūdų nuėmimo sąlygos. Sandėlių būklė taip pat yra labai svarbi ir reikšminga.
Darbo tikslas: nustatyti Fusarium spp. kitimą grūduose ir fuzariotoksinų dinamiką sandėliavimo metu bei įvertinti profilaktinių priemonių efektyvumą prieš Fusarium spp. plitimą grūduose.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti sandėliavimo metu grūdų (kviečių ir miežių) užsikrėtimą mikromicetais;
2. Įvertinti fuzariotoksinų (deoksinivalenolio, zearalenono, T–2 toksino) paplitimą grūduose sandėliavimo metu;
3. Įvertinti profilaktinių priemonių efektyvumą X ir XX ūkiuose prieš Fusarium spp. plitimą grūduose.
Darbo praktinė reikšmė: atlikti tyrimai turėtų būti naudojami kaip priemonė, skirta įvertinti ir suvaldyti Fusarium spp. plitimą sandėliuojamuose grūduose, įvertinant profilaktinių priemonių efektyvumą.
Darbo struktūra: santrauka (lietuvių, anglų kalbomis), įvadas, literatūros apžvalga, tyrimo metodika ir organizavimas, tyrimo rezultatai, rezultatų aptarimas, išvados, literatūra, priedai. Darbo apimtis 62 psl. Darbe pateikiama 23 paveikslai, 1 schema, 4 lentelės.
12
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Grūdų užsikrėtimo mikromicetais šaltiniai ir keliai
Mikromicetai plinta sporų pagalba. Derliaus užkrėstumą pelėsiniais grybais nulemia dvi pagrindinės priežastys: tai dirvožemis (kai mikromicetai ant grūdo patenka iš dirvožemio) ir sėkla (kai apkrėsti grūdai transportuojami į laukus iš sandėliavimo vietų) (United States Department of Agriculture, 2006; Lugauskas, 2006).
Su sėkla gali plisti didelė dalis varpinių augalų ligų sukėlėjų. Tai gali būti Fusarium, Sporotrix, Alternaria genčių ir kiti mikromicetai. Dėl jų įtakos gali sumažėti sėklos daigumas, jauni daigai sunyksta (Dabkevičius ir kt., 2005).
Mikromicetų sporos gali būti pernešamos vėjo ar su lietaus lašais, iš vienų laukų į kitus, taip pat gali būti pernešamos paukščių nuo vieno augalo ant kito. Grūdų technologinio apdorojimo proceso metu, keičiant įrangą, grūdai taip pat gali būti užkrečiami mikromicetais. Sporos yra atsparios daugeliui aplinkos veiksnių ir gali išsilaikyti ilgą laiką (United States Department of Agriculture, 2006).
Ypač palankios sąlygos mikromicetams plisti atsiranda tada, kai oro santykinė drėgmė yra 70 proc. ir aplinkos temperatūra viršija 30°C (trunka nuo kelių dienų iki savaitės).
Didelę įtaką turi sėklos parinkimas, augalų stresas, vabzdžiai ir drėgmės kiekis pačiuose augaluose (United States Department of Agriculture, 2006).
Augalo stresas – tai tokia būsena, kurią gali sukelti aplinkos veiksniai, tokie kaip sausros, potvyniai ir pan. Vabzdžių pažeisti augalai tampa mažiau atsparūs infekcijoms. Per pažeistas vietas, sporos lengvai patenka į augalą ir jame pradeda vystytis. Didelis drėgmės kiekis augaluose gali įtakoti mikromicetų vystymąsi (pvz.: kukurūzuose 20 proc. ir didesnis drėgmės kiekis sudaro palankias sąlygas) (United States Department of Agriculture, 2006). Javai, turintys didelį drėgmės perteklių, tiek prieš vaškinę brandą, tiek ir vaškinės brandos metu yra neatsparūs mikromicetų invazijai (Roháčik, Hudec, 2007).
Dulkės gali būti taip pat mikromicetų sporų pernešėjas. Dulkės mikromicetų pradams (sporoms) padeda greitai išplisti po laukus, pateikia pirminius mitybos elementus, sudaro geras galimybes įsitvirtinti ekstremaliomis gamtinėmis sąlygomis bei funkcionuoti. Tokiu būdu grūdai užteršiami mikromicetų išskiriamais metabolitais (Lugauskas ir kt., 2009; Mayer 2008).
13 Javai gali būti užkrečiami mikromicetais tada, kai jie yra pažeidžiami mechaniškai: kuliant, tręšiant ar apdorojant mechaniškai (poliruojant). Esant lietingam periodui, užsitęsęs derliaus nuėmimas (Schollenberger et al., 2002).
1.2. Veiksniai lemiantys mikromicetų vystymąsi ant grūdų sandėliavimo metu
Po derliaus nuėmimo grūdai yra sandėliuojami, kur juos veikia aplinkos sąlygos. Po derliaus nuėmimo mikroorganizmai toliau dauginasi grūduose, esant palankioms aplinkos sąlygoms (Magan, Aldred, 2007; Mostafa et al., 2011).
Blogas grūdų derliaus valymas yra vienas iš pagrindinių veiksnių, lemiančių mikromicetų dauginimąsi grūduose (Golob, 2009). Blogai išvalyti grūdai ima kaisti, jei jie nedžiovinami. Juose taip pat yra užsilikusių vabzdžių, kurie toliau gali pažeisti grūdą, sudarydami sąlygas plisti ligoms (Mostafa et al., 2011). Gerai neišvalytuose grūduose aptinkama įvairių piktžolių, ant kurių gali būti mikromicetų, o šiems atsiranda palankios sąlygos daugintis ant grūdų. Tokiu atveju, pažeisti grūdai praranda savo išvaizdą (pakinta jų spalva), atsiranda sausųjų medžiagų nuostoliai, prarandamos maistinės medžiagos, sumažėja daigumas, jie tampa prastos kokybės (Magan, Aldred, 2007).
Bloga ventiliacija yra taip pat vienas iš svarbių veiksnių, užtikrinančių grūdų sandėliavimo sąlygas, jei ji bus nepakankama, grūdai neišsivėdins. Taip pat, CO2 gamybos lygis gali būti naudojamas kaip "rizikos faktorius" (Magan, Aldred, 2007; Golob, 2009).
Jei vandens aktyvumas (aw) yra didelis sandėliuojamuose grūduose 15 – 19 proc. drėgnumo = 0,75 – 0,85 vandens aktyvumo, tai sandėliuojamuose grūduose mikromicetų, ypač Eurotium spp., Aspergillus ir Penicillium rūšys intensyviai vystosi.
Dauguma mikotoksinų yra atsparūs temperatūrai, saugojimui ir perdirbimo sąlygoms, todėl detoksikacija ne visada veiksminga. Patikimiausias būdas išvengti maisto produktų užteršimo mikotoksinais, pašalinti jų kilimo priežastis (Zvicevičius ir kt., 2006).
Nors daugelis žemės ūkio augalų yra gana atsparūs mikromicetų invazijai, tačiau esant drėgniems orams, mikromicetai nugali įgimtą augalų atsparumą ir pamažu grūdus teršia. Nuimant derlių subrendę mikromicetų pradai su grūdais, dulkėmis, vėjo padedami, pasklinda po aplinką ir patenka į saugyklas, kuriose jų egzistavimo sąlygos keičiasi (Lugauskas, 2006). Dėl nesureguluoto tręšimo ir kitų priežaščių javai išgula, augalų visas stiebas ir varpa prigula prie dirvožemio paviršiaus ir taip užsikrečia Chaetomium Trichoderma, Verticillium, Phoma, Gliocladium, Volutella, Myrothecium genčių rūšimis (Lugauskas, 2006). 1 pav. pateikiami veiksniai, skatinantys mikromicetų plitimą sandėliavimo metu.
