LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS
MAISTO SAUGOS IR GYVŪNŲ HIGIENOS KATEDRA
Toma Vaivadait÷
Mikromicetų ir jų produkuojamų mikotoksinų dinamika
pagamintuose konservuotuose pašaruose karv÷ms ir aflatoksino B
1metabolizmas į M
1piene
Magistro darbas
Darbo vadovas: Prof. Dr. Bronius Bakutis
Baigiamasis darbas atliktas 2008 – 2010 metais Lietuvos veterinarijos
akademijoje Maisto saugos ir gyvūnų higienos katedroje, Gyvūnų gerov÷s tyrimų
laboratorijoje.
Magistro darbą paruoš÷: Toma Vaivadait÷
Magistro darbo konsultant÷ lektor÷ dr. Violeta Baliukonien÷.
Magistro darbo vadovas : Prof. Dr. Bronius Bakutis (Maisto saugos ir gyvūnų higienos katedra)
Recenzentas : ...
SANTRUMPOS AFL – aflatoksinai AFL B1 – aflatoksinas B1 AFL M1 – aflatoksinas M1
AESC - aukšto efektyvumo skystin÷ chromatografija Cv - įvairavimo koeficientas %
DON – deoksinivalenolas DAS – diacetoksiscirpenolis EDC – elektroninis dektorius
FP - fluorescencijos poliarizacijos imunoanaliz÷ GC – dujin÷ chromatografija
IR - infraraudonieji spinduliai KSV – kolonijas sudarantys vienetai mx - vidurkio paklaida
min – mažiausia reikšm÷ max - didžiausia reikšm÷ MS – masių spektometras NIV – nivalenolas
ng/kg-1 – nanogramai kilograme
PGR - polimerizacin÷s grandin÷s reakcija PSCh – plonasluoksn÷ chromatografija p - patikimumo kriterijus OT – ochratoksinai UV – ultravioletiniai spinduliai ZEN – zearalenonas x - aritmetinis vidurkis δ - standartinis nuokrypis µg/kg-1 – mikrogramai kilograme
TURINYS
ĮVADAS...6
1. LITERATŪROS APŽVALGA...8
1.1 Silosas – mikromicetų ir mikotoksinų šaltinis - kelia pavojų gyvulių sveikatai ...8
1.2 Mikromicetai ir jų gaminami mikotoksinai ...8
1.2.1 Aflatoksinus produkuojantys mikromicetai...9
1.2.2 Aflatoksinai ...10
1.2.3 Aflatoksinas M1...11
1.2.4 Trichotecenus produkuojantys mikromicetai ...12
1.2.4.1 Deoksinivalenolas...12
1.2.4.2 T-2 toksinas ...12
1.2.5 Zearalenonas ...13
1.2.6 Ochratoksinai ir juos produkuojantys mikromicetai ...13
1.3 Veiksniai, sąlygojantys mikromicetų vystymąsi ir mikotoksinų produkavimą...15
1.4 Pašarų silosavimas...16
1.4.1 Konservuotų pašarų higienin÷ kokyb÷ ...18
1.4.2 Siloso konservantai...19
1.5 Mikotoksinų nustatymas ir detoksikacija ...21
1.5.1 Mikotoksinų nustatymas...21
1.5.2 Mikotoksinų detoksikacija...22
1.6 Mikromicetų ir mikotoksinų prevencija pašaruose ...23
1.7 Literatūrin÷s dalies apibendrinimas...25
2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI ...26
3. TYRIMŲ REZULTATAI ...29
3.1 2007 m. pavasario laikotarpiu paimtų siloso m÷ginių be konservatų mikrobiologiniai ir mikotoksikologiniai rodikliai ...29
3.2 2008-2009 m. rudens ir pavasario siloso m÷ginių be konservantų mikrobiologiniai ir mikotoksikologiniai rodikliai...34
3.3 Siloso m÷ginių su sil-all 4x4 konservantu mikrobiologiniai ir mikotoksikologiniai rodikliai ...38
3.4 Siloso m÷ginių su austrų gamybos ,,X“ konservantu mikrobiologiniai ir mikotoksikologiniai rodikliai...40
3.5 Siloso m÷ginių kokyb÷s palyginimas pagal jų paruošimo technologijas ...41
4. TYRIMŲ REZULTATŲ APIBENDRINIMAS...49 IŠVADOS ...51 PASIŪLYMAI ...52 PADöKA ...52 SUMMARY...53 LITERATŪRA ...54 PRIEDAI ...61
ĮVADAS
Maisto produktų sauga harmoningame saugios aplinkos kontekste suprantama, kaip orientacija į aplinkos užterštumo mažinimą ir naujų ekologiškai švarių maisto technologijų kūrimą. Žemdirbyst÷s intensyvinimas, kitų įvairių technologijų vystymasis teršia aplinką (orą, dirvą, vandenį, pašarus), o tai daro neigiamą įtaką gyvulininkyst÷s produktų kokybei ir jų saugai žmogui.
Vienas pagrindinių kasdienių maisto produktų yra pienas bei jo produktai. Jų užterštumas labai priklauso nuo aplinkos. Tod÷l pieno kokybę apibr÷žiančiame standarte nurodoma nustatyti ne vien tik pieno rūšį reglamentuojančius rodiklius (bendrą bakterijų kiekį bei somatinių ląstelių kiekį), bet ir tokių teršalų kaip aflatoksino M1 kiekius.
Pieno ūkiuose didelę pašarų dalį sudaro silosas. Stambieji (žoliniai) pašarai mikromicetais gali apsikr÷sti dar augdami laukuose bei laikant juos saugyklose. Mikromicetų augimą ir jų dauginimąsi silose mažina siloso žemas pH, mažas sausųjų medžiagų kiekis, didelis tankis (geras susl÷gimas) ir saugyklos sandarumas ( silosas turi būti uždengtas ar suvyniotas į ritinius, taip kad būtų išvengta siloso kontakto su aplinkos oru). Prad÷jus naudoti silosą gyvulių š÷rimui, svarbu, kad nesusidarytu palankios sąlygos mikromicetų vystymuisi ir mikotoksinų gamybai.
Mikotoksinų paplitimas yra globalinis. Manoma, kad puse javų pas÷lių pasaulyje yra užteršti tam tikru laipsniu mikotoksinų ypač besivystančiose šalyse. 77-nios šalys turi specifinių priemonių, padedančių reguliuoti mikotoksinų kiekius skirtinguose maisto produktuose ir pašare. 13 šalių turi bendras nuostatas, tuo metu, kai apytiksliai 50 šalių neturi jokių duomenų (FAO, 2004). Maistas yra skirtas ne tik tenkinti vartotojų poreikius ir tikslus, bet taip pat tiekti naudą sveikatai.
Didelę augalin÷s kilm÷s pašarinių žaliavų pažeid÷jų dalį sudaro įvairių rūšių mikromicetai, kurie, vystydamiesi ant augalin÷s kilm÷s žaliavų ir iš jų pagamintų pašarų, sintetina ir išskiria į aplinką įvairios chemin÷s sud÷ties antrinius metabolitus – toksinus. Dalis jų yra toksiški ir labai pavojingi žmon÷ms bei gyvūnams. Pastaraisiais metais nustatyta, kad ypač žmonių bei gyvūnų sveikatai pavojingi Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Paecilomyces, Alternaria, Stachybotrys ir kitų genčių sintetinami toksinai: aflatoksinai (AFL), ochratoksinai (OT), zearalenonas (ZEN), deoksinivalenolas (DON), T-2 toksinas, fumonizinai, aflatremai, patulinai, rugulozinai, emodinai ir daugelis kitų cheminių junginių. Mikotoksinų sintez÷ susijusi su mikromicetų geb÷jimu adaptuotis prie įvairių aplinkos sąlygų ir mitybinių substratų. Mikromicetai, vystydamiesi pašarin÷se žaliavose, pašaruose, naudoja
juose esančias maisto medžiagas, o jų išskiriami mikotoksinai sutrikdo organizmo funkcijas. D÷l to pablog÷ja maisto medžiagų įsisavinimas, gali sukelti žmonių ir gyvulių ligas – mikotoksikozes ar tapti v÷žio priežastimi. Šiuo metu žinoma daugiau kaip 400 įvairių mikotoksinų, kurie įvairioms žinduolių rūšims turi toksišką poveikį. D÷l jų visuotinio išplitimo jie laikomi vienu iš svarbiausių žmogaus ir gyvulių sveikatos rizikos veiksnių.
Darbo tikslas: įvertinti siloso, pagaminto pagal skirtingas technologijas, mikrobiologinį ir mikotoksikologinį užterštumą ir aflatoksino B1 metabolizmą į M1 frakciją karvių piene.
Uždaviniai:
• Nustatyti siloso, pagaminto pagal skirtingas technologijas, bendrą mikrobiologinį užterštumą;
• Nustatyti ir palyginti mikotoksinų (AFL, DON, ZEN) kiekius silose, pagamintame pagal skirtingas technologijas;
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Silosas – mikromicetų ir mikotoksinų šaltinis - kelia pavojų gyvulių sveikatai Žaliavų užsiteršimas mikromicetais ir mikotoksinais priklauso nuo dirvos būkl÷s, kurioje auginamos žaliavos silosui ( O‘Brien ir kt., 2006). Silosas, kuris laikomas netinkamomis sąlygomis, gali tapti mikotoksinų šaltiniu, tod÷l jam yra skiriama daugiau d÷mesio ( Wilkinson, 1999; Fink-Gremmels, 2005; Richard ir kt., 2007).
Silosuota žol÷ ar šienas gali būti užteršti kompleksiniais mikotoksinų junginiais, kurie susiformuoja dar prieš nuimant derlių. Pašaras yra užteršiamas Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Monascus, Trichoderma, Mucor, Fusarium bei Byssochlamys ir Geotrichum genčių gaminamais toksinais (Fink-Gremmels, 2008). Mikotoksinus produkuoja tam tikros mikromicetų rūšys, kuriomis pašaras užteršiamas po derliaus nu÷mimo (Boysen ir kt., 2000, Garon ir kt., 2006). Silose dažniausiai mikotoksinus produkuoja šios mikromicetų rūšys: Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. parasiticus, A. niger, A. ochraceus, A. carbonarius, Penicillium viridicatum, P. verrucosum, Fusarium moniliforme, F. graminearum (Fink-Gremmels, 2008, Pitt, 2000). Pavojingi šių mikromicetų gaminami toksinai, kaip patulinas, aflatoksinai, deoksinivalenolas ir įvairūs kiti susintetinti toksinai, kurie patekę su pašarais į galvijų organizmus sukelia antimikrobinį efektą ar modifikuoja skrandžio mikroflorą. Taip pat gyvuliams d÷l prastos mitybos gali atsirasti skrandžio disbakterioz÷, kuri gali progresuoti iki acidoz÷s. Tuomet sutrinka pašaro įsisavinimas, maž÷ja kūno svoris ir atsiranda silpna diar÷ja d÷l netinkamai virškinamo maisto (Puel ir kt., 2005).