14
1 pav. Mikromicetų paplitimas sandėliavimo metu (Magan, Aldred, 2007) Agronominė praktika Klimato sąlygos Numanomas veiksnys Mikromicetų rūšys ir sporos. Sąveika su vabzdžiais ir erkėmis. Mikrobiologinė ekosistema. Augalų ligos. Vandens aktyvumas. Augalų veislės skirtumai. Substrato pobūdis. Maisto medžiagos. Iki derliaus nuėmimo Sąveika su vabzdžiais ir erkėmis. Klimato sąlygos Perdirbimo veiksniai Džiovinimo normos. Mechaniniai pažeidimai. Maišomi grūdai. Temperatūra. Vidiniai veiksniai Drėgmės kiekis Derliaus nuėmimo/ džiovinimo metu Numanomas veiksnys Mikromicetų rūšys ir sporos. Sąveika su vabzdžiais ir erkėmis. Mikrobiologinė ekosistema. Augalų ligos. Perdirbimo veiksniai, Greitas džiovinimas. Mechaniniai pažeidimai. Atmosfera. Maišomi grūdai. Cheminiai konservantai. Higienos sąlygos. Vandens aktyvumas. Substrato pobūdis. Mineralinė mityba. Maistinė sudėtis. Temperatūra. Klimato sąlygos. Deguonies lygis.
15 Schemoje, pateiktoje 2 paveiksle, nurodomos grūdų gedimo priežastys:
2 pav. Grūdų gedimo priežastys sandėliuose (Bakutis, 2004)
1.2.1. Saugyklų paruošimas grūdų sandėliavimui
Svarbu yra grūdų saugyklos vietos parinkimas. Sandėlys turėtų būti pastatytas ant lygaus paviršiaus, aukštesnėje vietovėje, kad neužlietų, esant potvynių metui. Saugykla turėtų būti netoli nuo pagrindinio kelio. Tačiau turi būti pastatyta toliau nuo gyvenviečių. Šalia sandėlio turi būti išasfaltuota aikštelė, kad būtų lengva privažiuoti transporto priemonėms įvežant ar išvežant grūdus iš teritorijos (FAO corporate document repository, 2012).
Grūdų saugyklų ir visų jiems priklausančių statinių bei įrengimų teritorija privalo būti aptverta. Grūdų saugykloje turi būti sąlygos atlikti svėrimo, džiovinimo, valymo, atvėsinimo, ėminių ėmimo, kokybės kontrolės, grūdų partijų formavimo, laikymo bei transportavimo darbus. Turi būti užtikrintas lietaus, gruntinio ir sniego vandens nutekėjimas iš saugyklos teritorijos į vandens nutekamuosius įrenginius (Licencijuoto sandėlio grūdų saugyklų techninis Reglamentas Nr. 382/2002). Grūdų saugyklos turi būti įrengtos taip, kad būtų lengva prižiūrėti, valyti, dezinfekuoti (FAO corporate document repository, 2012).
Grūdų sandėliai turi būti tvarkingi, švarūs, sandari stogo danga. Labai svarbu paruošti visas sandėliavimo patalpas iki naujo sezono grūdų sandėliavimo pradžios. Kol tušti sandėliai, būtina Pradinis aruodų užterštumas
Temperatūra Santykinis drėgnis Saugojimo laikas Grūdų vėdinimas Džiovinimas, cheminis apdorojimas Vandens aktyvumas Grūdų subrendimo lygis ir jų būklė nuėmimo metu Priemaišų kiekis
Patirti mikoziniai susirgimai augalui augant Pradinis grūdų užterštumas Grūdai kaip mitybinė terpė bakterijoms ir mikroskopiniams grybams
16 pasirūpinti jų dezinfekcija (Groot, 2004). Reikia pasirūpinti, kad neatsirastų graužikų ir nebūtų parazitų, kartais yra panaudojamos cheminės medžiagos (Mason, Obermeyer, 2010). Susikaupusias šiukšles sandėlyje svarbu po darbo ar darbo metu pašalinti iš patalpos ir sudeginti ar kitaip sunaikinti, kad nesikauptų parazitai ar kiti kenkėjai (Groot, 2004; Mason, Obermeyer, 2010; Golob, 2009). Saugyklų sąšlavose galima aptikti erkių, milčių, grūdinių kandžių, straubliukų. Šių kenkėjų galima aptikti ne tik sąšlavose, bet ištisus metus tiek tuščiuose, tiek pilnuose sandėliuose (Abd El– Aziz, 2011).
Kovojant su parazitais svarbu, kad sandėlys būtų tuščias, jei reikia, turi būti atjungta elektra. Tada atitinkamai pasirenkamos cheminės medžiagos, kurios dažniausiai yra tolygiai išpurškiamos. Jei yra sunkiai prieinamos vietos, patartina įrengti dūmų generatorius arba dulkių surinktuvus (Groot, 2004; Golob, 2009). Siekiant visiškai užkirsti kelią parazitams, patartina praėjus penkioms dienoms po dezinsekcijos įvertinti saugyklos aplinką. Jei po dezinsekcijos aptinkama kenkėjų, rekomenduojama dar kartą atlikti dezinsekciją (Groot, 2004). Kuo labiau bus pažeisti grūdai, tuo greičiau jie ims gesti. Mažiausiai aruodiniai kenkėjai pažeidžia tuos grūdus, kurie yra sausi ir šalti, aruodinių kenkėjų dauginimasis ir plitimas grūduose priklauso nuo temperatūros ir drėgmės (Mason, Obermeyer, 2010).
Grūdų džiovinimas yra kitas labai svarbus žingsnis siekiant išsaugoti grūdų kokybę. Literatūroje yra aprašomi du pagrindiniai džiovinimo būdai, tai džiovinimas išbėrus grūdus ir apdorojimas karštu oru. Labai svarbu, kad ką tik atvežti grūdai iš laukų būtų džiovinami, ypač, kai drėgmės kiekis didesnis nei 20 proc. per pirmas 24 valandas mikroorganizmai ima aktyviai plisti (ypač, kai drėgmė daugiau nei 25 proc.) ir gali labai stipriai pažeisti grūdus (Groot, 2004). Jei grūdų drėgmė yra apie 22 proc., tai juos patartina džiovinti aktyviąja ventiliacija, o jei dar didesnis drėgmės kiekis – džiovinti kelis kartus arba konservuoti. Kuo bus lėtesnis ir ilgesnis džiovinimas, tuo greičiau pradės daugintis mikromicetai, kurie gamins mikotoksinus (Krasauskas ir kt., 2005; Zvicevičius ir kt., 2006).
17 Džiovinimo principinė schema (3 pav.): 1 – ventiliatorius, 2 – kamera statiniam slėgiui, 3 – lanksti jungtis, 4 – vožtuvas, 5 – ventiliuojami talpos balionai, pripildyti su grūdais, 6 – temperatūros ir drėgmės jutikliai, 7 – vidurinis ALMEMO metras, 8 – kompiuteris, 9 – natūralios ventiliacijos cilindras, kuris pripildytas grūdais (Zvicevičius ir kt., 2006).
Grindys, sienos – sausos, be plyšių ar įtrūkimų, izoliuotos nuo gruntinių ir polaidžio vandenų patekimo. Grindų paviršius turi būti lengvai valomas (Groot, 2004). Mūrinės sienos – ištinkuotos arba atskirtos medinėmis pertvaromis. Geriau, kad vidinės sienos būtų išdažytos balta spalva, tada lengviau pastebimi vabzdžiai ar kiti parazitai. Taip pat jos gali būti iš cinkuotos skardos, arba aliuminio plėvelės, tačiau tokios sienos lengviau pažeidžiamos, jos turi mažai izoliacinių savybių ir kartais linkę į erozijas (FAO corporate document repository, 2012).
Elevatoriai turi būti švarūs, neturi būti neužtaisytų konstrukcijų elementų, vertikalių ir horizontalių sudūrimų (Licencijuoto sandėlio grūdų saugyklų techninis Reglamentas Nr. 382/2002).
Vidaus ramsčių, palaikančių stogo rėmus reikėtų vengti, nes, jie gali trukdyti kenkėjų kontrolės ir kitų atsargų valdymo procedūroms (FAO corporate document repository, 2012). Stogų karkasai, pagaminti iš medienos tinka tik sandėliuose, ne daugiau kaip 4 ar 5 metrų pločio. Naudojama mediena turi būti gerai išdžiovinta. Stogo danga gali būti iš cinkuoto plieno arba aliuminio lakštų, ar asbesto cemento, tačiau pastarasis yra labiau pažeidžiamas, bet turi geresnes izoliacines savybes. Plytelės yra nerekomenduojama, ypač didelių sandėlių (FAO corporate document repository, 2012).