Padid÷ję mikotoksinų kiekiai koncentruotuose pašaruose yra sunkiau nukenksminami, nes padid÷ja jų absorbcija gyvulio organizme. Ši hipotez÷ paremta steb÷jimais, atliktais su melžiamomis karv÷mis fermose. Tyrimo metu pasteb÷ta sumaž÷jusi pieno išeiga ir padid÷jęs gyvulių sergamumas infekcin÷mis ligomis, apsinuodijimai silosu, kuris užterštas pel÷siais ir dideliais kiekiais DON ir zearalenonu ir kitais mikotoksinais. Taip pat žymūs metabolitų ir hormonų pasikeitimai pastebimi karv÷ms, nes karv÷s pereinamuoju laikotarpiu yra jautrios pašarui, užterštu mikotoksinais (Fink-Gremmels, 2008).
1.2 Mikromicetai ir jų gaminami mikotoksinai
Maisto ir maisto produktų užteršimas mikotoksinais yra vienas iš aktualiausių problemų, susijusių su žmonių ir gyvūnų saugumu. Vartotojai vis labiau rūpinasi savo sveikata ir viena iš pagrindinių problemų, kuri kelią didžiausią susirūpinimą, yra susijusi su apsaugojimu nuo mikotoksinų. Iš tikrųjų, mikotoksinai yra grybeliniai metabolitai, kurie kaip
buvo įrodyta pasižymi kancerogeniniu, mutageniniu, teratogeniniu ir imunosupresiniu poveikiu (Sarter ir kt., 2004). Be to, mikotoksinai suk÷l÷ didelį pasaulinį d÷mesį d÷l patiriamų ekonominių nuostolių, kurie susiję su neigiamu poveikiu žmogaus sveikatai, gyvulių produktyvumui vidaus ir tarptautin÷je prekyboje (Otsuki ir kt., 2001, Vandeven ir kt., 2002).
D÷l gyvybin÷s mikroskopinių grybų veiklos gali susidaryti metabolitai, toksiški žmon÷ms ir gyvuliams (mikotoksinai), taip pat toksiškos mikroorganizmams medžiagos (antibiotikai). Žinoma apie 250 grybų rūšių, galinčių gaminti mikotoksinus. Šiuo metu žinoma apie 400 grybų metabolitų, pasižyminčių toksiniu poveikiu. Mikotoksikoz÷s – gyvulių, paukščių ir žuvų ligos, kuriomis susergama apsinuodijus pašaru, užterštu toksiškų grybų antriniais medžiagų apykaitos produktais – mikotoksinais (Bakutis, 2004).
1.2.1 Aflatoksinus produkuojantys mikromicetai
Aflatoksinus gamtoje produkuoja Aspergillus flavus, A. parasiticus ir neseniai atrasta rūšis, A. nomius (Dykstehin‘s ir kt., 2007) .
A. flavus plačiai paplitęs aplinkoje. Indentifikavus aflatoksinus, tai tapo plačiausiai maistu plintantis mikromicetas, kuris svarbus tiek ekonominiu, tiek medicininiu požiūriu. A. flavus pripažintas vienu iš svarbiausių, šios genties mikromicetu. A. parasiticus mažiau paplitęs, bet juo taip pat dažnai užteršiami maisto produktai ir maitas. A. nomius praktin÷s reikšm÷s neturi (Dykstehin‘s ir kt., 2007).
A. flavus ir A. parasiticus mikromicetais dažniausiai būna užteršti riešutai ir aliejinių augalų s÷klos. Kukurūzų ir medvilnin÷s s÷klos dažniausiai šių mikromicetų pažeidžiamos kultūros. Anksčiau buvo manoma, kad invazija pirmiausiai įvyksta netinkamai džiovinant ar laikant javus, nes šie faktoriai yra svarbūs aflatoksinų formavimuisi dr÷gno klimato zonose. Tačiau atskirose zonose A. flavus augalai užsikrečia anksčiau, negu nuimamas derlius. Kukurūzų derliaus užikr÷timas priklauso nuo vabzdžių pakenkimo, bet mikromicetai gali taip pat vystytis augalų vystymosi metu. Daugumoje riešutų taip pat susidaro palankios sąlygos vystytis mikromicetams. Javų savyb÷s įtakoja A. flavus vystymąsi, bet, skirtingai nuo riešutų ir aliejinių augalų s÷klų, A. flavus poveikis priklauso nuo javų apdorojimo priemonių po derliaus nu÷mimo. Aflatoksinų kiekiai mažo dr÷gnio grūduose yra retai reikšmingi (Frisvad ir kt., 2005a).
Prieskoniai kartais gali būti užkr÷sti A. flavus ir aflatoksinų kiekiai gali būti dideli. Pramonin÷se šalyse, griežtai atliekant rūšiavimo ir valymo procedūras, galima sumažinti
garantuoja, kad javai ir maistui tinkantys grūdai atitinka sveikatos įstatymų reikalavimus, nustatytus eksportuojančiose ir importuojančiose šalyse (Frisvad ir kt., 2005a).
1.2.2 Aflatoksinai
Aflatoksinai yra žinomi kaip difurankumarino dariniai, priklauso didelei mikotoksinų klasei. Iš aflatoksinų (B1, B2, G1 ir G2) aflatoksinas B1 yra toksiškiausias žmon÷ms ir gyvūnams ir potencialus kancerogenas. Metabolitas M1 pasirodo piene ir pieno produktuose ir tiesiogiai suvartojamas su užkr÷stais pašarais ( http://www.efsa.eu.int. Prieiga per internetą 2008 m. spalio 20 d.).
Aflatoksinas B1 aptinkamas pašaruose, užterštuose Aspergillus flavus ir Aspergillus parasiticus mikromicetais. Aflatokinų kiekis pašaruose priklauso nuo daugelio veiksnių: temperatūros, substrato dr÷gm÷s, aplinkos augalams augant, derliaus nu÷mimo laiko, sand÷lių sanitarijos, laikymo sąlygų (Bakutis, 2004). Aflatoksinui B1 su pašaru patekus į melžiamos karv÷s organizmą, vyksta jo hidroksilinimo reakcija į medžiagų apykaitos produktą aflatoksiną M1 (Food Standards Agency, 2001, Kuilman ir kt., 2000). Šie mikotoksinai laikomi kancerogenais, tod÷l jų kiekis piene turi būti kontroliuojamas. Aflatoksino M1 koncentracija piene gali siekti 0,33 µg l-1 ir tokia gali išlikti 3-4 dienas jau su÷dus pašarą (Bakutis, 2004). Visame pasaulyje tiriamas pieno produktų užterštumas aflatoksinais, išsivysčiusiose šalyse retai randama daugiau leistinos normos, kitur tai rimta maisto saugos problema (Minervini ir kt., 2000).
Aflatoksinai, patekę su maistu į žmonių organizmą, gali kauptis ir sukelti ūminę arba l÷tinę aflatoksikozę. Ūmi žmonių aflatoksikoz÷ paprastai pirmiausia pasireiškia ūmiu hepatitu, o pagrindin÷ ligos priežastis – daug aflatoksinų turinčių maisto produktų, ypač kukurūzų bei riešutų, vartojimas. L÷tin÷ žmonių aflatoksikoz÷ paprastai pasireiškia karcinoma. Tai patvirtina daugelis epidemiologinių tyrimų (Garalevičien÷, 2005).
Aflatoksinai potencialūs kepenų nuodai. Jų kenksmingas poveikis gyvuliams priklauso nuo toksino kiekio, gyvulio rūšies, pašaro sud÷ties, š÷rimo trukm÷s ir pan. Didel÷s aflatoksinų doz÷s gali būti mirtinos. Subletalin÷s koncentracijos sukelia l÷tinius susirgimus, o nedideli toksinų kiekiai predisponuoja navikų vystymąsi, pirmiausia – kepenyse. Jaunikliai jautresni toksinams negu suaugę gyvuliai (Garalevičien÷, 2005). Nedidelis kiekis aflatoksino gali sukleti ląstelių ir įgimtos imunin÷s sistemos pažeidimus, tod÷l gali sumaž÷ti gyvulių atsparumas infekcin÷ms ligoms (Marin ir kt., 2002).
1 pav. Aflatoksinai ir jų virsmai į kancerogeninius darinius (www. bchi.lt/ LBD/ images/a-aflatok.gif Prieiga per internetą 2009 m. geguž÷s 20 d.)
1.2.3 Aflatoksinas M1
Aflatoksinas M1 yra pagrindinis aflatoksino B1 metabolitas. Aflatoksinas M1 yra labai svarbus toksinas randamas piene ir pieno produktuose, kurie yra pagrindiniai Aspergillus falavus ir A. parasiticus gaminami metabolitai (Mendonca ir kt., 2005).
Aflatoksinas B1 į karv÷s organizmą patenka su aflatoksinu užkr÷stais pašarais, o po organizme vykstančių pokyčių susidaro aflatoksinas M1,kuris patenka į pieną. Šis AFM1 yra pagrindinis rizikos veiksnys žmon÷ms, kurie vartoja užterštus šiuo mikotoksinu pieną ir pieno produktus. AFM1 yra mažiau mutageninis ir kancerogeninis nei AFB1, bet jis pasižymi dideliu genotoksiniu poveikiu ( Mendonca ir kt., 2005).
Eksperimentai su karv÷mis parod÷, kad patekusio į organizmą aflatoksino B1 1–3 % virsta M1 piene, tačiau susidarančio aflatoksino M1 kiekiui piene labai didelę įtaką turi š÷rimo ir melžimo laikas bei gyvulio organizmo būkl÷ (Sarimehmetoglas ir kt., 2003). Aflatoksinas M1 yra gana stabilus, jo koncentracijai piene pasterizacija neturi įtakos, tod÷l iš užteršto pieno pagaminti produktai taip pat gali būti užteršti aflatoksinu M1 (Jasutien÷ ir kt., 2004). Visame
2001, Rodrigesas ir kt.,2003, Lopez ir kt., 2003, Bakirci, 2001). Didelis d÷mesys aflatoksino tyrimams piene skiriamas ir tod÷l, kad pieną ir pieno produktus dažnai vartoja vaikai, kurie yra jautresni neigiamam aflatoksino poveikiui. Lietuvoje agroklimatin÷s sąlygos yra palankios mikromicetams augti, tod÷l maisto produktai ir pašarai gali būti užteršti aflatoksinais. Išsamūs epidemiologiniai tyrimai Lietuvoje neatlikti, 2003 m. Nacionalin÷je veterinarijos laboratorijoje ištirti 104 pieno ir jo produktų m÷giniai, iš jų 41 rasta aflatoksino M1, tačiau nustatyta koncentracija buvo mažesn÷ už leidžiamą 0,05 µg/kg (50 ng/kg) (Brukštien÷ ir kt., 2003).
1.2.4 Trichotecenus produkuojantys mikromicetai
Trichotecenai nustatyti, kaip plačiausiai pasaulyje vyraujantys. Trichotecenai gaminami nedideliais kiekiais Myrothecium, Stachybotrys, Trichothecium mikromicetų genčių, nors didžiausia dalis skiriama Fusarium genties mikromicetams. (Cole ir kt., 2003).