Durys ir langai turi sandariai užsidaryti. Langai turi būti įstiklinti ir su vielos tinkleliais iš vidinės pusės (Licencijuoto sandėlio grūdų saugyklų techninis Reglamentas Nr. 382/2002).
Durų skaičius priklauso nuo sandėlio dydžio, tačiau negali būti mažiau nei dvejos. Rekomenduojama dvigubos stumdomos durys, pageidautina pagamintos iš plieno, ar bent sustiprinta jų apačia metalinėmis juostomis, taip apsaugant patalpas nuo graužikų. Jei įrengtos varstomos durys, jos turėtų atsidaryti į išorę, kad nebūtų sumažinta sandėlio talpa. Rekomenduojama, kad durys būtų apsaugotos nuo lietaus. Tinkama šviesa sandėlyje yra svarbus veiksnys (FAO corporate document repository, 2012).
Sandėliai turi būti švarūs, juose neturi būti užsilikę senų grūdų. Grūdų negali būti pribarstyta sandėliuose. Grūdus reikia nuolat stebėti: ar jie nekaista, ar gerai vėdinasi, nedrėksta, ar neužkrėsti aruodinių kenkėjų, ar neturi nemalonaus kvapo, stebima grūdų temperatūra. Jei tai licencijuotas sandėlys, tai turi būti pildomi žurnalai, stebimi grūdai ir daromi atitinkami įrašai. Jei sandėlys yra licencijuotas, tai jame turi būti įrengta laboratorija, o jei jos nėra, tai turi būti pasirašyta sutartis su kita laboratorija, kuri tirs grūdus.
18 Sandėlyje turi būti tvarkinga techninė įranga paruošta grūdams priimti, iškrauti, transportuoti, džiovinti, valyti. Vietose, kur iškraunami grūdai turi būti paruošti pakankamos keliamosios galios hidrauliniai autokėlikliai, kurių darbas turi būti nuolat tikrinamas (Licencijuoto sandėlio grūdų saugyklų techninis Reglamentas Nr. 382/2002). Grūdų saugyklų transportavimo įranga turi būti pajėgi, kad būtų galima greitai pervežti grūdus iš vienos vietos į kitą, kad kuo mažiau būtų jie pažeidžiami. Aspiracijos įrenginiai turi būti sumontuoti taip, kad dulkės būtų nuolat šalinamos iš patalpos. Svarbu darbuotojus apmokyti kaip tinkamai naudotis įranga ir ją prižiūrėti (Golob 2009).
Jei sandėliuojami grūdai yra laikomi maišuose, tai maišai negali stovėti ant grindų, turi būti sukrauti ant medinių padėklų, taip kaip parodyta 4 pav. (Groot, 2004).
4 pav. Mediniai padėklai, skirti maišams su grūdais laikyti (Groot, 2004)
1.2.2. Aplinkos veiksnių įtaka sandėliuojamų grūdų kokybei
1.2.2.1. Fiziniai veiksniai
Sandėliuojamų grūdų kokybei didelę įtaką daro šie fiziniai veiksniai: mechaniniai pažeidimai, dulkėtumas, temperatūra, santykinė oro drėgmė, džiovinimas, ventiliacija.
Mechaniniai pažeidimai grūduose gali atsirasti juos dar laukuose kuliant. Pačiame sandėlyje grūdai gali būti pažeidžiami juos iškraunant, transportuojant į aruodus, ar valymo mašinose. Tokie grūdai praras atsparumą ir didelė tikimybė, kad į juos pateks mikroorganizmai. Siekiant to išvengti, reikia nuolat tikrinti sandėlyje naudojamą įrangą. Dulkės – yra kitas fizinis veiksnys darantis neigiamą įtaką grūdams. Jei sandėlyje nėra sumontuota ar blogai sureguliuoti aspiraciniai įrengimai (http://krex.kstate.edu/dspace/bitstream/handle/2097/2373/JosephineBoac2010.pdf?sequence=3).
19 Prieiga per internetą 2013–02–14), tai bus gausu dulkių, kurios nusės ant grūdų kartu pernešdamos įvairius mikroorganizmus ir kitus nešvarumus iš vienos vietos į kitą. Dulkės nusės ant aruodų sienų, grindų, langų, pertvarų, sijų, įrengimų ir galiausiai pačių grūdų. Tokiu atveju, grūdų kokybė gerokai suprastės, o pats sandėlys neatitiks saugos ir kokybės reikalavimų (Golob 2009).
Temperatūra – yra vienas iš svarbiausių fizinių veiksnių, darančių didžiausią nuostolį grūdams sandėliavimo metu. Kuo žemesnė temperatūra, tuo geriau išsilaiko grūdai (+10°
C). Jei aukšta aplinkos temperatūra, grūdai gali kaisti, ypač tai tikėtina rudenį, kada dar tik grūdai pargabenami iš laukų (Licencijuoto sandėlio grūdų saugyklų techninis Reglamentas Nr. 382/2002). Labai svarbu stebėti grūdų temperatūrą, jei ji aukštesnė nei +20°C, grūdų kokybės būklė tikrinama kas 10 dienų, kai grūdų temperatūra svyruoja nuo +10°C iki +20°C kas 15 dienų, jei temperatūra žemesnė nei +10°C – vieną kartą per mėnesį (Licencijuoto sandėlio grūdų saugyklų techninis Reglamentas Nr. 382/2002).
Santykinis drėgnis, tai rodiklis, kuriuo įvertinamas oro drėgmės kiekis. Sandėlio saugus drėgmės kiekis siejamas su santykiniu drėgnumu. Nustatyta, kad grūdai absorbuoja vandens garus iš oro ir šis procesas vyksta tol, kol pasiekiama pusiausvyra. Optimalus grūdų drėgnis yra 14 proc., kai temperatūra 15oC (Groot, 2004). Esant didelei santykinei oro drėgmei, grūdai sudrėksta ir jei didelė temperatūra, jie ima kaisti, tada susidaro labai gera terpė mikroorganizmams vystytis grūduose. Dažniausiai jie įgauna nemalonų kvapą, išvaizdą, pablogėja kokybė (White, 2005).
Aukšta temperatūra ir didelė drėgmė yra svarbiausi veiksniai, darantys įtaką saugojamų grūdų kokybei. Kiekvienas iš jų gali sukelti sparčiai mažėjančią daigumo, salyklinių kokybę, kepimo kokybę, spalvą, cheminę sudėtį (White, 2005; Golob 2009).
Džiovinimas taip pat gali pažeisti grūdus, jei jis bus atliekamas netinkamai, pavyzdžiui, džiovinant karštu oru, jei bus per aukšta temperatūra, tai gali sumažėti grūdų daigumas (Groot, 2004). Džiovinimas stabdo sėklos dygimą, bakterijų dauginimąsi, mikromicetų atsiradimą ir mažina vabzdžių atsiradimo sąlygas (Groot, 2004).
Jei ventiliacijos sistema nebus įrengta, arba bus blogai sumontuota, tokiu atveju grūdai nesivėdins, jie gali pradėti kaisti, gali įgauti nemalonų kvapą, suprastės jų kokybė (Golob 2009).
1.2.2.2. Cheminiai veiksniai
Oro tarša. Orui judant sandėliuose, mikromicetų gyvybingos sporos yra išnešiojamos po visas patalpas, taip jie plinta iš vienos vietos į kitą (Lugauskas ir kt., 2004).
Dujų koncentracija – amoniako, sieros vandenilio, anglies dvideginio, įvertinamas anglies dvideginio ir deguonies santykis. Didelės CO2 koncentracijos (>20 proc.) ir mažos O2
20 koncentracijos (<10 proc.) inhibuoja aflatoksinų, ochratoksinų, patulino, T–2 toksino sintezę (http://krex.kstate.edu/dspace/bitstream/handle/2097/2373/JosephineBoac2010.pdf?sequence=3. Prieiga per internetą 2013–02–14).