Dabartiniu metu chemiškai identifikuota daugiau kaip 60 skirtingų trichotecenų: svarbiausi atstovai – T-2 toksinas; HT-2 toksinas; diacetoksiscirpenolis (DAS); deoksinivalenolas (DON); nivalenolas (NIV); krotocinas, roridinas A, D, E; verukarinas A, B; satratoksinas H, G.
1.2.4.1 Deoksinivalenolas
DON yra dažniausiai nurodomas Fusarium spp. gaminamas mikotoksinas. Esant DON kiekiams pašaruose, sumaž÷ja pašaro suvartojimas, sumaž÷ja priesvoriai, gali vykti endokrinin÷s ir neuroendokrinin÷s sistemų funkciniai pokyčiai. Manoma, jog DON yra pašarų gedimo indikatorius. Dažniausiai DON pasitaiko pašaruose su ZEN. Žmon÷ms, kurie su maistu suvartoja nemažus kiekius DON, pasireiškia pykinimu, v÷mimu, skrandžio ir žarnyno skausmais, kai kurie tuštindavosi kruvinomis išmatomis, žmones išberdavo. Šie susirgimai literatūroje dar vadinami ,,raudonųjų pel÷sių” arba ,,juodųjų d÷mių” liga (Garalevičien÷, 2005).
1.2.4.2 T-2 toksinas
T-2 toksinas priklauso trichotecenams. T-2 toksiną gamina Fusarium sporotrichioides bei F. poae. Esant melžiamų galvijų pašaruose šio toksino, galvijams pasireiškia gastroenteritas, žarnyno hemoragija, didžojo prieskrandžio, žarnyno opos. Žmon÷ms T-2 toksinas yra pavojingas tuo, kad dideli jo kiekiai gali sukelti alimentinę toksinę leukemiją (Garalevičien÷, 2005, Huszenicza ir kt., 2000).
1.2.5 Zearalenonas
Zearalenonas randamas plačiai kukurūzuose ir kukurūzų produktuose ir šiek tiek avižose, ryžiuose, rugiuose, sorguose ir kviečiuose (Zinedine ir kt., 2007). Atrajotojai ZEN greitai paverčia į α- ir ß-zearalenolį. Zearalenonas ir jo metabolitai ( įskaitant zearalenolį) susijungę su estrogeno receptoriais sudaro mišinį antagonistų/agonistų ir sukelia gyvuliams sindromą, kuris apibūdinamas kaip hiperoestrogenizmas ( Zinedine ir kt., 2007). Galvijams pasireiškia nevaisingumas, vaginitas, pablog÷ja reprodukciniai rodikliai. Esant dideliems ZEN kiekiams apie 1-1,5 mg/kg galimi galvijų abortai. Esant galvijų racionuose apie 750 µg/kg-1 ir 500 µg/kg-1 DON pablog÷ja pašaro įsisavinimas, sumaž÷ja priesvoriai, pasireiškia diar÷ja ir sutrinka reprodukcin÷s funkcijos (Fink-Gremmels, 1999, Minervini ir kt., 2001).
Apie toksišką zearalenono poveikį žmon÷ms žinoma nedaug. Vienas žinomiausių šios toksikoz÷s epideminių reiškinių aprašytas Puerto Rike. Septynerių - aštuonerių metų abiejų lyčių vaikai itin anksti lytiškai subręsdavo, jiems išsivystydavo antriniai lytiniai požymiai. Ištyrus vaikų valgomą maistą, jame, ypač m÷soje, rasta daug estradioliui ekvivalentiškos medžiagos – zearalanolio, kuris buvo vartojamas kaip augimo stimuliatorius galvijininkyst÷je ir avininkyst÷je. Buvo nustatyta, jog zearalenonas ir jo metabolitai α ir β-zearalenoliai konkurentiškai jungiasi prie žmogaus estrogeninių receptorių ir veikia estrogeniškai (Garalevičien÷, 2005).
1.2.6 Ochratoksinai ir juos produkuojantys mikromicetai
Ochratoksinai dažniau ir didesn÷mis koncentracijomis yra randami Šiaurin÷je ir Rytin÷je Europos dalyse (Danijoje,Vokietijoje, Lenkijoje). Dažniausiai iš ochratoksinų minimas ochratoksinas A, kuris yra toksiškiausias. Ypač palankios sąlygos šio mikotoksino gamybai susidaro dr÷gnų vasarų metu netinkamai sand÷liuojant pašarus. Net ir nedideli ochratoksinų kiekiai sukelia toksinius efektus: galvijams (ypač jautrūs veršeliai) (Yiannikouris ir kt., 2003).
Ochratoksinai yra gaminami Penicillium genties mikromicetų: P. verrucosum ir Aspergillus genties: A. ochraceus. Iki šiol geriausiai ištirti ochratoksinai A, B, C, D. Pavojingiausias yra ochratoksinas A. Šie mikotoksinai turi kancerogeninių, nefrotoksinių, teratogeninių, imunotoksinių ir galbūt net neurotoksinių savybių. Per pašarus jis patenka į gyvūnų organizmą ir kaupiasi inkstuose, kepenyse ir kraujyje, d÷l to gyvūnų inkstai bei kepenys gali tapti kenksmingu maisto produktu (www.nmvrvi.lt Prieiga per internetą 2009 m.
klinikiniai intoksikacijos požymiai (Bakutis, 2004). Daugiausia ochratoksino A yra grūduose ir grūdų produktuose. Didelis ochratoksino A kiekis į žmogaus organizmą patenka vartojant vyną, kavą ir alų. Vaikai kaip specifin÷ grup÷ iš labiausiai pažeidžiamų vartotojų grupių didelį ochratoksino A kiekį gauna per džiovintas vynuoges ir vynuogių sultis (Komisijos reglamentas (EB) Nr. 123/2005). Ochratoksinas A – viena iš žmonių edemin÷s nefropatijos priežasčių, pasireiškiančių l÷tin÷mis inkstų ligomis bei šalinimo organų sistemų augliais.
1 lentel÷. Pagal EU Sąjungos direktyvas maisto žaliavose ir maisto produktuose: LEIDŽIAMI MIKOTOKSINŲ KIEKIAI
Mikotoksinai Maisto žaliavos ir maisto produktai
Leidžiama koncentracija
Aflatoksino M1 piene 0,05 µg kg-1
Ochratoksino A grūduose 5 µg kg-1
Patulino sultyse 50 mg l-1
Deoksinivalenolas (DON) Grūduose (išskyrus avižas, kukurūzus)
1250 µg kg-1
avižose 1750 µg kg-1
duonoje 500 µg kg-1
Zearalenonas (ZEN) grūduose 100 µg kg-1
grūdų miltuose 75 µg kg-1
duonoje 50 µg kg-1
2 lentel÷. Dažniausios žmonių mikotoksikoz÷s (Garalevičien÷, 2005)
Susirgimas Serga Substratas Etiologinis agentas
Akabio-bio
Žmon÷s Kviečiai, miežiai, avižos, ryžiai
Fusarium gentis
Alimentin÷ toksin÷ aleukija (ATA, septin÷ angina)
Žmon÷s Maistiniai grūdai (toksiška duona)
Fusarium gentis
Balkanų nefropatija Žmon÷s Maistiniai grūdai Penicillium gentis
Širdies beriberi Žmon÷s Ryžiai Aspergillus,
Penicillium gentys Salierų augintojų liga Žmon÷s Salierai (rožinis
puvinys)
Dendrodochiotoksikoz÷ Žmon÷s, arkliai
Pašarai (kontaktas su oda, užkr÷stų dalelių inhaliacija)
Dendrodochium toxicum
Ergotizmas Žmon÷s Rugiai, maistiniai
grūdai Claviceps purpurea
Stemlp÷s v÷žys Žmon÷s Kukurūzai
Fusarium moniliforme Hepatokarcinoma (ūmi
aflatoksikoz÷)
Žmon÷s Maistiniai grūdai, riešutai
Aspergillus flavus A. parasiticus Kašin Bek liga Žmon÷s Maistiniai grūdai Fusarium gentis Kwashiorkor Žmon÷s Maistiniai grūdai Aspergillus flavus
A. parasiticus
Onyalai Žmon÷s Soros
Phoma sorgina R÷jaus sindromas Žmon÷s Maistiniai grūdai Aspergillus gentis Stachibotriotoksikoz÷ Žmon÷s,
gyvūnai
Šienas, maistiniai grūdai, pašarai
(kontaktai su oda, šieno dalelių inhaliacija)
Stachybotrys atra
1.3 Veiksniai, sąlygojantys mikromicetų vystymąsi ir mikotoksinų produkavimą Jau lauko sąlygomis varpinių javų grūdai, žol÷ ir gyvulių pašarai yra pažeidžiami mikroorganizmų. Užterštumo lygis tiesiogiai priklauso nuo oro sąlygų brendimo metu. Pagal parazitavimo aktyvumą jie sąlyginai skirstomi į „laukų“ ir „sand÷lių“ grybus. Veiksniai, didinantys augalų jautrumą, yra stresas, kurį sukelia skersv÷jai, pernelyg intensyvus laistymas, vabzdžių ir pesticidų poveikis. Gamtoje grybus – patogenus gali išplatinti v÷jas, vanduo, vabzdžiai ir paukščiai. Mikroskopinių grybų plitimo intensyvumas priklauso ir nuo dirvožemio pH ir sud÷ties (Bakutis, 2004).
Dauguma atvejų, mikotoksinai pradedami sintetinti laukuose, pašarinių žaliavų augimo metu, tačiau jie gali būti sintetinami ir jų koncentracija gali did÷ti žaliavų ir pašarų apdorojimo, džiovinimo ir sand÷liavimo metu. Svarbiausia mikotoksinų formavimosi tarpsnis
angliavandenių skilimo ir azoto kiekis (Garalevičien÷, 2005). Sand÷liavimo metu tokie veiksniai kaip vandens aktyvumas, temperatūra, mikrobin÷ intervencija, mechaninis pavojus ir vabzdžių infekcijos, gali įtakoti užsikr÷timą mikromicetais.
1.4 Pašarų silosavimas
Pastaraisiais metais ES, JAV ir kitose su gerai išvystytu žem÷s ūkiu šalyse iš didžiosios dalies žolių ir kitų žalių augalų, naudojamų pašarui yra gaminamas silosas (O`Kiely ir kt., 1998). Wilkins (2000), Davies ir kt. (2005) pažymi, kad silosuotų pašarų gamyba išplito d÷l mokslo pasiekimų, pagrindžiančių fermentacijos mechanizmą silosuojamoje mas÷je, d÷l naujos žolių dorojimo ir silosavimo technikos progreso, d÷l sukurtų įvairių cheminių ir biologinių silosavimo priedų ir d÷l silosuojamai masei sandarinti (hermetizuoti) naujai sukurtų ir gaminamų specialių pl÷velių. Dabartiniu metu Lietuvoje didžioji dalis ūkininkų ir žem÷s ūkio bendrovių iš žolių ir kitų žalių augalų gamina silosą ir ypač išpopuliar÷jo ritininio siloso gamyba.