1.2.2.3. Biologiniai veiksniai
Aplinkos mikrobiologinis užterštumas, užterštumas kenkėjais. Mikroorganizmais grūdai gali būti užteršti paukščių, vabzdžių ar graužikų pagalba. Vabzdžiai gali išnešioti sporas nuo vieno augalo ant kito. Dažnai lipnios grybų sporos prilimpa prie vabzdžių, kai šie juda užkrėstu augalu (Bakutis, Taruta, 2006).
Taip pat grūdai gali būti užteršiami mikroorganizmais juos transportavimo metu iš laukų į sandėlį. Mikrobiniai teršalai dažniausiai būna susitelkę išoriniuose grūdo sluoksniuose (sėlenose, kviečių gemaluose) (Hocking, 2003).
1.3. Grūdus pažeidžiančių mikromicetų morfologiniai, fiziologiniai ir
adaptaciniai savitumai
Grūdai yra substratai, kurie labiausiai mikromicetų pažeidžiami (Tabuc et al., 2010). Pagrindinės mikromicetų gentys, kurios aptinkamos grūduose yra Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Alternaria, Cladosporium (Dabkevičius ir kt., 2005). Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria ir Claviceps rūšys – mikotoksinų gamintojai, kurie periodiškai kelia maisto saugai pavojų (Benbrook, 2005; Rasch et al., 2010).
Mikromicetai patenka ant grūdų dažniausiai dar laukuose jų augimo metu, taip pat nuimant derlių bei sandėliuojant, ar perdirbant grūdus. Mikromicetų paplitimui didelę įtaką daro klimato sąlygos (Mankevičienė, 2004). Optimalus terpių pH, kuriuose geriausiai auga mikroskopiniai grybai, turi būti nuo 4,5 iki 6,5 (Bakutis, Taruta, 2006). Mikotoksinus gaminantys mikroskopiniai grybai ardo grūdus, keičia jų struktūrą, o pasigaminę toksinai užkrečia maistą bei gyvulių pašarus (Bartkienė ir kt., 2010).
Aspergillus genties rūšys yra plačiai geografiškai pasiskirstę (Tabuc et al., 2010). Aspergillus rūšys dažniausiai sutinkamos tropikuose ir subtropikuose, tačiau su maisto produktais, pvz, riešutais, jie atkeliauja ir išplinta ir kitose geografinėse zonose (Mankevičienė, 2004). Prie vėsesnio klimato yra labiau prisitaikę ir dažniausiai Lietuvoje aptinkami Penicillium ir Fusarium genčių mikromicetai (Mankevičienė, 2004). Šie grybai ir daro didžiausius nuostolius Lietuvos ūkininkams.
21 Ypač didelę grėsmę kelia Fusarium genties grybai, kurie labai gerai prisitaikę prie drėgno ir vėsaus klimato.
Aspergillus sp. auga ant pūvančių organinių medžiagų, dirvožemio, komposto, maisto produktų, grūdų. Kai kurios rūšys gali būti tiesiogiai patogeniškos žmonėms ir gyvūnams, bei sukelti aspergiliozę (Tabucet et al., 2010; Golob, 2009).
Pagrindinės rūšys: Aspergillus flavus, A. fumigatus, A. niger, A. ochraceus ir A. oryzae. Šalia šių rūšių yra daug kitų rūšių, gaminančių mikotoksinus. A. flavus ir A. parasiticus yra pagrindiniai gamintojai aflatoksinų, aflatoksinas B1 (Sultana, Hanif, 2009).
A. flavus sukelia plaučių aspergiliozę. A. niger sukelia ausies uždegimus, sinusitą ir dažnai dalyvauja odos, plaučių uždegimuose. Aflatoksinai yra gaminami dažniausiai trijų Aspergillus rūšių: A. flavus, kuri gamina daugiausia aflatoksinus B1 ir B2; A. parasiticus, kuri gamina aflatoksinus B1, B2, G1, G2 ir A. nomius, daugiau retų rūšių, morfologiškai panašus į A. flavus, kuri gamina aflatoksinus B1, B2, G1 ir G2 (Tabuc et al., 2010; Stack, Carlson, 2003).
Optimalios aflatoksinų gamybos sąlygos yra šios: žemas substrato vandens aktyvumas (0,84– 0,86) ir aukšta temperatūra tarp 25°C ir 40°C (Tabuc et al., 2010). Aflatoksinų grupė turi 13 skirtingų molekulių, svarbiausi iš jų yra aflatoksinų B1, B2, G1, G2 ir aflatoksinas M1 (Tabuc et al., 2010). Aflatoksinas B1 (AFB1) su pašarais patenka į karvių organizmą, metabolizuojamas kepenyse ir transformuojasi į 4–hidroksi darinį, kitaip dar žinomą kaip aflatoksinas M1, kuris išsiskiria su pienu (Baliukonienė ir kt., 2012). Dėl gyvūnų sveikatos aflatoksinų poveikis kinta priklausomai nuo rūšies, amžiaus, lyties ir gyvūno fiziologinės būklės, vartojimo būdo, mitybos. Pats toksiškiausias yra AF B1, po to AF M1, AF G2, AF B2 ir AF G1 (Tabuc et al., 2010).
Alternaria sp. – plačiai paplitusi mikromicetų gentis, dažniausiai ją galima aptikti tiek drėgnuose, tiek pusiau sausringuose regionuose (Maškova ir kt., 2012), dirvožemyje, augaluose, patalpų ore (Kütt et al., 2010). Vienos Alternaria rūšys gali užkrėsti augalą, jo augimo metu, o kitos tik pakenkti po derliaus nuėmimo, sandėliavimo laikotarpiu. Šio mikromiceto sporomis augalai užsikrečia per oro sroves, ar lietų. Sporos gali atlaikyti nepalankias aplinkos sąlygas kelias dienas, ir po to sudaryti infekciją esant palankioms sąlygoms. Alternaria rūšis gamina daugiau kaip 70 antrinių metabolitų, kurie yra toksiški augalams (Maškova ir kt., 2012). Dalis šių metabolitų yra toksiški ir yra apibūdinami kaip mikotoksinai pavojingi žmonių ir gyvūnų sveikatai (Maškova ir kt., 2012). Remiantis jų poveikiu augalams, Alternaria genties toksinai skirstomi į nespecifinius (non– hostspecific) ir specifinius (host–specific). Kaip kurie nespecifiniai (non–hostspecific) toksinai tokie kaip alternariolis, alternariolio monometileteris, tenuazoniko rūgštis ir altertoksinas buvo išbandyti ir yra aprašyti kaip sukeliantys žalingą poveikį gyvūnams, galintys sukelti fetotoksinį ir teratogeninį poveikį (Maškova ir kt., 2012). Ypatingai tenuazoniko rūgštis yra nuodinga pelėms,
22 vištoms, šunims (Ostry, 2008). Alternariolis, alternariolio monometildibromdifenilmetano eteris, altenuenas ir altertoksinas nėra labai ūmiai toksiški (Ostry, 2008). Specifiniai (host–specific) toksinai, tokie kaip AAL–toksinai, turi ribotą šeimininkų įvairovę ir vaidina svarbų vaidmenį sukeliant augalų patogeniškumą, tačiau ar jie yra toksiški gyvūnų organizmui, iki galo neištirta (Maškova ir kt., 2012). AAL–toksinai yra susiję su fumonizinais (Ostry, 2008).
Svarbiausi Alternaria genties mikotoksinai yra alternariolis (AOH), alternariolo monometildibromdifenilmetanao eteris (AME), altenuenas (ALT), altertoksinas I, II, III (ATX–I– II–III) ir tenuazoniko rūgštis (TEA), kuri priklauso trims struktūrinėms klasėms: dibenzopirono dariniai (AOH, AME, ALT), perileno dariniai (ATX–I,–II,–III), tetramiko rūgšties dariniai (TEA) (Ostry, 2008).
Mikotoksinai, tokie kaip alternariolis, alternariolio monometileteris pasižymi mutageniškomis ir genotoksiškomis savybėmis įvairiose in vitro sistemose (Maškova ir kt., 2012). Alternariolis gali prisidėti prie žmogaus gaubtinės žarnos vėžio ląstelių atsiradimo, DNR vientisumo sutrikimų (Ostry, 2008). Taip pat buvo nustatyta, kad Alternaria genties mikotoksinų buvimas grūduose, gali būti stemplės vėžio atsiradimo priežastimi (Maškova ir kt., 2012).