Silosavimas - tai techninis - biocheminis procesas, kurio metu žol÷s ar kiti žali augalai yra užkonervuojami ir gali būti saugomi ir naudojami gyvūnams šerti ilgą laiką (Hancock ir kt., 2006). Techninis procesas vyksta kai silosuojama mas÷ (žol÷s ar kiti žali augalai) nupjaunami, smulkinti arba nesmulkinti sukraunami į talpas (tranš÷jas arba kaupus) arba suvyniojami į ritinius ir hermetizuojami orui nepralaidžia pl÷vele. Tai atlikus prasideda biocheminis procesas. Bakterijos (svarbiausios pieno rūgšties bakterijos) augaluose ar kitoje silosuojamoje žaliavoje esantį cukrų ir kitus tirpius angliavandenius deguonies neturinčioje aplinkoje (anaerobin÷je) fermentuoja į organines rūgštis (svarbiausia pieno rūgštis), kurios ir užkonservuoja pašarą. Šis pašaras vadinamas silosu.
Sudaryti palankias sąlygas reikiamai silosuojamos mas÷s fermentacijai, tai yra geros kokyb÷s silosui pagaminti (nepriklausomai nuo to ar silosas gaminamas tranš÷joje, kaupe ar ritinyje) būtinos 3 pagrindin÷s sąlygos:
1. Pakankamas sausųjų medžiagų (SM) kiekis silosuojamoje žaliavoje (25-35%) 2. Pakankamas tirpiųjų angliavandenių (svarbiausias cukrus) silosuojamoje žaliavoje
(60-90 g kg/SM)
3. Tinkamas silosavimo technologijos prisilaikymas t.y. Geros siloso gamybos praktikos taikymas:
a) greitas saugyklų užpildymas ar ritinių suvyniojimas;
b) geras silosuojamos mas÷s susl÷gimas tranš÷joje arba geras silosuojamos mas÷s suspaudimas ritinyje;
c) tinkamas silosuojamos mas÷s sandarinimas (hermetizavimas) tam, kad nepatektų oras.
Tokiu būdu vienas iš svarbiausių silososavimo Geros gamybos praktikos elementų yra geras silosuojamos mas÷s hermetizavimas. Tinkamai užsandarinus silosuojamą masę yra: a) sustabdomas mikromicetų bei mielių augimas ir jų veikla; b) sudaromos sąlygos pieno rūgšties bakterijų dauginimuisi ir svarbiausios siloso rūgšties (pieno rūgšties) gaminimui. Gerą silosuojamos mas÷s hermetizavimą (sandarinimą) nulemia du pagrindiniai faktoriai:
1) tinkamas hermetizavimo darbų atlikimas, naudojant tam reikalui skirtą įrangą ir kvalifikuotą techninį personalą;
2) hermetizavimui (sandarinimui) naudojama pl÷vel÷.
Ritininio siloso gamyba yra patrauklus žolinių pašarų konservavimo būdas Europoje bei JAV. Dabartiniu metu vis daugiau Lietuvos pašarų gamintojų pasirenka šią pašarų konservavimo technologiją. Ritininio siloso hermetizavimui (sandarinimui – ritinio apvyniojimui) yra naudojama speciali technika ir tam reikalui skirta elastinga (tąsi) pl÷vel÷ („stretch film“) (500 arba 750 mm pločio ir 0,025 µ storio). Ritininiams apvynioti (ritininio siloso gamybai) skirta pl÷vel÷ turi garantuoti nepriekaištingą silosuojamos mas÷s hermetizavimą. Ji turi būti elastinga, tvirta, gerai sukimbanti, atspari aplinkos ir saul÷s poveikiui, nepralaidi orui (Borreani ir kt., 2005). Tokiu būdu ritiniams sandarinti skirta pl÷vel÷ turi atitikti keletą pagrindinių reikalavimų:
1) ji turi tur÷ti geras mechanines savybes (optimalus storis - 0,025µ (mikronai), elastinga esant net labai šiltam orui, tempiant neturi atsirasti suplon÷jančių, šviesesnių mažesnių ar didesnių tarpų, atspari mechaniniam poveikiui, pradūrimui);
2) ji turi praleisti kuo mažiau oro ir nepralaidi vandeniui; 3) pl÷vel÷s sluoksniai turi gerai sukibti;
4) ji turi netrūkin÷ti, nesuplyšti, veikiant tiesioginiams saul÷s spinduliams, ultravioletiniams spinduliams, turi išlikti elastinga, laikant keletą m÷nesių.
Kai kuriose Europos Sąjungos šalyse labai aukštos kokyb÷s ritininio siloso pl÷vel÷ yra pažym÷ta specialiu nacionaliniu „kokyb÷s ženklu“, kaip „NF“ ženklu Prancūzijoje arba „SP“ ženklu Švedijoje. Teis÷ tokiam kokyb÷s žym÷jimui suteikiama, atlikus pl÷vel÷s kokyb÷s įvertinimą nacionalin÷je nepriklausomoje tos srities mokslo įstaigoje. Tik atlikusi tyrimus, min÷ta institucija, gali nurodyti ar tam tikroje įmon÷je gaminama pl÷vel÷ atitinka keliamus reikalavimus ir garantuoja tinkamą ritinių sandarinimą ir jų išsaugojimą ( Silage Strech
Lietuvojeritininio siloso gamintojams yra siūlomos ir parduodamos įvairiose užsienio šalyse gaminamos pl÷vel÷s, kurių dalis yra patikrintos ir aprobuotos naudojimui Europos Sąjungos šalyse. Ūkininkams yra labai svarbu, kad pl÷vel÷, kurią jie perka ir naudoja, užtikrintų geros kokyb÷s ritininio siloso gamybą ir kad kuo ilgiau ritiniai išliktų nesuirę ir taip negadintų pašaro. Kartais ritiniams sandarinti skirta pl÷vel÷ yra per daug pralaidi orui, neelastinga, neatspari tempimui, plyšin÷ja, sandarinant ritinius yra jos sunaudojama didesnis kiekis nei įprastai reikia. Sandarinant ritinius nekokybiška pl÷vele pablog÷ja siloso fermentacijos rodikliai, sumaž÷ja pašaro mitybin÷ vert÷ ir pablog÷ja higienin÷ kokyb÷ (vystosi mikromicetai ir gali augti miel÷s) (Degano, 1999, Forristal ir kt., 1999).
UAB „Umaras“ prad÷jo Lietuvoje gaminti „agro - stretch“ pl÷velę ritininiam silosui sandarinti (hermetizuoti), tačiau neatlikti jokie tyrimai apie jos tinkamumą ritininio siloso gamybai. Kaip rodo anksčiau pateikti faktai, neatlikus bent minimalaus šios pl÷vel÷s įvertinimo moksliniu pagrindu, yra galima rizika platinti ją Lietuvos ar kitų šalių rinkoje. Tod÷l buvo atlikti tyrimai, kad nustatyti UAB „UMARAS“ gaminamos pl÷vel÷s tinkamumą ritininiam silosui gaminti (ritiniams sandarinti).
1.4.1 Konservuotų pašarų higienin÷ kokyb÷
Apie silosuotų (konservuotų) pašarų higieninę kokybę jau galima spręsti pagal jų fermentacijos rodiklius. Jei konservuotame pašare vyrauja pieno rūgštis ir yra nedaug acto rūgšties bei amoniakinio azoto, n÷ra ar beveik n÷ra sviesto rūgšties, tada galime daryti prielaidą, kad pašaras yra geros higienin÷s kokyb÷s ir jį galima saugiai šerti gyvūnams. Jei silose yra daug acto rūgšties, jame didel÷ amoniakinio azoto ir sviesto rūgšties koncentracija, mažai pieno rūgšties, tada galima manyti, kad toks pašaras nehigieniškas, jame yra daug enterobakterijų ir klostridijų, kurios gali neigiamai įtakoti gyvūnų sveikatą ir produkcijos (ypač pieno) higieninę kokybę (saugumą) žmonių sveikatos požiūriu. Be to, blogos fermentacijos konservuotuose pašaruose gali augti mikromicetai, gaminantys mikotoksinus, kurie, šeriant melžiamas karves taip užterštu pašaru, yra randami piene ( Jatkauskas ir kt., 2003).
Konservuotų pašarų mikroflora gali būti suskirstyta į dvi grupes - naudingi (pageidaujami) ir kenksmingi (nepageidaujami) mikroorganizmai. Pageidaujami mikroorganizmai - tai pieno rūgšties bakterijos, produkuojančios konservuojamuose žaliuose augaluose pieno rūgštį. Nepageidaujami mikroorganizmai yra tie, kurie sukelia silosuoto pašaro anaerobinį gedimą (t.y. klostridijos ir enterobakterijos) arba aerobinį pašaro gedimą (t.y. mikromicetai, miel÷s, bacilli, listerijos). Šie mikroorganizmai ne tik gadina pašarą, bet
kartu kenkia gyvūnų sveikatai ir menkina gyvūnin÷s produkcijos, ypač pieno, higieninę kokybę ( Jatkauskas ir kt., 2004).
1.4.2 Siloso konservantai
Uždengus siloso saugyklą arba apvyniojus siloso ritinį pl÷vele, fermentacijos procesų nebegalima valdyti. Pašaro rūgimą gali pagerinti priedai, kurie įterpiami į silosuojamą žaliavą. Pagal jų veikimo mechanizmą silosavimo priedus galima suskirstyti į dvi pagrindines kategorijas: priedai, stimuliuojantys fermentacijos procesą (biologiniai inokuliantai), ir priedai, inhibituojantys silosavimo procesą (cheminiai konservantai). Siloso konservantų nauda:
Greitina siloso fermentacijos procesą.
Stabdo nepageidaujamų mikroorganizmų dauginimąsi. Mažina maisto medžiagų nuostolius fermentacijos metu. Stabdo sviesto rūgšties gamybą fermentacijos metu. Gerina siloso ir šienainio kokybę.
Didina siloso ir šienainio maistinę vertę.
Didina siloso ir šienainio aerobinį stabilumą (stabdo antrinę - nepageidautiną siloso ir šienainio fermetaciją).
Nepavojingi gyvulių sveikatai. Mažina galvijų š÷rimo savikainą. Didina gyvulių produktyvumą.
(http://www.kemiragrowhow.com/LIT/Produktai/Silosas/04silosoKonservantai.htm. Prieiga per internetą 2009 m. kovo 3 d.)
Cheminiai konservantai (dažniausiai naudojama skruzdžių rūgštis arba jos druskos ir propionin÷s bei benzoin÷s rūgščių derinys) labiausiai tinka sunkiai besifermentuojantiems augalams: liucernoms, dobilų atolams. Jie slopina klostridijų veiklą, išsaugo silose daugiau cukraus ir kitų maisto medžiagų bei didina atsparumą antrinei fermentacijai.