1 lentelė. Alternaria rūšys gaminančios mikotoksinus (Ostry, 2008)
Rūšys Mikotoksinai Šaltinis
A. brassicae (Berk.) Sacc. AOH, AME Bottalico and Logrieco, 1998 A. capsici–anui Săvul. & Sandu AME, TeA, AOH Bottalico and Logrieco, 1998 A. cassiae Jurair & A. Khan ATX–I, –II Hradil et al., 1989
A. citri Ell. & Pierce AOH, AME, TeA Freeman, 1965; Kinoshita et al.,1972
A. cucumerina (Ell. & Ev.) Elliott AOH, AME Raistrick et al., 1953; Freeman, 1965
A. dauci (Kühn) Groves & Skolko AOH, AME Freeman, 1965; Raistrick et al., 1953
A. japonica Yoshii TeA Kinoshita et al., 1972
A. kikuchiana Tanaka AOH, AME, TeA Tirokata et al., 1969; Kinoshita et al., 1972; Kameda et al., 1973
A. longipes (Ell. & Ev.) AME, TeA Mikami et al., 1971; Bottalico and Logrieco, 1998 A. mali Roberts ATX–I, –II, –III, TeA Kinoshita et al., 1972
A. oryzae Hara TeA Kinoshita et al., 1972
A. porri (Ell.) Cif. AME, TeA Bottalico and Logrieco, 1998 A. radicina Meier, Drechsler &
Eddy
ATX–I, –II, –III, TeA Bottalico and Logrieco, 1998; Solfrizzo et al., 2005
A. solani Sorauer AOH, AME, TeA Stoessl, 1969; Pollock et al., 1982; Bottalico and Logrieco, 1998 A. tenuissima (Kunze) Wiltshire AOH, AME, ATX-I, -III, TeA Davies et al., 1977; Young et
al., 1980; Bottalico and Logrieco, 1998
23 Fusarium spp. yra laikoma viena iš labiausiai paplitusių ir svarbiausių grupių grybų, nes yra įvairi, kosmopolitiška ir gebanti sukelti sunkias ligas augalams, gyvūnams, žmonėms, sukelti mikotoksikozes (Izham, Nor, 2008).
Fusarium spp. mikromicetai gali atsirasti visuose augalo vystymosi etapuose, nuo sėklos iki subrendimo (Moretti, 2009). Fusarium gentis be ne labiausiai paplitusi, toksinus produkuojantys grybai, šiauriniuose vidutinio klimato regionuose. Dažniausiai aptinkami ant grūdų, auginamų švelnaus klimato regionuose Amerikoje, Europoje ir Azijoje (Yazar, Omurtag, 2008).
Fusarium spp. sukelia javų ligą – fuzariozę. Ypač palankios sąlygos javams užsikrėsti šia liga, kaip vyrauja drėgni ir šilti orai. Kai temperatūra svyruoja nuo 16 iki 30°C šilumos, o sporoms sudygti pakanka 12 valandų drėgno periodo. Derliui prognozuoti fuzariozę galima tuo atveju, jei varpų žydėjimo metu drėgmė pasėliuose laikosi 2 – 4 paras, oro temperatūra svyruoja nuo 22°C iki 27°C šilumos (Semaškienė, 2006). Fusarium spp. dar laukuose galima matyti, kad varpos yra pažeistos šios genties mikromicetais, nes varpų galvutės nusidažo šviesiai rožine spalva (Chehri et al., 2011). Taip pat gali gaminti mikotoksinus, kurie daro neigiamą poveikį gyvūnų ir žmonių sveikatai (Chehri et al., 2011).
Fusarium genties rūšių yra priskaičiuojama daugiau kaip 80 (Moretti, 2009). Pagrindinės Fusarium genties rūšys gaminančios toksinus yra: F. graminearum, F. verticillioides, F. pseudograminearum, F. proliferatum, F. compactum, jos yra laikomos svarbiausiomis (Summerell et al., 2011). F. graminearium gali produkuoti zearalenoną, nivalenolį ir deoksinavalenolį (Summerell et al., 2011). F. proliferatum produkuoja kaip kuriuos fumonizinus. F. pseudograminearum gali produkuoti deoksinavalenolį ir zearalenoną. F. verticillioides produkuoja fumoniziną (Summerell et al., 2011; Pereira et al., 2011). Ši gentis pasižymi tuo, kad dirvos paviršiuje ar dirvožemyje gali išlikti atspari mechaniniams pažeidimams, taip pat gali išlikti gyvybinga iki 900 dienų vėsioje ir sausoje vietoje (Summerell et al., 2011). F. compactum produkuoja A tipo trichotecenus.
Jungtinėse Valstijose buvo atvejis, kai išgaišo daug laukinių paukščių, buvo ištirta, kad jie nugaišo sulesę trichotecenais užkrėstų žemės riešutų lukštų (Summerell et al., 2011). Kalakutai yra jautresni Fusarium mikotoksinams. Tyrimais įrodyta, kad antys yra labiausiai atspari paukščių rūšis (Girgis, Smith, 2010). Fusarium mikotoksinams jautriausios yra kiaulės (Girgis, Smith, 2010).
Ši gentis priklauso aukšliagrybiams, askomicetų klasei (Moretti, 2009). Fusarium rūšys gamina trijų tipų sporas: makrokondijas, mikrokondijas ir chlamydosporas, kurios gaminasi užkrėstuose augaluose, kurie užsikrečia per dirvožemį. Kai užkrėsti augalai miršta, mikromicetas ir
jo sporos patenka vėl į dirvožemį, kur jie gali išlikti gyvybingi neribotą laiką (Ramya, 2011). Fusarium rūšys yra fuzariozės ligos sukėlėjai, pasireiškus šiai ligai, sumažėja javų derlingumas ir
24 kokybė (Yli–Mattila, 2010). Svarbiausi Fusarium mikotoksinai yra trichotecenai ir zearalenonas (Yli–Mattila, 2010). Pagal chemines savybes trichotecenai gali būti skirstomi į tipus, įskaitant T–2 toksiną, HT–2 toksiną, diacetoksirpenolį (DAS), monoacetoksiscirpenolį (MAS), B tipo, įskaitant deoksinivalenolio (DON, taip pat vadinamas vomitoksinu) ir nivalenolį (NIV) bei jų mono– ir di–acetilinto darinius (Yli–Mattila, 2010).
Penicillium genties mikromicetai yra prisitaikę prie vėsesnio klimato. Šiais mikromicetais pažeistos sėklos prastai sudygsta (Mankevičienė, Auškalnienė, 2004). Penicillium spp. priklauso tai pačiai deuteromicetų klasei kaip ir Aspergillus spp. Šie mikromicteai gamina kelias sporas ar kondijas, ant ilgų kotelių vadinamas konidosporomis (Schwab, Straus, 2004). Dauguma Penicillium rūšių ant agaro terpės nusidažo mėlynai žalsvos spalvos (Schwab, Straus, 2004). Penicillium spp. yra labiau priskiriami sandėlių grybams, todėl dažnai aptinkami sandėliuojamuose grūduose. Šiems mikromicetams augti palanki temperatūra svyruoja nuo 25o
C iki 30oC (Bakutis, 2004).
1.4. Grūduose aptinkami mikotoksinai
Mikotoksinai yra mikromicetų antriniai metabolitai, kurie daro neigiamą poveikį, žmonėms, gyvūnams ir augalams, jie sukelia ligas ir didelius ekonominius nuostolius (Zain, 2010). Visame pasaulyje tai yra didelė problema, nes mikotoksinais yra užteršiami tiek pašarai, tiek maisto produktai (Zain, 2010, Mayer, 2008). Aflatoksinai, ochratoksinai, trichotecenai, zearalenono, fumonizinų toksinai ir skalsių alkoloidai daro didžiausią reikšmę žemės ūkio ekonomikai (Zain, 2010). Mikotoksinai dažniau pasireiškia vietovėse, kuriose yra karštas ir drėgnas klimatas, palankus pelėsių augimui, jie taip pat gali būti nustatyti vidutinio klimato zonoje (Bennett, Klich, 2003).