Biologiniai priedai pranašesni, nes yra visiškai saugūs įrenginių, žmogaus sveikatos ir gamtos atžvilgiu, tačiau jie yra brangesni ir ne visada efektyvūs.
Bakteriniai inokuliantai šiuo metu yra vieni iš pagrindinių silosavimo priedų Europoje ir JAV. Pavyzdžiui, Nyderlanduose pra÷jusiais metais apie 1/3 žolių siloso buvo pagaminta naudojant siloso priedus (2 pav.).
Konservantai; 29%
Melasa; 31%
Inokuliantai; 40%
2 pav. Nyderlanduose naudojami silosavimo priedai
Bakterinių inokuliantų populiarumas padid÷jo, kai biotechnologai sukūr÷ naujus, daug pieno rūgšties produkuojančius ir atsparius aplinkos pokyčiams bakterijų štamus.
Kai kurios įmon÷s gamina inokuliantus, kurių sud÷tyje be pieno rūgštį produkuojančių bakterijų prid÷ta celiuliozę skaidančių fermentų. Pastarieji ardo augalų ląstelių sieneles, atpalaiduodami iš sud÷tinių angliavandenių cukrų ir taip sudarydami palankesnes sąlygas pieno rūgšties bakterijoms gaminti pieno rūgštį (Jatkauskas, 2005).
3 lentel÷. Siloso priedų tipai (Paulauskas, 2009)
Organin÷s rūgštys Sumažina biocheminių procesų aktyvumą, sudaro sąlygas pieno rūgšties bakterijų veiklai, saugo pašarus nuo klostridijų, sumažina pašarų pH, baltymų skaidymą bei sausųjų medžiagų nuostolius; Bakteriniai
inokuliantai
(gyvosios pieno rūgšties bakterijos)
Silosuojamos mas÷s cukrų paverčia pieno ir acto rūgštimis, mažina siloso pH, spartina siloso fermentaciją, mažina siloso baltymų skaidymą;
Fermentai Skaido krakmolą ir ląstelieną, gerina siloso ląstelienos virškinamumą; Angliavandenių
šaltiniai (melasa, džiovinti cukrinių runkelių griežiniai)
Sudaro sąlygas mikroorganizmų veiklai, spartina silosuojamos mas÷s fermentaciją, mažina siloso pH, didina pieno rūgšties kiekį;
Nebaltyminis azotas (amoniakas,
karbamidas)
Veikia antimikrobiškai, didina žaliųjų baltymų kiekį silose, gerina sąlygas pieno rūgšties bakterijoms.
1.5 Mikotoksinų nustatymas ir detoksikacija 1.5.1 Mikotoksinų nustatymas
Mikotoksinai - tai tokie cheminiai junginiai, kurie išlieka stabilūs juos apdorojant karščiu, šalčiu ar šviesa. Tai yra daugiausiai bespalviai, bekvapiai ir beskoniai junginiai, kuriuos maiste ir pašaruose yra sunku aptikti. Šių junginių aptikimui ir nustatymui yra naudojami mikotoksikologiniai tyrimai. Dažniausiai mikotoksinų nustatymui pašaruose naudoja ELISA ir PSCh metodai.
Plačiausiai yra taikomi chromatografiniai metodai. Šiuos metodus taikant būtinos referentin÷s medžiagos – m÷giniai su žinomais toksinų kiekiais ir kalibracijos standartai. Plonasluoksn÷ chromatografija (PSCh) yra analitinis metodas, taikomas atskiriems mikotoksinams nustatyti pašaruose. PSCh dažniausiai taikoma trichotecenų nustatymui. Taip pat dar gali būti naudojama aukšto sl÷gio skysčių chromatografijos (AESC) ir dujin÷s chromatografijos metodai (GC). AESC su UV detekcija naudojamas trichotecenų nustatymui. Skystin÷ chromatografija su masių spektrometru (MS) taikoma A ir B tipo trichotecenų kiekio nustatymui. Dabar dažniausiai taikoma kapiliarin÷ dujin÷ chromatografija (GC) su vienu iš dviejų – elektroniniu detektoriumi (EDC) ir masių spektrometru (MS) išskyrimui ir nustatymui mikotoksinų (Kraska, 1998). Šiuo metu maisto pramon÷je ir farmacijoje plačiai yra taikomi ir naudojami liuminescencijos tyrimai (Sarter ir kt., 2004), kurie pasižymi tikslumu ir jautrumu.
Mikotoksinų nustatymui taip pat plačiai yra taikomi imunocheminiai metodai, kurių principas yra imunofermentin÷ analiz÷ (Magan, 2004). Pagrįsta antikūno-antigeno reakcija, antikūnų panaudojimas prieš beveik visus pagrindinius mikotoksinus: DON, T-2, ZEN, AFL, OTA (Desaeger ir kt., 2002, Bird ir kt., 2002, Nilüfer ir kt., 2002, Escobar ir kt., 2002, Velasco ir kt., 2003). Imunin÷ analiz÷ paremta jautrumu, greitumu ir tikslumu mikotoksinų monitoringe ir taikoma, esant dideliems m÷ginių kiekiams vienu metu. Taip pat gali būti naudojami komerciniai testai (ELISA). Jų pagalba atliekama kokybin÷ ir kiekybin÷ analiz÷ (Zheng ir kt., 2004, CAST , 2003; Anklam ir kt., 2002; Seefelder ir kt., 2002). Dabar dažniausiai yra naudojami komerciniai komplekai, tokie kaip Ridascreen komplektai aflatoksinams, fumonizinams, DON ir zearalenonui (R Biopharm Ltd), Aflatox Cup (Tarptautin÷ Diagnostin÷ Sistema) ir Aflatoksinui B1 testas (Cite Probe).
kaip specifinis aflatoksino monokloninis antikūnis tirpale. FP tyrimai turi du svarbius skirtumus nuo ELISA: aptikimo doz÷ neapima enzimin÷s reakcijos ir laisvas žymeklis n÷ra reikalingas. Tod÷l, FP tyrimams nereikalingas išplovimo žingsnis, kuris būtinas atliekant tyrimus ELISA metodu. Nereikia laukti, kol susidarys spalvotas enzimų junginys.
Esant dideliam m÷ginių skaičiui ir nustatant toksinį m÷ginio aktyvumą, gali būti naudojami biologiniai metodai. Biomol÷kulin÷s technologijos, tokios kaip polimerizacin÷s grandin÷s reakcija (PGR), yra laikoma kaip daug žadanti naudojant ją mikromicetų aptikimui dažniau nei mikotoksinų nustatymui (Zur ir kt., 2002). Tačiau ši technika reikalauja brangių investicijų ir apmokytų analitikų. Šis metodas puikiai tinka nustatant mikromicetų genus, atsakingus už mikotoksinų produkavimą, bet netinka tiriant užterštas javų kultūras. Mikotoksinų toksiškumui nustatyti naudojamos jūrinių krevečių lervos, miel÷s, bakterijos, viščiukų embrionai. Vis labiau taikomas ląstelių kultūrų in vitro metodas.
Šiuo metu prad÷ti naudoti mikotoksinų analizei greiti tyrimų metodai: infraraudonųjų spindulių (IR) spektroskopija, biosensoriai ir kolorimetrinis nustatymas (Zheng ir kt., 2006).
1.5.2 Mikotoksinų detoksikacija
Mikotoksiniais užteršti pašarai gyvulių augintojams daro didelius ekonominius nuostolius. Svarbiausias uždavinys ūkiuose – kaip detoksikuoti mikotoksinais užterštus pašarus. Reikia atlikti daug įvairių darbų:
• suardyti, inaktyvuoti arba pašalinti mikotoksinus;
• panaudojus chemines (ir fizikines) priemones, reikia neleisti susidaryti naujiems toksiškiems junginiams;
• detoksikuoti taip, kad nenukent÷tų pašaro vert÷;
• kuo daugiau sunaikinti sporų ir grybų micelio ir sustabdyti galimybę atsinaujinti mikotoksinų produkavimui;
• parinkti lengvai įterpiamas, nebrangias ir nekenksmingas aplinkai detoksikavimo priemones (Bakutis, 2004).
Mikotoksinų kiekį maisto produktuose ir pašaruose galima sumažinti fizikiniais, cheminiais arba mikrobiologiniais būdais. Technologinio proceso metu pvz.: aflatoksinai gali jungtis su matricos komponentais, skilti į mažiau toksiškas medžiagas veikiant karščiui ar kitiems veiksniams. Toksinus akumuliuoti arba sujungti gali ir mikroorganizmai. Žinoma, kad kai kurios pieno rūgšties ir bifidobakterijų paderm÷s gali sumažinti aflatoksino B1 kiekį (Lahtinen ir kt., 2004).
4 lentel÷. Pašarų detoksikavimo metodai (Bakutis, 2004)
Prieš šeriant Š÷rimo metu
Fizikiniai: Mechaniniai Apdorojimas karščiu Poveikis spinduliais Absorbcija: Aktyvuota anglis Bentonitas Ceolitai ir kt. Cheminiai: Amoniakas Monometylaminas, Kalcio hidrochloridas ir kt. Biologiniai: Poveikis mikroorganizmais Poveikis enzimais
1.6 Mikromicetų ir mikotoksinų prevencija pašaruose
Gyvulių augintojams ir pašarų gamintojams norint išvengti mikromicetų augimo ir mikotoksinų produkavimo pašaruose yra būtina kontroliuoti mikromicetų augimą ir mikotoksinų gamybą. Mikromicetų augimą pašaruose galima kontroliuoti pašarus laikant sausai ir kiek įmanoma žemesn÷je temperatūroje, kuo trumpiau juos laikant sand÷liuose iki jie bus sušerti gyvuliams, tinkamai valyti ir prižiūr÷ti pašarų laikymo patalpas, naudoti mikromicetų augimo inhibitorius (Bakutis, 2004).
Taip pat yra žinoma, kad mikotoksinai, su užterštu pašaru patekę į gyvulių organizmą, sukelia riebalų peroksidaciją, kurios pasekm÷ mikotoksikoz÷s. Tod÷l norint sumažinti mikotoksinų neigiamą poveikį gyvuliams, patariama gyvulius šerti pašaru praturtintais antioksidantais. D÷l to kad antioksidantai gali efektyviai apsaugoti nuo neigiamo mikotoksinų poveikio. Atlikus eksperimentus su vitaminu E, pasteb÷ta, kad jis pad÷jo apsisaugoti nuo aflatoksino, deoksinivalenolo, T-2 toksino, fumonizino, zearalenono ir ochratoksino neigiamo poveikio. Pasirodo selenas taip pat turi apsauginį poveikį prieš aflatoksiną ir T-2 toksiną. Antioksidantų mišinį, kurį sudaro: vitaminai A ir E, Co-fermentas Q10, selenas ir sintetiniai antioksidantai, patariama naudoti kaip prevencinę priemonę, kuri apsaugo nuo lipidų peroksidacijos, kurią sukelia mikotoksinai (Whitlow, 2009).
Norint apsaugoti silosą silosavimo metu nuo mikromicetų augimo ir mikotoksinų gamybos, visų pirmiausia iš tranš÷jos reikia pašalinti deguonį. Taip pat galima panaudoti keletą siloso priedų tokių kaip, amoniakas, propiono rūgštis, mikrobų kultūros ar siloso enzimai, kurie efektyviai sumažina mikromicetų augimą ir mikotoksinų gamybą (http://www.admani.com/alliancedairy/TechBulletins/Mycotoxins%20in%20feeds.html.
Mikromicetų augimui ir mikotoksinų gamybos prevencijai galima naudoti mikromicetų augimo inhibitorius. Inhibitorių pagrindin÷s rūšys yra: individualios ar sukombinuotos organin÷s rūgštys (propiono, sorbo, benzonin÷ ir acto rūgštys), organinių rūgščių druskos (kalio priopionatas ir kalio sorbatas) ir vario sulfatas. Kietos ar skystos formos dirba vienodai, jeigu inhibitoriai vienodai pasiskirstę pašare. Paprastai rūgščių formos inhibitoriai yra aktyvesni, nei jas atitinkančios druskos (http://www.ces.ncsu.edu/disaster/ drought/dro-29.html. Prieiga per internetą 2009 m. geguž÷s 15 d.)
1.7 Literatūrin÷s dalies apibendrinimas
Išanalizavus literatūros duomenis, galima teigti, kad mikromicetai gali lengvai prisitaikyti prie aplinkos sąlygų. Svarbu nustatyti mikromicetus pašaruose, jų kiekį ir rūšį. Mikromicetai nustatomi juos auginant ant mitybinių terpių. Tai padeda juos identifikuoti. O mikotoksinų kiekiams pašaruose nustatyti yra naudojami chromatografiniai, imunoheminiai ir biologiniai metodai.
Kai kurie mikromicetai gamina nuodingas medžiagas mikotoksinus, kurie yra pavojingi tiek gyvūnams, tiek žmon÷ms. Jie sukelia ligas – mikotoksikozes. Iš mikromicetų labiausiai aplinkoje yra paplitusios Penicillium, Fusarium ir Aspergillus gentys, kurios gamina žmon÷ms ir gyvūnams nuodingus junginius – mikotoksinus. Esant palankioms lauko sąlygoms augalai gausiai užsikrečia mikromicetais, tai dažniausiai būna Fusarium, Alternaria, Cladosporium, Aspergillus ir Penicillium genčių grybai. Mikromicetų plitimui turi įtakos dirvos įdirbimas, s÷jomaina, tręšimas, bei klimato sąlygos – tai yra temperatūra ir dr÷gnumas. Sand÷liuojant konservuotus pašarus, juose parazituoja taip vadinamieji ,,sand÷lių“ mikromicetai: Penicillium sp., Aspergillus sp., Rhizopus sp., Mucor sp.. Pašarų laikymo vietose jų kiekis priklauso nuo santykinio deguonies ir anglies dioksido kiekio, saugyklos sanitarin÷s higienin÷s būkl÷s, temperatūros, dr÷gm÷s.
Mikotoksinai yra pavojingi žmonių ir gyvūnų sveikatai, jie pasižymi: imunotoksiniu, hepatotoksiniu, neurotoksiniu, kancerogeniniu, dermatotoksiniu poveikiu. Tokiu poveikiu pasižymi zearaleonas, ochratoksinai, trichotecenai, aflatoksinai ir fumonizinai.
Mikromicetų dauginimuisi pašaruose slopinti naudojamos įvairios prevencin÷s priemon÷s, tokios kaip dr÷gm÷s, temperatūros, deguonies kiekio kontrol÷. Naudojant mikromicetų inhibitorius (priopiono, acto, sorbo ir kitas rūgštis arba jų druskas). Mikotoksinų kiekį maisto produktuose ir pašaruose galima sumažinti fizikiniais, cheminiais arba mikrobiologiniais būdais.
Siloso silosavimas susideda iš fermentacijos fazių, kurių metu vyksta įvairūs pokyčiai. Siloso konservavimui naudojami įvairūs priedai: biologiniai inokuliantai, organin÷s rūgštys, fermentai ir kt.
2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI
Tyrimų objektas. Nuo 2007 iki 2009 m. įvairiais laikotarpiais buvo renkami skirtingos botaninin÷s sud÷ties siloso m÷giniai iš skirtingų ūkių. Iš viso buvo surinkta 97 siloso m÷giniai, iš kurių 66 siloso m÷giniai buvo be konservantų (1, 2 ir 3 priedai) ir 31 siloso m÷giniai buvo su konservantais: 14 buvo užkonservuoti su sil-all 4x4 konservantu (4 priedas), 17 – su austrų gamybos ,,X” konservantu (5 priedas). Tyrimų metu įvertinta mikrobiologinis ir mikotoksikologinis užterštumas siloso m÷ginių, pagamintų iš įvairių rūšių žolių pagal skirtingas technologijas.
2007 m. iš skirtingų žem÷s ūkio bendrovių buvo surinkti 36 siloso m÷giniai be konservantų, kurie buvo tiesiogiai paimti iš ritinių. Iš jų 12 varpinių žolių atolo mišinio siloso m÷ginių, 8 – dobilų siloso m÷giniai, 4 – dobilų atolo siloso m÷giniai ir 12 žol÷s svidr÷s siloso m÷ginių. 16-ka šių siloso m÷ginių buvo įvynioti į umaro ,,agro-stretch“ gamybos žalios spalvos pl÷velę ir 12-ka į baltos spalvos pl÷velę. TRIOPLAST-TRIOWRAP (gamintojas Švedija) pl÷velę buvo įvynioti 8 siloso m÷giniai.
2008 metų rudenį iš skirtingų ūkių būvo surinkta 15-ka siloso m÷ginių be konservantų. Tiesiogiai buvo paimta 11-ka siloso m÷ginių iš ritinių ir 4 m÷giniai iš tranš÷jų. Iš jų 14-ka varpinių žolių mišinio siloso m÷giniai ir 1 dobilų siloso m÷ginys.
2009 metais pavasarį iš skirtingų ūkių buvo surinkta 46 siloso m÷giniai, iš kurių 15-ka siloso m÷ginių be konservantų. Aštuoni siloso m÷giniai buvo paimti iš tranš÷jų, o septyni m÷giniai paimti iš ritinių. 4 siloso m÷giniai buvo pagaminti iš varpinių žolių mišinio, 5 pagaminti iš kukurūzų ir 6 - iš dobilų.
Taip pat iš keleto ūkių buvo paimti siloso m÷giniai, kurie buvo pagaminti naudojant konservantus. Tiesiogiai iš tranš÷jų buvo paimta 14-ka siloso m÷ginių su sil-all 4x4 konservantu ir 4 siloso m÷giniai su austrų gamybos ,,X“ konservantu. Tiesiogiai iš kaupų paimti 9 siloso m÷giniai, o iš ritinių 4 siloso m÷giniai su austrų gamybos ,,X“ konservantu. Iš viso paimta 17-ka siloso m÷ginių su austrų gamybos ,,X“ konservantu.
UAB ,,Alltech technologijos“ sukurtas Sil-all 4x4 konservantas yra bakterinis, tod÷l jį galima naudoti ir ekologiniuose ūkiuose. Įmaišytas į silosuojamą masę jis anaerobiškai veikia mielių ir mikromicetų vystymąsi silose ir sumažina siloso nuostolius. Su šiuo konservantu tyrimams atlikti paimti 3 vaškin÷s brandos kukurūzų siloso m÷giniai ir 11 varpinių žolių mišinio siloso m÷ginių. Austrų gamybos ,,X“ konservanto pavadinimas ir sud÷tis nežinoma.
Su šiuo konservantu tyrimams atlikti paimti 8 varpinių žolių mišinio siloso m÷giniai ir 9 liucernos siloso m÷giniai.
Paimta 12 pieno m÷ginių iš žem÷s ūkio bendrovių. Tyrimų seka pavaizduota schemoje:
2.1 Tyrimų schema
Siloso ir pieno m÷ginių tyrimai
Mikrobiologiniai tyrimai Mikotoksikologiniai tyrimai Siloso m÷ginių kokyb÷s nustatymas Sanitariniai rodikliai 1. Bendras mikroorganizmų skaičius 2. Mikromicetų pradų skaičius 3. Procentinis užterštumas vyraujančiomis mikromicetų gentimis ir rūšimis AFL, DON ir ZEN mikotoksinų nustatymas silose AFL M1 nustatymas piene Siloso m÷ginai pagaminti
pagal skirtingas tecchnologijas
Bendras mikroorganizmų skaičius (KSV g-1) tiriamajame m÷ginyje nustatytas skiedimų būdu, panaudojus mitybinį agarą. L÷kštel÷s su užkratu inkubuotos termostate 30oC temperatūroje..Augančios kolonijos skaičiuotos po 24 val. ir 48 val. Po to apskaičiuotas bendras mikroorganizmų skaičius (KSV g-1 - kolonijas sudarančių vienetų) 1 g m÷ginio. Tyrimai atlikti vadovaujantis Lietuvos higienos normos HN 26:2006 „Maisto produktų mikrobiologiniai kriterijai“, LST EN ISO 4833:2003.
Siekiant išaiškinti m÷ginio paviršiuje esančius mikromicetus ir nustatyti jų pradų kiekį, naudotas nuoplovų skiedimo metodas (KSV g-1). Kiekvienas m÷ginio ekstraktas (praskiedimas 1:10-3) s÷tas į Petri l÷kšteles su Čapeko ir Saburo terpe, inkubuotas termostate 26±2oCtemperatūroje 10 parų.. Augančios mikromicetų kolonijos vertinamos 5-tą , 7-tą, 10-tą vystymosi parą. (Kurasovos ir kt., 1971, Smirnova ir kt., 1989). Mikromicetų skaičius įvertintas pagal LST ISO 6611:2004.
Nustatant m÷ginio tiesioginį užkr÷stumą mikromicetais, kurie aptinkami ant išorinio m÷ginio dalelių paviršiaus, įvertintas procentinis išorinis užsikr÷timas gyvybingu mikromicetų miceliu. Mikromicetų rūšys identifikuotos pagal Lugausko ir kitų (2002), Ellis ir kt., (1971), Domsch ir kt., (1980), Nelson ir kt., (1983), Samson ir kt., (1988), Samson ir kt., (2000) apibudinimus.
Mikotoksinų koncentracija nustatyta imunofermentin÷s analiz÷s metodu (IFA), panaudojus komercinius VERATOX® DON 5/5, VERATOX® T-2 Toxin, VERATOX® Zearalenone, VERATOX® Aflatoxin, VERATOX® Ochratoxin (Neogen, JAV) rinkinius bei RIDASCREEN® FAST DON, RIDASCREEN® FAST Zearalenon, RIDASCREEN® FAST Aflatoxin (R-Biopharm AG, Vokietija) rinkinius, pagal pateiktą gamintojo metodiką. Kiekybiniam aflatoksino M1 nustatymui naudotas imunofermentinis analiz÷s metodo (IFA) testas RIDASCREEN® Aflatoxin M1 (R-Biopharm AG, Vokietija).