Mikotoksinų poveikis yra dažniausiai juos prarijus, bet taip pat gali atsirasti susilietus su oda ar įkvėpus (Mayer, 2008). Jie gali sukelti ūmų ir lėtinį poveikį žmonėms ir gyvūnams, priklausomai nuo gyvūno rūšies ir jautrumo (Mayer, 2008; Zain, 2010). Atrajotojai paprastai yra labiau atsparūs mikotoksinų poveikiui nei kiti gyvūnai, taip yra todėl, kad prieskrandžio mikroflora gali skaidyti mikotoksinus (Zain, 2010).
Siekiant sumažinti toksinų poveikį žmonių ir gyvūnų gyvybei, didėja sveikatos priežiūros ir veterinarinės priežiūros išlaidos (Zain, 2010). Visi mikotoksinai yra mažos molekulinės masės natūralūs produktai (Bennett, Klich, 2003). Terminas mikotoksinas buvo sukurtas 1962 metais po neįprastos veterinarinės krizės, kuri įvyko netoli Londono, kai nugaiško maždaug 100 000 kalakučiukų (Zain, 2010). Ši paslaptinga liga buvo susijusi su žemės riešutais, kurie buvo užteršti antrinių metabolitų iš Aspergilus flavus (Zain, 2010). Mikotoksinai gali būti klasifikuojami kaip hepatotoksiniu, neurotoksiniu, nefrotoksiniu, imunotoksiniu poveikiu pasižymintys toksinai
25 (Bennett, Klich, 2003; Zain, 2010). Ląstelių biologai juos linke klasifikuoti į teratogeninius, mutageninius, kancerogeninius ir alergenus (Zain, 2010). Chemikai bandė juos klasifikuoti pagal jų cheminę struktūrą (laktonai, kumarino dariniai); biochemikai, pagal mikotoksinų biosintezės kilmę (poliketidai, amino rūgštys ir t.t.), gydytojai pagal ligas, kurias gali jie sukelti (rožė ir kt.), toksikologai, pagal mikromicetus (Aspergillus toksinai, Penicillium toksinai), (Zain, 2010).
2 lentelė. Mikotoksinų produkavimo sąlygos (Bakutis, Taruta, 2006) Pagrindiniai
producentai Laukų grybai Sandėlių grybai
Pvz. Fusarium genties Pvz. Aspergillus, Penicillium genties
Mikotoksinai F. roseum, F. graminearum, F. poae, F. tricinetum, F. moniliforme ir kt. A. parasiticus, A. ochraceus, A. flavus, P. viridicatum Optimali toksino produkavimo temperatūra, 0 C 25 8-25 27 - 30 16 Optimali substrato drėgmė, % 15,5 20 18 17,6 Aktyvuojantys veiksniai: Angliavandeniai N-kiekis + + + + ++ ++ ++ ++
1.4.1. Fusarium spp. produkuojami mikotoksinai
Vidurio Europoje labiausiai paplitusi lauko grybų gentis – Fusarium spp. (Rohweder et al., 2011).
Fusarium genties mikromicetai yra svarbūs ligų sukėlėjai, lemiantys didelius derliaus nuostolius (Eckard et al., 2011).
Remiantis 2005 m. birželio 6 d. Komisijos Reglamento (EB) Nr. 856/2005, iš dalies keičiančio Reglamentą (EB) Nr. 466/2001 dėl Fusarium toksinų toleruojamos paros dozės (TPD) yra:
26 zearalenono laikiną TPD (l–TPD) – 0,2 μg/kg kūno masės/parai;
nivalenolio
laikiną TPD (l–TPD) – 0,7 μg/kg kūno masės/parai; deoksinivalenolio TPD – 1 μg/kg kūno masės/parai;
toksinų T–2 ir HT–2 laikiną TPD – 0,06 μg/kg kūno masės/parai.
Iš visų smulkiųjų grūdų (rugių, kviečių, miežių, avižų) avižos yra atspariausios fuzariozei (Marshall et al., 2013).
1.4.1.1. Deoksinivalenolis (DON)
5 pav. DON cheminė struktūra (Zain, 2010)
Deoksinivalenolis (DON) – mikotoksinas išskiriamas iš Fusarium genties pelėsinių grybų. Jis priklauso trichotecenų B grupei kartais dar yra vadinamas vomitoksinu, nes dažnai sukelia gyvuliams vėmimą (Kushiro, 2008).
DON yra B tipo trichotecenas, kuris gali slopinti baltymų sintezę (Marshall et al., 2013). Šis toksinas įprastai randamas ant grūdinių kultūrų: kviečių, miežių avižų, rugių, ryžių, kukurūzų ir daugiausiai gaminamas dviejų svarbiausių javų ligų sukėlėjų, tai F. graminearum Schwabe ir F. culmorum Sacc (Yazar, Omurtag, 2008). Deoksivalenolis yra vienas iš labiausiai paplitusių grūduose mikotoksinų. Jo didelės dozės gyvūnų organizme sukelia pykinimą, vėmimą, viduriavimą, padidėjusį seilėtekį (Bennett, Klich, 2003).
Patenkant šio toksino mažesnėm dozėm į gyvūno organizmą, gyvūnui suprastėja apetitas, gali pakisti kūno masės svoris, pasireikšti vėmimas esant didesnei koncentracijai (Bennett, Klich, 2003; Marshall et al., 2013). Kiaulės yra jautresnės DON toksinui, nei pelės, paukščiai ir atrajotojai (Yazar, Omurtag, 2008). Šis toksinas yra mažiau toksiškas, lyginant su T–2 toksinu (Yazar, Omurtag, 2008). Žmonėms jis gali sukelti pykinimą, vėmimą, galvos skausmą. HT2 ir T2 buvo susijęs su protrūkiu Rusijoje 1930 – aisiais, kai žmons mirė po grūdų vartojimo, kurie buvo žiemą sandėliuojami (Marshall et al., 2013). Tyrimai atlikti su gyvūnais parodė, kad panašų poveikį DON gali sukelti ir žmonėms. In vivo DON slopina imuninį atsaką į ligų sukėlėjus ir kartu skatina
27 autoimunius reiškinius, kurie yra panašūs į žmogaus imunoglobulino A (IgA) nefropatiją (Yazar, Omurtag, 2008).
DON kiekiui fuzariozės pažeistų grūdų masėje nustatyti pritaikytas akustinis metodas, naudojant akustinį spektrometrą, veikiantį žemų (4,95 – 35,71) dažnių kHz diapazone (Bartkienė ir kt., 2010).
1.4.1.2. Zearalenonas (ZON)
6 pav. Zearalenono cheminė struktūra (Zain, 2010)
Zearalenonas (ZON) yra mikotksinas (ankščiau buvo žinomas kaip F–2), kurį produkuoja Fusarium spp. gentis. Šis toksinas yra ne steroidinis, estrogeninis mikotoksinas (Yazar, Omurtag, 2008).