Statistinis duomenų įvertinimas. Tyrimų duomenys įvertinti statistiniu ,,R 2.9.2.“ ir ,,Microsoft Excel“ programa. Buvo apskaičiuoti gautų duomenų aritmetiniai vidurkiai (x ), vidurkio paklaida (mx), mažiausia (min) ir didžiausia (max) reikšm÷, standartinis nuokrypis (δ) ir įvairavimo koeficientas % (Cv). Aritmetinių vidurkių skirtumo patikimumas (p) nustatytas pagal Stjudentą. Atliekant dispersinę analizę (ANOVA) buvo sudarytas statistinis modelis ir nustatyta veiksnių įtaka bendram mikroorganizmų kiekiui (x10-5 KSV g-1). Duomenys laikomi patikimais kai p<0,05. Duomenims grafiškai pateikti panaudota Microsoft Excel programa.
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1 2007 m. pavasario laikotarpiu paimtų siloso m÷ginių be konservatų mikrobiologiniai ir mikotoksikologiniai rodikliai
Bendras mikroorganizmų kiekis varpinių žolių mišinio atolo silose svyravo nuo 0,2x10-5 iki 64x10-5 KSV g-1 (palyginus su 2008-2009 m. varpinių žolių mišinio siloso m÷giniais p>0,05, Cv - 128,15, mx – 6,28), mikromicetų pradų kiekis svyravo nuo 0,3x10-3 iki 30x10-3 KSV g-1 (palyginus su 2008-2009 m. varpinių žolių mišinio siloso m÷giniais p>0,05, Cv - 172,29, mx – 2,62). Dobilų atolo siloso m÷giniuose bendras mikroorganizmų kiekis svyravo nuo 1x10-5 iki 156x10-5 KSV g-1 (palyginus su 2008-2009 m. dobilų siloso m÷giniais p>0,05, Cv - 188,56, mx – 38,42), mikromicetų pradų kiekis svyravo nuo 0 iki 1x10-3 KSV g-1 (palyginus su 2008-2009 m. dobilų siloso m÷giniais p>0,05, Cv - 126,32, mx – 0,24). Ištyrus aštuonis dobilų siloso m÷ginius, juose bendras mikroorganizmų kiekis siek÷ nuo 0,1x10-5 iki 43x10-5 KSV g-1 (palyginus su 2008-2009 m. dobilų siloso m÷giniais p>0,05, Cv - 50,7, mx – 5,19), mikromicetų pradų kiekis svyravo nuo 0 iki 11x10-3 KSV g-1 (palyginus su 2008-2009 m. dobilų siloso m÷giniais p>0,05, Cv - 93,21, mx – 1,65). Žol÷s svidr÷s siloso m÷giniuose bendras mikroorganizmų kiekis svyravo nuo 0,2x10-5 iki 29x10-5 KSV g-1 (palyginus su 2008-2009 m. kukurūzų siloso m÷giniais p>0,05, Cv - 151,6, mx – 3,15 ), mikromicetų pradų kiekis svyravo nuo 0 iki 9,3x10-3 KSV g-1 (palyginus su 2008-2009 m. kukurūzų siloso m÷giniais p>0,05, Cv - 47,75, mx – 0,85).
Mikromicetų pradų kiekis žolių silose svyravo įvairiose ribose. Vidutiniškai varpinių žolių mišinio atolo siloso m÷giniuose nustatyta 6,6x10-3 KSV g-1 mikromicetų pradų, tai yra 16% (p>0,05) daugiau negu dobiluose. Toks didelis varpinio žolių mišinio atolo siloso užterštumas mikromicetais sąlygotas aplinkos sąlygų. Žol÷s svidr÷s silose užterštumas mikromicetų pradais palyginus su dobilų silosu nustatytas 83% (p>0,05) mažesnis (3 pav.).
6,6 0,75 5,54 5 0 1 2 3 4 5 6 7
Varpinių žolių mišinio atolo silosas
Dobilų atolo silosas Dobilų silosas Žol÷s svidr÷s silosas
x 1 0 -3(K S V /g -1)
3 pav. Vidutinis mikromicetų pradų kiekis x10-3(KSV g-1) silose (2007 m. pavasaris)
Konservuotų pašarų užterštumas mikroorganizmais ir mikromicetų pradais priklauso nuo jų paruošimo technologijos ir laikymo sąlygų. Tai įvertinti iš įvairių žem÷s ūkio bendrovių buvo paimti siloso m÷giniai, kurie buvo pagaminti naudojant skirtingas ritinių pl÷veles. Keli ūkiai naudojo TRIOPLAST-TRIOWRAP (gamintojas Švedija) pl÷velę, o kiti ūkiai - Umaro gamybos „agro-stretch“ baltos spalvos arba žalios spalvos pl÷veles.
Palyginus šiuos siloso m÷ginius pagal užterštumą mikroorganizmais, nustatyta, kad labiausiai užterštas dobilų atolo silosas, kurio užterštumas 28,75% (p>0,05) didesnis, nei varpinių žolių mišinio atolo siloso.
Taip pat skirtingas užterštumas mikroorganizmais vyrauja tarp vienodos rūšies žolių siloso m÷ginių, juos lyginant pagal jų paruošimo technologijas. Šis skirtumas matomas lyginant varpinių žolių mišinio atolo siloso m÷ginius, kurie buvo paruošti naudojant skirtingas ritiniams įvynioti pl÷veles (4 pav.). Varpinių žolių mišinio atolo siloso, įvynioto TRIOPLAST-TRIOWRAP pl÷velę, bendras mikroorganizmų užterštumas 48% (p>0,05) didesnis nei siloso, įvynioto į Umaro gamybos ,,agro-stretch“ gamybos pl÷velę.
16,7 7,74 13,92 32,1 53,33 0 10 20 30 40 50 60
varpinių žolių mišinio atolo silosas
žol÷s svidr÷s silosas dobilų silosas varpinių žolių mišinio atolo silosas
dobilų atolo silosas
Umaro ,,agro-stretch" pl÷vel÷ TRIOPLAST-TRIOWRAP pl÷vel÷
x 1 0 -5 ( K S V g -1 )
4 pav. Vidutinis bendras mikroorganizmų kiekis x10-5(KVS/g-1) siloso m÷giniuose paimtuose iš ritinių, įvyniotų į Umaro gamybos ,,agro-stretch“ ir TRIOPLAST-TRIOWRAP pl÷veles (2007 m. pavasaris)
Palyginus dobilų atolo siloso m÷ginius, kurie pagaminti naudojant TRIOPLAST-TRIOWRAP pl÷velę ir dobilų siloso m÷ginius, kurie pagaminti naudojant Umaro gamybos ,,agro-stretch“ baltą arba žalią pl÷veles, matome skirtingą mikroorganizmų užterštumą (4 pav.).
Dobilų atolo siloso, įvynioto į TRIOPLAST-TRIOWRAP pl÷velę, užterštumas mikroorganizmais 74% ( p>0,05) didesnis nei dobilų siloso, įvynioto į Umaro gamybos stretch“ pl÷velę. Varpinių žolių mišinio atolo siloso, įvynioto į Umaro gamybos ,,agro-stretch“ pl÷velę, užterštumas mikroorganizmais 53,7% (p>0,05) didesnis nei žol÷s svidr÷s siloso, įvynioto į Umaro gamybos ,,agro-stretch“ pl÷velę, ir 16,6 % (p>0,05) daugiau nei dobilų siloso, įvynioto į Umaro gamybos ,,agro-stretch“ pl÷velę. Dobilų siloso užterštumas mikroorganizmais 44,4% (p>0,05) didesnis nei žol÷s svidr÷s siloso ( 4 pav.).
Skirtingas užterštumas mikromicetų pradais vyravo varpinių žolių mišinio atolo siloso m÷giniuose, juos palyginus pagal jų paruošimo technologijas ( 5 pav.). Varpinių žolių mišinio atolo siloso, įvynioto į Umaro gamybos ,,agro-stretch“ pl÷velę, užterštumas mikromicetų pradais 96% (p>0,05) didesnis nei siloso, įvynioto į TRIOPLAST-TRIOWRAP pl÷velę.
10,7 4,6 6,9 0,4 0,75 0 2 4 6 8 10 12 varpinių žolių mišinio atolo silosas žol÷s svidr÷s silosas
dobilų silosas varpinių žolių mišinio atolo
silosas
dobilų atolo silosas
Umaro ,,agro-stretch" pl÷vel÷ TRIOPLAST-TRIOWRAP
pl÷vel÷ x 1 0 -3 ( K S V g -1 )
5 pav. Vidutinis mikromicetų pradų kiekio palyginimas siloso m÷giniuose paimtuose iš ritinių, įvyniotų į Umaro gamybos ,,agro-stretch“ ir TRIOPLAST-TRIOWRAP pl÷veles (2007 m. pavasaris)
Palyginus dobilų atolo siloso m÷ginius, kurie pagaminti naudojant TRIOPLAST-TRIOWRAP pl÷velę, ir dobilų siloso m÷ginius, kurie pagaminti naudojant Umaro gamybos ,,agro-stretch“ pl÷velę, matome skirtingą užterštumą mikromicetų pradais ( 5 pav.).
Dobilų siloso, įvynioto į Umaro gamybos ,,agro-stretch“ pl÷velę, užterštumas mikromicetų pradais 89% (p>0,05) didesnis nei dobilų atolo siloso, įvynioto į TRIOPLAST-TRIOWRAP pl÷velę. Varpinių žolių mišinio atolo siloso, įvynioto į Umaro gamybos
,,agro-siloso, įvynioto į Umaro gamybos ,,agro-stretch“ pl÷velę. Dobilų siloso užterštumas mikromicetų pradais 33% (p>0,05) didesnis nei žol÷s svidr÷s siloso ( 5 pav.).
Visuose 2007 m. pavasario siloso m÷giniuose vyravo Rhizomucor sp. 3,3-41,7 % (Cv- 80,5), Actinomycetes sp. 1,7-20% (Cv – 72,1). Didžiausias užterštumas mikromicetais nustatytas varpinių žolių mišinio atolo siloso m÷giniuose. Varpinių žolių mišinio atolo silosas buvo užsikr÷tęs nuo 1,7 iki 21,7% (Cv – 67,72) Mucor genties mikromicetais. Didesnis vyraujančių mikromicetų genčių skaičius išskirtas iš dobilų siloso. Iš žolių siloso m÷ginių buvo išskirtos toksiškos mikromicetų rūšys: dobilų - Aspergillus niger (6 pav.),žol÷s svidr÷s – Aspergillus parasiticus, varpinių žolių – Aspergillus flavus (7 pav.), Fusarium solani, kukurūzų siloso – Trichoderma hamatum (8 pav.). Šios mikromicetų rūšys, esant tam tikroms aplinkos sąlygoms ar mikromicetams patyrus „stresą“, gali prad÷ti gaminti mikotoksinus.