ZON gamybą skatina didelis drėgmės kiekis ir žemos temperatūros sąlygos (Yazar, Omurtag, 2008). In vivo tyrimai parodė, kad šis toksinas greitai metabolizuojamas gyvūnų ir žmonių (Yazar, Omurtag, 2008). Zearalenonas yra pagrindinis mikotoksinas, gaminamas Fusarium graminearum. Jei dideli kiekiai šio mikotoksino su pašarais pateks gyvuliams, tai gali sukelti nevaisingumą (Murphy et al., 2006). Vien iš Fusarium genties mikromiceto išvaizdos negalima nuspėti ar jis gali gaminti toksiną ar ne (Murphy et al., 2006). ZON yra kiaulių reprodukcijos sutrikimo priežastis (Yazar, Omurtag, 2008). Kiaulės labiau jautrios ZON nei kiti gyvūnai (Arslanbas, Baydan, 2010). ZON pasižymi hepatotoksiniu, imunotoksiniu, genotoksiniu poveikiu (Arslanbas, Baydan, 2010). Gali sukelti patelėms abortus, lytinių organų sutrikimus (Bennett, Klich, 2003). Zearalenonas yra termiškai stabilus ir nėra sunaikinamas 120°C temperatūroje (Lawley et al., 2008). Manoma, kad ZON gali išlikti keptoje duonoje ar sausainiuose, taip pat gali išlikti ir fermentinių procesų gaminiuose, pvz.: aluje (Lawley et al., 2008). Šį toksiną galima nustatyti taikant didelio slėgio skysčių chromatografijos metodą (HPLC) su UV detektoriumi (Lawley et al., 2008). Taip pat yra taikomi ELISA metodai, bet šie yra mažiau jautrūs (Lawley et al., 2008). ES nustato didžiausią leistiną ZON kiekį 100 µg/kg labiausiai neperdirbtų grūdų, miltai ir sėlenos skirti tiesiogiai vartoti žmonėms leidžiamas ZON kiekis 75 µg/kg (Lawley et al., 2008). 20 µg/kg – riba nustatyta maisto produktų, skirtų kūdikiams ir mažiems vaikams (Lawley et al., 2008).
28 1.4.1.3. T–2 toksinas
7 pav. T–2 toksino cheminė struktūra (Zain, 2010)
T–2 toksinas yra A tipo trichotecenas. Šį toksiną produkuoja Fusarium sporotrichioides (Yazar, Omurtag, 2008). F. sporotrichioides atsiranda grūduose ir išlieka juose, kai ilgą laiką grūdai laikomi lauke arba po derliaus nuėmimo ar, kai grūdai yra laikomi drėgni sandėliavimo metu. F. sporotrichioides vystosi ir dauginasi nuo –2°C iki 35°C ir kaip aukštas vandens aktyvumas. Optimalios T–2 atsiradimo sąlygos, kaip temperatūra yra 8–14°C. T–2 labiausiai stabilus yra tada, kai temperatūra yra 4°C, o mažiau stabilus, kai temperatūra yra 37°C (Yazar, Omurtag, 2008).
Šis mikotoksinas paprastai yra randamas įvairiose grūdų kultūrose: kviečiuose, kukurūzuose, miežiuose, avižose, rugiuose ir perdirbtuose grūduose (salyklas, alus, duona) (Yazar, Omurtag, 2008). T–2 toksino daugiausiai pasigamina javams augant ir bręstant. Toksinas pasižymi imuniteto slopinimu, sumažėja atsparumas infekcinėms ligoms (Bennett, Klich, 2003). Taip pat šis toksinas pasižymi neurotoksiniu, genotoksiniu, karcinogeniniu poveikiu (EFSA Journal, 2011). Sukelia įvairius virškinamojo trakto, odos ir neurologinius simptomus (Bennett, Klich, 2003). T–2 slopina DNR, RNR ir baltymų sintezę, mitochondrijų funkciją, gali sukelti eukariotinių ląstelių mirtį, baltųjų kraujo kūnelių sumažėjimą (Yazar, Omurtag, 2008). Fusarium langsethiae produkuoja T–2 ir HT–2 toksinus, taip pat manoma, kad gali ir kitos Fusarium genties rūšys gaminti šiuos toksinus, tai F. poae ir F. sporotrichioides (EFSA Journal, 2011). Jei į organizmą patenka šio toksino didelės dozės, tai organizmui gali pasireikšti nekrozės burnos ertmėje, kraujavimas iš nosies ertmės, burnos ir makšties, bei atsirasti centrinės nervų sistemos sutrikimai (Bennett, Klich, 2003). Pirmoji žmonių toksikozė pasireikšė Kinijoje dėl supelijusių ryžių, kurie buvo užkrėsti T–2 toksinu (Yazar, Omurtag, 2008). Mirtina dozė žiurkių patelėms yra didesnė kaip 10000 mg/kg, jūrų kiaulytėms yra 5,000 mg/kg (Bennett, Klich, 2003). T–2 toksino koncentracijos yra toksiškos visoms gyvūnų rūšims, taip pat žmonėms (EFSA Journal, 2011). Šie toksinai slopina baltymų sintezę, įtakos turi imunoglobulinų sintezei, sudaro sisteminį toksinį poveikį maiste (EFSA Journal 2011).
29
1.5. Profilaktinės priemonės prieš Fusarium spp. paplitimą grūduose
Grūdų produktai yra svarbi mūsų maisto grandinės ir ekonomikos dalis. Todėl maisto produktai turi būti kontroliuojami, analizuojami perdirbant maistą. Svarbu toliau stebėti mikotoksinų susidarymą grūduose ir grūdų produktuose (Yazar, Omurtag, 2008).
Geros žemės ūkio praktikos priemonės skirtos sumažinti Fusarium infekciją javuose, taip pat yra veiksmingos siekiant apriboti zearalenoną. Kontrolės priemonės yra šios (Lawley et al., 2008; Skurdenienė ir kt., 2007; Golob, 2009):
žemės paruošimas, sėjomaina ir pasėlių atliekų šalinimas, siekiant sumažinti Fusarium užkratą srityje;
naudoti grybelinei infekcijai atsparias javų veisles;
laiku taikyti efektyvių fungicidų infekcijos kontrolę;
derlių nuimti reikiamos drėgmės ir brandos;
turi būti atliekamas tikslus ir nuolatinis drėgmės matavimas;
greitas džiovinimas.
Sieros dioksidas gali būti panaudotas kaip vienas iš dezinfektantų. SO2 laikomas toksišku mikroorganizmams, nes pasižymi mutageniniu poveikiu (Magan, Aldred, 2007).
Džiovinimas yra populiariausias būdas grūdų derliaus išsaugojimui (Zvicevičius ir kt., 2006; Skurdenienė ir kt., 2007). Mažas drėgmės kiekis yra svarbus veiksnys siekiant apsaugoti grūdus nuo mikologinio užteršimo. Ne iki galo išdžiovintuose grūduose, arba lėtai džiovinant gali greitai atsirast pelėsis ir tokie grūdai greičiau ims gest. Todėl labai svarbu pasirinkti tinkamą džiovinimo režimą (Zvicevičius ir kt., 2006).
Dažniausiai naudojami du grūdų konservavimo būdai: fizikinis, kai grūdai greitai išdžiovinami iki 12–13 proc., cheminis, kai grūdai apdorojami fungistatiniais preparatais, dažniausiai sukurtais propiono rūgšties pagrindu, plačiausiai naudojamas fizikinis būdas (Bakutis, Taruta, 2006).
Pašarai gali būti detoksikuojami. Yra žinomi keli detoksikavimo būdai: fizikinis, cheminis ir biologinis (Bakutis, Taruta, 2006). Pirmiausiai turėtų būti atliekamas fizikinis detoksikavimas, kai grūdai yra valomi nuo piktdžolių sėklų, nuo pažeistų grūdų ar kitų priemaišų (Bakutis, Taruta, 2006).
Cheminė detoksikacija vykdoma grūdus veikiant šarminėmis medžiagomis. Galima ženkliai sumažinti mikotoksinų koncentraciją pašarus veikiant amoniaku (Bakutis, Taruta, 2006). Taip pat yra naudojama biologinė detoksikacija.
30 3 lentelė. Pašarų detoksikavimo metodai (Bakutis, Taruta, 2006)
Prieš šeriant Šėrimo metu
Fizikiniai: Adsorbcija:
mechaniniai aktyvuota anglis
apdorojimas karščiu bentonitas Cheminiai(amoniakas,
monometylaminas, kalciohidrochloridas)
ceolitai ir kt.
Biologiniai Poveikis mikroorganizmais
Poveikis enzimais
Pastaruoju metu mikotoksinams eliminuoti iš maisto produktų ir pašarų vis plačiau taikoma biologinė detoksikacija (Bartkienė ir kt., 2010). Išskirta ir identifikuota daugiau kaip 20 bakterijų ir mielių rūšių, pasižyminčių detoksikuojančiomis savybėmis (Bartkienė ir kt., 2010).