6 pav. Aspergillus niger 7 pav. Aspergillus flavus
8 pav. Trichoderma hamatum
Varpinių žolių mišinio atolo ir dobilų siloso m÷giniai buvo užsikr÷tę toksiškomis Penicillium, Aspergillus, Fusarium genčių mikromicetų rūšimis. Varpinių žolių mišinio atolo siloso m÷giniuose nustatytas 0,5% užsikr÷timas Fusarium sp. mikromicetais. Dobilų siloso
m÷giniuose nustatytas didelis užsikr÷timas „dirvožemio“ mikromicetais: Cladosporium sp., Humicola sp., Sporotrix schenckii, Eurotium sp. ir kt. Žol÷s svidr÷s siloso m÷giniai buvo mažiausiai užkr÷sti mikromicetais. Šiuose m÷giniuose vyravo Actinomycetes sp. (20%). Taip pat buvo aptikta Fusarium sp. (1,7%) ir Trichoderma harzianum (10%). Kukurūzų silose vyravo Penicillium sp., Aspergillus sp. Trichoderma sp. procentinis užterštumas siek÷ 60% (13 priedas).
Palyginus konservuotų pašarų ruošimo technologijas buvo nustatyta, kad pašaruose, kurie buvo paruošti naudojant TRIOPLAST-TRIOWRAP (gamintojas Švedija) pl÷velę, vyravo mažiau įvairių mikromicetų genčių nei pašaruose, kurie buvo paruošti naudojant Umaro gamybos „agro-stretch“ pl÷velę.
TRIOPLAST-TRIOWRAP (gamintojas Švedija) pl÷vel÷je įvyniotuose ritiniuose vyravo: 1,3-7% (Cv – 95,5) Mucor sp., 5-17% (Cv – 73,21) Actinomicetes sp., 3,3% Penicillium sp., 37% (Cv – 39,12) Aspergillus sp., buvo aptikta ir Fusarium sp. 0,55% (Cv -105,73) ( 14 priedas).
Umaro gamybos „agro-stretch“ baltos spalvos pl÷vel÷je įvyniotuose ritiniuose vyravo: Aspergillus sp. 1,7-8,3% (Cv – 5,02), Penicillium sp. 1,7-3% (Cv – 30,7), Fusarium sp. 1,7%, Actimomycetes sp. 1,7-20% (Cv – 78,28), Mucor sp. 3,3-21,7% (Cv – 46,45) ir kt. (15 priedas).
Umaro gamybos „agro-stretch“ žalios spalvos pl÷vel÷je įvyniotuose ritiniuose vyravo: Aspergillus sp. 5-10 % (Cv – 48,29), Penicillium sp. 3,3-17% (Cv – 94,47), Trichoderma sp. 10%, Rhizomucor sp. 3-26,7% (Cv – 80,23), Mucor sp. 1,7-22% (Cv- 68,57), Actinomycetes sp. 1,7-11,7 % (Cv – 67) ir kt. ( 16 priedas).
Iš 14-to, 15-to ir 16-to priedų, matome, kad labiausiai užkr÷stas silosas, kuris paruoštas naudojant Umaro gamybos ,,agro-stretch“ žalios spalvos pl÷velę.
Atlikus pavasarį paimtų siloso m÷ginių mikotoksikologinius tyrimus, buvo nustatyta DON, T-2, ZEN, AFL, OT kiekiai (6 priedas). Daugiausiai žolių siloso m÷giniuose vyravo DON ir ZEN, jų nustatytos didžiausios koncentracijos (9 pav.). Varpinių žolių mišinio atolo silose DON kiekis svyravo nuo nežymių p÷dsakų iki 1100 µg/kg-1 ( Cv – 70,25, mx – 50,07), AFL nuo 2,2 iki 40 µg/kg-1( Cv –70,54 , mx – 1,72), ZEN kiekis nustatytas nuo 50 iki 700 µg/kg-1( Cv – 57,26, mx – 30,79). Varpinių žolių mišino atolo silose nustatytas didžiausias DON kiekis – 1100 µg/kg-1.
Ochratoksinų buvo nustatyta nuo p÷dsakų iki 63 µg/kg-1 ( Cv –51,81, m
x –2,26). Didžiausias OT kiekis 63 µg/kg-1 buvo nustatytas taip pat varpinių žolių mišinio atolo silose.
13,01 578 398 25,2 83 0 100 200 300 400 500 600 700
Aflatoksinas Deoksinivelenolas Zearalenonas Ochratoksinai T-2 toksinas
p
p
b
9 pav. Mikotoksinų kiekiai silose (2007 m. pavasaris)
3.2 2008-2009 m. rudens ir pavasario siloso m÷ginių be konservantų mikrobiologiniai ir mikotoksikologiniai rodikliai
Bendras mikroorganizmų kiekis varpinių žolių mišinio silose svyravo nuo 0,5x10-5 iki 562x10-5 KSV g-1(palyginus su 2007 m. varpinių žolių atolo mišinio siloso m÷giniais p>0,05, Cv – 127,69, mx – 36,17), mikromicetų pradų kiekis svyravo nuo 0 iki 136x10-3 KSV g-1 (palyginus su 2007 m. varpinių žolių atolo mišinio siloso m÷giniais p>0,05, Cv – 144,96, mx – 8,78). Dobilų siloso m÷giniuose bendras mikroorganizmų kiekis svyravo nuo 29x10-5 iki 424x10-5 KSV g-1(palyginus su 2007 m. dobilų siloso m÷giniais p>0,05, Cv – 85,86, mx – 58,32), mikromicetų pradų kiekis svyravo nuo 1x10-3 iki 227x10-3 KSV g-1 (palyginus su 2007 m. dobilų siloso m÷giniais p>0,05, Cv – 235,74, mx - 31,89). Ištyrus penkis kukurūzų siloso m÷ginius, juose bendras mikroorganizmų kiekis siek÷ nuo 199x10-5 iki 1175x10-5 KSV g-1 (palyginus su 2007 m. žol÷s svidr÷s siloso m÷giniais p>0,05, Cv – 61,91, mx – 177,08), mikromicetų pradų kiekis svyravo nuo 175x10-3 iki 1711x10-3 KSV g-1 (palyginus su 2007 m. žol÷s svidr÷s siloso m÷giniais p>0,05, Cv – 73,75, mx – 27,90).
Kukurūzų siloso m÷giniuose nustatytas vidutiniškai didžiausias bendras mikroorganizmų kiekis 639,6x10-5 KSV g-1, tai yra 71,9% (p>0,05) didesnis užterštumas nei dobilų siloso ir 81,21% (p>0,05) didesnis nei varpinių žolių mišinio siloso (10 pav. ).
7,75 153 152,32 340 639,6 0,00 100,00 200,00 300,00 400,00 500,00 600,00 700,00 Varpinių žolių mišinio silosas
Dobilų silosas Varpinių žolių mišinio silosas
Dobilų silosas Kukurūzų silosas
Ruduo Pavasaris x 1 0 -5 ( K S V g -1 )
10 pav. Vidutinis bendras mikroorganizmų kiekis x10-5 (KSV g-1) rudens ir pavasario siloso m÷giniuose (2008-2009 m.)
Kukurūzų siloso m÷giniuose nustatytas didžiausias vidutinis užterštumas 84,6x10-3 KSV g-1 mikromicetų pradų, tai yra 49,26% (p>0,05) daugiau negu dobiluose. Toks didelis kukurūzų siloso užterštumas mikromicetais sąlygotas aplinkos sąlygų. Varpinių žolių mišinio siloso užterštumas mikromicetų pradais nustatytas 69,63% (p>0,05) mažesnis nei kukurūzų silose (11 pav.). 31,36 4 5,88 41,08 84,6 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00
Varpinių žolių mišinio silosas
Dobilų silosas Varpinių žolių mišinio silosas
Dobilų silosas Kukurūzų silosas
Ruduo Pavasaris x 1 0 -3 ( K S V g -1 )
11 pav. Vidutinis mikromicetų pradų kiekis x10-3(KSV g-1) rudens ir pavasario siloso m÷giniuose (2008-2009 m.)
Palyginus rudens ir pavasario m÷ginius pagal jų paruošimo technologijas, matome, kad didesnis bendras mikroorganizmų kiekis nustatytas pavasario siloso m÷giniuose (12 pav.). Šių siloso m÷ginių užterštumas mikroorganizmai 35,36% (p>0,05) didesnis nei rudens siloso m÷ginių. Mikromicetų pradų kiekis 57,5% (p>0,05) didesnis pavasario siloso m÷giniuose (13 pav.). Tai įtakojo aplinkos sąlygos, nes did÷jant temperatūrai susidaro palankios sąlygos daugintis mikroorganizmams.
104,85 251 153 400,13 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Ritinys Tranš÷ja Ritinys Tranš÷ja
Ruduo Pavasaris x 1 0 -5 ( K S V g -1 )
12 pav. Vidutinis bendras mikroorganizmų kiekis x10-5 (KSV g-1) rudens ir pavasario siloso m÷giniuose pagal paruošimo technologijas (2008-2009 m.)
38,95 1,13 41,08 55,5 0 10 20 30 40 50 60
Ritinys Tranš÷ja Ritinys Tranš÷ja
Ruduo Pavasaris x 1 0 -3 ( K S V g -1 )
13 pav. Vidutinis mikromicetų pradų kiekis x10-3 (KSV g-1) rudens ir pavasario siloso m÷giniuose pagal paruošimo technologijas (2008-2009 m.)
Visuose 2008 m. rudens siloso m÷giniuose vyravo Penicillium sp. 0,6-100% (Cv – 70,37), Aspergillus sp. 1-83% (Cv – 81,51) (17 priedas). 2009 m. pavasario siloso m÷giniuose vyravo taip pat Aspergillus sp. 0,3-100% (Cv – 84,6), Penicillium sp. 6-99,9% (Cv – 73,97), bei plačiose ribose vyravo Rhizopus sp. 0,3-100% (Cv – 70,92) ir Rhizomucor sp. 46 -100% (Cv – 27,12) (17 priedas).
Didžiausias užterštumas mikromicetais nustatytas pavasario siloso m÷giniuose. Tai nul÷m÷ aplinkos veiksnys - atmosferos oro temperatūra, nes pavasarį atšylant orui kilo ir temperatūra. Tai paskatino mikromicetų vystymąsi ir didesnį užterštumą. Rudens varpinių žolių mišinio siloso m÷giniai buvo užsikr÷tę nuo 1 iki 63% (Cv – 70,37) Aspergilus sp., Penicillium sp. nuo 0,6 iki 100% (Cv – 81,51) mikromicetais. Pavasario siloso m÷giniuose didesnis vyraujančių mikromicetų genčių skaičius išskirtas iš kukurūzų siloso. Iš žolių siloso m÷ginių buvo išskirtos toksiškos mikromicetų rūšys: Aspergillus niger, A. parasiticus, Penicillium expansum, Fusarium poe ir F. solani.