31
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS
2.1. Tyrimo objektai
Tiriamasis darbas buvo pradėtas 2011 metais rugsėjo mėnesį. Tyrimams buvo naudoti dviejų X ir XX sandėlių, esančių Vilkaviškio rajone, grūdai. X sandėlyje miežių „Luokė“ mėginiai imti iš S3 aruodo, kviečių „Munk“ mėginiai imti iš S4 aruodo. XX sandėlyje miežių „Ūla“ mėginiai imti iš K1 aruodo, o kviečių „Triso“ mėginiai imti iš K2 aruodo. Kas mėnesį iki sėjos pradžios buvo imami kviečių ir miežių mėginiai, visada iš tų pačių sandėliuose esančių aruodų (8 pav. ir 9 pav.).
Siekiant nustatyti grūdų užterštumą mikromicetais ir fuzariotoksinais, mėginiai buvo imami iš įvairių aruodo vietų ir gylių, mėginį išmaišius voko principu sudaromas jungtinis mėginys, kuris supilamas į maišelį ir transportuojamas į laboratoriją.
Mikotoksinų įvertinimui mėginiai buvo užšaldomi –18oC temperatūroje iki tyrimo eigos. Tyrimai buvo atliekami nuo 2011 metų iki 2013 metų Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijoje, Gyvūnų gerovės tyrimų laboratorijoje vadovaujantis 1 schema.
8 pav. XX sandėlys K2 aruodas. Vilkaviškio raj., Švitrūnų km. (Autorė E.Kazakevičienė)
32 1 schema. Darbo schema
XX sandėlys (K1 ir K2 aruodai) X sandėlys (S3 ir S4 aruodai)
I ETAPAS
Atlikta apklausa taikant anketavimo būdą
Deoksinivalenolio (DON) paplitimas Grūdų vidinio užsikrėtimo mikromicetais įvertinimas Grūdų išorinio užsikrėtimo mikromicetais įvertinimas Mikromicetų pradų (sporų) skaičiaus įvertinimas grūduose
Mikromicetų kaupimosi grūduose tyrimai
III ETAPAS
Mikotoksinų kaupimosi grūduose tyrimai
Zearalenono (ZON) paplitimas
T–2 toksino paplitimas
33 Buvo atlikta apklausa, naudojant anketos formą. Sandėlių savininkai turėjo atsakyti į keletą klausimų susijusių su grūdų auginimo ir laikymo sąlygomis. Taip buvo siekta išsiaiškinti, kaip ūkininkai ruošiasi sėjai, javapjūtei ir grūdų sandėliavimui. Įvertinus apklausos duomenis buvo galima lengviau įvertinti mikromicetų ir mikotoksinų paplitimą javuose. Anketa pateikiama 1 priede.
Mikotoksinų kaupimuisi grūduose didelę įtaką daro meteorologinės sąlygos. Siekiant įvertinti šio rajono oro sąlygas, duomenys 2011–2012 metų buvo gauti iš meteorologinės stoties, esančios Kybartuose (Vilkaviškio raj.).
4 lentelė. Meteorologinės sąlygos 2011–2012 m. javvų vegetacijos metu
2011 metais oro sąlygos buvo nepastovios. Javų vegetacijos laikotarpiu gegužės mėnesį oro temperatūra buvo mažiausia, o liepos mėnesį didžiausia – 19,2o
C. Birželio ir rugpjūčio mėnesiais oro temperatūra buvo vienoda.
2012 metais oro sąlygos buvo labai nepastovios. Didžiausia temperatūra buvo užfiksuota liepos mėn. – 19,2o
C, tokia pati kaip 2011 metų liepą. Lyginant abiejų metų oro temperatūrą, galima teigti, kad ji buvo panaši 2011 m. vid. 16,9oC . 2012 m. vid. 16,2oC. Drėgmės atžvilgiu, 2012 metai buvo drėgnesni už 2011 metus, tačiau kritulių daugiau iškrito 2011 metais. Kadangi vasara buvo drėgnesnė 2012 metais, tai buvo sudarytos palankios sąlygos Alternaria, Fusarium, Cladosporium, Drechslera ir kitų genčių mikromicetams plisti (Mankevičienė, Auškalnienė, 2004).
Mėn. Oro temperatūra, o C Drėgmė, % Krituliai, mm 2011 m. 2012 m. Vid. 2011 m. 2012 m. Vid. 2011 m. 2012 m. Vid. Gegužė 12,9 13,7 13,3 72 67 70 45,9 44,4 45,2 Birželis 17,7 14,9 16,3 74 76 75 40,4 97,8 69,1 Liepa 19,2 19,2 19,2 83 78 81 166,4 118,4 142,4 Rugpjūtis 17,7 16,8 17,3 79 80 80 124,5 46,2 85,4 Vid. 16,9 16,2 77 75,2 94,3 76,7
34
2.2. Tyrimo metodai
Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijoje, Gyvūnų gerovės tyrimų laboratorijoje buvo atlikti šie tyrimai:
įvertintas kiekybinis kviečių ir miežių užkrėstumas mikromicetų pradais (sporomis); įvertintas išorinis procentinis grūdų užterštumas mikromicetais;
įvertintas vidinis (giluminis) grūdų užkrėstumas mikromicetais; įvertintos mikotoksinų T–2, DON, ZON koncentracijos grūduose.
2.2.1. Kiekybinis kviečių ir miežių užkrėstumas mikromicetų pradais
Kiekybinis kviečių ir miežių užkrėstumas mikromicetų pradais (KSV/g) nustatytas skiedimo būdu. Atsveriama 10 g kviečių (miežių) sumalama, talpinama į 90 ml distiliuoto vandens kolbutę ir maišoma 20 min. Atliekami mėginio skiedimai iki – 1:10-3
.
Gavus reikiamą skiedimą, imamas 1 ml ekstrakto ir sėjama į Petri lėkštelę ant Čapeko agarizuotos terpės užpilimo būdu. Petri lėštelės inkubuojamos 26 ±2oC temperatūroje 7–10 parų. Augančios mikromicetų kolonijos vertinamos 7–10 vystymosi parą. Po to apskaičiuojamas mikromicetų gyvybingų sporų skaičius grame grūdų (3 priedas).
10 pav. Gyvybingos mikromicetų sporos (Autorė E. Kazakevičienė)
2.2.2. Išorinis procentinis grūdų užterštumas mikromicetais
Išorinis procentinis grūdų užterštumas mikromicetais nustatytas naudojantis tiesioginio sėjimo metodu (Trojanovska, 1991). Tyrimams iš kiekvieno mėginio imama po 30 grūdų, kurie sterilioje
35 patalpoje išdėlioti Petri lėkštelėse ant sterilios agarizuotos Čapeko (ČA) terpės. Vienoje Petri lėkštelėje išdėliota ratu 9 grūdai ir viduryje – 1 grūdas.
Sėjimai atliekami 3-iose Petri lėkštelėse. Lėkštelės inkubuojamos 26 ±2oC temperatūroje 7 – 10 parų. Augančios mikromicetų kolonijos vertinamos 7–10 vystymosi parą. Grybų morfologiniai požymiai tirti šviesiniu mikroskopu, remiantis įvairiais apibūdinimais (Samson et al., 1988; Lugauskas ir kt., 2002). Nustatyta kokios mikromicetų gentys auga ir apskaičiuota procentinė jų sudėtis (4 priedas).
11 pav. Išorinis procentinis kviečių užterštumas mikromicetais (Autorė E. Kazakevičienė)
2.2.3. Vidinis (giluminis) grūdų užkrėstumas mikromicetais
Norint nustatyti vidinį (giluminį) grūdų užkrėstumą mikromicetais, grūdai buvo dezinfekuojami 70o etilo spiritu. Ekspozicija 3 min. Grūdai buvo praplaunami steriliame distiliuotame vandenyje, išdėliojami ir įvertinami kaip nedezinfekuoti grūdai.
Išaugusios mikromicetų kolonijos išgrynintos sėjant ant ČA terpės su chloramfenikoliu ir augintos 26 ±2oC temperatūroje 5–6 paras. Identifikuotos pagal kultūrinius ir morfologinius požymius šviesinės mikroskopijos metodu. Mikromicetų rūšys identifikuotos vadovaujantis apibūdintojais (Samson et al., 1988; Lugauskas ir kt., 2002).
